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Neuroscience

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

doi: 10.3791/60299 Published: November 6, 2019

Summary

Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.

Abstract

El procesamiento auditivo en la cócleara depende de la integridad de las células pilosas mecanosensoriales. A lo largo de toda la vida, la pérdida auditiva se puede obtener de numerosas etiologías, como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el proceso de envejecimiento. La pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de las variedades de pérdida auditiva adquirida. Además, la sinapsis de la célula del cabello interno puede ser dañada por leves insultos. Por lo tanto, las preparaciones superficiales de la epitelía coclear, en combinación con técnicas de inmunoetiquetado e imágenes confocales, son una herramienta muy útil para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas sensoriales, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas y células de apoyo, regeneración de células pilosas y determinación de la expresión génica del informe (es decir, GFP) para la verificación de la transducción exitosa y la identificación de tipos de células transducidas. La cócleara, una estructura ósea en forma de espiral en el oído interno, sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). Las células pilosas sensoriales y las células de soporte circundantes en la OC están contenidas en el conducto coclear y descansan sobre la membrana basilar, organizadas de manera tonotópica con detección de alta frecuencia que se produce en la base y baja frecuencia en el ápice. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la capacidad de manipular genes mediante técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la investigación biológica, incluso en la ciencia auditiva. Sin embargo, la cócleara de ratón adulta es minúscula, y el epitelio coclear está encapsulado en un laberinto óseo, lo que dificulta la microdisección. Aunque las técnicas de disección se han desarrollado y utilizado en muchos laboratorios, este método de microdisección modificada utilizando adhesivo celular y tisular es más fácil y más conveniente. Se puede utilizar en todo tipo de cocleares de ratón adultos después de la descalcificación.

Introduction

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La cócleara se dedica a la detección de sonido y responsable de la audición. El conducto coclear se enrolla en forma de espiral en el laberinto óseo y sostiene el órgano final sensorial auditivo, el órgano de Corti (OC). El OC descansa sobre la membrana basilar, que compone el epitelio coclear, con una longitud de unos 5,7 mm cuando se desenrolla en ratones ADULTOs CBA/CaJ1,2. Debido a que el OC está organizado tonotópicamente con altas frecuencias detectadas en la base y frecuencias bajas en el ápice, el epitelio coclear a menudo se divide en tres partes para comparaciones analíticas: los giros apicales, medios y basales correspondientes a bajos, detección de frecuencia media y alta, respectivamente. Además de una serie de células de apoyo, la OC se compone de una fila de células pilosas internas (IHC) ubicadas medialmente y tres filas de células del cabello exteriores (OHC) ubicadas lateralmente con respecto a la espiral coclear.

El procesamiento auditivo correcto depende de la integridad de las células pilosas sensoriales en la cócleara. El daño o la pérdida de células pilosas sensoriales es una característica patológica común de la pérdida auditiva adquirida, causada por numerosas etiologías como la exposición al ruido excesivo, el uso de medicamentos ototóxicos, infecciones bacterianas o virales del oído, lesiones en la cabeza y el envejecimiento proceso3. Además, la integridad y la función de las sinapsis de la célula capilar interna/nervio auditivo pueden verse afectadas por leves insultos4. Con la disponibilidad de información molecular y genética y la manipulación de genes por técnicas de nocaut y knock-in, los ratones han sido ampliamente utilizados en la ciencia auditiva. Aunque la cócleara de ratón adulta es minúscula y el epitelio coclear está rodeado por una cápsula ósea que resulta en microdisecciones técnicamente difíciles, preparaciones superficiales del epitelio en combinación con inmunoetiquetado o inmunohistoquímica y las imágenes confocales se han utilizado ampliamente para la investigación de patologías cocleares, incluyendo pérdidas de sinapsis de cinta y células pilosas, cambios en los niveles de proteínas en las células pilosas sensoriales y células de apoyo, y la regeneración de células pilosas. También se han utilizado preparaciones de superficie coclear para determinar el patrón de expresión de los genes reporteros (es decir, GFP) y confirmar la transducción exitosa e identificar tipos de células transducidas. Estas técnicas se han utilizado previamente para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a la pérdida auditiva inducida por ruido utilizando ratones CBA/J adultos5,6,7,8,9.

A diferencia de la inmunohistoquímica usando secciones de parafina o criosecciones para obtener pequeñas porciones transversales de la cócleara que contienen tres células del cabello exteriores (OHC) y una célula del cabello interno (IHC) en cada sección, las preparaciones de la superficie coclear permiten visualización de toda la longitud del OC para el recuento de células pilosas sensoriales y sinapsis de cinta e inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales correspondientes a frecuencias funcionales específicas. La Tabla 1 muestra el mapeo de frecuencias auditivas en función de la distancia a lo largo de la longitud de la espiral coclear en el ratón adulto CBA/J según estudios de Muller1 y Viberg y Canlon1,2. Preparaciones de superficie coclear han sido ampliamente utilizados para la investigación de patologías cocleares4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. El método de disección coclear de montaje completo fue descrito originalmente en un libro editado por Hans Engstrom en 196616. Esta técnica fue posteriormente refinada y adaptada a una variedad de especies como se describe en la literatura por un número de científicos en ciencias auditivas10,11,12,13, 15,17 y por los Laboratorios Eaton-Peabody en Massachusetts Eye and Ear18. Recientemente, Montgomery et al.19informó otro método de disección coclear. La microdisección de la cócleara es un paso esencial y crítico para las preparaciones de superficie coclear. Sin embargo, la diseción de las cocleares de ratón es un desafío técnico y requiere una práctica considerable. Aquí, se presenta un método de preparación de superficie coclear modificado para su uso en cócleares de ratón adultos. Este método requiere la descalcificación y el uso de adhesivo celular y tisular (es decir, Cell-Tak) para adherir las piezas de epitelio coclear a 10 mm de cubres redondos para inmunoetiquetado. Adhesivo celular y tisular ha sido ampliamente utilizado para la inmunohistoquímica20. Este método de microdisección coclear modificado es relativamente simple en comparación con los reportados anteriormente18,19.

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Protocol

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Todos los protocolos de investigación que involucran ratones CBA/J adultos adultos a las edades de 10-12 semanas y ratones C57BL/6J a las edades de 6-8 semanas fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC). El cuidado de animales estaba bajo la supervisión de la División de Recursos Animales de Laboratorio del MUSC.

NOTA: Para los procedimientos que se presentan a continuación, los ratones se anestesian con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) mediante inyecciones intraperitoneales. Los ratones son decapitados después de que el animal ya no responde a estímulos dolorosos, como un pellizco en el dedo del dedo del sol.

1. Extracción de huesos temporales

  1. Decapitar el ratón inmediatamente postmortem con tijeras quirúrgicas (17 cm de largo) y cortar el hueso del cráneo con tijeras desde el aspecto posterior hacia adelante a lo largo de la línea central del cráneo después de exponer el hueso del cráneo tirando de la piel antes.
  2. Retire el tejido cerebral usando fórceps y retire manualmente los huesos temporales con el pulgar y el dedo índice para ratones de tres meses de edad o más. Use pequeñas tijeras quirúrgicas (11 cm de largo) para cortar el hueso temporal de ratones de menos de tres meses de edad.
  3. Coloque el hueso temporal en una placa Petri (30 mm de diámetro) que contenga una solución de paraformaldehído fresco de hielo 4% (PFA) disuelta en solución salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7.4.
    NOTA: Preparar la solución fresca de PFA 4% y ajustar el pH a 7.4 justo antes de fijar los huesos temporales, porque el equilibrio de pH incorrecto de la solución pfA disminuirá la calidad de la inmunoetiquetado.

2. Fijación y perfusión

  1. Retire las estapas de la ventana ovalada y perfore la membrana de la ventana redonda con el tamaño #5 fórceps. Bajo un microscopio de disección estéreo hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclear usando una aguja de 27 G conectada a una jeringa de 1 ml.
  2. Perfumar suavemente y lentamente la cócleara con una solución de PFA al 4% a través de las ventanas redondas y ovaladas hasta que la solución se lave del pequeño agujero en el ápice. Transfiera la cócleara (una o dos coclearas por vial) a viales de centelleo de volumen de 20 ml que contengan 10 ml de solución de PFA al 4%.
  3. Agitar suavemente los viales de centelleo a temperatura ambiente (RT) durante 2 horas y dejar pasar la noche en un frigorífico (4oC) en un rotador.
    NOTA: El tiempo de fijación se puede ajustar dependiendo del anticuerpo utilizado. Por ejemplo, limitar la fijación a 1,5 h permitirá una inmunoetiquetado exitosa de terminales postsinápticos cuando se utilice el anticuerpo GluA 2.

3. Descalcificación del hueso temporal

  1. Retire la solución de PFA y lave las cocleares con PBS 3x fresco durante 5 min cada una.
  2. Añadir 20 ml de solución de sal disódica de ácido etilendiaminetetraacético al 4% (PH 7.4) a los viales de centelleo y mantener en nevera durante 48-72 h en un rotador con agitación suave. Cambie la solución de EDTA diariamente hasta que las cocleares estén descalcificadas. Compruebe si las cocleares se descalcifican tocando la porción vestibular ósea con fórceps para evaluar la elasticidad o simplemente cortar una pequeña pieza desde el borde de la porción vestibular. Si tal corte da como resultado una pieza triturada, la cócleara no se descalcifica.
    NOTA: La solución EDTA puede interferir con la inmunorreacción de los anticuerpos primarios dependiendo de la concentración de la solución. Preparar 4% EDTA en PBS y ajustar el pH a 7.4. Para una descalcificación constante de los huesos temporales, se utiliza una solución EDTA fresca.
  3. Cambie la solución a PBS para microdisección una vez completada la descalcificación.
    NOTA: Si las cocleares no están suficientemente descalcificadas, no se puede realizar la disección de las cocleares.

4. Microdisección del epitelio coclear

NOTA: Una vez completada la descalcificación, es necesario realizar la microdisección del epitelio coclear para el inmunoetiquetado lo antes posible. En una placa Petri limpia de 30 mm que contiene PBS, el oído interno está orientado de la siguiente manera: en referencia a la parte superior (tapa) y la parte inferior de la placa Petri, las ventanas redondas y ovaladas cocleares dan a la parte superior. En referencia al dessector, la porción coclear se orienta hacia el frente (lejos del dessector) y la parte vestibular hacia la parte posterior (cerca de dissector). A continuación se describen los pasos en detalle.

  1. Sostenga la porción vestibular del hueso temporal con fórceps y corte el giro apical con el bisturí en un ángulo de 45o como se indica en la línea roja (Figura 1a).
  2. Corte verticalmente a lo largo de la línea débil entre la ventana redonda y la ventana ovalada, como se indica en la línea roja (Figura 1b) para separar la cócleara de la porción vestibular(Figura 1c).
    NOTA: Esta porción coclear contiene las porciones medias, basales y de gancho del epitelio.
  3. Coloque la porción coclear con el giro basal hacia la parte inferior y el giro central hacia la parte superior de la placa Petri y corte la cápsula ósea y la pared lateral del giro medio hacia el extremo desde el que se eliminó la sección apical, como indica la línea roja (Figu re 1d,e).
  4. Continúe cortando para separar completamente la parte media de las regiones basales y de gancho(Figura 1f,g).
    NOTA: La región de gancho de la cócleara es el final del epitelio coclear correspondiente a la sensibilidad a los tonos 48 kHz y superiores en ratones.
  5. Coloque la porción basal y de gancho con el sitio de la membrana basilar orientado hacia la parte inferior del plato y corte verticalmente el modiolus de la región del gancho para eliminar el modiolus como se indica en la línea roja vertical(Figura 1g).
    NOTA: El modiolus es el eje central de forma cónica de la cóclear que consiste en hueso esponjoso y nervio coclear, así como el ganglio espiral. Puede ser preferible realizar este corte con tijeras.
  6. Corte las regiones basales y de gancho como la otra línea roja indica en la Figura 1g para separar la porción del gancho(Figura 1h).
    NOTA: La cócleara ahora se ha separado en porciones apicales, medias, basales y de gancho. Los siguientes pasos serán la disección final de cada uno de los giros individuales, utilizando el giro medio como ejemplo.
  7. Corte las porciones relativamente grandes de la cápsula ósea y el tejido de la pared lateral del giro medio como se indica en la línea roja (Figura 1i).
    NOTA: La pared lateral del conducto coclear está formada por el ligamento espiral y la estría vascular.
  8. Sostenga la pared lateral con fórceps para alinear la cápsula ósea y la pared lateral con la parte inferior de la placa Petri y corte estos tejidos del lado de la membrana basilar. Luego aplanar la muestra para orientar el lado de la superficie de la célula del cabello sensorial hacia arriba. Recortar el resto de la cápsula ósea y la pared lateral(Figura 1j).
  9. Retire la membrana tectorial utilizando fórceps para separar completamente la región media(Figura 1k).
  10. Repita los pasos 4.7 a 4.9 para las secciones finales de los giros o regiones restantes, como se muestra en la Figura 1l.
  11. Preparar un cubreobjetos redondo de 10 mm para la adhesión del epitelio sensorial. Utilice una pipeta para esparcir a mano 0,5 ml de adhesivo celular y tisular en el centro de la cubierta redonda. Después del secado (3-5 min a RT), poner los labios de las cubiertas en PBS en platos Petri.
  12. Pegue las cuatro piezas del epitelio sensorial en el cubreobjetos redondo de 10 mm en el plato Petri. A continuación, sostenga un borde de la cubierta para transferirlo a un plato de cuatro pozos para inmunoetiquetado o inmunohistoquímica(Figura 1m).
    NOTA: La Figura 2 ilustra la ubicación de los principales cortes.

5. Inmunoetiquetado para las sinapsis cocleares

NOTA: El protocolo de inmunoetiquetado para las sinapsis cocleares seguido en este estudio ha sido descrito previamente13. Las cintas presinápticas fueron etiquetadas con un anticuerpo CtBP2 (proteína de unión anticarboxilo-terminal de ratón 2 IgG1, que etiqueta el dominio B de la proteína de andamiaje RIBEYE). Los terminales postsinápticos fueron etiquetados con anticuerpos GluA2 (receptor antiglutamato de ratón 2 IgG2a, subunidades de etiquetado del receptor AMPA).

  1. Lavar el epitelio sensorial con PBS 3x durante 5 minutos cada lavado en un plato de cuatro pozos y luego añadir 2 ml de surfactante no iónico 2% (es decir, Tritón-X 100) en el plato durante 30 minutos a RT en un rotador.
  2. Retire la solución tensioactivo no iónica del plato utilizando una pipeta y agregue 100 ml de solución de bloqueo que contenga un 10% de suero de cabra normal a cada pocador durante 1 h en un rotador con agitación suave en RT.
  3. Retire la solución de bloqueo de cada pocal, lave con PBS 3x durante 5 min cada lavado bajo agitación suave en RT.
  4. Añadir 100 l de los anticuerpos primarios diluidos con PBS a cada pocal: ratón anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), ratón anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Cubra cada plato de cuatro pozos con su tapa y colóquelo en un recipiente grande humidificado que proteja de la luz. Incubar a 37oC durante 24 h.
    NOTA: Como opción, se puede añadir antimiosina VIIa de conejo (1:400) para el inmunoetiquetado de células pilosas sensoriales.
  5. Lavar 3x con PBS durante 5 min cada lavado con agitación suave a RT.
  6. Añadir 100 l de los anticuerpos secundarios Alexa 594 cabra anti-ratón IgG1a (1:1,000), Alexa 488 cabra anti-ratón IgG2a (1:1,000) diluido con PBS a cada pocto. Cubra cada plato de cuatro pozos con su tapa y colóquelo en un recipiente grande humidificado que proteja de la luz. Incubar a 37oC durante 2 h.
    NOTA: Si se utiliza miosina VIIa, añadir Alexa 350 cabra anticonejo (1:200).
  7. Lavar 3x con PBS durante 5 min. A continuación, transfiera el cubreobjetos redondo de 10 mm a una diapositiva con las muestras en la parte superior.
  8. Agregue con cuidado 8 ml de Fluoro-Gel con tampón Tris en el centro de la cubierta. A continuación, sostenga el borde de otro cubreobjetos redondo de 10 mm con fórceps para montar en la parte superior, emparejiendo los dos cubreobjetos juntos.
  9. Use esmalte de uñas para sellar las diapositivas, colóquelas en una carpeta de diapositivas de cartón y guárdelas en el refrigerador.
    NOTA: Si se filtra un poco de Fluoro-Gel entre los labios de las cubiertas durante el montaje, limpie los bordes de los labios de las cubiertas antes de sellar el portaobjetos con esmalte de uñas. Las imágenes confocales deben tomarse en un plazo de 7 días.

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Representative Results

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Las preparaciones superficiales del epitelio coclear, en combinación con el inmunoetiquetado y la imagen confocal, se han utilizado ampliamente en la audición para la investigación de patologías cocleares, como la cuantificación de sinapsis de cinta, células pilosas sensoriales, y expresión proteica en células pilosas sensoriales5,6,7,8. Aunque la disección de cócleares de ratón adultos para preparaciones de superficie no es simple, los nuevos estudiantes de posgrado son capaces de aprender este método modificado después de practicar con 10-15 orejas(Figura 1 y Figura 2). Con esta técnica, en combinación con el inmunoetiquetado para CtBP2 (un marcador para cintas presinápticas) y GluA2 (un marcador para terminales postsinápticos), contando sinapsis nerviosas IHC/auditoria utilizando imágenes confocales bajo proyecciones Z con intervalos de 0,25 m, basados en el tamaño de las sinapsis de la cinta de ratón, es posible21. Esto es coherente con los resultados publicados4,6,13. Los preparados superficiales de ratones CBA/J (sin tratamiento) a la edad de 10-12 semanas inmunoetiquetados con CtBP2 (rojo) y GluA2 (verde) mostraron que tanto las cintas presinápticas como los terminales sinápticos se encuentran debajo de los núcleos IHC y están yuxtapuestos, lo que indica que tanto las cintas presinápticas como los terminales sinápticos se encuentran debajo de los núcleos IHC y son yuxtapuestos, lo que indica que, lo que indica sinapsis funcionales (Figura 3)6,13.

Mediante el inmunoetiquetado de preparaciones superficiales con diferentes anticuerpos, es posible evaluar la señalización molecular y la estructura en las células pilosas sensoriales. Por ejemplo, la Figura 4 muestra los resultados de la inmunoetiquetado para la miosina VIIa y la contramanchación con faloicina y 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Se han realizado experimentos de inmunoetiquetado paralelo con y sin el adhesivo celular y tisular utilizando soluciones idénticas para evaluar si el adhesivo utilizado interfiere con las inmunorreaciones. Las preparaciones de la superficie coclear fueron inmunoetiquetadas con miosina VIIa y contrarrestadas con faloideidirina. Las imágenes confocales se tomaron con una lente de aumento de 63x en condiciones idénticas y ajustes de parámetros iguales para ganancias láser y ganancias de tubo fotomultiplicador (PMT). No hubo diferencia en las inmunorreaciones o uniformidad con y sin el adhesivo celular y tisular(Figura 5). Utilizando diferentes fijadores, las preparaciones superficiales han proporcionado la base para escanear imágenes de microscopía electrónica (SEM) para la visualización de estereocilia coclear9. Los ratones C57BL/6J (sin tratamiento) a la edad de 6-8 semanas muestran estereocilias bien organizadas en forma de V de OHC en tres filas(Figura 6). Además, se han utilizado preparaciones de superficie coclear para determinar el patrón de expresión de un gen de informe (es decir, GFP) y confirmar la transducción exitosa e identificar tipos de células transducidas.

Figure 1
Figura 1: Representación de los pasos para preparaciones de superficie de ratón para adultos. (a) La cápsula ósea coclear del hueso temporal se enfrenta hacia arriba. La línea roja indica el primer corte para separar el giro apical. RW - ventana redonda, OW - ventana ovalada. (b) El ápice está separado de la cócleara como se indica en la flecha. La línea roja entre la ventana redonda y la ventana ovalada indica el segundo corte realizado en la cócleara. (c) La porción coclear que contiene las regiones media, basal y de gancho se separa de la porción vestibular. (d) La porción coclear está situada hacia arriba. La línea roja indica el tercer corte, dirigido hacia el final desde el que se eliminó la sección apical. (e) La flecha indica el espacio dejado después de la finalización del tercer corte. (f) Esta imagen muestra la región media. (g) Esta imagen muestra las regiones basales y de gancho combinadas. La línea roja vertical indica el corte entre el modiolus y la región del gancho. El corte entre las regiones basal y del gancho está indicado por la otra línea roja. (h) Las regiones basales y de gancho se separan según lo indicado por las flechas. (i) La región media de la cápsula ósea se corta como se indica mediante la línea roja. (j) La imagen muestra la región media después de eliminar un lado de la cápsula ósea. (k) Esta imagen muestra la región media después de la finalización de la disección. (l) Las cuatro regiones están completamente diseccionadas. (m) Giros cocleares fijados a un cubreobjetos redondo de 10 mm transferido a una placa Petri de cuatro pozos con las cuatro regiones indicadas. Todas las imágenes se tomaron bajo un microscopio de disección estéreo a aumentos de 1,2x, 2.5x y 0.6x. Las barras de escala se indican en cada imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ubicación de los principales cortes. Se eliminó toda la cápsula ósea coclear. Se indican las ubicaciones de los principales cortes. 1) La ubicación donde se corta el giro apical. 2) El sitio donde se separa el giro central. 3) El corte crítico para eliminar el modiolus. 4) La línea para dividir las regiones basales y de gancho. Barra de escala de 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Las imágenes confocales revelan inmunoetiquetado para CtBP2 y GluA2 en preparaciones de superficie de ratón para adultos. Las regiones apical, media y basal están etiquetadas. Las imágenes confocales de aumento inferior se tomaron con una lente de 10x. Rojo- CtBP2, verde - GluA2. Barra de escala de 100 m. Se tomaron imágenes confocales de regiones de 5, 16 y 32 kHz con una lente de 63x. Vistas ampliadas de las áreas indicadas por los rectángulos blancos en las partes ápice, central y base. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Las imágenes confocales revelan el inmunoetiquetado de las células pilosas sensoriales de una preparación superficial de la región de 32 kHz. Todas las imágenes se fusionaron proyecciones de la pila Z. Phalloidin (verde) tiñó la estructura de las tres filas de OHC y una fila de IHCs. La miosina VIIa (rojo) inmunolabeló tres filas de OHC y una fila de IHCs. Núcleos celulares de cabello teñidos con DAPI. Las imágenes confocales combinadas fueron reconstruidas para vistas laterales de las células pilosas sensoriales. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Las preparaciones de la superficie coclear con y sin el adhesivo celular y tisular se procesaron en paralelo, inmunoetiquetadas para miosina VII (rojo) y contrarrestadas con faloideiidina (verde) utilizando soluciones idénticas. El adhesivo celular y tisular utilizado no interfiere con las inmunorreaciones. Las imágenes confocales se tomaron con una lente de aumento de 63x en condiciones idénticas y ajustes de parámetros iguales. Se tomaron imágenes de la región de 32 kHz. El inmunoetiquetado para la miosina VIIa y la tinción de la faloiina en los OHC fue similar con y sin el adhesivo celular y tisular. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La microscopía electrónica de barrido muestra tres filas de estereocilia OHC de ratones C57BL/6J. Se tomaron imágenes de la región media. (a) Una vista de baja ampliación de tres filas de OHC. (b) Las imágenes ampliadas muestran tres filas de estereocilias OHC bien organizadas que aparecen en formas "V". Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre
Distancia desde el ápice (mm) 0.4 1 2.4 3.3 3.9 4.7 5.7
Distancia desde el ápice (%) 7.7 18 43 54 68 82 100
Frecuencias (kHz) 6 8 16 22 32 48

Tabla 1: Mapeo de la sensibilidad de frecuencia coclear del ratón CBA/J en función de la distancia desde el ápice según Muller1 y Viberg y Canlon2.

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Discussion

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La microdisección coclear de preparaciones de superficie de montaje completo en combinación con el inmunoetiquetado proporciona una herramienta básica para la investigación de patologías del oído interno y mecanismos moleculares. Este método de disección coclear de ratón adulto modificado utilizando el adhesivo celular y tisular simplifica este difícil procedimiento.

Aunque este método de preparación de superficie coclear modificado es relativamente fácil y accesible, todavía requiere práctica para lograr la competencia. Para hacer los cortes correctos, el dessector necesita una concentración cuidadosa. Debido a que las células pilosas sensoriales cocleares en el giro basal están tan cerca del limbo espiral, es difícil eliminar completamente el tejido del limbo para permitir que la preparación de la superficie se acueste completamente plana, pero las proyecciones Z confocales pueden compensar este problema. Además, la región de gancho de la cócleara sigue siendo la porción más difícil de diseccionar. Pueden producirse separaciones entre los OHC y los IHE de la región del gancho. La región del gancho muestra grandes variaciones anatómicas en humanos y es importante para la audición de conducción ósea22,23. Basado en el mapeo de frecuencia coclear reportado por Muller1 y Viberg y Canlon2, la región del gancho, a partir de 4,7 mm desde el ápice, corresponde a la sensibilidad a los tonos de 48 kHz y superior(Tabla 1), mientras que la funcional auditiva Las evaluaciones de la pérdida auditiva adquirida en ratones, incluyendo inducida por ruido, pérdida auditiva inducida por aminoglucósido, y pérdida auditiva relacionada con la edad, se miden generalmente a 8, 16 y 32 kHz con respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR)5,6 ,7,9,24 y de 6 a 45 kHz con distorsión producto emisión otoacústica (DPOAE)25. De acuerdo con Montgomery et al., la distorsión del epitelio no se ve comúnmente cuando la espiral se divide en 3-4 piezas19.

El método modificado presentado aquí consiste en disección de la espiral coclear en sólo cuatro piezas (apex, giros medios, basales y la región del gancho), mientras que la técnica Eaton-Peabody produce seis piezas18. La técnica Eaton-Peabody comienza con una bisección coclear, que evita hacer cortes tangenciales a través del epitelio para separar primero el giro apical del resto de la espiral, como se describe en esta técnica modificada. Al producir piezas más pequeñas, la técnica Eaton-Peabody está diseñada para minimizar el aplanamiento necesario para ver una pieza grande con un objetivo de inmersión. De hecho, las porciones más grandes de tejido facilitan la medición del mapeo de frecuencias desde el giro apical hasta el basal, en línea con Montgomery et al.19. Además, una diferencia entre este método y Montgomery et al.19 es que el método de disección coclear modificado descrito aquí emplea un bisturí para la mayoría de los cortes y solo un paso se realiza con tijeras (es decir, la separación de las regiones basales y de gancho como Ilustrado en el tercer corte de la Figura 2), mientras que Montgomery et al.19 utilizaron tijeras con un plato de disección recubierto de elastómero de silicona para preparaciones superficiales. Para evitar la distorsión del tejido, la desconexión de la membrana basilar para eliminar el modiolus es crítica.

Este protocolo utiliza un adhesivo celular y tisular(Tabla de Materiales)para la adhesión de las piezas de epitelio coclear al cubreobjetos redondos de 10 mm para inmunoetiquetado o inmunohistoquímica, lo que hace que los procesos sean más convenientes y evita la pérdida de tejidos de epitelio durante los múltiples lavados de los procedimientos de inmunoetiquetado. El adhesivo celular y tisular es una formulación de proteínas polifenólicas que se adhiere a las células y tejidos y ha sido ampliamente utilizado en muchas técnicas in vitro comunes, incluyendo inmunohistoquímica, hibridación in situ e inmunoensayos20. Consistente con la noción de que el adhesivo celular y tisular no interfiere con las inmunorreaciones, el inmunoetiquetado paralelo de la miosina VIIa con preparaciones superficiales no muestra diferencias de inmunorreaciones o uniformidad con y sin la célula y el tejido Adhesivo. Comparando estos tres métodos de disección (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, y el método modificado descrito), los estudiantes graduados en el laboratorio están de acuerdo en que este método modificado usando el adhesivo celular y tisular es más fácil de aprender y Maestro.

En resumen, la producción de preparaciones de superficie de ratón para adultos de montaje completo es una habilidad básica para la evaluación de patologías cocleares. El protocolo modificado descrito para preparaciones de superficie de ratones adultos simplifica este difícil procedimiento.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El proyecto de investigación descrito fue apoyado por la subvención R01 DC009222 del Instituto Nacional de Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación, Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo se llevó a cabo en el edificio WR de MUSC en un espacio renovado apoyado por la subvención C06 RR014516. Los animales fueron alojados en instalaciones animales MUSC CRI apoyados por la subvención C06 RR015455 del Programa de Instalaciones de Investigación Extramuros del Centro Nacional de Recursos de Investigación. Los autores agradecen al Dr. Jochen Schacht por sus valiosos comentarios y a Andra Talaska por la corrección del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm Rund Coverslips Microscopy products for science and industry 260367
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 Thermo Fisher Scientific A-21131
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 Thermo Fisher Scientific A-21125
Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A11012
Carboard Micro Slide Trays Fisher Scientific 12-587-10
Cell-Tak BD Biosciences 354240
Corning Petri Dishes Fisher Scientific 353004
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
Dumont #5 Forceps FST fine science tools 11251-20
EDTA Disodium Salt Sigma-Aldrich E5134
Fluoro-gel with Tris Buffer Electron Microscopy Sciences 17985-10
Four-well Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 627170
Goat Anti-myosin VIIa Antibody Proteus Biosciences 25-6790
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse Anti-CtBP2 Antibody BD Biosciences #612044
Mouse Anti-Glu2R Antibody Millipore MAB397
Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 31872
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Scalpel VWR 100491-038
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15001-08

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References

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Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto
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Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).More

Fang, Q. J., Wu, F., Chai, R., Sha, S. H. Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (153), e60299, doi:10.3791/60299 (2019).

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