Summary
Denna artikel presenterar en modifierad Cochlear ytbehandling metod som kräver urkalkning och användning av en cell och vävnad lim för att fästa bitar av Cochlear epitel till 10 mm runda täcker glider för immunohistokemi i Adult Mouse cochleae.
Abstract
Hörsel behandling i hörselsnäckan beror på integriteten hos de mechanosensoriska hårcellerna. Under en livstid, hörselnedsättning kan förvärvas från många etiologier såsom exponering för överdriven buller, användning av ototoxiska mediciner, bakteriella eller virala öroninfektioner, huvudskador, och åldrandet. Förlust av sensoriska hårceller är ett vanligt patologiskt inslag i de sorter av förvärvad hörselnedsättning. Dessutom kan den inre hår cells synapsen skadas av milda förolämpningar. Därför är ytbehandling av Cochlear epithelia, i kombination med immunolabeling tekniker och konfokala bilder, ett mycket användbart verktyg för utredning av Cochlear patologier, inklusive förluster av band synapser och sensoriska hårceller, förändringar i proteinnivåer i hårceller och stödjande celler, hår cellförnyelse, och bestämning av rapport genuttryck (dvs., GFP) för verifiering av framgångsrik transduktion och identifiering av sensorik celltyper. Hörselsnäckan, en benig Spiral-formad struktur i innerörat, håller auditiva sensoriska änden orgel, organ Corti (OC). Sensoriska hårceller och omgivande stödjande celler i OC finns i cochleaimplantat och vila på basilaris membran, organiserade i en tonotopic mode med högfrekvent detektion som sker i basen och lågfrekventa i spetsen. Med tillgången till molekylär och genetisk information och förmågan att manipulera gener genom knockout-och Knock-in-tekniker har möss ofta använts i biologisk forskning, bland annat i hörselvetenskap. Men den vuxna musen snäckan är miniscule, och Cochlear epitel är inkapslad i en benig labyrint, vilket gör microdissection svårt. Även dissektion tekniker har utvecklats och används i många laboratorier, denna modifierade microdissection metod med hjälp av cell-och vävnadslim är lättare och bekvämare. Det kan användas i alla typer av vuxna mus cochleae efter decalcification.
Introduction
Snäckan är tillägnad detektering av ljud och ansvarig för hörsel. Cochleaimplantat är lindad i en spiralform i beniga labyrinten och håller den auditiva sensoriska änden orgel, organ Corti (OC). OC vilar på basilaris membran, vilket gör upp Cochlear epitel, med en längd av ca 5,7 mm när utrullas i vuxen CBA/Caj möss1,2. Eftersom OC är tonotopically organiseras med höga frekvenser upptäcks i basen och låga frekvenser i spetsen, är cochleaimepitel ofta uppdelad i tre delar för analytiska jämförelser: den apikala, mellersta och basala svängar som motsvarar låg, respektive hög frekvens detektering. Förutom en rad stödjande celler, är OC består av en rad av inre hårceller (IHCs) ligger medialt och tre rader av yttre hårceller (OHCs) ligger i sidled med avseende på Cochlear spiral.
Korrekt hörsel behandling beror på integriteten hos de sensoriska hårcellerna i hörselsnäckan. Skador eller förlust av sensoriska hårceller är ett vanligt patologiskt inslag i förvärvade hörselnedsättning, orsakas av många etiologier såsom exponering för överdriven buller, användning av ototoxiska mediciner, bakteriella eller virala öroninfektioner, huvudskador, och åldrande process3. Dessutom kan integriteten och funktionen hos den inre hår cellen/hörselnerven synapser försämras av milda förolämpningar4. Med tillgången till molekylär och genetisk information och manipulering av gener genom knockout-och Knock-in-tekniker har möss ofta använts i hörsel vetenskapen. Även om den vuxna musen snäckan är mycket liten och Cochlear epitel är omgiven av en benig kapsel som resulterar i tekniskt svåra mikrodissektioner, ytpreparationer av epitelet i kombination med immunolabeling eller immunohistokemi och konfokala bilder har i stor utsträckning använts för utredning av Cochlears patologier, inklusive förluster av band synapser och hårceller, förändringar i nivåer av proteiner i sensoriska hårceller och stödjande celler, och hår cellförnyelse. Cochlear Surface-preparat har också använts för att bestämma mönstret för uttryck av rapportörer (dvs. GFP) och bekräfta lyckad transduktion och identifiera celltyper som är omvandade till celler. Dessa tekniker har tidigare använts för studiet av molekylära mekanismer bakom bullerinducerad hörselnedsättning med hjälp av vuxna CBA/J möss5,6,7,8,9.
Till skillnad från immunohistokemi med hjälp av paraffin sektioner eller kryosektioner att få små tvärsnitts delar av hörselsnäckan som innehåller tre yttre hårceller (OHCs) och en inre hårcell (IHC) på varje sektion, Cochlear Surface preparat tillåter visualisering av hela längden av OC för att räkna sensoriska hårceller och band synapser och immunolabeling av sensoriska hårceller som motsvarar specifika funktionella frekvenser. Tabell 1 visar kartläggningen av hörsel frekvenser som en funktion av avståndet längs Cochlears spiral i vuxen CBA/J-mus enligt studier från Muller1 och Viberg och Canlon1,2. Cochlear ytbehandling har använts i stor utsträckning för undersökning av Cochlear-patologier4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Den hela-Mount Cochlear dissektion metoden beskrevs ursprungligen i en bok redigerad av hans Engström i 196616. Denna teknik har därefter förfinats och anpassats till en rad olika arter som beskrivs i litteraturen av ett antal forskare inom hörselvetenskap10,11,12,13, 15,17 och av Eaton-Peabody Laboratories i Massachusetts Eye och Ear18. Nyligen rapporterades en annan Cochlear dissekeringsmetod av Montgomery et al.19. Microdissektion av snäckan är ett viktigt och kritiskt steg för cochleaimplantat. Emellertid, dissekera mus cochleae är en teknisk utmaning och kräver betydande praxis. Här presenteras en modifierad Cochlear Surface-prepareringsmetod för användning i Adult Mouse cochleae. Denna metod kräver urkalkning och användning av cell-och vävnadslim (dvs cell-tak) att fästa bitar av cochlea epitel till 10 mm runda täckband för immunolabeling. Cell-och vävnadslim har använts i stor utsträckning för immunohistokemi20. Denna modifierade Cochlear microdissekeringsmetod är relativt enkel jämfört med de som tidigare rapporterades18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla forskningsprotokoll som involverar manliga vuxna CBA/J möss i åldrarna 10 – 12 veckor och C57BL/6J möss i åldrarna 6 – 8 veckor godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid Medical University of South Carolina (MUSC). Djuromsorg var under överinseende av delningen av laboratorium djur resurserna på MUSC.
Anmärkning: För de förfaranden som presenteras nedan är möss sövda med ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) via intraperitoneala injektioner. Möss är halshuggen efter djuret inte längre reagerar på smärtsamma stimuli, såsom en tå nypa.
1. extraktion av temporala ben
- Halshugga musen omedelbart efter döden med kirurgisk sax (17 cm lång) och skär skallbenet med sax från den bakre aspekten framåt längs mittlinjen av skallen efter att utsätta skallbenet genom att dra i huden anteriorly.
- Ta bort hjärnvävnaden med hjälp av pinps och manuellt ta bort temporala ben med tummen och pekfingret för möss tre månaders ålder eller äldre. Använd små kirurgiska sax (11 cm lång) för att skära tinningbenet av möss yngre än tre månader gammal.
- Sätt temporala benet i en petriskål (30 mm i diameter) som innehåller iskall färsk 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4.
Anmärkning: Förbered färsk 4% PFA-lösning och justera pH till 7,4 strax innan fastställande av temporala ben, eftersom felaktig pH-balansering av PFA-lösningen kommer att minska kvaliteten på immunolabeling.
2. fixering och perfusion
- Ta bort stigbygeln från det ovala fönstret och punktera den runda fönster membranet med storlek #5 tång. Under en stereo dissektion Mikroskop göra ett litet hål i spetsen av snäckan med en 27 G nål ansluten till en 1 ml spruta.
- Lätt och långsamt parfymera snäckan med 4% PFA lösning via runda och ovala fönster tills lösningen tvättar ur det lilla hålet i spetsen. Överför snäckan (en eller två cochleae per injektionsflaska) till 20 ml volym scintillationinjektionsflaskor innehållande 10 ml 4% PFA-lösning.
- Skaka försiktigt scintillationinjektionsflaskorna i rumstemperatur (RT) i 2 h och lämna över natten i kylskåp (4 ° c) på en rotator.
Anmärkning: Tidpunkten för fixering kan justeras beroende på vilken antikropp som används. Till exempel, att begränsa fixering till 1,5 h kommer att möjliggöra en lyckad immunolabeling av postsynaptiska terminaler när du använder GluA 2 antikroppen.
3. decalcification av tinningbenet
- Ta bort PFA-lösningen och tvätta cochleae med färska PBS 3x för 5 min vardera.
- Tillsätt 20 mL 4% etylendiamintetraättiksyra-natriumsaltlösning (EDTA) (pH 7,4) till scintillationsflaskorna och förvara i kylskåp i 48 – 72 timmar på en rotator med mild agitation. Ändra EDTA-lösningen dagligen tills cochleae är decalcified. Kontrollera om cochleae är urkalkade permanenta genom att röra den beniga vestibulära Portion med pinkoppar att bedöma för elasticitet eller helt enkelt klippa en liten bit från kanten av vestibulära delen. Om en sådan sänkning resulterar i en krossad pjäs, är snäckan inte decalcified.
Anmärkning: EDTA-lösningen kan störa immunoreverkan av primära antikroppar beroende på lösnings koncentrationen. Förbered 4% EDTA i PBS och justera pH till 7,4. För konsekvent urkalkning av temporala ben, färsk EDTA lösning används. - Ändra lösningen till PBS för microdissection efter dealcification är klar.
Anmärkning: Om cochleae inte är tillräckligt avalstrade kan dissektion av cochleae inte utföras.
4. microdissektion av Cochlear epitel
Anmärkning: När urkalkning är klar, microdissection av Cochlear epitel för immunolabeling måste utföras så snart som möjligt. I en ren 30 mm petriskål innehållande PBS, är innerörat orienterad på följande sätt: med hänvisning till petriskål topp (lock) och botten, cochleaimrunda och ovala fönster ansikte toppen. Med hänvisning till dissector, Cochlear portion är orienterad mot fronten (bort från dissector) och vestibulära portion mot ryggen (nära dissector). Nedan beskrivs stegen i detalj.
- Håll den vestibulära delen av tinningbenet med tång och skär den apikala svängen med skalpell vid en 45 ° vinkel som indikeras av den röda linjen (figur 1a).
- Skär vertikalt längs den svaga linjen mellan det runda fönstret och det ovala fönstret, vilket indikeras av den röda linjen (figur 1b) för att separera snäckan från den vestibulära delen (figur 1c).
Anmärkning: Detta Cochlear portion innehåller den mellersta, basal, och krok delar av epitelet. - Placera Cochlear Portion med den basala sväng mot botten och mittsväng mot toppen av petriskål och skär beniga kapseln och laterala väggen i mitten sväng mot slutet från vilken apikala avsnitt togs bort, vilket indikeras av den röda linjen (figuren Re 1d, e).
- Fortsätt att skära för att helt separera mittendelen från de basala och krok regionerna (figur 1f, g).
Anmärkning: Krok regionen i snäckan är slutet på Cochlears epitel motsvarande känslighet för toner 48 kHz och högre hos möss. - Sätt basal och krok Portion med basilaris membran plats inriktad mot botten av skålen och vertikalt skära modiolus utanför krok regionen för att ta bort modiolus som indikeras av den vertikala röda linjen (figur 1g).
Anmärkning: Den modiolus är den koniska-formade centrala axeln i cochlean som består av svampiga ben och snäckan nerv samt spiral ganglion. Det kan vara bättre att utföra denna klippa med sax. - Skär de basala och krok regioner som den andra röda linjen visar i figur 1g att separera kroken delen (figur 1h).
Anmärkning: Snäckan har nu separerats i apikala, mellersta, basala och krok portioner. Nästa steg blir den slutgiltiga dissektion av var och en av de enskilda svängar, med hjälp av mittsväng som ett exempel. - Klipp bort de relativt stora delarna av benig kapsel och lateral vägg vävnad i mittsväng som indikeras av den röda linjen (figur 1i).
Anmärkning: Den laterala väggen i Cochlear Duct bildas av spiral ligament och stria vascularis. - Håll den laterala väggen med tång för att anpassa beniga kapseln och laterala väggen med botten av petriskål och skär dessa vävnader från basilaris membran sidan. Plattar sedan preparatet för att orientera den sensoriska hår cellernas ytsida uppåt. Trimma bort resten av beniga kapseln och laterala väggen (figur 1j).
- Ta bort det tekniska membranet med hjälp av tång för att helt separera mittområdet (figur 1k).
- Upprepa steg 4.7 − 4.9 för de slutliga dissektionerna av de återstående svängar eller regioner som visas i figur 1l.
- Förbered en 10 mm rund täckslip för vidhäftning av det sensoriska epitelet. Använd en pipett för att handsprida 0,5 μL cell-och vävnadslim i mitten av den runda täckglasen. Efter torkning (3 – 5 min vid RT), Lägg täckband i PBS i petriskålar.
- Stick alla fyra bitar av det sensoriska epitelet på 10 mm rund täckslip i petriskål. Håll sedan en kant av täckslip att överföra den till en fyra-väl skålen för immunolabeling eller immunohistokemi (figur 1m).
Anm.: bild 2 illustrerar placeringen av de stora nedskärningarna.
5. immunolabeling för Cochlear synapses
Anmärkning: Protokollet för immunolabeling för cochleaimsynapser som följde i denna studie har tidigare beskrivits13. Presynaptiska band var märkta med en CtBP2 antikropp (Mouse anti-karboxyl-Terminal bindande protein 2 IgG1, märkning B-området för RIBEYE byggnadsställningar protein). Post synaptiska terminaler var märkta med GluA2 antikropp (mus anti-glutamat receptor 2 IgG2a, märkning subenheter av AMPA-receptorn).
- Tvätta sensorisk epitel med PBS 3x för 5 min varje tvätta i en fyra-väl skålen och tillsätt sedan 2 ml av 2% icke-jonaktivt tensid (dvs., Triton-X 100) i skålen för 30 min vid RT på en rotator.
- Ta bort den nonjoniska tensiden från skålen med hjälp av en pipett och tillsätt 100 μL blockerande lösning som innehåller 10% normalt get serum till varje brunn för 1 h på en rotator med mild agitation vid RT.
- Ta bort den blockerande lösningen från varje brunn, tvätta med PBS 3x för 5 min varje tvätt under skonsam omrörning vid RT.
- Tillsätt 100 μL av de primära antikropparna spädda med PBS till varje brunn: mus anti-GluA2 IgG2a (1:2000), mus anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Täck varje fyra-bra skålen med locket och placera i en stor fuktad behållare som skyddar mot ljus. Inkubera vid 37 ° c i 24 timmar.
Anmärkning: Som ett alternativ, kanin anti-myosin VIIa (1:400) för immunolabeling sensoriska hårceller kan tillsättas. - Tvätta 3x med PBS i 5 min varje tvätt med mild agitation vid RT.
- Tillsätt 100 μL av de sekundära antikropparna Alexa 594 Goat anti-Mouse IgG1a (1:1000), Alexa 488 get anti-Mouse IgG2a (1:1000) späddes med PBS till varje brunn. Täck varje fyra-bra skålen med locket och placera i en stor fuktad behållare som skyddar mot ljus. Inkubera vid 37 ° c i 2 timmar.
Anmärkning: Om myosin VIIa används, tillsätt Alexa 350 Goat anti-kanin (1:200). - Tvätta 3x med PBS i 5 min. Överför sedan den 10 mm runda täckglaset till en bild med proverna ovanpå.
- Tillsätt försiktigt 8 μL fluoro-gel med Tris buffert i mitten av täckbrickan. Håll sedan kanten av en annan 10 mm rund täckglas med tång för att montera på toppen, sandwiching de två täckglas tillsammans.
- Använd nagellack för att täta bilderna, Lägg dem i en papp-bildmapp och förvara i kylskåpet.
Anmärkning: Om vissa fluoro-gel läcker ut mellan täckglas under monteringen, rengör kanterna på täckband innan du tätar bilden med nagellack. Konfokalbilder måste tas inom 7 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ytbehandling av cochlea epitel, i kombination med immunolabeling och konfokal avbildning, har använts i stort sett i hörselvetenskap för utredning av Cochlear patologier, såsom kvantifiering av band synapser, sensoriska hårceller, och proteinuttryck i sensoriska hårceller5,6,7,8. Även om dissektion av vuxna mus cochleae för ytbehandling är inte enkelt, nya doktorander kan lära sig denna modifierade metod efter att ha tränat med 10-15 öron (figur 1 och figur 2). Med denna teknik, i kombination med immunolabeling för CtBP2 (en markör för presynaptiska band) och GluA2 (en markör för postsynaptiska terminaler), räknar IHC/auditiva nerv synapser med hjälp av konfokalbilder under Z-projektioner med 0,25 μm intervall, baserat på storleken på mus band synapser, är möjligt21. Detta är förenligt med publicerade resultat4,6,13. Ytberedningar av CBA/J-möss (utan behandling) vid en ålder av 10 – 12 veckor immunolabeled med CtBP2 (röd) och GluA2 (grön) visade att både presynaptiska band och postsynaptiska terminaler är placerade under IHC-kärnor och står bredvid, vilket indikerar funktionella synapser (figur 3)6,13.
Genom immunolabeling yta preparat med olika antikroppar, bedömning av molekylär signalering och struktur i sensoriska hårceller är möjligt. Till exempel visar figur 4 resultaten för immunolabeling för myosin VIIa och motfärgning med phalloidin och 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Parallella immunolabeling experiment med och utan cell-och vävnadslim med identiska lösningar har utförts för att bedöma om det lim som används stör immunoreactions. Cochlear Surface preparat var immunolabeled med myosin VIIa och motbetsad med phalloidin. Konfokala bilder togs med en 63x förstoringsglas under identiska förhållanden och lika parameterinställningar för laser vinster och Fotomultiplikator Tube (PMT) vinster. Det fanns ingen skillnad i immunoreactions eller enhetlighet med och utan cell-och vävnadslim (figur 5). Med hjälp av olika fixeringsmedel har ytpreparaten legat till grund för skanning av elektronmikroskopi (SEM) bilder för visualisering av Cochlear sinnes9. C57BL/6J möss (utan behandling) vid en ålder av 6 – 8 veckor visar välorganiserade V-formade stereocilier av OHCs i tre rader (figur 6). Dessutom har Cochlear Surface-preparat använts för att bestämma uttrycksmönstret för en rapportgen (dvs. GFP) och bekräfta en lyckad transduktion och identifiera celltyper som har omvandlas.
Figur 1: Beskrivning av stegen för vuxna mus ytor. (a) Cochlears beniga kapsel av tinningbenet är vänd uppåt. Den röda linjen indikerar det första snittet för att separera den apikala svänden. RW = runt fönster, AJ = oval fönster. b) spetsen separeras från hörselsnäckan enligt pilen. Den röda linjen mellan runda fönster och ovala fönster indikerar den andra snittet som gjorts i hörselsnäckan. (c) Cochlear portion som innehåller mellersta, basal och krok områden separeras från den vestibulära delen. (d) Cochlear portion är placerad vänd uppåt. Den röda linjen indikerar den tredje snittet, riktad mot slutet från vilket den apikala sektionen togs bort. (e) pilen indikerar den lucka som återstår efter avslutad tredje nedskärning. (f) den här bilden visar mittregionen. (g) denna bild visar de kombinerade basal-och krok regionerna. Den vertikala röda linjen indikerar snittet mellan regionen modiolus och Hook. Snittet mellan de basala och krok regionerna indikeras av den andra röda linjen. h) bas-och krok områden separeras enligt pilarna. (i) mellersta regionen av beniga kapseln skärs som indikeras av den röda linjen. (j) bilden visar mittregionen efter en sida av ben kapseln avlägsnas. (k) denna bild visar mittregionen efter avslutad dissektion. (l) alla fyra regioner är helt dissekerade. (m) cochleaimvänder anbringas på en 10 mm rund täckslip överförs till en fyra-väl petriskål med de fyra regionerna som anges. Alla bilder togs under en stereo-dissektion Mikroskop vid 1,2 x, 2.5 x, och 0,6 x förstoringar. Skalstreck anges i varje bild. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: placeringen av de stora nedskärningarna. Hela Cochlears beniga kapsel togs bort. Platserna för de stora nedskärningarna indikeras. 1) platsen där den apikala svänden skärs. 2) den plats där mittsväng är separerad. 3) den kritiska snittet för att ta bort modiolus. 4) linjen att dela basal och krok regioner. Scale bar = 0,5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: konfokala bilder avslöjar immunolabeling för CtBP2 och GluA2 på vuxna möss ytpreparat. De apikala, mellersta och basala regionerna märks. De lägre förstoringen konfokala bilder togs med en 10X lins. Röd = CtBP2, grön = GluA2. Scale bar = 100 μm. Konfokalbilder av 5-, 16-och 32-kHz-regioner togs med en 63x lins. Förstorade vyer av de områden som indikeras av de vita rektanglar i Apex-, Middle-och bas delarna. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: konfokala bilder avslöjar immunolabeling av sensoriska hårceller i en ytpreparering från 32-kHz-regionen. Alla bilder slogs samman Z-stack projektioner. Phalloidin (grön) färgade strukturen av de tre raderna i OHCs och en rad IHCs. Myosin VIIa (röd) immunolabeled tre rader av OHCs och en rad av IHCs. DAPI-färgade hår cells kärnor. Sammanslagna konfokalbilder rekonstruerades för sidovyer av sensoriska hårceller. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cochlear Surface-preparat med och utan cell-och vävnadslim behandlades parallellt, immunolabeled för MYOSIN VII (röd), och motfärgas med phalloidin (grön) med identiska lösningar. Den cell-och vävnadslim som används stör inte immunoreactions. Konfokala bilder togs med en 63x förstoringslins under identiska förhållanden och lika parameterinställningar. Bilder har hämtats från regionen 32 kHz. Immunolabeling för myosin VIIa och färgning för phalloidin i OHCs var likartad med och utan cell-och vävnadslim. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: scanningelektronmikroskopi visar tre rader av OHC sinnes från C57BL/6j möss. Bilder togs från mittregionen. a) envy med låg förstoring av tre rader av ohcs. (b) förstorade bilder visar tre rader av välorganiserade OHC sinnes som visas i "V" former. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | ||||||||
| Avstånd från spetsen (mm) | 0,4 | 1 | 2,4 | 3,3 | 3,9 | 4,7 | 5,7 | |
| Avstånd från Apex (%) | 7,7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Frekvenser (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tabell 1: mappning av CBA/J-musen Cochlears frekvens känslighet som en funktion av avståndet från Apex enligt Muller1 och Viberg och Canlon2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cochlear microdissection av helmonterade ytpreparat i kombination med immunolabeling ger ett grundläggande verktyg för utredning av innerörat patologier och molekylära mekanismer. Denna modifierade vuxna mus Cochlear dissektion metod med hjälp av cell-och vävnadslim förenklar detta svåra förfarande.
Även om denna modifierade Cochlears ytbehandlingsmetod är relativt enkel och tillgänglig, krävs fortfarande övning för att uppnå färdighet. För att göra de rätta nedskärningarna behöver semisharp noggrann koncentration. Eftersom Cochlears sensoriska hårceller i den basala vänden är så nära spiral limbus, är det svårt att helt ta bort limbus vävnad så att ytan beredningen att ligga helt platt, men konfokala Z-prognoser kan kompensera för denna fråga. Dessutom är krok regionen av snäckan fortfarande den svåraste delen att dissekera. Separationer mellan OHCs och IHCs i krok regionen kan förekomma. Kroken regionen visar stora anatomiska variationer hos människor och är viktigt för ben-överledning hörsel22,23. Baserat på Cochlears frekvens mappning som rapporteras av Muller1 och Viberg och Canlon2, motsvarar Hook-regionen, som börjar runt 4,7 mm från spetsen, känslighet för 48 kHz-toner och högre (tabell 1), medan auditiv funktionell bedömningar av förvärvad hörselnedsättning hos möss, inklusive buller-inducerad, aminoglykosid-inducerad hörselnedsättning, och åldersrelaterade hörselnedsättning, är i allmänhet mäts vid 8, 16, och 32 kHz med hörselhjärnstammen svar (ABR)5,6 ,7,9,24 och från 6 – 45 kHz med distorsionsprodukt otoakustisk emission (dpoae)25. I samförstånd med Montgomery et al., är distorsion av epitelet inte ofta ses när spiralen är uppdelad i 3-4 stycken19.
Den modifierade metod som presenteras här innebär dissekera Cochlear spiral i endast fyra stycken (Apex, mellersta, basal svängar, och krok regionen), medan Eaton-Peabody tekniken producerar sex stycken18. Eaton-Peabody teknik börjar med en Cochlear bisektion, som undviker att göra tangentiella nedskärningar genom epitelet för att först separera den apikala sväng från resten av spiralen, som beskrivs i denna modifierade teknik. Genom att tillverka mindre delar är Eaton-Peabody-tekniken utformad för att minimera den förenkling som krävs för att se en stor bit med ett nedsänknings mål. I själva verket, de större delarna av vävnad underlättar mätning av frekvens mappning från apikala till basal vändning, i linje med Montgomery et al.19. Dessutom, en skillnad mellan denna metod och Montgomery et al.19 är att den modifierade Cochlear dissektion metod som beskrivs här sysselsätter en skalpell för de flesta nedskärningar och endast ett steg görs med sax (dvs separation av basal och krok regioner som illustrerad i tredje snittet i figur 2), medan Montgomery et al.19 använde saxar med ett silikonelastomerbelagt dissekerat fat för ytpreparationer. För att undvika snedvridning av vävnaden, är frånkoppling av basilaris membran för att ta bort modiolus kritisk.
Detta protokoll använder en cell och vävnadslim (tabell över material) för vidhäftning av bitar av Cochlear epitel till 10 mm rund täckslip för immunolabeling eller immunohistokemi, vilket gör processerna bekvämare och undviker förlust av epitel vävnader under flera tvättar av immunolabeling förfaranden. Cell-och vävnadslim är en formulering av polyfenolproteiner som följer celler och vävnader och har ofta använts i många vanliga in vitro-tekniker, inklusive immunohistokemi, in situ hybridisering, och immunanalyser20. I överensstämmelse med uppfattningen att cell-och vävnadslim inte stör immunoreaktioner, uppvisar parallell immunolabeling av myosin VIIa med ytpreparat ingen skillnad i immunoreactions eller enhetlighet med och utan cell-och vävnads Självhäftande. Jämföra dessa tre dissekeringsmetoder (Eaton-Peabody Laboratories, Montgomery et al.19, och den modifierade metoden som beskrivs), är doktorander i labbet överens om att denna modifierade metod med hjälp av cell-och vävnadslim är lättare att lära och Master.
Sammanfattnings, producera hel-Mount vuxen mus yta förberedelser är en grundläggande färdighet för utvärdering av Cochlear patologier. Det beskrivna modifierade protokollet för vuxna möss ytberedningar förenklar detta svåra förfarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskningsprojektet som beskrevs stöddes av Grant R01 DC009222 från det nationella institutet för dövhet och andra kommunikationsstörningar, National Institutes of Health. Detta arbete genomfördes i WR byggnaden på MUSC i renoverade rymden stöds av Grant C06 RR014516. Djur var inrymt i MUSC CRI djurfaciliteter som stöds av Grant C06 RR015455 från Extramural forskning anläggningar program för National Center for Research Resources. Författarna tackar Dr Jochen Schacht för hans värdefulla kommentarer och andra Talaska för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
