Summary
Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.
Abstract
Kokleada işitsel işleme mekanosensory saç hücrelerinin bütünlüğüne bağlıdır. Bir ömür boyunca, işitme kaybı aşırı gürültüye maruz kalma gibi çok sayıda etiyolojisi elde edilebilir, ototoksik ilaçların kullanımı, bakteriyel veya viral kulak enfeksiyonları, kafa yaralanmaları, ve yaşlanma süreci. Duyusal saç hücrelerinin kaybı edinilmiş işitme kaybı çeşitlerinin ortak bir patolojik özelliğidir. Ayrıca, iç saç hücre sinaps hafif hakaretler tarafından zarar görebilir. Bu nedenle, koklear epitelin yüzey preparatları, immünetiketleme teknikleri ve konfokal görüntülerle birlikte, şerit sinapsları ve duyusal saç hücrelerinin kayıpları da dahil olmak üzere koklear patolojilerin araştırılması nda çok yararlı bir araçtır, saç hücrelerinde ve destekleyici hücrelerde protein düzeylerinde değişiklikler, saç hücresi yenilenmesi, ve rapor gen ekspresyonunun belirlenmesi (yani, GFP) başarılı transdüksiyon doğrulama ve transdükse hücre tiplerinin belirlenmesi için. Koklea, iç kulakta kemikli spiral şekilli bir yapı, işitsel duyu salkım organı tutar, Corti organı (OC). Duyusal saç hücreleri ve OC çevreleyen destek hücreleri koklear kanal ve basiler membran üzerinde dinlenme, baz ve apeks düşük frekanslı meydana gelen yüksek frekanslı algılama ile tonotopik bir şekilde düzenlenen bulunur. Moleküler ve genetik bilginin kullanılabilirliği ve nakavt ve nakavt teknikleri ile genleri manipüle etme yeteneği ile, fareler yaygın işitme bilimi de dahil olmak üzere biyolojik araştırmalarda kullanılmıştır. Ancak, yetişkin fare koklea miniscule, ve koklear epitel kemikli bir labirent içinde kapsüllenmiş, mikrodisesit zor hale. Diseksiyon teknikleri birçok laboratuvarda geliştirilmiş ve kullanılmış olsa da, hücre ve doku yapıştırıcısı kullanan bu modifiye mikrodisesiyöntemi daha kolay ve kullanışlıdır. Kireçlenmeden sonra her türlü yetişkin fare kokleasında kullanılabilir.
Introduction
Koklea ses in algılanmasına adanmıştır ve işitmeden sorumludur. Koklear kanal kemik labirent bir spiral şeklinde sarılır ve işitsel duyusal son organ tutar, Corti organı (OC). OC baziler membran üzerinde, koklear epitel oluşturan, yaklaşık bir uzunluğu ile 5.7 mm yetişkin CBA / CaJ fareler de uncoiled1,2. OC tonotopik baz ve apeks düşük frekanslarda tespit yüksek frekansları ile organize olduğundan, koklear epitel genellikle analitik karşılaştırmalar için üç bölüme ayrılır: apikal, orta ve bazal düşük karşılık gelen döner, orta ve yüksek frekans algılama, sırasıyla. Destekleyen hücreler dizisine ek olarak, OC, medial olarak bulunan bir iç saç hücresi (IHC) sırası ve koklear spirale göre yanal olarak bulunan üç sıra dış saç hücrelerinden (OhC) oluşur.
Doğru işitsel işleme koklea duyusal saç hücrelerinin bütünlüğüne bağlıdır. Duyusal saç hücrelerinin hasar veya kaybı, aşırı gürültüye maruz kalma, ototoksik ilaçların kullanımı, bakteriyel veya viral kulak enfeksiyonları, kafa yaralanmaları ve yaşlanma gibi çok sayıda etiyolojisi neden olduğu kazanılmış işitme kaybı, ortak bir patolojik özelliğidir süreç3. Ayrıca, bütünlük ve iç saç hücresi fonksiyonu / işitsel sinir sinapsları hafif hakaret ler tarafından bozulabilir4. Moleküler ve genetik bilginin mevcudiyeti ve genlerin nakavt ve nakavt teknikleri ile manipüle edilebisi ile, fareler işitme biliminde yaygın olarak kullanılmaktadır. Yetişkin fare koklea küçük ve koklear epitel teknik olarak zor mikrodiskes ile sonuçlanan kemikli bir kapsül ile çevrili olmasına rağmen, immünetiketleme veya immünohistokimya ile birlikte epitel yüzey preparatları ve konfokal görüntüler geniş kollear patolojilerin araştırılması için kullanılmıştır, şerit sinaps ve saç hücrelerinin kayıpları da dahil olmak üzere, duyusal saç hücrelerinde protein düzeylerinde değişiklikler ve destekleyici hücreler, ve saç hücresi rejenerasyonu. Koklear yüzey preparatları da muhabir genlerin ekspresyon deseni belirlemek için kullanılmıştır (yani, GFP) ve başarılı transdüksiyon onaylamak ve transdükse hücre tiplerini belirlemek. Bu teknikler daha önce yetişkin CBA / J fareler5,6,7,8,9kullanarak gürültü kaynaklı işitme kaybı altında yatan moleküler mekanizmaların çalışması için kullanılmıştır.
Her bölümde üç dış saç hücresi (OHC) ve bir iç saç hücresi (IHC) içeren kokleanın küçük kesitkısımlarını elde etmek için parafin kesitleri veya kriyokesitler kullanarak immünohistokimyanın aksine, koklear yüzey preparatları duyusal saç hücreleri ve şerit sinapsları sayma ve duyusal saç hücrelerinin belirli fonksiyonel frekanslara karşılık gelen immünetiketleme için OC tüm uzunluğu görselleştirme. Tablo 1 Muller1 ve Viberg ve Canlon1,2çalışmalara göre yetişkin CBA / J fare koklear spiral uzunluğu boyunca mesafe bir fonksiyonu olarak işitme frekansları haritalama gösterir . Koklear yüzey preparatları koklear patolojilerin araştırılmasında yaygın olarak kullanılmıştır4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Tüm montaj koklear diseksiyon yöntemi aslında hans Engstrom tarafından 196616yılında düzenlenmiş bir kitapta tanımlanmıştır. Bu teknik daha sonra rafine edilmiş ve işitme bilimi bilim adamları bir dizi tarafından literatürde açıklandığı gibi türlerin çeşitli adapte10,11,12,13, 15,17 ve Eaton-Peabody Laboratuvarları tarafından Massachusetts Göz ve Kulak18. Son zamanlarda, başka bir koklear diseksiyon yöntemi Montgomery ve ark.19tarafından bildirilmiştir. Kokleanın mikrodiseksiyonu koklear yüzey preparatları için önemli ve kritik bir adımdır. Ancak, fare kokleae diseksiyon teknik bir sorundur ve önemli bir uygulama gerektirir. Burada, yetişkin fare kokleae kullanılmak üzere değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunulmaktadır. Bu yöntem, kochlear epitel parçalarını immünetiketleme için 10 mm yuvarlak kapaklara yapıştırmak için hücre ve doku yapıştırıcısının (yani Cell-Tak) kireçlenmeyi ve kullanımını gerektirir. Hücre ve doku yapıştırıcıyaygın immünohistokimya20için kullanılmaktadır. Bu modifiye koklear mikrodisesiksiyon yöntemi daha önce bildirilen18göre nispeten basittir18 ,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
10-12 haftalık erkek erişkin CBA/J fareleri ve 6-8 haftalık C57BL/6J fareleri içeren tüm araştırma protokolleri Güney Carolina Tıp Üniversitesi'ndeki (MUSC) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı MUSC'deki Laboratuvar Hayvan Kaynakları Bölümü'nün gözetimi altındaydı.
NOT: Aşağıda sunulan işlemler için fareler intraperitoneal enjeksiyonlar yoluyla ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) ile anestezi edilir. Fareler, hayvan artık bir ayak çimdik gibi ağrılı uyaranlara yanıt sonra kafası kesilir.
1. Temporal Kemiklerin Çıkarılması
- Farenin hemen cerrahi makasla (17 cm uzunluğunda) kafasını koparın ve kafatası kemiğini ön ten çekerek kafatası kemiğini ortaya çıkardıktan sonra arka taraftan ileriye makasla kesin.
- Forseps kullanarak beyin dokusu çıkarın ve el ile yaş veya daha büyük fareler için başparmak ve işaret parmağı ile temporal kemikleri kaldırın. Üç aylıktan küçük farelerin temporal kemiğini kesmek için küçük cerrahi makas (11 cm uzunluğunda) kullanın.
- Temporal kemiği, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4'te çözünmüş buz gibi taze %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi içeren bir Petri kabına (30 mm çapında) yerleştirin.
NOT: Taze %4 PFA çözeltisi hazırlayın ve pH'ı temporal kemikleri sabitlemeden hemen önce 7,4'e ayarlayın, çünkü PFA solüsyonunun yanlış pH dengelemesi immünetiketlemenin kalitesini düşürecektir.
2. Fiksasyon ve Perfüzyon
- Oval pencereden stapes çıkarın ve boyutu #5 forseps ile yuvarlak pencere zarı delin. Bir stereo diseksiyon mikroskobu altında 1 mL şırınga bağlı bir 27 G iğne kullanarak koklea apeks içine küçük bir delik yapmak.
- Çözelti tepedeki küçük delikten yıyana kadar yuvarlak ve oval pencereler aracılığıyla kokleayı %4 PFA çözeltisi ile yavaşça ve yavaşça perfitleyin. Kokleayı (şişe başına bir veya iki kokleae) 10 mL%4 PFA çözeltisi içeren 20 mL hacimli sintilasyon şişelerine aktarın.
- Oda sıcaklığındaki (RT) ışıltılı şişeleri 2 saat boyunca hafifçe çalkalayın ve bir rotator üzerinde bir buzdolabında (4 °C) gece bırakın.
NOT: Fiksasyon süresi kullanılan antikora bağlı olarak ayarlanabilir. Örneğin, fiksasyonu 1,5 saatle sınırlamak, GluA 2 antikorunu kullanırken post sinaptik terminallerin başarılı immünetiketlemesini sağlayacaktır.
3. Temporal Kemik Kireçlenmesi
- PFA çözeltisini çıkarın ve kokleayı her biri 5 dakika boyunca taze PBS 3x ile yıkayın.
- Sintilasyon şişelerine %4 oranında etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (EDTA) çözeltisi (pH 7.4) ekleyin ve hafif ajitasyonlu bir rotatörüzerinde 48-72 saat buzdolabında saklayın. Kokleae sökülene kadar EDTA çözümünü günlük olarak değiştirin. Kokleae elastikiyetini değerlendirmek için forseps ile kemikli vestibüler kısmı dokunarak dekalcified olup olmadığını kontrol edin ya da sadece vestibüler kısmının kenarından küçük bir parça kesti. Bu tür kesme ezilmiş bir parça ile sonuçlanırsa, koklea dekalcified değildir.
NOT: EDTA solüsyonu, çözelti konsantrasyonuna bağlı olarak primer antikorların immünreaksiyonuna engel olabilir. PBS'de %4 EDTA hazırlayın ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. Temporal kemiklerin tutarlı kireçlenmesi için taze EDTA çözeltisi kullanılır. - Kireçlenme tamamlandıktan sonra mikrodiseksiyon için çözeltiyi PBS olarak değiştirin.
NOT: Kokleae yeterince kireçlenmezise kokleae diseksiyonu yapılamaz.
4. Koklear Epitelin mikrodiseksiyonu
NOT: Kireçlenme tamamlandıktan sonra immünetiketleme için koklear epitelin mikrodiseksiyonunun mümkün olan en kısa sürede yapılması gerekmektedir. PBS içeren temiz bir 30 mm Petri kabında, iç kulak aşağıdaki şekilde yönlendirilir: Petri kabının üst (kapak) ve alt referans olarak, koklear yuvarlak ve oval pencereler üst yüz. Dissector referans olarak, koklear kısmı ön doğru (uzak dissector) ve vestibüler kısmı arka doğru (dissector yakın) doğru yönlendirilir. Aşağıdaki adımları ayrıntılı olarak açıklanır.
- Temporal kemiğin vestibüler kısmını forsepslerle tutun ve kırmızı çizgide belirtildiği gibi neşterle apikal dönüşü 45° açıyla kesin(Şekil 1a).
- Kırmızı çizgi(Şekil 1b)ile gösterildiği gibi yuvarlak pencere ile oval pencere arasındaki soluk çizgi boyunca dikey olarak keserek kokleayı vestibüler kısımdan ayırın (Şekil 1c).
NOT: Bu koklear kısmı epitelorta, bazal ve kanca bölümlerini içerir. - Koklear kısmı alta doğru çevirerek koklear kısmı yerleştirin ve ortadaki kemikli kapsülü ve orta daki lateral duvarı kırmızı çizgide belirtildiği gibi apikal bölümün çıkarıldığı uca doğru kesin (Figu re 1d,e).
- Orta kısmı bazal ve kanca bölgelerinden tamamen ayırmak için kesmeye devamedin( Şekil 1f,g).
NOT: Kokleanın kanca bölgesi, farelerde 48 kHz ve daha yüksek tonlara duyarlılık la karşılık gelen koklear epitelin sonudur. - Çanak altına doğru yönlendirilmiş bazal membran site ile bazal ve kanca kısmı koyun ve dikey kırmızı çizgi(Şekil 1g)ile belirtildiği gibi modiolus kaldırmak için kanca bölgeden modiolus kesip dikey olarak .
NOT: Modiolus süngerimsi kemik ve koklear sinir yanı sıra spiral ganglion oluşan koklea konik şekilli merkezi eksenidir. Bu kesimin makasla yapılması tercih edilebilir. - Diğer kırmızı çizginin şekil 1g'da gösterdiği gibi bazal ve kanca bölgelerini kesilerek kanca kısmını ayırın (Şekil 1h).
NOT: Koklea şimdi apikal, orta, bazal ve kanca kısımları ayrılmıştır. Sonraki adımlar, orta dönüşü örnek olarak kullanarak, her bir dönüşün son bölümü olacaktır. - Kırmızı çizgiile belirtildiği gibi kemik kapsülü ve orta dönüş lateral duvar dokusunispeten büyük kısımları kes (Şekil 1i).
NOT: Koklear kanalın lateral duvarı spiral ligament ve stria vascularis tarafından oluşturulur. - Kemikkapsülü ve lateral duvarı Petri kabının alt kısmıyla hizalamak ve bu dokuları basiler membran tarafından kesmek için çiller ile lateral duvarı tutun. Sonra duyusal saç hücresi yüzey ilerler için örnek düzleştirmek. Kemikkapsülünün ve lateral duvarın geri kalanını kırpın (Şekil 1j).
- Orta bölgeyi tamamen ayırmak için tektorial membranı forcep'ler kullanarak çıkarın (Şekil 1k).
- Şekil 1l'degösterildiği gibi kalan dönüşlerin veya bölgelerin son diseksiyonları için 4.7−4.9 adımlarını tekrarlayın.
- Duyusal epitelin yapışması için 10 mm'lik yuvarlak bir kapak fişi hazırlayın. Yuvarlak kapak kaymasının ortasına 0,5 μL hücre ve doku yapıştırıcısı yaymak için bir pipet kullanın. Kuruduktan sonra (RT'de 3-5 dk), Petri kaplarında PBS'deki kapakları koyun.
- Petri kabındaki 10 mm'lik yuvarlak kapak lıya duyusal epitelin dört parçasını da yapıştırın. Daha sonra immünetiketleme veya immünohistokimya için dört kuyulu bir tabağa aktarmak için kapak kapağının bir kenarını tutun (Şekil 1m).
NOT: Şekil 2 büyük kesimlerin yerini göstermektedir.
5. Koklear Sinapslar için Immünetiketleme
NOT: Bu çalışmada takip edilen koklear sinapslar için immünetiketleme protokolü daha önce13tanımlanmıştır. Presinaptik kurdeleler CtBP2 antikor (fare anti-karboksil-terminal bağlayıcı protein 2 IgG1, RIBEYE iskele proteininin B etki alanını etiketleme) ile etiketlenmiştir. Post sinaptik terminaller GluA2 antikor (fare anti-glutamat reseptörü 2 IgG2a, AMPA reseptörünün alt birimlerini etiketleme) ile etiketlendi.
- Dört kuyulu bir tabakta her yıkamada 5 dakika pbs 3x ile duyusal epiteli yıkayın ve sonra bir rotator üzerinde RT'de 30 dakika boyunca tabağa %2 noniyonik yüzey aktif madde (yani Triton-X 100) 2 mL ekleyin.
- Bir pipet kullanarak çanaktan noniyonik yüzey aktif solüsyonu çıkarın ve RT'de hafif ajitasyon ile bir rotator üzerinde 1 saat boyunca her kuyuya %10 normal keçi serumu içeren 100 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
- Engelleme çözeltisini her kuyudan çıkarın, RT'de nazik ajitasyon altında her yıkamada 5 dk pbs 3x ile yıkayın.
- Her kuyuya PBS ile seyreltilmiş birincil antikorların 100 μL'sini ekleyin: fare anti-GluA2 IgG2a (1:2,000), fare anti-CtBP2 IgG1 (1:400). Her dört kuyulu yemeğin üzerini kapağını kapatın ve ışıktan koruyan büyük bir nemlendirilmiş kap içine yerleştirin. 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Bir seçenek olarak, tavşan anti-miyozin VIIa (1:400) duyusal saç hücreleri immünetiketleme için eklenebilir. - RT'de hafif ajitasyon ile her yıkamada 5 dakika pbs ile 3kat yıkayın.
- Alexa 594 keçi anti-fare IgG1a (1:1.000), Alexa 488 keçi anti-fare IgG2a (1:1.000) her kuyuya PBS ile seyreltilmiş ikincil antikorlar 100 μL ekleyin. Her dört kuyulu yemeğin üzerini kapağını kapatın ve ışıktan koruyan büyük bir nemlendirilmiş kap içine yerleştirin. 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Miyozin VIIa kullanılırsa, Alexa 350 keçi anti-tavşan (1:200) ekleyin. - 5 dakika PBS ile 3x yıkayın. Daha sonra, 10 mm'lik yuvarlak kapak kaymasını, örnekler in üstünde ki bir slayta aktarın.
- Coverslip'in ortasına Tris tamponu ile 8 μL Floro-Jel'i dikkatlice ekleyin. Daha sonra 10 mm'lik başka bir yuvarlak örtünün kenarını, üzerine monte etmek için forceps ile tutun ve iki örtüyü birbirine sıkıştırın.
- Slaytları mühürlemek için oje kullanın, bir karton slayt klasörüne koyun ve buzdolabında saklayın.
NOT: Bazı Floro-Jel montaj sırasında kapaklar arasında dışarı sızıntıları ise, oje ile slayt mühürleme önce kapakların kenarlarını temizleyin. Konfokal görüntülerin 7 gün içinde alınması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kollear epitelin yüzey preparatları, immünetiketleme ve konfokal görüntüleme ile birlikte, kollear patolojilerin araştırılmasında, şerit sinapslarının, duyusal saç hücrelerinin sayısallaştırılması, duyusal saç hücrelerinde protein ekspresyonu5,6,7,8. Yüzey preparatları için yetişkin fare koklealarının diseksiyonu basit olmasa da, yeni mezun öğrenciler 10-15 kulakla pratik yaptıktan sonra bu değiştirilmiş yöntemi öğrenebilirler(Şekil 1 ve Şekil 2). Bu teknikle, CtBP2 (presinaptik kurdeleler için bir marker) ve GluA2 (post sinaptik terminaller için bir belirteç) için immünetiketleme ile birlikte, 0,25 μm aralıklarla Z projeksiyonları altında konfokal görüntüler kullanılarak IHC/işitsel sinir sinapsları sayma fare şerit sinaps boyutu,mümkündür 21. Bu yayınlanan sonuçlar4,6,13ile tutarlıdır. 10-12 haftalık kenlerde CtBP2 (kırmızı) ve GluA2 (yeşil) ile etiketlenmiş CBA/J farelerin yüzey preparatları, hem presinaptik şeritlerin hem de post sinaptik terminallerin IHC çekirdeklerinin altında yer aldığıve yan yana olduğunu göstermiştir, fonksiyonel sinapslar (Şekil 3)6,13.
Yüzey preparatlarının farklı antikorlarla immünetiketleme ile moleküler sinyalizasyonunun ve duyusal saç hücrelerindeki yapının değerlendirilmesi mümkündür. Örneğin, Şekil 4 miyozin VIIa için immünetiketleme ve phalloidin ve 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile karşı boyama sonuçlarını göstermektedir. Kullanılan yapıştırıcının immünreaksiyonlara müdahale edip etmediğini değerlendirmek için hücre ve doku yapıştırıcısı ile ve hücre ve doku yapıştırıcısız paralel immünetiketleme deneyleri yapılmıştır. Koklear yüzey preparatları miyozin VIIa ile immünoetiketli ve phalloidin ile karşıt. Konfokal görüntüler, lazer kazançları ve fotoçarpan tüpü (PMT) kazançları için aynı koşullar altında 63x büyütme lensi ve eşit parametre ayarları ile çekilmiştir. Hücre ve doku yapıştırıcısı ile immünoreaksiyonlarda veya tekdüzelikte fark yoktu (Şekil 5). Farklı fiksatifler kullanarak, yüzey preparatları koklear stereocilia9görselleştirme için tarama elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri için temel sağlamıştır. 6-8 haftalık kenlerde C57BL/6J fareler (tedavi edilmeden) üç sıra halinde KiSVelerin iyi organize edilmiş V şeklindestereosiya'sını göstermektedir(Şekil 6). Ayrıca, koklear yüzey preparatları bir rapor geninin (gfp) ifade modelini belirlemek ve başarılı transdüksiyonu onaylamak ve transdükse hücre tiplerini tanımlamak için kullanılmıştır.
Şekil 1: Yetişkin fare yüzeyi hazırlıkları için adımların tasviri. (a) Temporal kemiğin koklear kemik kapsülyukarı yüzler. Kırmızı çizgi, apikal dönüşü ayırmak için ilk kesimi gösterir. RW = yuvarlak pencere, OW = oval pencere. (b) Apeks okla belirtildiği gibi kokleadan ayrılır. Yuvarlak pencere ve oval pencere arasındaki kırmızı çizgi koklea yapılan ikinci kesim gösterir. (c) Orta, bazal ve kanca bölgelerini içeren koklear kısım vestibüler kısımdan ayrılır. (d) Koklear kısmı yukarı bakacak şekilde yer almaktadır. Kırmızı çizgi, apikal bölümün kaldırıldığı sona doğru yönlendirilen üçüncü kesimi gösterir. (e) Ok, üçüncü kesimtamamlandıktan sonra kalan boşluğu gösterir. (f) Bu resim orta bölgeyi gösterir. (g)Bu resim kombine bazal ve kanca bölgelerini gösterir. Dikey kırmızı çizgi modiolus ve kanca bölge arasındaki kesim gösterir. Bazal ve kanca bölgeleri arasındaki kesik diğer kırmızı çizgi ile gösterilir. (h) Bazal ve kanca bölgeleri oklarla belirtildiği şekilde ayrılır. (i)Kemikli kapsülün orta bölgesi kırmızı çizgide belirtildiği gibi kesilir. (j) Kemikkapsülünün bir tarafı çıkarıldıktan sonra görüntü orta bölgeyi gösterir. (k) Bu resim, diseksiyonun tamamlanmasından sonra orta bölgeyi gösterir. (l) Dört bölge de tamamen parçalanır. (m) Koklear, belirtildiği gibi dört bölgeli dört kuyulu petri kabına aktarılan 10 mm'lik yuvarlak bir kapak kaymasına yapıştırılmış döner. Tüm görüntüler 1.2x, 2.5x ve 0.6x büyütmelerde stereo-diseksiyon mikroskobu altında alınmıştır. Ölçek çubukları her resimde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Büyük kesiklerin yeri. Tüm koklear kemikkapsülü çıkarıldı. Büyük kesintilerin yerleri belirtilir. 1) Apikal dönüşün kesildiği yer. 2) Orta dönüşün ayrıldığı yer. 3) modiolus kaldırmak için kritik kesim. 4) Bazal ve kanca bölgeleri bölmek için çizgi. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Konfokal görüntüler yetişkin fare yüzey preparatlarında CtBP2 ve GluA2 için immünetiketlemeyi ortaya koymaktadır. Apikal, orta ve bazal bölgeler etiketlenir. Alt büyütme konfokal görüntüleri 10x lens ile alınmıştır. Kırmızı = CtBP2, yeşil = GluA2. Ölçek çubuğu = 100 μm. 5-, 16-ve 32-kHz bölgelerin konfokal görüntüleri 63x lens ile alınmıştır. Tepe, orta ve taban kısımlarındaki beyaz dikdörtgenlerle gösterilen alanların genişletilmiş görünümleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Konfokal görüntüler, 32-kHz bölgesinden bir yüzey hazırlığının duyusal saç hücrelerinin immünetiketlemesini ortaya koymaktadır. Tüm görüntüler Z-yığın projeksiyonları birleştirildi. Phalloidin (yeşil) OHCs ve IHCs bir satır üç satır yapısı lekeli. Myosin VIIa (kırmızı) üç sıra OHC ve bir sıra IHC'yi immünolojisi ile etiketledi. DAPI lekeli saç hücresi çekirdekleri. Birleştirilmiş konfokal görüntüler duyusal saç hücrelerinin yan görünümleri için yeniden oluşturuldu. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kollear yüzey preparatları hücre ve doku yapıştırıcısı ile paralel olarak işlendi, miyozin VII (kırmızı) için immünoetiketli ve phalloidin (yeşil) ile aynı solüsyonlar kullanılarak karşıtlandı. Kullanılan hücre ve doku yapıştırıcısı immünreaksiyonları engellemez. Konfokal görüntüler, aynı koşullar ve eşit parametre ayarları altında 63x büyütme lensi ile çekilmiştir. Görüntüler 32 kHz bölgeden alınmıştır. Miyozin VIIa için immünetiketleme ve OHCs phalloidin için boyama hücre ve doku yapıştırıcısı ile ve olmadan benzerdi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Taramalı elektron mikroskobu, C57BL/6J farelerden üç sıra OHC stereocilia gösterir. Görüntüler orta bölgeden alındı. (a) Üç sıra OHC'nin düşük büyütme görünümü. (b) Genişletilmiş görüntüler, "V" şekillerinde görünen üç sıra iyi düzenlenmiş OHC stereocilia'yı gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adı | ||||||||
| Apeksten uzaklık (mm) | 0.4 | 1 | 2.4 | 3.3 | 3.9 | 4.7 | 5.7 | |
| Apeksten uzaklık (%) | 7.7 | 18 | 43 | 54 | 68 | 82 | 100 | |
| Frekanslar (kHz) | 6 | 8 | 16 | 22 | 32 | 48 | ||
Tablo 1: Muller1 ve Viberg ve Canlon2'yegöre apeksten uzaklık fonksiyonu olarak CBA/J fare koklear frekans hassasiyetinin haritalaması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immünetiketleme ile birlikte tam montaj yüzey preparatlarının koklear mikrodizise, iç kulak patolojileri ve moleküler mekanizmaların araştırılması için temel bir araç tır. Bu modifiye yetişkin fare koklear diseksiyon yöntemi hücre ve doku yapıştırıcı kullanarak bu zor prosedürü basitleştirir.
Bu modifiye koklear yüzey hazırlama yöntemi nispeten kolay ve erişilebilir olmasına rağmen, yine de yeterlilik elde etmek için uygulama gerektirir. Doğru kesimyapmak için, dissector dikkatli konsantrasyon gerekir. Bazal dönüş koklear duyusal saç hücreleri spiral limbus çok yakın olduğundan, yüzey hazırlık tamamen düz yalan izin vermek için limbus dokusunu tamamen kaldırmak zordur, ancak konfokal Z-projeksiyonlar bu sorunu telafi edebilirsiniz. Ayrıca, koklea kanca bölge hala incelemek için en zor kısmıdır. Kanca bölgesinin OHC'leri ve IHC'leri arasında ayrımlar oluşabilir. Kanca bölge insanlarda büyük anatomik varyasyonlar görüntüler ve kemik iletimi işitme için önemlidir22,23. Muller1 ve Viberg ve Canlon2tarafından bildirilen koklear frekans haritalama dayanarak , kanca bölge, apeks yaklaşık 4.7 mm başlayan, 48 kHz tonları ve daha yüksek hassasiyete karşılık gelir(Tablo 1), işitsel fonksiyonel ise farelerde, gürültüye bağlı, aminoglikozite bağlı işitme kaybı ve yaşa bağlı işitme kaybı da dahil olmak üzere edinsel işitme kaybı değerlendirmeleri genellikle 8, 16 ve 32 kHz işitsel beyin sapı yanıtı (ABR)5,6 olarak ölçülür ,7,9,24 ve distorsiyon ürünü otoakustik emisyon ile 6-45 kHz (DPOAE)25. Montgomery ve ark. ile anlaşma içinde, epitel bozulması yaygın spiral 3-4 adet19bölündüğünde görülmez.
Burada sunulan modifiye yöntemi sadece dört parça (apeks, orta, bazal döner ve kanca bölge) koklear spiral diseksiyon içerir, Eaton-Peabody tekniği altı adet üretir ise18. Eaton-Peabody tekniği, bu değiştirilmiş teknikte açıklandığı gibi, apikal dönüşü spiralin geri kalanından ayırmak için epitel yoluyla teğetsel kesikler yapmaktan kaçınan koklear bir bisection ile başlar. Daha küçük parçalar üreterek, Eaton-Peabody tekniği daldırma amacı ile büyük bir parça görüntülemek için gerekli düzleşmesi en aza indirmek için tasarlanmıştır. Aslında, doku büyük bölümleri Montgomery ve ark.19doğrultusunda, bazal dönüş apikal frekans haritalama ölçümü kolaylaştırmak. Ayrıca, bu yöntem ve Montgomery ve ark.19 arasındaki fark, burada açıklanan modifiye koklear diseksiyonu yöntemi en kesim için bir neşter kullanır ve sadece bir adım makas ile yapılır (yani, bazal ve kanca bölgelerin ayrılması gibi Şekil 2'dekiüçüncü kesimde gösterilmiştir), oysa Montgomery ve ark.19 yüzey preparatları için silikon elastomer kaplı diseksiyon kabına sahip makas kullanabilmiştir. Doku bozulmasını önlemek için, modiolus kaldırmak için baziler membran bağlantısı nın kesilmesi önemlidir.
Bu protokol, koklear epitel parçalarının immünetiketleme veya immünohistokimya için 10 mm'lik yuvarlak kapak kaymasına yapışması için bir hücre ve doku yapıştırıcısı(Malzeme Tablosu)kullanır, bu da süreçleri daha uygun hale getirir ve immünetiketleme prosedürlerinin birden fazla yıkama sırasında epitel dokuları. Hücre ve doku yapıştırıcısı, hücre ve dokulara yapışan polifenolik proteinlerin formülasyonudur ve immünohistokimya, yerinde hibridizasyon ve immünoassays20dahil olmak üzere birçok yaygın in-vitro tekniklerde yaygın olarak kullanılmıştır. Hücre ve doku yapıştırıcısının immünreaksiyonlara müdahale etmediği fikriyle tutarlı olarak, yüzey preparatları ile miyozin VIIa'nın paralel immünitesi, hücre ve doku ile ve hücre sizde immünoreaksiyonlar veya tekdüzelik açısından bir fark göstermez. Yapıştırıcı. Bu üç diseksiyon yöntemini (Eaton-Peabody Laboratuvarları, Montgomery ve ark.19ve açıklanan değiştirilmiş yöntem) karşılaştırarak, laboratuvardaki yüksek lisans öğrencileri hücre ve doku yapıştırıcısını kullanarak bu değiştirilmiş yöntemin daha kolay öğrenilebildiği ve Master.
Özetle, tam monte yetişkin fare yüzey preparatları üretmek koklear patolojilerin değerlendirilmesi için temel bir beceridir. Yetişkin fareler yüzey preparatları için açıklanan değiştirilmiş protokol bu zor prosedürü basitleştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Açıklanan araştırma projesi, Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Hibe R01 DC009222 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Hibe C06 RR014516 tarafından desteklenen yenilenmiş alanda MUSC'deki WR Binası'nda gerçekleştirilmiştir. Hayvanlar, Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi'nin Ekstramural Araştırma Tesisleri Programı'ndan C06 RR015455 hibe ile desteklenen MUSC CRI hayvan tesislerinde barındı. Yazarlar değerli yorumları için Dr. Jochen Schacht'a ve el yazmasının okunması için Andra Talaska'ya teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).
- MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
