Summary
ここでは、細菌性萎痛病の研究のための簡単な遺伝子解析を行うために、ラストニア・ソラナ科を接種した後、トマト根形質転換のための汎用性の高い方法を提示する。
Abstract
ラルストニア・ソラナ科は、広範囲の植物種に感染し、農業に対する重要な脅威を引き起こす壊滅的な土壌媒介血管病原体です。しかし、ラストニアモデルは、シロイヌナプシスのシュードモナスシリンゲのような細菌性植物病原体を含む他のモデルと比較してかなり未踏である。ラルストニアと作物植物の相互作用を理解することを目的とした研究は、細菌性萎し病と戦うために持続可能な解決策を開発するために不可欠であるが、現在、ネイティブホスト植物における相互作用の異なる成分を特徴付ける簡単な実験的アッセイの欠如によって妨げられている。このシナリオでは、我々は、トマトのラルストニア感染の遺伝子解析を行う方法を開発しました,ラルストニアの自然なホスト.この方法は、トマト根のアグロバクテリウム・リゾゲレンス-媒介性変換に基づいており、続いて得られた植物の土壌びしょ濡れの接種を行い、目的の構築物を発現する形質転換された根を含む。根形変換アッセイの汎用性により、RNAiによって媒介される遺伝子過剰発現または遺伝子サイレンシングのいずれかを行うことができます。概念実証として、この方法を用い、RNAi媒介性のトマト根におけるSlCESA6のサイレンシングがラルストニアに対する耐性を与えることを示した。ここでは、この方法を詳細に説明し、比較的短時間で、機器や植物の成長空間の要件が小さい細菌性萎し病を理解するための遺伝的アプローチを可能にする。
Introduction
細菌性萎痛病の原因物質であるラルストニア・ソラナ科は、ジャガイモ、トマト、タバコ、バナナ、コショウ、ナスなど、植物種の広い範囲に感染する可能性のある世界的な分布を有する壊滅的な土壌媒介血管病原体1,である。ラルストニアによって引き起こされる収量損失は、品種、気候、土壌および他の要因に応じて、トマト、ジャガイモまたはバナナの生産の80-90%に達することができます3.しかし、ラルストニアモデルは、シュードモナスシリンガエやキサントモナス属などの細菌性植物病原体を含む他のモデルと比較してかなり未踏である。さらに、植物と微生物の相互作用のほとんどの研究は、モデル植物シロイヌナズナ科に焦点を当てています。これらのモデルを用いた研究は、植物と細菌の相互作用の理解に大きく貢献していますが、作物植物におけるこれらの相互作用を理解する現在の必要性には対処していません。ラルストニアと作物植物の相互作用を理解することを目的とした研究は、細菌性萎し病と戦うために持続可能な解決策を開発するために不可欠であるが、現在、相互作用の異なる構成要素を特徴付けるための簡単な実験アッセイの欠如によって妨げられている。特に、ラルストニアの天然宿主であるトマトは、世界で2番目に重要な植物作物であり、細菌性萎し症を含む多くの疾患4の影響を受ける。本研究では、トマトのラルストニア感染の遺伝子解析を行う簡素な方法を開発した。この方法は、トマト根のアグロバクテリウム-媒介性形質転換に基づいており、DsRed蛍光を選択マーカー5として使用し、続いて得られた植物のラルストニア土壌びしょ濡れの接種を行い、目的の構築物を発現する形質転換された根を含む。根形変換アッセイの汎用性により、RNAiによって媒介される遺伝子過剰発現または遺伝子サイレンシングのいずれかを行うことができます。
この方法の潜在的な制限は、非変換された根の残留成長に基づいて行われます。これは、使用されるプラスミドが変換された根の選択を可能にするレポーター遺伝子を欠いている場合に特に重要である。この問題を解決するために、我々は、健康な抗生物質耐性形質転換根の成長を可能にしながら、非形質化された根の成長を阻害する抗生物質選択に基づく代替方法を開発した。A.根生は芽の変態を誘発しないので、抗生物質の影響を受けやすく、したがって、抗生物質含有培地から分離しておくべきである。
ラルストニアに対する植物耐性はよく理解されていないが、いくつかの報告は、細菌のしおれ,6、7、8、97に対する耐性の強化に関連する細胞壁の変化を有する。8,96これらの細胞壁の変化が血管の発達に影響を及ぼすことが示唆されている、 植物10内のラルストニアの生活様式に不可欠な側面。シロイヌナズナのセルロース合成酵素CESA4、CESA7およびCESA8をコードする遺伝子の突然変異は、二次細胞壁の完全性を損なうことを示しており、これはABAシグナル伝達8に関連していると思われるラルストニアに対する耐性の増強を引き起こす。 CESA4そこで、我々の方法の概念実証として、SlCESA6(Solyc02g072240)、Solyc02g072240セルロース合成酵素の二次細胞壁セルロースシンターゼ、およびAtCESA8のオルソログ(At4g18780)のRNAi媒介遺伝子サイレンシングを行った。 SlCESA6その後のラルストニアによる土壌びしょ濡れの接種は、SlCESA6をサイレンシングする細菌性萎し症状に対する耐性が高まることを示し、ラルストニアに対する細胞壁媒介性耐性がトマト中で保存される可能性が高いことを示唆し、トマト根における細菌性萎し耐性の遺伝子解析を行う方法を検証した。ここでは、この方法を詳細に説明し、比較的短時間で、機器や植物の成長空間の要件が小さい細菌性萎し病を理解するための遺伝的アプローチを可能にする。
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Protocol
注:この方法の重要な部分は、インビトロで植物材料を取り扱うことを含むので、DsRed蛍光の可視化を含むすべてのこれらの手順の間に無菌状態を維持することが重要です。すべての変換プロセス中に、トマトの苗は25-28 °Cおよび16時間/8時間のライト/ダーク(130 μmol光子m-2s-1光)で成長する。プレートは、ガス交換および蒸散を容易にするためにマイクロポアテープで密封されています。
1. トマト植物とアグロバクテリウム根茎遺伝子の調製
- 殺菌トマト種子(ソラナムリコペルシカムcv.マネーメーカー、LA2706、トマト遺伝学リソースセンター、TGRC)5%(v/v)次亜塩素酸ナトリウム5分間洗浄し、蒸留滅菌水で4-5回洗浄し、種子を1晩以上にわたって滅菌水でゆっくりと揺らし続けます。
- トマトの種をスクロース(2.21 g/L MS、8%w/v寒天)なしで半強度の村重とスクーグ(1/2 MS)培地に移します。25-28 °Cの暗闇の中で3日間シーズを保ちます(図1A)。
注:通常、各構成体に必要な種子は約40種です。 - オートクレーブ8.5 cm2平方フィルターペーパー。正方形のフィルターペーパーを9 cm2の正方形のシャーレの中に入れて(寒天の上に紙を置く)、各プレートに6つの発芽トマトの種を置く(図1B)。プレートをマイクロポアテープで密封し、発芽した種子を25-28°Cで3〜4日間インキュベートします。
- 植物の形質転換の2日前に28°Cで固形LB培地中のアグロバクテリウム・リゾゲネスMSU440を成長させる。
注:A.リゾゲネスは、フアン・アントニオ・ロペス・ラエス博士、EEZ-CSIC、グラナダ、スペインによって提供されています。この記事で説明した実験では、pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6または空のベクターを含むA.根茎遺伝子を制御として使用した。pK7GWIWG2_II-RedRootは、シロイヌナプシス・タリアナ・ユビキチンプロモーター(pAtUBQ10)によって駆動されるレポーター遺伝子DsRedを含み、スペクチノマイシン(50μg/mL)に対する耐性を与える。5より前に報告されているように、遺伝子過剰発現に他のベクターを使用することが可能です。本研究では、SlCESA6サイレンシングに特異的な断片の増幅を、トマト(S.リコパルシカムcv)から単離したRNAを用いた逆転写(RT)PCR法により得られ、p-ENTR/D-TOPOベクターに連結した(表1)。続いて、SlCESA6-RNAiフラグメントをpK7GWIWG2_II-RedRootバイナリベクターにクローン化した。
2. プラントの変換と選択
- 無菌メスを使用して、トマト苗のラジクルと低コチルの底部を切断する(図1C,D)。
- プラスチックチップまたはメスの刃を用いてLB培地の表面からA.リゾゲネスバイオマスを収穫し、切断されたトマト苗を細菌バイオマスに慎重に浸す(図1E)。
- A.根茎遺伝子で接種した後、トマトの苗を2cm x 4cm半円形のフィルター紙(図1F)で覆い、高湿度を維持し、生存と新しい根の開発を容易にします。
- 6-7日間の変換トマトの苗を保存します。次に、無菌メスを使用して新しい毛深い根(図1G,H;このステップでは根はまだ変換されていません)をカットし、苗が新しい毛深い根を作り出すことを可能にします。
- 第2世代の毛深い根が現れたら(図1I)、苗の上にフィルターペーパーを取り除き、再びマイクロポアテープでプレートを密封します。
注: この時点で、変換ベクトルに DsRed 蛍光マーカーが存在することで、新しいルートの変換効率を視覚化できます。 - DsRed蛍光を可視化するには、生体内イメージングの植物に対して立体顕微鏡またはその他の装置を用いる(図1J)。陽性(赤色蛍光)変換された根をマークし、無菌メスを使用して陰性の非形質化された根(赤い蛍光なし)を除去します。
- 赤色蛍光を示す苗を1/2MS培地を含む新しいプレートに移し、変換された根を主根として開発しやすくする(図1K)。同じプレートに赤色蛍光を示さない苗を保管し、後の時点で蛍光根(図1L)の出現を確認します。
- 抗生物質の選択に基づく代替方法
- ステップ2.5の代わりに、適切な抗生物質で1/2 MS培地を含む半分充填された9 cm 2平方プレートを調製する。調製プロセス中にプレートを約5°傾斜させて、培地なしで空きスペースを生成し(図2A)、抗生物質との接触を避けて芽を成長させます。
- ステップ2.6の代替として、最初の非変形毛深い根を切断した後(ステップ2.4)、適切なサイズのフィルターペーパーを使用して根のない苗を半分充填されたプレートに移す(図2B)。
注意:陽性対照として、同じ抗生物質耐性とレポーター遺伝子を含むプラスミドを持ついくつかの苗を変換することをお勧めします(このプロトコルでは、pK7GWIWG2_II-RedRoot;カナマイシン50 μg/mL)。 - ステップ2.7の代替として、苗が新しい毛深い根を開発し、これらの根が抗生物質の選択を避ける可能性があるため、フィルターサンドイッチペーパーの表面に直接接触していないそれらの根を切断させる。
注:抗生物質の効果により、根の発生は抗生物質のないプレートよりも遅くなる可能性があります。新しい変換された毛深い根は、半満たされたプレートに根のない苗を移した後、14〜18日以内に現れます(ステップC-E2.8.2)。
- 苗を2cm x 4cm半円のフィルターペーパーで覆い、プレートを密封し、苗をインキュベートして新しい毛深い根を開発できるようにします。
注:抗生物質を使用してA.根茎を排除する必要はありません。MS培地の上のろ紙とスクロースの欠如は、プレート5上のA.根茎遺伝子の広がりを阻害する。 - 最初のルート選択から 5 ~ 7 日経過した後、選択プロセスを繰り返して新しい変換されたルートを選択し、変換されていないルートを削除します。1/2 MS培地を含む新しいプレートに、変換された根を含む苗を移します。
3. 接種ポットへの移行
- 根の表面が細菌の接種物にさらされる接種ポットを準備する:水で接種ポットを浸し、余分な水を注ぎ、プラスチック製の植栽トレイに入れます。ピンセットを使用して、根を変換した苗を接種ポットに移します(図3A)。
- ラップまたは透明な蓋でトレイを覆い、25-28 °Cおよび65%の湿度(16時間/8時間光/暗い;130 μmol光子m-2s-1光)に保ち、高レベルの湿度を維持します図3B)。5~6日後にカバーを取り外します。
注:変換されたトマトの植物は、土壌にそれらを転送した後、2〜3週間の接種の準備ができています(図3C)。土壌上の成長中に、トマトの植物は、変換されていない新しい根を生成することができます。この現象の程度を決定するために、赤色蛍光を3週齢形転換トマト植物の根で可視化した。ほとんどの根(80%-100%)赤色蛍光を示し、それらが実際に変換されていることを示す(図3D,E)。
4. 土壌びしょ濡れの接種
- 28°Cの軌道シェーカー(200rpm)で、28°Cのピリキッド媒体(表211)でR.ソランサーム(このプロトコルでは株GMI1000)を定常相まで成長させます。
- 細菌培養物の光学密度を600nm(OD600)で測定して600細菌数を決定する。0.1のOD600に水で細菌培養物を希釈します(ここで使用される条件では、これは約108コロニー形成単位[CFU]/mLに相当します)。
- 変換されたトマト植物を含む16-20の接種ポットを接種トレイ(29 cm x 20 cm)に入れます。図 4A)
- 接種ポットを含むトレイに細菌接種(0.1のOD600)の300 mL(植物当たり15 mL〜15 mL)を注ぎます。彼らに20分間接種を浸して下す(図4B)。
- ポッティング土壌の層で新しいトレイを準備します。接種されたポットを新しいトレイ(図4C)に移し、湿度75%、26-28°C、12時間光と12時間の暗闇(130 μmol光子m-2s-1光)の成長チャンバーにトレイを置きます。
5. 感染パラメータの決定と統計解析
- 前述の12,13,13に従って疾患症状をスコア付けし、0(症状なし)から4(完全なしおれ)(図4D-H)の範囲のスケールを使用して、ラルストニア接種後毎日2週間の間に。
注:疾患指数データは、同じ実験ユニット(各植物)から時間の経過とともに収集されます。
6. 遺伝子発現解析
注: トランスジーンの発現または標的遺伝子のサイレンシングは、RT-PCR または定量的 RT-PCR (qRT-PCR) によって決定できます。
- サンプルを収集し、変換された根系の代表的な部分からRNAを抽出します(標的遺伝子への影響を評価する)と葉(内部制御として)。
- DNase処理RNAの1 μgを使用してcDNAを合成します。
- qRT-PCRにより標的遺伝子の遺伝子発現を解析する。2-ΔΔCT法14を用いて相対転写レベルを算出し、SlEFα-1をハウスキーピング遺伝子15として用いた。
注: プライマー シーケンスは、表 1に示します。
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Representative Results
図5は、空のベクター(EV)で形質転換した根を有するトマト植物の疾患症状の発達を示し、そして、RNAi構築物を標的とする根を有する植物はSlCESA6(Solyc02g072240)を標的とする。 SlCESA6 Solyc02g072240疾患指標データ(図5A)は、0から4までの任意のスケールに従って、同じ実験単位(各植物)から時間の経過とともに収集され、ガウス分布に従わない、パラメトリックデータの標準テストの使用を除外する。さらに、この種の実験には、植民地化と感染ダイナミクスによる固有の植物間のバリエーションがあります。以下、我々は、ラルストニア感染に関連する症状の表現および統計解析のための異なる方法を検討した。
標準的なアプローチとして、コントロール(EV)とSlCESA6-RNAi感染曲線の両方を比較するU Mann-Whitney両側非パラメトリック試験が使用された。この分析によれば、両曲線の中央値の差は有意ではない(P = 0.16)ように見える。
また、疾患進行曲線(AUDPC)の下の領域を定量化することも可能であり、疾患進行の複数の観測を単一値に組み合わせることが可能である。AUDPCは、感染プロセスの最後にSlCESA6-RNAi(21.01±4.74)植物と比較して、コントロール植物(EV;28.75±4.75)に対してより高い値を示し、SlCES6-サイレンス植物は対照植物よりもラルストニア感染に対してより耐性があることを示した(図5B)。 SlCESA6
信頼区間 (CI) は、高い確率で、特定の変数の母集団値 (またはパラメーター) が見つかる値の範囲を推定する方法を提供します。図5Cに示すように、制御用CI(EV)およびSlCESA6-RNAi感染曲線の面積は、SlCESA6が沈黙したときの抵抗の可能性が高いと推定している。 SlCESA6
疾患指数値は、バイナリデータに変換することができ、"0"に対応する2未満の疾患指標と、「1」12に対応する2以上の疾患指標を考慮する。これは、ラルストニア接種後の生存曲線の表現を可能にする。この変換は、植物が明確な症状(2の疾患指標)を発症し始めると、それらは「感染した」と見なされ、この感染の結果として死ぬという観察に基づいています。EVとSlCESA6-RNAi植物間の生存率の差は、ゲハン・ブレスロー・ウィルコクソン統計検定(P=0.13)に従って統計的に有意ではなかった(図5D)。P
統計分析を行うことに加えて、得られたP値に関係なく、異なる反復内で観察された傾向の再現性に基づいてこれらのデータを解釈する価値がある(補足図1)。この概念に従って、最近、厳格な統計的閾値(標準P ≤ 0.05など)を過度に使用するリスクについてコメントする科学者が増えています。
SlCESA6の発現を接種工程の前に無作為に選択した2つの形質転換根で分析した結果、ラルストニアに対する抵抗力の増強がSlCESA6の発現低下と相関することを示した(図5E)。この方法を使用すると、2回の選択後に35-40%の変換率を得ることができます(図5F)。この値は、追加の選択ラウンド5を実行することによって増加できます。
図1:プラントの準備、変換、選択。(A)半強度MS(1/2)培地でトマト種子の発芽。(B)1/2 MS培地を含むプレート上に置かれたフィルター紙の上に入れた発芽トマトの種。Bトマト苗の前(C)と後(D)は、ラジクルと低血糖の底を切断する。(E)細菌バイオマスに浸漬することによりトマト苗の形質転換を行う。(F)湿度を維持するために濾紙で覆われたトマトの苗を変換しました。新しい(非形質)毛深い根の出現(G)と除去(H)。(I) 変換されたルート。(J) DsRed蛍光の可視化による形質転換トマト毛根の選択赤い矢印は、DsRed蛍光を発現する正の形質転換根を示す。(K) 主なルーツとして変換されたルーツの開発。(L) 成熟形化した根のDsRed蛍光の可視化この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:抗生物質の選択に基づく代替方法。(A)1/2 MS培地を含む半角板。(B) 最初の非形質毛根を除去した後、抗生物質で1/2 MS培地上に置いたフィルター紙に配置された苗をカットする。(C) 追加のフィルターペーパーで覆われたルーツ。(D) トマトは、抗生物質で1/2 MS培地上で成長した根を形質転換した。(E) pK7GWIWG2_II-RedRoot(カナマイシン50 μg/mL)で変換された苗を、正のコントロールとしてDsRedを発現させる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:転写トマトを接種ポットへ移す。(A)根形化されたトマトを、浸し込んだ接種ポットに移した。(B)高い湿度を維持するために、プラスチック製の蓋で覆われた接種ポットでトマトを変換しました。(C) 2~3週齢の根形質転換トマトは、接種ポットに移した後、接種の準備が整った。(D) 土を取り除いた後、生後3週間のトマト植物。(E) 3週齢形質転換トマト植物の根に蛍光を付けたDsRed。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ラルストニア土壌びしょ濡れ接種。(A) R. ソラナ科GMI1000接種に必要な材料。(B) R. ソラナ科GMI1000接種との接種ポットで形質転換トマトの土壌びしょ濡れ.(C)ポッティング土壌の層の上に置かれた接種トマト。(D-H)ラルストニア病の症状は、0(症状なし)から4(完全なしおれ)までの範囲で拡大します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: SlCESA6サイレンシングは、R. ソラナ科に対する抵抗性を高めます。(A)RNAi媒介性SlCESA6-沈黙(CESA6-RNAi)および空のベクター(EV)の病気症状は、R.ソラナ科で接種時にトマト植物を根形変換した。値は8つの植物の平均±SEに対応する。(B)パネルAに示された植物の疾患進行曲線下の領域(C)パネルAに示された植物の95%の信頼区間(D)パネルAに示された植物の生存率(E)RNAi媒介SlCESA6-サイレンス(CESA6i)およびEV根形化されたトマト植物のqRT-PCRによる遺伝子発現解析(1,2)およびS(S)。値は、3つの技術複製の平均±SEに対応する。(F)2つの独立した実験のEVおよびCESA6-RNAi-RNAi根形転換トマト植物の形質転換率。値は、2回の選択の後、平均±SEに対応する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| プライマー名 | プライマーシーケンス(5'-3') |
| EFα-1-F | グットッグガグカトガットガ |
| EFα-1-R | クグッカアカッカッガアカーアカーア |
| qCESA6-F | ガクトクトクトクトクトクトクト |
| qCESA6-R | TCCCTTTCATACCTTG |
| チェーサ6-RNAi-F | カックグクガクガーグガッグタグ |
| チェーサ6-RNAi-R | TTTガガクトットチャクトッガ |
表1: プライマーシーケンス
| 成分 | 1 L の場合 |
| バクトペプトン | 10g |
| 酵母エキス | 1 g |
| カサミノ酸 | 1 g |
表2:ピ(Ø)培地組成物。
補足図1:図5Aに示す結果の再現性。RNAi媒介性SlCESA6-サイレンセ(CESA6-RNAi)およびEV根形転換トマト植物の疾患症状はR.ソラナ科で接種した。値は8つの植物の平均±SEに対応する。遺伝子発現解析は、RNAi媒介SlCESA6-サイレンス(CESA6i)および空ベクトル(EV)の根形転換トマト植物の根(1,2)およびシュート(S)のqRT-PCRによって行われた。値は、3つの技術複製の平均±SEに対応する。こちらをダウンロードしてください。
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Discussion
ラルストニア・ソラナ科は農業に対して重要な脅威を与えている。しかし、農業の重要性の自然の宿主との相互作用は、特に作物植物種において、他の細菌病原体と比較してまだ十分に理解されていない。ほとんどの場合、遺伝的解析は、宿主植物を遺伝的に改変するために必要な時間と費用によって妨げられる。この問題に対処し、トマトにおけるR.ソラナ科の感染の遺伝子解析を容易にするために、我々はトマト根のアグロバクテリウム・リゾゲネス媒介性形質転換に基づく容易な方法を開発した(図1)、続いて土壌びしょ濡れの接種(図3)。変換された根は蛍光レポーター(このプロトコルではDsRed)を使用して選択される(図1)。また、非変形した空中部分に損傷を与えない抗生物質の選択に基づく代替方法も開発しました(図2)。
変換プロトコルは、Ho-Plágaroら(5)によって記述されたプロトコルに基づいており、いくつかの変更が加えられてある。この方法の多様性は植物生理学、化学処理への応答および/または異なった生物および不生物のストレスに対する応答を分析するもののような形質転換された根の多数の付加的なアッセイを可能にする。
形質転換した植物を土壌に移した後、植物が形質転換されない新しい根を生み出す可能性を検討しました。我々は、変換された植物の根系におけるDsRedからの蛍光を、土壌(ラルストニア接種前)に移した2週間後に観察することによって、この可能性を探った。その結果、大部分の根に赤色蛍光が示された(図3D)。
アグロバクテリウムによるT-DNAの移動は、ランダムな方法で宿主ゲノムに統合され、したがって、この方法は、標的遺伝子の異なる発現量を有するトマト植物の不均一集団を生成する。R.ソラナ科感染は通常、植物の死を引き起こし、その後、各植物の遺伝子発現を分析する実験後に根サンプルの採取を妨げる。実験中の標的遺伝子の発現量を解析するために、接種工程前に2~3個の根形転換植物を、接種される集団の代表的なサンプルとして選択する。図5は、トマト植物における疾患症状の減少が、接種工程前のSlCESA6サイレンシングの効率と相関していることを示している。したがって、プロトコルの限界にもかかわらず、我々の代表的な結果は、この方法がトマト中のR.ソラナ科ラムに対する耐性または感受性に関与する候補遺伝子を研究するための強力なツールであることを明確に示している。この記事に示す例では、SlCESA6、二次細胞壁関連セルロース合成酵素をノックダウンすると、R.ソラナシアラムによる感染に対する耐性を高め、シロイヌナプス・タリスナ8の直射体AtCESA8(At4g18780)を使用して以前の観測に似ていることがわかります。 AtCESA8 At4g18780
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
マッチョ研究所の研究室メンバーの皆さんに、有益な議論、統計アドバイスのためのアルバロ・ロペス・ガルシア、そしてこの作業中の技術的および管理的支援のための新宇建に感謝します。我々は、蛍光イメージングの支援のためのPSC細胞生物学のコア施設に感謝この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム(助成金XDB27040204)、上海植物ストレス生物学センター(中国語)科学アカデミー)と中国の1000タレントプログラム。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
References
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