Summary
神经内分泌肿瘤（NETs）来自神经峰的神经内分泌细胞。它们生长缓慢，对文化充满挑战。我们提出了一个替代策略，通过培养它们作为球体，从小肠中种植NET。这些球体有小肠NET标记，可用于药物测试。
Abstract
小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）是肠道肠色素细胞的罕见癌症。这一领域的研究是有限的，因为很少患者衍生的SBNET细胞系被生成。分化良好的SBNET细胞生长缓慢，难以繁殖。已经建立的少数细胞系不是现成的，在培养中一段时间后可能无法继续表达NET细胞的特性。产生新的细胞系可能需要很多年，因为SBNET细胞有很长的倍增时间，并且需要许多浓缩步骤来消除快速分裂的癌症相关成纤维细胞。为了克服这些限制，我们开发了一种方案，从手术切除的肿瘤中培养SBNET细胞，将其作为细胞外基质（ECM）中的球形体。ECM 形成一个三维矩阵，封装 SBNET 细胞，并模仿肿瘤微环境，允许 SBNET 细胞生长。在这里，我们描述了SBNET球体的生长速率，并描述了使用免疫荧光显微镜和免疫组织化学识别SBNET标记物的方法，以确认球体是神经内分泌肿瘤细胞。此外，我们使用SBNET球体来测试拉帕霉素的细胞毒性。
Introduction
小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）起源于小肠的肠色素细胞。虽然SBNET通常已知生长缓慢，但它们通常转移至肝脏1。虽然手术切除或肿瘤消融可以考虑在许多情况下，复发几乎是普遍的，因此，药物治疗在管理中起着重要的作用。已经投入了巨大的努力来产生新的SBNET细胞系用于药物检测。然而，收效甚微。只报告了6个SBNET细胞系（KRJ-I、CND2、GOT1、P-STS、L-STS、H-STS）。不幸的是，一个细胞系不再表示NET标记6和三个其他SBNET细胞系（KRJ-I，L-STS，H-STS）被确定为从转化淋巴细胞，而不是NET7派生。为了加速识别针对SBNET的药物，需要采用替代方法进行体外药物检测。
在这里，我们利用被切除的SBNET的可用性，并建立了一种方法，培养这些患者衍生的SBNET作为在ECM中生长的球体。本手稿的总体目标是将一种将 SBNET 培养为三维 （3D） 培养方法描述为一种三维 （3D） 培养方法，并概述通过免疫荧光染色和免疫组织化学来描述这些球体以保留 SBNET 标记的过程。
此外，我们演示了这些SBNET球体如何可用于测试拉帕霉素的效果，一种抗癌药物NET8。该协议背后的原理是开发一种在体外培养SBNET细胞的新方法，并将其用于药物测试。与建立SBNET细胞系的传统方法相比，该技术的优点是可以快速获得SBNET的3D培养物，并在3周内进行药物测试。SBNET球体可能被用作执行体外药物屏幕的模型，以识别SBNET患者的新药。由于SBNET细胞系并不广泛可用，SBNET球体的3D培养物可以作为研究SBNET的新体外模型，并可在该领域的科学家之间共享。
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Protocol
所有使用人类神经内分泌肿瘤样本的实验都已获得爱荷华大学医院和诊所IRB委员会的批准（协议号199911057）。所有材料和设备的列表在材料表中描述。增长介质和关键解决方案的列表见表1。
1. 小肠神经内分泌肿瘤（SBNET）采集和细胞分离
- 从外科病理学核心确认肿瘤组织后，获取切除的患者SBNET样本。
- 将 SBNET 切成 5 mm 立方体，并储存在 25 mL 的 DMEM/F12 介质中，放入锥形管中，以便运输至实验室。
- 在含有1%FBS、1%青霉素/链霉素（Pen/链球菌）、1%谷氨酰胺（洗涤介质）的DMEM中转移肿瘤，并在此洗涤介质中孵育15分钟。
- 使用无菌弯曲剪刀将肿瘤转移到新盘和薄荷肿瘤到小于 1 毫米片。
- 将切碎的组织转移到含有25 mL洗涤介质的50 mL管中。
- 在 4°C 下在 500 x g下离心 15 分钟。
- 丢弃上清液，在含有胶原酶（100 U/mL）和DNase（0.1mg/mL）的洗涤介质中重新悬浮颗粒。
- 允许消化切碎的肿瘤发生在37°C的培养箱中，缓慢摇动（50 rpm），1.5小时。
2. SBNET作为ECM肿瘤球体的培养
- 消化完成后（步骤1.8），在4°C下以500 x g离心15分钟，丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在15 mL的洗涤介质中。
- 将 70 μm 细胞滤网放在新的 50 mL 管顶部，并将 10 mL 的洗涤介质转移到细胞滤网上。旋转洗涤介质以覆盖塑料管的一侧，以防止 NET 细胞粘在塑料管的侧面。
- 通过细胞过滤器过滤细胞悬浮液。
- 在 500 x g下在 4°C 下离心 15 分钟，丢弃上清液，在 200 μL 的洗涤介质（总体积为 ± 250 μL）中重新悬浮颗粒，并将其放在冰上。
- 将5μL细胞转移到500μL的洗涤介质（1/100稀释因子）。使用血细胞计使用稀释的细胞进行细胞计数，以获得每毫升的细胞数。乘以 100 以校正稀释系数。
- 将步骤 2.5 中获得的每 mL 的细胞数乘以步骤 2.4 （= 250 μL） 中获得的悬浮细胞总体积。
- 在 500 x g下在 4°C 下离心 15 分钟，丢弃上清液，并将细胞重新悬浮在液体 ECM 中（1 x 106细胞/mL），并保持在冰上。
- 将 ECM 中的 5-20 μ0 ΜL SBNET 球体转移到 96 孔板中，通过将板置于 37°C 培养箱中 5 分钟，使液体 ECM 固化。
- 在含有ECM中SBNET球体的96孔板中，每口孔中加入200 μL的SBNET培养基（DMEM/F12 = 10% FBS + 1% PEN/STREP = 1% 谷氨酰胺 + 10 mMM烟酰胺 + 10 μg/mL 胰岛素）。
- 或者，培养SBNET有机体在干细胞培养基中类似于以前描述的人类肝脏或胰腺器官生长9，并列在材料表中。
- 每 5-7 天更换一次介质。
3. 使用 ImageJ 定量 SBNET 球体尺寸
- 在第 1 天、第 4 天、第 7 天、14 天、23 日和 97 日拍摄 5-10 张 SBNET 球体照片，使用 10 倍目标。
- 在 ImageJ 中打开保存的图像。转到"分析"选项卡，选择"设置测量值"选项，然后对"区域"选项进行检查。
- 使用工具栏中的椭圆选择工具在聚焦良好的球形周围生成椭圆或圆形。
- 转到"分析"选项卡并选择"度量值"选项。重复步骤 3.4 和 3.5，以便从 25-50 SBNET 球体获得面积测量。这些值以像素平方提供。
- 通过将每个像素的大小与每个像素的长度除以显微镜图像的 μm 转换系数，将像素区域转换为 μm2。
注：SBNET细胞主要以球形生长，有些时候作为椭圆体生长。
4. 通过免疫荧光对SBNETS球体进行表征
- 使用 P1000 移液器将 ECM 中生长的有机物转移到 1.5 mL 管中。
- 在 1，500 x g下离心 1 分钟，并去除上清液。
- 通过加入1 mL的PBS清洗有机体培养物，混合、在1，500 x g下离心1分钟，并去除上清液。
- 加入500μL的4%甲醛，孵育15分钟，修复有机体。
- 用 1 mL 的 PBS 洗涤培养液两次。
- 通过添加 500 μL 的 PBS + 3% BSA = 0.1% Triton X 100 5 分钟来渗透培养物。
- 然后用 1 mL 的 PBS = 3% BSA 洗涤三次。
- 用初级抗体对突触素 （SYP）10孵育 1h，在 1/600 稀释或色丹素 A （CgA）11和体母素受体 2 （SSTR2）12在抗体缓冲液中稀释 1/400 （2.5% 牛血清白蛋白， 0.1% 钠）阿齐德，25 mM Tris pH 7.4，150 mM 氯化钠）。
注：每管使用300μL或更多抗体溶液。 - 用 1 mL 的 PBS = 3% BSA 洗涤三次。
- 在抗体缓冲液中以1/500稀释时与FITC耦合的二级抗体孵育1小时。每管使用300μL或更多抗体溶液。
- 洗涤 3 次，使用 1 mL 的 PBS = 3% BSA。确保吸出并丢弃所有上清液。
- 加入5μL的安装介质，其中包含核污渍DAPI。
- 使用 P20 移液器将 5 μL 的 SBNET 球体从步骤 4.12 转移到玻璃滑块上，并密封盖玻片。
- 使用 10x、20x 或 40x 物镜使用荧光显微镜拍摄图像。
5. 通过免疫组织化学 （IHC） 进行 SBNET 球体表征
- 使用 P1000 移液器将 SBNET 球体从培养板转移到 1.5 mL 管。
- 在 1，500 x g下离心 1 分钟，并去除上清液。
- 修复SBNET球体，从步骤5.2向管中加入500μL的10%形式，并在石蜡嵌入前2-5天室温下孵育，并切割4μm厚的球形部分。
- 在pH9的抗原检索溶液中，使用热诱导表位提取，使用3合1自动滑动处理站加热至97°C20分钟，为抗体孵育准备幻灯片。
- 以1/100稀释15分钟对SYP10进行块状滑轨和孵育，在1/800稀释时用CgA11进行15分钟，在1/5，000稀释时用SSTR21孵育30分钟。
- 使用二级抗体检测系统孵育抗SYP和CgA染色15分钟，抗SSTR2染色30分钟。使用 400x 目标拍照。
6. 用拉帕霉素治疗SBNET类有机物
- 在 DMSO 中溶解拉帕霉素，以获得 10 mM 库存溶液。
- 使用 DMSO（例如，1 mL 的 SBNET 培养基 = 1 μL 的 DMSO）和带 10 μM 雷帕霉素的 SBNET 培养基（例如，1 mL 的 SBNET 培养基 = 1 μL 的 10 mM 雷帕霉素库存溶液）制备 SBNET 培养基。
- 将 200 μL 介质与带 DMSO 或 10 μM 拉帕霉素的 SBNET 培养基转移到 SBNET 球形培养物。
- 在37°C培养箱中孵育SBNET球体5天。
- 加入1 μM的紫杉醇，孵育30分钟。取出含有苯二甲酸酯的介质，用200μL的PBS清洗，并将200μL的PBS转移到每个井。
- 使用带有荧光显微镜10x、20x或40x物镜的红色滤镜立方体，拍摄带药物治疗或不药物治疗的SBNET球体的显微镜图像。
注：使用市售显微镜的红色滤镜立方体G（材料表），沾染了被染色的死细胞显示为红色。或者，可以使用535nm激发和624nm发射分光光度计捕获信号。
7. 分割 SBNET 球体
注：这样做是为了扩展和与其他研究人员共享。
- 使用 P1000 移液器以机械方式断开 ECM，并使用 SBNET 球形将 ECM 吸到无菌的 1.5 mL 管中。
- 在 4°C 下以 1，000 x g离心，去除所有上清液，并将管放在冰上。
- 将新 ECM 的体积增加 2-4 倍。通过上下移液 10 倍，将新 ECM 与旧 ECM 和 SBNET 球体混合。避免引入气泡。
- 将 ECM 和 SBNET 球体混合物的 5-20 μL 转移到新板，并允许 ECM 固化。
- 用新的SBNET介质盖住并转移到孵化器。回收率约为 95 到 100%。
- 要将 SBNET 球体运送到另一个实验室，请使用新 ECM 将 SBNET 球体转移到 T25 烧瓶，并允许 ECM 固化。
- 用 SBNET 球形介质填充 T25 烧瓶，拧紧盖上，并准备装运包装。
- 收到 SBNET 球体培养体后，删除培养基，执行步骤 7.1 到 7.5，使 SBNET 球体回到培养体中。
8. SBNET 球体的冷冻存储和恢复
- 将 SBNET 球体从 5-10 个小井转移到 15 mL 管。在500 x g下在4°C下离心15分钟，去除上清液，重新悬浮在冷冻介质中（90%FBS = 10%DMSO），储存在细胞冷冻容器中，并将其置于-80°C。
- 转移到液氮中，以便延长储存时间。
- 要恢复 SBNET 球体，请将冷冻小瓶放在冰上，等待内容完全解冻。反转管子并重新放置在冰上，以加快解冻过程。
- 样品解冻后，放入预冷却离心机内，以1000 x g旋转10分钟。
- 拆下上清液并重新悬挂 ECM 中的球体。将管放在冰上，将 20 μL 转移到新板，然后等待 ECM 凝固。
- 用10μM的ROCK抑制剂（Y-27632）13转移200μL的SBNET培养基，并转移到培养箱。
- 允许 SBNET 球体恢复和生长 1 周。去除旧的培养基，补充200 μL的SBNET培养基，并返回到孵化器。
- 允许 SBNET 球体继续生长。
注意：快速生长的球体在冷冻保存13后开始恢复至少需要1周时间。SBNET球体至少需要2-4周才能开始生长。许多SBNET细胞将在前2周内死亡，存活率低于10%。由于这是一个非常耗时和低产量的过程，最好与其他研究人员共享培养瓶中的 SBNET 球体（如步骤 7 中所述）。冷冻储存和恢复应仅用作在发生细菌污染时的备用计划。
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Representative Results
目前只有2个SBNET细胞系建立和出版2，3，4，5，它们不是现成的许多研究人员。在这里，我们建议将 SBNET 培养为 ECM 中的球体，并将其用作研究 SBNET 药物敏感性的替代模型。从转移到肝脏的SBNET患者衍生的肿瘤被收集，消化以释放SBNET细胞，并与液体ECM混合，以建立SBNET球体培养物（图1A）。这个SBNET的Ki-67是4.3%。虽然SBNET球体的生长速度缓慢，但可以通过显微成像来监测其生长（图1A）。当培养介质每周更改一次时，SBNET 球体需要大约 14 天才能加倍（图 1B）。在培养14天后，SBNET球体的大小不会增加。相反，某些 SBNET 单元格将分离到相邻位置并形成新的球形。要传播 SBNET 球体培养体，可以收获包含 SBNET 球体的 ECM，并将其重新播种到具有新培养介质的新培养板中（步骤 7）。
为了确认有机体培养物含有SBNET细胞，我们描述了一种简单而快速的方法，使用免疫荧光（IF）显微镜染色SBNET标记物的球体，如突触素、色霉素A和体腺素受体2型（SSTR2）步骤 4）。使用针对突触素、色氨酸 A 和 SSTR2 的抗体，我们的 IF 数据显示，这些标记物在培养 1 或 9 个月后在细胞质和 SBNET 细胞膜（图 2A，绿色）中被局部化（Figure 2B）).为了确保SYP、CgA和SSTR2抗体的特异性，我们在胰腺肿瘤的有机体线上执行了相同的染色程序，该线没有表示SYP、CgA或SSTR2（图2C），因为未检测到绿色信号。此 SBNET 球体 IF 实验的主要优点是可在 4 小时内执行，并提供与免疫组织化学类似的染色信息（IHC;图 3.我们提供了用于执行步骤 5 中的 SBNET 球体的 IHC 的协议。
培养SBNET作为球体是一种有价值的技术，用于识别可以抑制SBNET生长的药物。作为原理的证明，我们用雷帕霉素治疗SBNET球体5天，一种mTOR抑制剂，一类常用用于治疗NET8的药物。与对照SBNET球体相比，拉帕霉素处理的球体形成了葡萄状结构，成为凋亡或坏死（图4A-D）。死亡细胞可以通过甲酸酯检测，以染色DNA和RNA，并产生明亮的红色信号14。这种染料不能穿透活细胞的细胞膜。
图1：患者衍生的小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）在细胞外基质（ECM）中生长为球体。 （A） 从切除的SBNET中分离肿瘤细胞，并通过与ECM混合放入培养中。比例尺表示 SBNET 球体的 100 μm （B） 相对于使用 ImageJ 量化的区域性天数的表面面积。数据来自1个患者的SBNET球体，并代表为均值的平均值面积=标准误差。测量每个时间点的表面积为30至60个球体。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：SBNET球体的免疫荧光（IF）染色。（A ） 1个月后在文化中和 （B） 9 个月在文化中的 SBNET 球体染色.（C） 胰腺肿瘤器官的染色，不表示SBNET标记物为阴性对照。肿瘤球体固定在4%的甲醛中，并使用抗体对突触素（SYP）进行1/600稀释，色丹素A（CgA）在1/400稀释，和索马他汀受体2（SSTR2）在1/400。IF 图像分别在 100 ms、200 ms 和 400 ms 的曝光时间下拍摄，分别使用 10x、20x 或 40x 目标进行染色。比例尺表示50μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：SBNET球体的免疫组织化学（IHC）染色。形式固定和石蜡嵌入SBNET球体部分被脱蜡，补水，阻塞和染色（A） SYP， （B） CgA和 （C） SSTR2抗体.使用 400x 目标拍摄了图像。比例尺表示50μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：使用SBNET球体进行药物检测. （A） 用DMSO处理的SBNET球体的明亮场图像为5天。（B） 用 DMSO 处理并沾染了紫杉石 （Ethidium H） 的 SBNET 球体的图像。（C） 用10μM的雷帕霉素治疗5天后形成葡萄状结构的死SBNET球体的明亮场图像。（D） 与 H 乙酸钠染色的死 SBNET 球形显示为红点。在100ms曝光时，使用红色滤镜立方体拍摄了H染色图像。比例尺表示10μm。请点击此处查看此图的较大版本。
| 增长介质或解决方案 | 组成 |
| 洗涤介质 | 含有 1% FBS、1% PEN/STREP、1% 谷氨酰胺的 DMEM |
| SBNET 文化介质 | DMEM/F12 = 10% FBS = 1% PEN/STREP = 1% 谷氨酰胺 = 10 mM 烟酰胺 = 10 μg/mL 胰岛素 |
| 抗体缓冲液 | 2.5% 牛血清白蛋白，0.1%阿齐德钠，25 mM Tris pH 7.4，150 mM 氯化钠 |
| 冷冻介质 | 90% FBS = 10% DMSO |
| 人类肝脏干细胞分离培养基 | DMEM/F12 ， 1% 笔/链球， 1% GlutaMAX， 10 mM HEPES， 1/50 B27 补充剂， 1/100 N2 补充剂， 1 mM N-乙酰半胱氨酸， 200 纳克/mL Rspo 1， 50ng/mL EGF， 100 纳克/mL FGF10， 10 m mMM酰胺， 10 uM forskolin， 5uM A83-01 |
| 人类胰腺干细胞分离培养基 | DMEM/F12 ， 1% 笔/链球， 1% 谷氨酸MAX， 10 mM HEPES， 1/50 B27 补充剂， 1/100 N2 补充剂， 1 mM N-乙酰半胱氨酸， 200 纳克/mL Rspo 1， 25 ng/mL Noggin， 50ng/mL EGF， 100 纳克/mL FGF10， 10 mM 烟酰胺， 10 uM forskolin， 5uM A83-01， 3 uM PGE-2 |
表 1.增长介质和解决方案列表。
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Discussion
肿瘤3D培养物已成为临床前药物检测的宝贵资源。各种肿瘤有机体生物库最近已建立从乳腺癌和前列腺癌肿瘤16，17。在这项研究中，我们为培养SBNET作为球体提供了详细的方案，以及一种简单快捷的方法，通过免疫荧光和测试药物敏感性验证NET标记物的球体培养。根据我们的经验，SBNET球体可以在各种文化媒介中成长。它们在干细胞培养基中生长稍快，用于人类胰腺或肝脏分离，我们根据先前公布的协议9改编而成。我们选择在DMEM/F12介质中种植SBNET，辅以胰岛素和烟酰胺，因为这比干细胞培养基便宜。提高胎儿牛血清的百分比是促进SBNET有机体培养的另一个策略;但是，这也会增加文化维护的总体成本。
使用 10x、20x 或 40x 物镜使用荧光显微镜执行 IF 染色和成像是测试表达 SBNET 标记的快速简便方法。然而，与IHC相比，它没有给出定义良好的本地化（图2，图3）。例如，IF数据显示SSTR2的膜定位难以检测。我们主要检测细胞SSTR2，这是以前报道18。为了获得标记蛋白的更好定位，我们建议使用IF和共聚焦显微镜。总体而言，IF 是快速确认 SBNET 标记的有用方法。我们的抗体（抗SYP、抗CgA、抗SSTR2）没有与在IF实验中不表达SYP、CgA或SSTR2（图2C）的阴性对照器官发生交叉反应。这个建议，我们检测到的荧光信号是特定于SBNET球体。
为了增加SBNET球体的收率，该协议的关键步骤是在细胞过滤步骤（步骤2.2）和混合SBNET与液体ECM进行等分到组织培养板（步骤2.8）。确保用介质盖住细胞滤膜和收集管，以防止 SBNET 细胞粘在塑料上。液体 ECM 如果不放在冰上，将迅速凝固。确保组织培养罩中有一个小冰容器，以保持 ECM 和 SBNET 细胞的低温。
该技术的局限性是SBNET球体的缓慢生长速度。实验必须有效地计划，避免使用过量的SBNET球体。另一个限制是冻结解冻后缓慢恢复。SBNET球体解冻后需要1个月以上才能开始生长。为了克服这一限制，我们建议在培养物中持续保持 SBNET 球体，并根据需要将其拆分（步骤 7）。即使在培养9个月后，SBNET球体仍然保持SBNET标记的表达（图2B）。
虽然 SBNET 球体的 3D 培养比其他癌症细胞系的传统 2D 培养更耗费人力，但它是 SBNET 体外培养的极有价值的模型，因为许多 SBNET 研究人员无法访问现有的细胞系。通过该协议，科学家和临床医生可以从切除的肿瘤中建立SBNET球体培养物，并与其他实验室共享。此外，SBNET球体可能用于建立SBNET患者衍生的异种小鼠模型。总体而言，这里介绍的技术可以适应其他NET的培养、特征和药物测试，如胰腺或肺NET。请注意，有机物的生长速度在不同类型的 NET 和患者样本之间会有所不同。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH授予P50 CA174521（J.R.豪和A.M.贝利齐）的支持。P.H. Ear 是 P50 CA174521 职业提升计划奖的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
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