Summary
Neuroendokrine tumorer (NETs) stammer fra neuroendokrine celler i neurale crest. De er langsomt voksende og udfordrende for kulturen. Vi præsenterer en alternativ strategi for at dyrke garn fra tyndtarmen ved at kulde dem som sfæroider. Disse sfæroider har små tarm NET markører og kan bruges til Drug test.
Abstract
Små tarm Neuroendokrine tumorer (SBNETs) er sjældne kræftformer stammer fra enterochromaffin celler i tarmen. Forskningen på dette område har været begrænset, fordi der er genereret meget få patient afledte SBNET-cellelinjer. Veldifferentierede SBNET-celler er langsomt voksende og er svære at udbrede. De få cellelinjer, der er blevet etableret, er ikke umiddelbart tilgængelige, og efter tid i kulturen kan ikke fortsætte med at udtrykke egenskaber af netto celler. Generering af nye cellelinjer kan tage mange år siden SBNET celler har en lang fordobling tid og mange berigelse trin er nødvendige for at eliminere de hurtigt dividere Cancer-associerede fibroblaster. For at overvinde disse begrænsninger har vi udviklet en protokol til kultur-SBNET-celler fra kirurgisk fjernede tumorer som sfæroider i ekstracellulær matrix (ECM). ECM danner en 3-dimensionel matrix, der indkapater SBNET celler og efterligner tumor mikro-miljø for at tillade SBNET celler til at vokse. Her karakteriserede vi vækstraten af SBNET sfæroider og beskrev metoder til at identificere SBNET markører ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi og immun histokemi for at bekræfte, at sfæroider er neuroendokrine tumorceller. Derudover brugte vi sbnet sfæroider til afprøvning af cytotoksicitet af Rapamycin.
Introduction
Små tarm Neuroendokrine tumorer (SBNETs) stammer fra enterochromaffin celler i tyndtarmen. Selv om sbnets er generelt kendt for at vokse langsomt, de almindeligvis metastaserer til leveren1. Mens kirurgisk fjernelse eller tumor ablation kan overvejes i mange tilfælde, gentagelse er næsten universel, og, derfor, medicinsk terapi spiller en vigtig rolle i ledelsen. Enorme indsats er blevet investeret for at generere nye SBNET cellelinjer for Drug test. Men der har været meget lidt succes. Kun 6 sbnet cellelinjer (krj-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) er blevet rapporteret2,3,4,5; og desværre en cellelinje ikke længere udtrykker netto markører6 og tre andre sbnet cellelinjer (krj-I, L-STS, H-STS) var fast besluttet på at være afledt af transformerede Lymfoblaster i stedet for NETs7. For at fremskynde identifikationen af lægemidler til målretning af Sbn'er er der behov for alternative metoder til in vitro-lægemiddel testning.
Her udnytter vi tilgængeligheden af generede Sbn'er og har etableret en måde at dyrke disse patient afledte Sbn'er på, da spheroider vokser i ECM. Det overordnede mål med dette manuskript er at beskrive en metode til kultur SBNET som en tredimensionel (3D) kultur og skitse procedurer til at karakterisere disse sfæroider til fastholdelse af SBNET markører ved immunofluorescens farvning og immun histokemi.
Derudover viser vi, hvordan disse sbnet sfæroider kan bruges til at teste effekten af Rapamycin, et anti-cancer-lægemiddel til NETs8. Rationalet bag denne protokol er at udvikle en ny metode til at vokse SBNET celler in vitro og bruge dem til Drug test. Fordelen ved denne teknik over den traditionelle metode til at etablere en SBNET cellelinje er, at 3D-kulturer af SBNETs hurtigt kan opnås og Drug test kan gøres inden for 3 uger. SBNET sfæroider kunne potentielt anvendes som model for udførelse af in vitro-lægemiddel skærme for at identificere nye lægemidler til SBNET-patienter. Da SBNET-cellelinjer ikke er alment tilgængelige, kan 3D-kulturer af SBNET sfæroider tjene som en ny in vitro-model til at studere SBNETs og kan deles blandt forskere i marken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med humane neuroendokrine tumorprøver er blevet godkendt af University of Iowa Hospital og klinikker IRB-Udvalget (protokolnummer 199911057). En liste over alle materialer og udstyr er beskrevet i tabellen over materialer. En liste overvækst medier og nøgle løsninger findes i tabel 1.
1. tyndtarm neuroendokrine tumor (SBNET) indsamling og celle dissociation
- Få resekterede patient sbnet prøver efter tumor væv bekræftelse fra kirurgisk patologi kerne.
- SBNETs skæres i 5 mm terninger og opbevares i 25 mL DMEM/F12-medium i et konisk rør til transport til laboratoriet.
- Overføre tumorer i DMEM indeholdende 1% FBS, 1% penicillin/streptomycin (pen/STREP), 1% glutamin (vask medium) og Inkubér i denne vask medium for 15 min.
- Overfør tumorer til en ny skål og hakkekød til mindre end 1 mm stykker ved hjælp af steril buet saks.
- Det hakkede væv overføres til et nyt 50 mL rør, der indeholder 25 mL vaske medium.
- Prøven centrifugeres ved 500 x g i 15 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten kasseres, og pellets opslæmmes i 10 mL vaske medium indeholdende kollagenase (100 U/mL) og DNase (0,1 mg/mL).
- Lad fordøjelsen af de hakkede tumorer forekomme i en 37 °C inkubator med langsom omrystning (50 rpm) for 1,5 h.
2. kultur af Sbn'er som tumor sfæroider i ECM
- Efter fordøjelsen er afsluttet (trin 1,8), centrifugeres ved 500 x g i 15 minutter ved 4 °c, kassér supernatanten og resuspension af pellet i 15 ml vaske medium.
- Placer et 70 μm-cellefilter oven på et nyt 50 mL-rør, og Overfør 10 mL af vaske mediet over celle sien. Drej vaske mediet for at dække siden af plastik røret for at forhindre, at NETCELLERNE klæber til siden af plastik røret.
- Filtrer cellesuspensionen gennem celle sien.
- Centrifugeres ved 500 x g i 15 minutter ved 4 °c, kassér supernatanten, resuspension af pellet i 200 ΜL vaskemiddel (total volumen er ~ 250 μl) og anbring den på is.
- 5 μL af cellerne overføres til 500 μL vaskemiddel (1/100 fortyndingsfaktor). Brug de fortyndede celler til celletælling ved hjælp af et hemocytometer for at opnå antallet af celler pr. milliliter. Multipliceres med 100 for at korrigere for fortyndingsfaktoren.
- Antallet af celler pr. mL, som er opnået i trin 2,5, ganges med den totale mængde af celler i suspension opnået i trin 2,4 (~ 250 μL).
- Centrifugeres ved 500 x g i 15 minutter ved 4 °c, kassér supernatanten, og resuspender cellerne i flydende ECM (1 x 106 celler/ml), og hold på is.
- Overfør 5-20 μL SBNET-sfæroider i ECM til en 96-brønd plade, og lad væske ECM størkne ved at anbringe pladen i en 37 °C inkubator i 5 min.
- Tilsæt 200 μL SBNET-kulturmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% glutamin + 10 mM nicotinamid + 10 μg/mL insulin) til hver brønd af 96-brønd pladen indeholdende SBNET sfæroider i ECM.
- Alternativt, kultur SBNET organoider i stamcelle medier svarende til hvad der tidligere er beskrevet for dyrkning af enten humane lever eller pancreas organoider9 og opført i tabellen over materialer.
- Skift medier hver 5-7 dage.
3. kvantificering af sbnet-sfæroide-størrelse ved hjælp af ImageJ
- Tag 5-10 billeder af sbnet sfæroider på dag 1, 4, 7, 14, 23 og 97 af kulturen ved hjælp af en 10x mål.
- Åbn gemte billeder i ImageJ. Gå til fanen Analysér , Vælg indstillingen Angiv mål , og Placer en kontrol af indstillingen område .
- Brug det ovale markeringsværktøj fra værktøjslinjen til at generere en ellipsoide eller cirkel omkring et velfokuseret sfæoid.
- Gå til fanen Analysér , og vælg indstillingen mål . Gentag trin 3,4 og 3,5 for at få areal måling fra 25-50 SBNET spheroids. Værdierne findes i pixel Square.
- Konverter pixel området til μm2 ved at dividere størrelsen af hver pixel med længden af hver pixel til μm omregningsfaktor af mikroskopi billeder.
Bemærk: SBNET-celler vokser hovedsageligt som sfæroider og engang som ellipsoids.
4. karakterisering af SBNETS-spheroider ved immunofluorescens
- Overfør de organoider, der dyrkes i ECM, til et 1,5 mL rør ved hjælp af en P1000-pipette.
- Centrifugeres ved 1.500 x g i 1 min., og supernatanten fjernes.
- Organoid-kulturen vaskes ved tilsætning af 1 mL PBS, blandes, centrifugeres ved 1.500 x g i 1 min., og supernatanten fjernes.
- Organoiderne fastsættes ved tilsætning af 500 μL 4% PARAFORMALDEHYD og Inkuber i 15 min.
- Vask kulturen to gange med 1 mL PBS.
- Permeabilize kulturen ved at tilføje 500 μL PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 i 5 min.
- Derefter vaskes tre gange med 1 mL PBS + 3% BSA.
- Inkubér i 1 time med primære antistoffer mod synaptophysin (SYP)10 ved 1/600 fortynding eller kromogranin a (CGA)11 og somatostatin receptor 2 (SSTR2)12 ved 1/400 fortynding i antistof buffer (2,5% bovin serumalbumin, 0,1% natrium 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumklorid).
Bemærk: Brug 300 μL eller mere af antistof opløsningen pr. tube. - Vask tre gange med 1 mL PBS + 3% BSA.
- Inkubatér med sekundære antistoffer koblet til FITC ved 1/500 fortynding i antistof buffer i 1 time. Brug 300 μL eller mere af antistof opløsningen pr. tube.
- Vask 3 gange med 1 mL PBS + 3% BSA. Sørg for at indsugning og kassere alle supernatanten.
- Der tilsættes 5 μL monterings medium indeholdende den nukleare plet DAPI.
- Brug en P20-pipette til at overføre 5 μL af SBNET-sfæroider fra trin 4,12 til et glas skred og tætning med en dækseddel.
- Tag billeder ved hjælp af et fluorescerende mikroskop ved hjælp af 10x, 20x eller 40x mål.
5. sbnet sfæroider karakterisering af immun histokemi (IHC)
- Overfør SBNET sfæroider fra kultur pladen til et 1,5 mL rør ved hjælp af en P1000-pipette.
- Centrifugeres ved 1.500 x g i 1 min., og supernatanten fjernes.
- Fix sbnet sfæroider ved at tilføje 500 μl af 10% formalin til røret fra trin 5,2 og inkubere ved stuetemperatur for 2-5 dage før paraffin indlejring og skære 4 μm tykke sfæoide sektioner.
- Deparaffinize, rehydrere, og bruge varme induceret epitop hentning i antigen hentning løsning ved pH 9 ved opvarmning til 97 °c i 20 min ved hjælp af 3-i-1 automatiseret slide Processing Station til at forberede dias til antistof inkubation.
- Bloker slides og Inkuber med primære antistoffer mod SYP10 ved en 1/100 fortynding i 15 min, CGA11 ved en 1/800 fortynding i 15 min, og SSTR212 ved en 1/5000 fortynding i 30 min.
- Inkubér med det sekundære antistof detekteringssystem i 15 minutter for anti-SYP og CgA-farvning og 30 min for anti-SSTR2 farvning. Tag billeder ved hjælp af en 400x mål.
6. behandling af SBNET-organoider med Rapamycin
- Rapamycin opløses i DMSO for at opnå en 10 mM stamopløsning.
- Forbered SBNET-kulturmediet med DMSO (f. eks. 1 mL SBNET-kulturmedium + 1 μL DMSO) og SBNET-kulturmedium med 10 μM Rapamycin (f. eks. 1 mL SBNET-kulturmedium + 1 μL 10 mM Rapamycin-stamopløsning).
- Overfør 200 μL medier med SBNET-kulturmedium med DMSO eller 10 μM Rapamycin til SBNET sfæooide kulturer.
- Incubate sbnet sfæroider i 5 dage i 37 °c inkubator.
- Tilsæt 1 μM ethidium homodimer og Inkuber i 30 min. Fjern mediet indeholdende ethidium homodimer, vask med 200 μL PBS, og Overfør 200 μL PBS til hver brønd.
- Tag mikroskopi billeder af SBNET sfæroider med og uden narkotikabehandling ved hjælp af den røde filter terning med 10x, 20x, eller 40x mål af et fluorescerende mikroskop.
Bemærk: døde celler, der er plettet med Ethidium homodimer, vises som røde ved hjælp af den røde filter kube G af et kommercielt tilgængeligt mikroskop (tabel over materialer). Alternativt kan signalet optages ved hjælp af et spektrofotometer ved 535 nm excitation og 624 nm emission.
7. opdeling af SBNET sfæroider
Bemærk: Dette gøres for ekspansion og for at dele med andre forskere.
- Brug en P1000-pipette til mekanisk afbrydelse af ECM, og Aspirér ECM med SBNET sfæroider til et sterilt 1,5 mL rør.
- Centrifuge ved 1.000 x g ved 4 °c, Fjern alle supernatanten og Placer røret på is.
- Tilsæt 2-4X mængden af ny ECM til pellet. Bland den nye ECM med de gamle ECM og SBNET sfæroider ved pipettering op og ned 10x. Undgå at indføre luftbobler.
- Overfør 5-20 μl af ECM-og sbnet sfæroider-blandingen til en ny plade, og gør det muligt for ECM at størkne.
- Dæk med nyt SBNET-medium og Overfør til inkubator. Inddrivelsesprocenten er ca. 95 til 100%.
- For at fragtsbnet sfæroider til et andet laboratorium, Overfør SBNET sfæroider med ny ECM til en T25-kolbe og gør det muligt for ECM at størkne.
- Fyld på T25-kolben med SBNET sfædmiddel, Skru hætten stramt på, og Forbered forsendelses pakken.
- Efter at have modtaget en SBNET sfæoidkultur, skal du fjerne kulturmediet og udføre trin 7,1 til 7,5 for at sætte SBNET sfæroider tilbage i kulturen.
8. kryolagring og genopretning af sfærospheroider
- Overfør SBNET sfæroider fra 5-10 små brønde til et 15 mL rør. Centrifuge ved 500 x g i 15 min ved 4 °c, Fjern supernatant, resuspension i fryse middel (90% FBS + 10% DMSO), Opbevar i en celle fryse container, og Placer dette ved-80 °c.
- Overfør til flydende nitrogen for længere opbevaring.
- For at inddrive SBNET sfæroider skal du placere det frosne hætteglas på is og vente, indtil indholdet er helt optøet. Vend røret og genplacer på isen for at fremskynde optøningen.
- Når prøven er optøet, anbringes inde i en præ-kølet centrifuge og spin ved 1.000 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten og resuspender sfæroider i ECM. Hold røret på is, Overfør 20 μL til en ny plade, og vent til ECM at størkne.
- Overfør 200 μL SBNET-kulturmedium med 10 μM ROCK-hæmmer (Y-27632)13 og Overfør til inkubator.
- Tillad sbnet sfæroider at inddrive og vokse i 1 uge. Fjern det gamle dyrkningsmedium, Genfyld med 200 μL SBNET-kulturmedium, og vend tilbage til inkubator.
- Tillad SBNET sfæroider at fortsætte med at vokse.
Bemærk: det tager mindst 1 uge for hurtigt voksende sfæroider at begynde at inddrive efter kryopræservering13. Sbnet sfæroider tage mindst 2-4 uger til at begynde at vokse. Mange SBNET celler vil dø inden for de første 2 uger og overlevelsesraten er mindre end 10%. Da dette er en meget tidskrævende og lav udbytte proces, er det bedre at dele med andre forskere SBNET sfæroider i kultur kolber (som beskrevet i trin 7). Kryoopbevaring og nyttiggørelse bør kun anvendes som en backup-plan i tilfælde af en bakteriel kontaminering opstår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er i øjeblikket kun 2 sbnet cellelinjer etableret og offentliggjort2,3,4,5 og de er ikke umiddelbart tilgængelige for mange forskere. Her foreslår vi at kultur SBNET som sfæroider i ECM og bruge dette som en alternativ model til at studere SBNET stof følsomhed. Patient-afledte tumor fra en sbnet, der stase til leveren blev indsamlet, fordøjet at frigive sbnet celler, og blandet med flydende ECM til etablering af en sbnet sfænoide kultur (figur 1A). Ki-67 af denne SBNET var 4,3%. Selv om SBNET-sfæroider har en langsom vækstrate, kan deres vækst overvåges ved mikroskopisk billeddannelse (figur 1a). Det tager cirka 14 dage for sbnet sfæroider at fordoble i størrelse, når kulturen medierne ændres en gang om ugen (figur 1B). Efter 14 dage i kulturen stiger sbnet sfæroider ikke i størrelse. I stedet vil nogle SBNET-celler adskille sig til en nærliggende placering og danne nye sfæroider. At udbrede sbnet sfæroider kultur, høst ECM indeholder sbnet sfæroider og seedingen dem i ny kultur plade med nye kulturmedium (trin 7).
For at bekræfte, at organoide kulturer indeholder SBNET-celler, beskriver vi en enkel og hurtig metode til at plette sfæroider for SBNET-markører som synaptophysin, chromogranin A a og somatostatin-receptor type 2 (SSTR2) ved hjælp af immunofluorescens (IF) mikroskopi ( Trin 4). Brug af antistoffer specifikt mod synaptophysin, chromogranin A A og SSTR2, vores hvis data viste, at disse markører er lokaliseret i cytoplasmaet og påmembranenaf sbnet celler (figur 2A, i grøn) efter 1 eller 9 måneder i kultur (Figuren 2b ). For at sikre specificiteten af SYP-, CGA-og SSTR2-antistoffer udførte vi de samme farvnings procedurer på en organoid-linje fra bugspytkirtlen tumor, der ikke udtrykker SYP, CGA eller SSTR2 (figur 2C), da der ikke blev fundet noget grønt signal. Den største fordel ved denne sbnet sfæroide hvis eksperiment er, at det kan udføres inden for 4 h og giver lignende farvning oplysninger som immun histochemistry (IHC; Figur 3). Vi leverer en protokol til udførelse af IHC af sbnet sfæroider i trin 5.
Culturing SBNET som sfæroider er en værdifuld teknik til at identificere lægemidler, der kan hæmme SBNET vækst. Som et bevis på princippet behandlede vi sbnet sfæroider med Rapamycin i 5 dage, en MTOR-hæmmer, en klasse af lægemidler, der almindeligvis anvendes til behandling af NETs8. Sammenlignet med vores Control sbnet sfæroide dannede den Rapamycin-behandlede sfæroide en drue lignende struktur og blev apoptotisk eller nekrotisk (figur 4a-D). Døende celler kan detekteres ved hjælp af Ethidium homodimer til pletter DNA og RNA og generere en lys rødt signal14. Dette farvestof kan ikke trænge ind i cellemembranen af levende celler.
Figur 1: patient-afledte små tarm Neuroendokrine tumorer (sbnets) dyrket i ekstracellulær matrix (ECM) som sfæroider. a) isolering af TUMORCELLER fra en redesignet sbnet og sat i kultur ved at blande med ECM. Skalalinjen repræsenterer 100 μm.B) overfladearealet af sbnet-sfæroider med hensyn til antallet af Kulturdage, som er kvantificeret ved hjælp af ImageJ. Data blev indhentet fra SBNET sfæroider på 1 patient og er repræsenteret som middelarealet ± standardfejl af middelværdien. Overfladearealet på 30 til 60 sfæroider blev målt for hvert tidspunkt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: immunofluorescens (IF) farvning af sbnet sfæroider. Hvis der farvning af SBNET sfæroider efter (A) 1 måned i kultur og (B) 9 måneder i kulturen. (C) Hvis farvning af bugspytkirtlen tumor organoider, der ikke udtrykker sbnet markører som negative kontroller. Tumor sfæroider blev fikseret i 4% PARAFORMALDEHYD og farves med antistoffer mod synaptophysin (SYP) ved 1/600 fortynding, kromogranin A (CgA) ved 1/400 fortynding og somatostatin receptor 2 (SSTR2) ved 1/400. Hvis billeder blev taget på 100 MS, 200 MS og 400 MS eksponeringstid for SYP, CgA og SSTR2 farvning, henholdsvis ved hjælp af 10x, 20x eller 40x mål. Skalalinjen repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: immun histokemi (IHC) farvning af sbnet sfæroider. Formalin-faste og paraffin-indlejrede sbnet sfæroider sektioner blev afparaffineret, rehydrerede, blokeret og plettet med (A) SYP, (B) CGA, og (C) SSTR2 antistoffer. Billeder blev taget ved hjælp af 400x mål. Skalalinjen repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: brug af sbnet sfæroider til dopingtest. a) lyse feltbilleder af sbnet-SFÆROIDER behandlet med DMSO i 5 dage. (B) billede af sbnet sfæroider behandlet med DMSO og farvet med ethidium homodimer (Ethidium H). (C) lyse felt billede af en død sbnet sfæroide danner drue lignende struktur efter behandling med 10 μM Rapamycin i 5 dage. (D) dødt sbnet sfæroide farvet med ethidium H vises som røde prikker. Billeder af Ethidium H farvning blev taget ved hjælp af den røde filter terning på 100 MS eksponeringstid. Skalalinjen repræsenterer 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Vækstmedier eller opløsning | Sammensætning |
| Vask medium | DMEM indeholdende 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% glutamin |
| SBNET-kulturmedium | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% glutamin + 10 mM nicotinamid + 10 μg/mL insulin |
| Antistof buffer | 2,5% bovint serumalbumin, 0,1% natriumazid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumchlorid |
| Fryse medium | 90% FBS + 10% DMSO |
| Humant lever stamcelle isolation medium | DMEM/F12, 1% pen/STREP, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 supplement, 1/100 N2 supplement, 1 mM N-acetylcystein, 200 ng/mL RSPO 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamid, 10 uM forskolin, 5uM A83-01 |
| Human bugspytkirtel stamcelle isolation medium | DMEM/F12, 1% pen/STREP, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 supplement, 1/100 N2 supplement, 1 mM N-acetylcystein, 200 ng/mL RSPO 1, 25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamid, 10 uM forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
Tabel 1. Liste overvækst medier og løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor 3D kulturer er blevet en værdifuld ressource for prækliniske dopingtest15. Forskellige tumor organoid biobanker er for nylig blevet etableret fra brystkræft og prostatakræft tumorer16,17. I denne undersøgelse, vi giver en detaljeret protokol til kultur SBNET som sfæroider og en enkel og hurtig metode til at validere de sfæide kulturer for netto markører ved immunofluorescens og teststof følsomhed. Fra vores erfaring kan sbnet sfæroider vokse i forskellige kultur medier. De vokser lidt hurtigere i stamcelle medier til menneskelig bugspytkirtel eller lever isolation, som vi har tilpasset fra tidligere udgivne protokoller9. Vi valgte at dyrke SBNETs i DMEM/F12-medium suppleret med insulin og nicotinamid, fordi dette er billigere end stamcelle medier. Forøgelse af andelen af føtal kvægserum er en anden strategi for at fremme væksten af SBNET organoid kulturer; Dette ville imidlertid også øge de samlede omkostninger for kultur vedligeholdelse.
Udførelse, hvis farvning og billeddannelse med en fluorescerende mikroskopi ved hjælp af 10x, 20x eller 40x mål er en hurtig og enkel metode til at teste for udtrykket SBNET markører. Den giver dog ikke en veldefineret lokalisering i forhold til IHC (figur 2, figur 3). For eksempel, hvis data viste, at membranen lokalisering af SSTR2 er vanskeligt at opdage. Vi detekterer primært cytosolisk SSTR2, som tidligere er blevet rapporteret18. For at opnå en bedre lokalisering af markør proteinerne anbefaler vi, at du bruger mikroskopi af IF og confokal. Samlet set, hvis er en nyttig metode til hurtigt at bekræfte SBNET markører. Vores antistoffer (anti-SYP, anti-CGA, anti-SSTR2) krydsreagerer ikke med de negative kontrol organoider, der ikke udtrykker SYP, CGA eller SSTR2 (figur 2C) i IF-eksperimentet. Dette forslag om, at de fluorescerende signaler, som vi opdagede, er specifikke for SBNET spheroids.
For at øge udbyttet af SBNET spheroids, de kritiske trin i denne protokol er under cellefiltrering trin (trin 2,2) og blande SBNET med væsken ECM for at citere i vævskultur plader (trin 2,8). Sørg for at dække cellen si membranen og opsamlingsrøret med medier for at forhindre, at sbnet-cellerne klæber til plastikken. Flydende ECM vil hurtigt størkne, hvis ikke placeret på is. Sørg for at have en lille is container i vævet kultur hætte for at holde ECM og SBNET celler kold.
Begrænsningen af denne teknik er den langsomme vækstrate af SBNET sfæroider. Eksperimenter skal planlægges effektivt og undgå at bruge en overskydende mængde SBNET sfæroider. En anden begrænsning er den langsomme genopretning efter fryse tø. Det tager over 1 måned efter optøning for SBNET sfæroider at begynde at vokse. For at overvinde denne begrænsning foreslår vi løbende at vedligeholde SBNET sfæroider i kulturer og opdele dem efter behov (trin 7). Selv efter 9 måneders kultur bevarer SBNET sfæroider stadig udtryk for SBNET-markører (figur 2B).
Selv om 3D kultur SBNET sfæroider er mere arbejdskraftintensiv end traditionel 2D kultur af andre kræft cellelinjer, det er en yderst værdifuld model for in vitro-kultur af SBNET fordi mange SBNET forskere ikke har adgang til de eksisterende cellelinjer. Med denne protokol, videnskabsfolk og klinikere kan etablere sbnet sfæroide kulturer fra resekterede tumorer og dele dem med andre laboratorier. Desuden kunne SBNET-sfæroider potentielt anvendes til at etablere SBNET-patient afledte xenograft-musemodeller. Samlet set kan de teknikker, der præsenteres her, tilpasses til dyrkning, karakterisering og udførelse af narkotika testning af andre net, såsom pankreatiske eller lunge garn. Bemærk, at vækstraten for organoider vil variere mellem de forskellige typer af net og patientprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH Grants P50 CA174521 (til J.R. Howe og A.M. Bellizzi). P.H. ear er modtager af P50 CA174521 Career Enhancement program Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
