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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

Published: October 14, 2019 doi: 10.3791/60303
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Surgery, University of Iowa Carver College of Medicine, 2High Throughput Screening Facility, University of Iowa Carver College of Medicine, 3Department of Pathology, University of Iowa Carver College of Medicine

Summary

Les tumeurs neuroendocrines (NET) proviennent des cellules neuroendocrines de la crête neurale. Ils sont à croissance lente et difficiles à la culture. Nous présentons une stratégie alternative pour cultiver des NETs des petites entrailles en les cultivant en tant que sphéroïdes. Ces sphéroïdes ont de petits marqueurs NET intestin et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues.

Abstract

Les tumeurs neuroendocrines de petite entrailles (SBNETs) sont des cancers rares provenant des cellules d'entéroochromaffin de l'intestin. La recherche dans ce domaine a été limitée parce que très peu de lignées cellulaires SBNET dérivées de patients ont été générées. Les cellules SBNET bien différenciées se développent lentement et sont difficiles à propager. Les quelques lignées cellulaires qui ont été établies ne sont pas facilement disponibles, et après le temps dans la culture peut ne pas continuer à exprimer des caractéristiques des cellules NET. La génération de nouvelles lignées cellulaires pourrait prendre de nombreuses années puisque les cellules SBNET ont un long temps de doublement et de nombreuses étapes d'enrichissement sont nécessaires afin d'éliminer les fibroblastes rapidement associés au cancer. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un protocole à la culture des cellules de SBNET des tumeurs chirurgicalement enlevées comme sphéroïdes dans la matrice extracellulaire (ECM). L'ECM forme une matrice tridimensionnelle qui encapsule les cellules SBNET et imite le micro-environnement tumoral pour permettre aux cellules SBNET de se développer. Ici, nous avons caractérisé le taux de croissance des sphéroïdes de SBNET et décrit des méthodes pour identifier des marqueurs de SBNET utilisant la microscopie et l'immunohistochimie d'immunofluorescence pour confirmer que les sphéroïdes sont des cellules neuroendocrines de tumeur. En outre, nous avons utilisé des sphéroïdes SBNET pour tester la cytotoxicité de la rapamycine.

Introduction

Les petites tumeurs neuroendocrines d'entrailles (SBNETs) proviennent des cellules d'entérosochromaffin du petit intestin. Bien que les SBNETs soient généralement connus pour se développer lentement, ils métastasent généralement au foie1. Tandis que le déplacement chirurgical ou l'ablation de tumeur peut être considéré dans beaucoup de cas, la répétition est presque universelle, et, par conséquent, la thérapie médicale joue un rôle important dans la gestion. D'énormes efforts ont été investis pour générer de nouvelles lignées cellulaires SBNET pour le dépistage des drogues. Cependant, il y a eu très peu de succès. Seules 6 lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) ont été signalées2,3,4,5; et malheureusement, une lignée cellulaire n'exprime plus de marqueurs NET6 et trois autres lignées cellulaires SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) ont été déterminées à provenir de lymphoblastes transformés au lieu de NETs7. Afin d'accélérer l'identification des médicaments pour cibler les SBNET, d'autres méthodes de dépistage in vitro des drogues sont nécessaires.

Ici, nous profitons de la disponibilité des SBNETs réséqués et avons établi un moyen de cultiver ces SBNETs dérivés du patient comme des sphéroïdes de plus en plus en ECM. L'objectif global de ce manuscrit est de décrire une méthode de culture SBNET comme une culture tridimensionnelle (3D) et des procédures de contour pour caractériser ces sphéroïdes pour la rétention des marqueurs SBNET par la coloration immunofluorescence et l'immunohistochimie.

En outre, nous démontrons comment ces sphéroïdes SBNET peuvent être utilisés pour tester l'effet de la rapamycine, un médicament anticancéreux pour lesNET8. La raison d'être de ce protocole est de développer une nouvelle méthode pour cultiver les cellules SBNET in vitro et de les utiliser pour le dépistage des drogues. L'avantage de cette technique par rapport à la méthode traditionnelle d'établissement d'une lignée cellulaire SBNET est que les cultures 3D des SBNETs peuvent être rapidement obtenues et que des tests de dépistage de drogues peuvent être effectués dans les 3 semaines. Les sphéroïdes SBNET pourraient potentiellement être utilisés comme modèle pour effectuer des écrans de médicaments in vitro afin d'identifier de nouveaux médicaments pour les patients atteints de SBNET. Étant donné que les lignées cellulaires SBNET ne sont pas largement disponibles, les cultures 3D des sphéroïdes SBNET peuvent servir de nouveau modèle in vitro pour l'étude des SBNETs et peuvent être partagées entre les scientifiques dans le domaine.

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Protocol

Toutes les expériences utilisant des échantillons neuroendocrines humains de tumeur ont été approuvées par le comité d'hôpital et de cliniques d'université de l'Iowa (numéro de protocole 199911057). Une liste de tous les matériaux et équipements est décrite dans le Tableau des matériaux. Une liste des médias de croissance et des solutions clés se trouve dans le tableau 1.

1. La collecte de la tumeur neuroendocrine des petites entrailles (SBNET) et la dissociation cellulaire

  1. Obtenir des échantillons sOFET de patient réséqués après confirmation de tissus de tumeur du noyau chirurgical de pathologie.
  2. Couper les SBNET en cubes de 5 mm et les conserver dans 25 ml de milieu DMEM/F12 dans un tube conique pour le transport jusqu'au laboratoire.
  3. Transférer les tumeurs dans DMEM contenant 1% FBS, 1% pénicilline/streptomycine (Pen/Strep), 1% glutamine (Wash Medium) et incuber dans ce moyen de lavage pendant 15 min.
  4. Transférer les tumeurs dans un nouveau plat et hacher les tumeurs à moins de 1 mm à l'aide de ciseaux incurvés stériles.
  5. Transférer les tissus hachés dans un nouveau tube de 50 ml contenant 25 ml de lave-vaisselle.
  6. Centrifuger l'échantillon à 500 x g pendant 15 min à 4 oC.
  7. Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 10 ml de lave-vaisselle contenant de la collagène (100 U/mL) et du DNase (0,1 mg/ml).
  8. Permettre à la digestion des tumeurs hachées de se produire dans un incubateur de 37 oC avec des secousses lentes (50 tr/min) pendant 1,5 h.

2. Culture des SBNETs comme sphéroïdes de tumeur dans L'ECM

  1. Une fois la digestion terminée (étape 1,8), centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez la pastille dans 15 ml de lavave moyenne.
  2. Placer une passoire cellulaire de 70 m sur un nouveau tube de 50 ml et transférer 10 ml du milieu de lavage au-dessus de la passoire cellulaire. Faites tourbillonner le moyen de lavage pour couvrir le côté du tube en plastique pour empêcher les cellules NET de coller sur le côté du tube en plastique.
  3. Filtrer la suspension cellulaire par la passoire cellulaire.
  4. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant, suspendez la pastille dans 200 l de Lave-Feu (volume total est de 250 l) et placez-la sur la glace.
  5. Transférer 5 l l de cellules à 500 oL de facteur de lavage moyen (1/100 facteur de dilution). Utilisez les cellules diluées pour le comptage cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre pour obtenir le nombre de cellules par millilitre. Multipliez par 100 pour corriger le facteur de dilution.
  6. Multipliez le nombre de cellules par mL obtenue à l'étape 2.5 par le volume total de cellules en suspension obtenue à l'étape 2.4 (250 l).
  7. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez les cellules en ECM liquide (1 x 106 cellules/mL) et conservez-les sur la glace.
  8. Transférer 5 à 20 l de sphéroïdes SBNET dans l'ECM dans une plaque de 96 puits et permettre à l'ECM liquide de se solidifier en plaçant la plaque dans un incubateur de 37 oC pendant 5 min.
  9. Ajouter 200 l de milieu de culture SBNET (DMEM/F12 - 10% FBS - 1% PEN/STREP - 1% glutamine - 10 mM de nicotinamide et 10 'g/mL d'insuline) à chaque puits de la plaque de 96 puits contenant les sphéroïdes SBNET en ECM.
  10. Alternativement, la culture sBNET organoïdes dans les médias de cellules souches semblables à ce qui a été précédemment décrit pour la croissance du foie humain ou des organoïdes pancréatiques9 et énumérés dans le tableau des matériaux.
  11. Changez de média tous les 5-7 jours.

3. Quantification de la taille sphéroïde SBNET à l'aide d'ImageJ

  1. Prenez 5-10 photos de sphéroïdes SBNET au jour 1, 4, 7, 14, 23 et 97 de la culture en utilisant un objectif 10x.
  2. Ouvrez les images enregistrées dans ImageJ. Passez à l'onglet Analyse, sélectionnez l'option Mesures de définir et vérifiez l'option Zone.
  3. Utilisez l'outil de sélection ovale de la barre d'outils pour générer un ellipsoïde ou un cercle autour d'un sphéroïde bien ciblé.
  4. Passez à l'onglet Analyse et sélectionnez l'option Mesure. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 afin d'obtenir la mesure de zone de 25-50 sphéroïdes SBNET. Les valeurs sont fournies en pixel carré.
  5. Convertissez la zone de pixels en 'm2 en divisant la taille de chaque pixel avec la longueur de chaque pixel en facteur de conversion 'm des images de microscopie.
    REMARQUE : Les cellules SBNET se développent principalement sous forme de sphéroïdes et parfois d'ellipsoïdes.

4. Caractérisation des sphéroïdes SBNETS par immunofluorescence

  1. Transférer les organoïdes cultivés en ECM dans un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P1000.
  2. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
  3. Laver la culture organoïde en ajoutant 1 ml de PBS, mélanger, centrifugeuse à 1500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
  4. Fixer les organoïdes en ajoutant 500 L de 4% de paraformaldéhyde et incuber pendant 15 min.
  5. Laver la culture deux fois avec 1 ml de PBS.
  6. Perméabilisez la culture en ajoutant 500 L de PBS - 3% BSA - 0,1% Triton X 100 pour 5 min.
  7. Ensuite, laver trois fois avec 1 ml de PBS - 3% BSA.
  8. Incuber pendant 1 h avec des anticorps primaires contre la synaptophyse (SYP)10 à 1/600 dilution ou chromogranine A (CgA)11 et le récepteur de la somatostatine 2 (SSTR2)12 à 1/400 dilution dans la mémoire tampon d'anticorps (2,5% d'albumine de sérum bovin, 0,1% de sodium azide, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM de chlorure de sodium).
    REMARQUE : Utilisez 300 L ou plus de solution d'anticorps par tube.
  9. Laver trois fois avec 1 ml de PBS et 3% de BSA.
  10. Incuber avec des anticorps secondaires couplés à FITC à 1/500 dilution dans le tampon d'anticorps pendant 1 h. Utilisez 300 L ou plus de solution d'anticorps par tube.
  11. Laver 3 fois avec 1 ml de PBS et 3% de BSA. Assurez-vous d'aspirer et de jeter tous les supernatants.
  12. Ajouter 5 ll de support de montage contenant la tache nucléaire DAPI.
  13. Utilisez une pipette P20 pour transférer 5 l des sphéroïdes SBNET de l'étape 4.12 à une lame de verre et sceller avec un bordereau de couverture.
  14. Prenez des images à l'aide d'un microscope fluorescent à l'aide des objectifs 10x, 20x ou 40x.

5. SBNET sphéroïdes caractérisation par immunohistochimie (IHC)

  1. Transférer les sphéroïdes SBNET de la plaque de culture à un tube de 1,5 ml à l'aide d'une pipette P1000.
  2. Centrifugeuse à 1 500 x g pendant 1 min et retirer le supernatant.
  3. Fixez les sphéroïdes SBNET en ajoutant 500 l de formaline de 10 % au tube à partir de l'étape 5.2 et incubez à température ambiante pendant 2-5 jours avant l'embedding de paraffine et coupez les sections sphéroïdes de 4 m d'épaisseur.
  4. Déparaffiniser, réhydrater et utiliser la récupération d'épitope induite par la chaleur dans la solution de récupération d'antigène au pH 9 en chauffant à 97 oC pendant 20 min à l'aide de la station automatisée de traitement des diapositives 3-en-1 pour préparer des diapositives pour l'incubation des anticorps.
  5. Bloquer les diapositives et incuber avec des anticorps primaires contre SYP10 à une dilution 1/100 pendant 15 min, CgA11 à une dilution 1/800 pendant 15 min, et SSTR212 à une dilution de 1/5 000 pour 30 min.
  6. Incuber avec le système secondaire de détection d'anticorps pendant 15 min pour la coloration anti-SYP et CgA et 30 min pour la coloration anti-SSTR2. Prenez des photos à l'aide d'un objectif 400x.

6. Traitement des organoïdes SBNET avec de la rapamycine

  1. Dissoudre la rapamycine dans DMSO pour obtenir une solution de stock de 10 mM.
  2. Préparer le milieu de culture SBNET avec DMSO (p. ex., 1 mL de milieu de culture SBNET et 1 euro de DMSO) et le milieu de culture SBNET avec 10 M de rapamycine (p. ex., 1 mL de milieu de culture SBNET - 1 l de 10 mM de solution de rapamycine).
  3. Transférer 200 médias L avec le milieu de culture SBNET avec DMSO ou 10 M rapamycine aux cultures sphéroïdes SBNET.
  4. Incuber les sphéroïdes SBNET pendant 5 jours dans un incubateur de 37 oC.
  5. Ajouter 1 m d'éthidium homodimère et incuber pendant 30 min. Retirez le milieu contenant de l'homodimère d'éthidium, lavez-le avec 200 L de PBS et transférez 200 L de PBS à chaque puits.
  6. Prenez des images de microscopie de sphéroïdes SBNET avec et sans traitement médicamenteux à l'aide du cube de filtre rouge avec les objectifs 10x, 20x ou 40x d'un microscope fluorescent.
    REMARQUE : Les cellules mortes tachées d'ethidium homodimer apparaissent en rouge à l'aide du cube de filtre rouge G d'un microscope disponible dans le commerce (Tableau des matériaux). Alternativement, le signal peut être capturé à l'aide d'un spectrophotomètre à 535 nm d'excitation et 624 nm d'émission.

7. Fractionnement des sphéroïdes SBNET

REMARQUE : Ceci est fait pour l'expansion et pour le partage avec d'autres chercheurs.

  1. Utilisez une pipette P1000 pour briser mécaniquement l'ECM et aspirer l'ECM avec des sphéroïdes SBNET à un tube stérile de 1,5 ml.
  2. Centrifugeuse à 1 000 x g à 4 oC, retirez tout le supernatant et placez le tube sur la glace.
  3. Ajouter 2-4x le volume de nouveau ECM à la pastille. Mélangez le nouvel ECM avec les anciens sphéroïdes ECM et SBNET en faisant monter et descendre 10 fois. Éviter d'introduire des bulles d'air.
  4. Transférer 5 à 20 L du mélange de sphéroïdes ECM et SBNET dans une nouvelle assiette et permettre à l'ECM de se solidifier.
  5. Couvrir avec le nouveau support SBNET et le transférer à l'incubateur. Le taux de récupération est d'environ 95 à 100%.
  6. Pour l'expédition des sphéroïdes SBNET dans un autre laboratoire, transférez les sphéroïdes SBNET avec un nouveau ECM dans un flacon T25 et permettez à ECM de se solidifier.
  7. Remplissez le flacon T25 avec le milieu sphéroïde SBNET, vissez fermement le bouchon et préparez le paquet d'expédition.
  8. En recevant une culture sphéroïde SBNET, retirez le milieu de culture et effectuez l'étape 7.1 à 7.5 pour remettre les sphéroïdes SBNET dans la culture.

8. Cryostorage et récupération des sphéroïdes SBNET

  1. Transférer les sphéroïdes SBNET de 5 à 10 petits puits à un tube de 15 ml. Centrifugeuse à 500 x g pendant 15 min à 4 oC, retirer le supernatant, le suspendre dans un milieu de congélation (90 % FBS et 10 % DMSO), le conserver dans un contenant de congélation cellulaire et le placer à -80 oC.
  2. Transférer dans l'azote liquide pour un stockage plus long.
  3. Pour récupérer les sphéroïdes SBNET, placez le flacon congelé sur la glace et attendez que le contenu soit complètement décongelé. Inverser le tube et le re-placer sur la glace afin d'accélérer le processus de décongélation.
  4. Une fois l'échantillon décongelé, placé à l'intérieur d'une centrifugeuse préréfrigérée et tourner à 1 000 x g pendant 10 min.
  5. Retirez le supernatant et suspendez les sphéroïdes dans ECM. Gardez le tube sur la glace, transférez 20 l dans une nouvelle plaque et attendez que l'ECM se solidifie.
  6. Transférer 200 l de milieu de culture SBNET avec 10 M d'inhibiteur ROCK (Y-27632)13 et transférer à l'incubateur.
  7. Permettre aux sphéroïdes SBNET de récupérer et de croître pendant 1 semaine. Retirez l'ancien milieu de culture, réapprovisionnez-vous avec 200 l de milieu de culture SBNET et retournez à l'incubateur.
  8. Permettre aux sphéroïdes SBNET de continuer à croître.
    REMARQUE: Il faut au moins 1 semaine pour les sphéroïdes à croissance rapide pour commencer à récupérer après cryoconservation13. Les sphéroïdes SBNET prennent au moins 2-4 semaines pour commencer à croître. De nombreuses cellules SBNET mourront dans les 2 premières semaines et le taux de survie est inférieur à 10%. Comme il s'agit d'un processus très long et à faible rendement, il est préférable de partager avec d'autres chercheurs SBNET sphéroïdes dans les flacons de culture (comme décrit à l'étape 7). Le cryostockage et la récupération ne doivent être utilisés qu'en tant que plan de sauvegarde en cas de contamination bactérienne.

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Representative Results

Il n'y a actuellement que 2 lignées cellulaires SBNET établies et publiées2,3,4,5 et elles ne sont pas facilement disponibles pour de nombreux chercheurs. Ici, nous proposons à la culture SBNET comme sphéroïdes dans eCM et l'utiliser comme un modèle alternatif pour étudier la sensibilité des médicaments SBNET. La tumeur patient-dérivée d'un SBNET qui a métastasé au foie a été rassemblée, digérée pour libérer des cellules de SBNET, et mélangée avec l'ECM liquide pour établir une culture sphéroïde de SBNET (figure 1A). Le Ki-67 de ce SBNET était de 4,3 %. Bien que les sphéroïdes SBNET aient un taux de croissance lent, leur croissance peut être surveillée par imagerie microscopique (figure 1A). Il faut environ 14 jours pour que les sphéroïdes SBNET doublent de taille lorsque les médias culturels changent une fois par semaine (figure 1B). Après 14 jours de culture, les sphéroïdes SBNET n'augmentent pas en taille. Au lieu de cela, certaines cellules SBNET se dissocieront à un endroit voisin et formeront de nouveaux sphéroïdes. Pour propager la culture des sphéroïdes SBNET, récoltez l'ECM contenant des sphéroïdes SBNET et les réensemencer dans une nouvelle plaque de culture avec un nouveau milieu de culture (étape 7).

Pour confirmer que les cultures organoïdes contiennent des cellules SBNET, nous décrivons une méthode simple et rapide pour tacher les sphéroïdes pour les marqueurs SBNET tels que la synaptophyse, la chromogranine A, et le récepteur de la somatostatine de type 2 (SSTR2) à l'aide de la microscopie d'immunofluorescence (IF) ( Étape 4). En utilisant des anticorps spécifiques contre la synaptophysine, la chromogranine A et le SSTR2, nos données IF ont montré que ces marqueurs sont localisés dans le cytoplasme et à la membrane des cellules SBNET(figure 2A, en vert) après 1 ou 9 mois de culture (Figure 2B ). Pour assurer la spécificité des anticorps SYP, CgA et SSTR2, nous avons effectué les mêmes procédures de coloration sur une lignée organoïde de tumeur du pancréas qui n'exprime pas SYP, CgA ou SSTR2 (figure 2C) car aucun signal vert n'a été détecté. Le principal avantage de cette expérience sphéroïde SBNET IF est qu'il peut être effectué dans un délai de 4 h et donne des informations de coloration similaires à l'immunohistochimie (IHC; Figure 3). Nous fournissons un protocole pour l'exécution des sphéroïdes SBNET à l'étape 5.

Culturing SBNET comme sphéroïdes est une technique précieuse pour identifier les médicaments qui peuvent inhiber la croissance SBNET. Comme preuve de principe, nous avons traité les sphéroïdes SBNET avec de la rapamycine pendant 5 jours, un inhibiteur mTOR, une classe de médicaments couramment utilisés pour traiter les NET8. Par rapport à notre sphéroïde SBNET de contrôle, le sphéroïde traité à la rapamycine a formé une structure ressemblant à un raisin et est devenu apoptotique ou nécrotique(figure 4A-D). Les cellules mourantes peuvent être détectées à l'aide d'Ethidium homodimer pour tainer l'ADN et l'ARN et générer un signal rouge vif14. Ce colorant ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire des cellules vivantes.

Figure 1
Figure 1: Tumeurs neuroendocrines de l'intestin grêle dérivées du patient (SBNETs) cultivées en matrice extracellulaire (ECM) comme sphéroïdes. (A) Isolement des cellules tumorales d'un SBNET réséqué et mis en culture en mélangeant avec l'ECM. La barre d'échelle représente 100 m. (B) Surface de sphéroïdes SBNET par rapport au nombre de jours de culture quantifiés à l'aide d'ImageJ. Les données ont été obtenues à partir de sphéroïdes SBNET d'un patient et sont représentées comme la zone moyenne - erreur standard de la moyenne. La surface de 30 à 60 sphéroïdes a été mesurée pour chaque point de temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Coloration immunofluorescence (IF) des sphéroïdes SBNET. FI coloration des sphéroïdes SBNET après (A) 1 mois dans la culture et (B) 9 mois dans la culture. (C) FI coloration des organoïdes tumoraux du pancréas qui n'expriment pas les marqueurs SBNET comme contrôles négatifs. Les sphéroïdes tumoraux ont été fixés dans 4% de paraformaldéhyde et tachés à l'aide d'anticorps contre la synaptophysine (SYP) à 1/600 dilution, chromogranin A (CgA) à 1/400 dilution, et le récepteur de somatostatine 2 (SSTR2) à 1/400. Des images SI ont été prises à 100 ms, 200 ms et 400 ms de temps d'exposition pour les taches SYP, CgA et SSTR2, respectivement en utilisant les objectifs 10x, 20x ou 40x. La barre d'échelle représente 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: La coloration immunohistochemistry (IHC) des sphéroïdes SBNET. Les sections sphéroïdes SBNET fixées à la formaline et à la paraffine ont été déparaffinisées, réhydratées, bloquées et tachées d'anticorps (A) SYP, (B) CgA et (C) SSTR2. Des images ont été prises en utilisant l'objectif 400x. La barre d'échelle représente 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Utilisation dessphéroïdes SBNET pour le dépistage des drogues. (A) Image de champ lumineuse des sphéroïdes SBNET traités avec dMSO pendant 5 jours. (B) Image de sphéroïdes SBNET traités avec DMSO et tachés d'ethidium homodimère (Ethidium H). (C) Image de champ lumineuse d'un sphéroïde SBNET mort formant la structure de raisin-comme après traitement avec 10 M de rapamycine pendant 5 jours. (D) Sphéroïde SBNET mort taché d'Ethidium H apparaît comme des points rouges. Des images de la coloration Ethidium H ont été prises à l'aide du cube de filtre rouge à 100 ms de temps d'exposition. La barre d'échelle représente 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Médias de croissance ou solution rédaction
Laver moyen DMEM contenant 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% Glutamine
Milieu de culture SBNET DMEM/F12 - 10% FBS - 1% PEN/STREP - 1% Glutamine - 10 mM nicotinamide - 10 g/mL d'insuline
Tampon d'anticorps 2,5 % d'albumine de sérum bovin, 0,1 % d'azide de sodium, 25 mM de pH Tris 7,4, 150 mm de chlorure de sodium
Milieu de congélation 90% FBS - 10% DMSO
Milieu d'isolement des cellules souches du foie humain DMEM/F12 , 1% Pen/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Supplément, 1/100 N2 Supplément, 1 mM N-acetylcystéin, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamide, 10 uM forskolin, 5uM A83-01
Milieu d'isolement pancréatique humain de cellules souches DMEM/F12 , 1% Pen/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Supplément, 1/100 N2 Supplément, 1 mM N-acetylcysteine, 200 ng/mL Rspo 1, 25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamide, 10 uM forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2

Tableau 1. Liste des médias de croissance et de la solution.

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Discussion

Les cultures 3D tumorales sont devenues une ressource précieuse pour les tests précliniques15. Diverses biobanques organoïdes tumorales ont récemment été établies à partir du cancer du sein et des tumeurs du cancer de la prostate16,17. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé à la culture SBNET comme sphéroïdes et une méthode simple et rapide pour valider les cultures sphéroïdes pour les marqueurs NET par immunofluorescence et sensibilité aux médicaments d'essai. D'après notre expérience, les sphéroïdes SBNET peuvent se développer dans divers médias culturels. Ils se développent légèrement plus rapidement dans les médias de cellules souches pour le pancréas humain ou l'isolement du foie que nous avons adapté à partir de protocoles précédemment publiés9. Nous avons choisi de cultiver les SBNETs en DMEM/F12 moyen complété avec de l'insuline et du nicotinamide parce que c'est moins cher que les milieuis de cellules souches. L'augmentation du pourcentage de sérum bovin fœtal est une autre stratégie visant à favoriser la croissance des cultures organoïdes SBNET; toutefois, cela augmenterait également le coût global de l'entretien de la culture.

Effectuer la coloration et l'imagerie DE L'IF à l'aide d'une microscopie fluorescente à l'aide des objectifs 10x, 20x ou 40x est une méthode simple et rapide pour tester l'expression des marqueurs SBNET. Toutefois, il ne donne pas une localisation bien définie par rapport au CSI (Figure 2, Figure 3). Par exemple, les données de la FI ont montré que la localisation des membranes de SSTR2 est difficile à détecter. Nous détectons principalement le SSTR2 cytosolique, qui a déjà été rapporté18. Afin d'obtenir une meilleure localisation des protéines marqueurs, nous vous recommandons d'utiliser la microscopie FI et confocale. Dans l'ensemble, la FI est une méthode utile pour confirmer rapidement les marqueurs SBNET. Nos anticorps (anti-SYP, anti-CgA, anti-SSTR2) n'ont pas réagi de façon croisée avec les organoïdes témoins négatifs qui n'expriment pas sYP, CgA ou SSTR2 (figure 2C) dans l'expérience IF. Cette suggestion que les signaux fluorescents que nous avons détectés sont spécifiques aux sphéroïdes SBNET.

Pour augmenter le rendement des sphéroïdes SBNET, les étapes critiques de ce protocole sont pendant l'étape de filtration cellulaire (étape 2.2) et le mélange du SBNET avec l'ECM liquide pour l'aliquoting dans les plaques de culture tissulaire (étape 2.8). Assurez-vous de couvrir la membrane de la passoire cellulaire et le tube de collecte avec des supports afin d'empêcher les cellules SBNET de coller au plastique. L'ECM liquide se solidifiera rapidement s'il n'est pas placé sur la glace. Assurez-vous d'avoir un petit contenant de glace dans le capuchon de culture tissulaire afin de garder les cellules ECM et SBNET froides.

La limitation de cette technique est le taux de croissance lent des sphéroïdes SBNET. Les expériences doivent être planifiées efficacement et éviter d'utiliser une quantité excessive de sphéroïdes SBNET. Une autre limitation est la récupération lente après le dégel. Il faut plus d'un mois après le dégel pour que les sphéroïdes SBNET commencent à pousser. Pour surmonter cette limitation, nous suggérons de maintenir continuellement les sphéroïdes SBNET dans les cultures et de les diviser au besoin (étape 7). Même après 9 mois de culture, les sphéroïdes SBNET maintiennent toujours l'expression des marqueurs SBNET (figure 2B).

Bien que la culture 3D des sphéroïdes SBNET soit plus laborieuse que la culture 2D traditionnelle d'autres lignées de cellules cancéreuses, c'est un modèle extrêmement précieux pour la culture in vitro de SBNET parce que de nombreux chercheurs de SBNET n'ont pas accès aux lignées cellulaires existantes. Avec ce protocole, les scientifiques et les cliniciens peuvent établir des cultures sphéroïdes SBNET à partir de tumeurs réséquées et les partager avec d'autres laboratoires. En outre, les sphéroïdes SBNET pourraient potentiellement être utilisés pour établir des modèles de souris xénogreffe dérivés du patient SBNET. Dans l'ensemble, les techniques présentées ici peuvent être adaptées pour la culture, la caractérisation et l'exécution de tests de dépistage de drogues d'autres NET tels que le pancréas ou les NET pulmonaires. Notez que le taux de croissance des organoïdes variera entre les différents types d'EPR et les échantillons de patients.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH P50 CA174521 (à J.R. Howe et A.M. Bellizzi). P.H. Ear est récipiendaire du prix P50 CA174521 Du Programme d'amélioration de carrière.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-rabbit FITC Jackson ImmunoResearch 11-095-152 Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution Agilent Dako S2367 Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48 Agilent Dako Not Available Automated system for antibody staining
Cell freezing container Thermo Scientific 5100-0001 Container to for freezing cells
CellSence Olympus Version 1.18 Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody Abcam-45179 RB-9003-PO Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10) Thermo Scientific MA5-13096 Antibodies for IHC
Collagenase Sigma C0130 Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM Gibco 11965-092 Medium for tissue preparation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 Medium for organoid cultures
DMSO Sigma D8418 Solvent for dissolving drug
DNAse Sigma DN25 Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer Chemodex CDX-E0012-T1E DNA and RNA binding dye
FBS Gibco 16000044 Reagent for culture media
Fluorescent microscope Olympus CKX35 Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine Gibco A2916801 Reagent for culture media
ImageJ National Institutes of Health Version 1.51 Computer software for image analysis
Insulin Sigma I0516 Reagent for culture media
Matrigel Corning 356235 Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD) Vector Laboratories H-1200 Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide Sigma 72340 Reagent for culture media
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Reagent to fix cells
PEN/STREP Gibco 15140-122 Reagent for culture media
PT Link Agilent Dako Not Available Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin Alfa Aesar J62473 Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC Agilent Dako K8000 Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody GeneScritp A01591 Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1) Abcam ab134152 Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody Abcam 32127 Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) Agilent Dako M7315 Antibodies for IHC
TritonX Mallinckrodt 3555 KBGE Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor Adipogen AG-CR1-3564-M005 To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw

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References

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Recherche sur le cancer Numéro 152 Petites tumeurs neuroendocrines intestinales sphéroïdes synaptophysine chromogranine A SSTR2 immunofluorescence immunohistochimie matrice extracellulaire rapamycine
Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin
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Ear, P. H., Li, G., Wu, M., Abusada, E., Bellizzi, A. M., Howe, J. R. Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids. J. Vis. Exp. (152), e60303, doi:10.3791/60303 (2019).

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