Summary
Neuroendokrine Tumoren (NETs) stammen aus neuroendokrinen Zellen des Neuralkamms. Sie sind langsam wachsend und herausfordernd für die Kultur. Wir präsentieren eine alternative Strategie, um NETs aus dem kleinen Darm zu züchten, indem wir sie als Sphäroide kultivieren. Diese Sphäroide haben kleine Darm-NET-Marker und können für Drogentests verwendet werden.
Abstract
Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) sind seltene Krebsarten, die aus Enterochromaffinzellen des Darms stammen. Die Forschung auf diesem Gebiet war begrenzt, da nur sehr wenige von Patienten abgeleitete SBNET-Zelllinien erzeugt wurden. Gut differenzierte SBNET-Zellen wachsen langsam und sind schwer zu vermehren. Die wenigen Zellenlinien, die festgelegt wurden, sind nicht ohne weiteres verfügbar, und nach der Zeit in der Kultur können die Eigenschaften von NET-Zellen nicht mehr zum Ausdruck kommen. Die Erzeugung neuer Zelllinien könnte viele Jahre dauern, da SBNET-Zellen eine lange Verdoppelungszeit haben und viele Anreicherungsschritte erforderlich sind, um die sich schnell trennenden krebsassoziierten Fibroblasten zu beseitigen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, um SBNET-Zellen aus chirurgisch entfernten Tumoren als Sphäroide in extrazellulärer Matrix (ECM) zu kultiieren. Das ECM bildet eine dreidimensionale Matrix, die SBNET-Zellen kapselt und die Tumor-Mikroumgebung imitiert, um SBNET-Zellen wachsen zu lassen. Hier charakterisierten wir die Wachstumsrate von SBNET Sphäroiden und beschriebene Methoden zur Identifizierung von SBNET-Markern mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Immunhistochemie, um zu bestätigen, dass es sich bei den Sphäroiden um neuroendokrine Tumorzellen handelt. Darüber hinaus verwendeten wir SBNET Sphäroide zur Prüfung der Zytotoxizität von Rapamycin.
Introduction
Kleine neuroendokrine Tumoren (SBNETs) stammen aus Enterochromaffinzellen des Dünndarms. Obwohl SBNETs allgemein dafür bekannt sind, langsam zu wachsen, metastasieren sie häufig zur Leber1. Während die chirurgische Entfernung oder Tumorablation in vielen Fällen in Betracht gezogen werden kann, ist das Wiederauftreten fast universell, und daher spielt die medizinische Therapie eine wichtige Rolle im Management. Es wurden enorme Anstrengungen unternommen, um neue SBNET-Zelllinien für Arzneimitteltests zu generieren. Es gab jedoch nur sehr wenig Erfolg. Es wurdennur6 SBNET-Zelllinien (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS) gemeldet 2,3,4,5; und leider drückt eine Zelllinie nicht mehr die NET-Marker6 aus und drei weitere SBNET-Zelllinien (KRJ-I, L-STS, H-STS) wurden bestimmt, aus transformierten Lymphoblasten anstelle von NETs7abgeleitet zu werden. Um die Identifizierung von Arzneimitteln für SBNETs zu beschleunigen, sind alternative Methoden für In-vitro-Arzneimitteltests erforderlich.
Hier nutzen wir die Verfügbarkeit von resezierten SBNETs und haben einen Weg etabliert, diese patientenabgeleiteten SBNETs als Sphäroide zu kultitonischen, die in ECM wachsen. Das übergeordnete Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Kultur von SBNET als dreidimensionale (3D) Kultur und Umrissverfahren zu beschreiben, um diese Sphäroide zur Beibehaltung von SBNET-Markern durch Immunfluoreszenzfärbung und Immunhistochemie zu charakterisieren.
Darüber hinaus zeigen wir, wie diese SBNET Sphäroide verwendet werden können, um die Wirkung von Rapamycin, einem Krebsmedikament für NETs8,zu testen. Der Grund für dieses Protokoll ist die Entwicklung einer neuen Methode, um SBNET-Zellen in vitro zu züchten und für Arzneimitteltests zu verwenden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber der traditionellen Methode zur Festlegung einer SBNET-Zelllinie besteht darin, dass 3D-Kulturen von SBNETs schnell gewonnen werden können und Arzneimitteltests innerhalb von 3 Wochen durchgeführt werden können. SBNET Sphäroide könnten möglicherweise als Modell für die Durchführung von In-vitro-Medikamentenscreens verwendet werden, um neue Medikamente für SBNET-Patienten zu identifizieren. Da SBNET-Zelllinien nicht weit verbreitet sind, können 3D-Kulturen von SBNET-Sphäroiden als neues In-vitro-Modell für die Untersuchung von SBNETs dienen und unter Wissenschaftlern auf diesem Gebiet geteilt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Experimente mit menschlichen neuroendokrinen Tumorproben wurden vom IRB-Ausschuss der University of Iowa Hospital and Clinics (Protokollnummer 199911057) genehmigt. Eine Liste aller Materialien und Ausrüstungen ist in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Eine Liste der Wachstumsmedien und Schlüssellösungen finden Sie in Tabelle 1.
1. Dünndarm neuroendokrinen Tumor (SBNET) Sammlung und Zelldissoziation
- Erhalten Sie resektierte SBNET-Proben nach der Bestätigung von Tumorgewebe n. Chr. vom Chirurgischen Pathologiekern.
- SBNETs in 5 mm Würfel schneiden und in 25 ml DMEM/F12-Medium in einem konischen Rohr für den Transport ins Labor lagern.
- Übertragen Sie die Tumoren in DMEM, die 1% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep), 1% Glutamin (Wash Medium) enthalten und in diesem Waschmedium für 15 min inkubieren.
- Übertragen Sie Tumore auf eine neue Schale und Mince-Tumoren auf weniger als 1 mm Stücke mit sterilen gebogenen Scheren.
- Übertragen Sie das Hackfleisch in ein neues 50 ml Rohr mit 25 ml Waschmedium.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 15 min bei 4 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Pellets in 10 ml Waschmedium mit Kollagennase (100 U/ml) und DNase (0,1 mg/ml) wieder aus.
- Lassen Sie die Verdauung der gehackten Tumoren in einem 37 °C-Inkubator mit langsamem Schütteln (50 Rpm) für 1,5 h auftreten.
2. Kultur von SBNETs als Tumorsphäride im ECM
- Nach Abschluss der Verdauung (Schritt 1.8), Zentrifuge bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, den Überstand entsorgen und das Pellet in 15 ml Waschmedium wieder aufhängen.
- Legen Sie ein 70 m Zellsieb auf ein neues 50 ml-Rohr und übertragen Sie 10 ml des Waschmediums über das Zellsieb. Wirbeln Sie das Waschmedium, um die Seite des Kunststoffrohres zu bedecken, um zu verhindern, dass NET-Zellen an der Seite des Kunststoffrohres kleben.
- Filtern Sie die Zellsuspension durch Dasbsie.
- Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie das Pellet in 200 l Waschmedium (Gesamtvolumen beträgt 250 l) wieder auf und legen Sie es auf Eis.
- Übertragen Sie 5 l zellenauf 500 l Waschmedium (1/100 Verdünnungsfaktor). Verwenden Sie die verdünnten Zellen für die Zellzählung mit einem Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu erhalten. Multiplizieren Sie mit 100, um den Verdünnungsfaktor zu korrigieren.
- Multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen pro ml, die in Schritt 2,5 erhalten wurden, mit dem Gesamtvolumen der Zellen in Suspension, die in Schritt 2,4 (ca. 250 l) erhalten wurden.
- Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in flüssigem ECM (1 x 106 Zellen/ml) wieder auf und halten Sie auf Eis.
- Übertragen Sie 5-20 L SBNET Sphäroide in ECM auf eine 96-Well-Platte und lassen Sie das flüssige ECM erstarren, indem Sie die Platte für 5 min in einen 37 °C-Inkubator legen.
- Fügen Sie 200 L SBNET-Kulturmedium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamin + 10 mM Nicotinamid + 10 g/ml Insulin) zu jeder Bohrung der 96-Well-Platte hinzu, die die SBNET-Sphäroide in ECM enthält.
- Alternativ, Kultur SBNET Organoide in Stammzellenmedien ähnlich dem, was zuvor für den Anbau von menschlichen Leber oder Bauchspeicheldrüsenorganoide9 beschrieben und in der Tabelle der Materialienaufgeführt .
- Wechseln Sie alle 5-7 Tage die Medien.
3. Quantifizierung der SBNET Sphäroidgröße mit ImageJ
- Machen Sie 5-10 Bilder von SBNET Sphäroiden an Tag 1, 4, 7, 14, 23 und 97 der Kultur mit einem 10x Objektiv.
- Öffnen Sie gespeicherte Bilder in ImageJ. Wechseln Sie zur Registerkarte Analysieren, wählen Sie die Option Messungen festlegen aus, und aktivieren Sie die Option Bereich.
- Verwenden Sie das ovale Auswahlwerkzeug aus der Werkzeugleiste, um ein Ellipsoid oder einen Kreis um ein gut fokussiertes Sphäroid zu generieren.
- Wechseln Sie zur Registerkarte Analysieren, und wählen Sie die Option Messen aus. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5, um eine Flächenmessung von 25-50 SBNET Sphäroiden zu erhalten. Die Werte werden in Pixelquadrat bereitgestellt.
- Konvertieren Sie den Pixelbereich in m2, indem Sie die Größe jedes Pixels mit der Länge jedes Pixels in den Konvertierungsfaktor der Mikroskopiebilder dividieren.
HINWEIS: SBNET-Zellen wachsen hauptsächlich als Sphäroide und irgendwann als Ellipsoide.
4. Charakterisierung von SBNETS Sphäroiden durch Immunfluoreszenz
- Übertragen Sie die in ECM angebauten Organoide mit einer P1000 Pipette auf ein 1,5 ml-Rohr.
- Zentrifuge bei 1.500 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand.
- Waschen Sie die Organoidkultur, indem Sie 1 ml PBS hinzufügen, mischen, Zentrifuge bei 1.500 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand.
- Fixieren Sie die Organoide, indem Sie 500 l 4% Paraformaldehyd hinzufügen und 15 min inkubieren.
- Waschen Sie die Kultur zweimal mit 1 ml PBS.
- Permeabilisieren Sie die Kultur, indem Sie 500 l PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 für 5 min hinzufügen.
- Dann dreimal mit 1 ml PBS + 3% BSA waschen.
- Inkubieren Sie für 1 h mit primären Antikörpern gegen Synaptophysin (SYP)10 bei 1/600 Verdünnung oder Chromogranin A (CgA)11 und Somatostatinrezeptor 2 (SSTR2)12 bei 1/400 Verdünnung im Antikörperpuffer (2,5% Rinderserumalbumin, 0,1% Natrium Azid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid).
HINWEIS: Verwenden Sie 300 L oder mehr Antikörperlösung pro Tube. - Dreimal mit 1 ml PBS + 3% BSA waschen.
- Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, die bei 1/500 Verdünnung im Antikörperpuffer für 1 h an FITC gekoppelt sind. Verwenden Sie 300 l oder mehr Antikörperlösung pro Tube.
- Waschen Sie 3 mal mit 1 ml PBS + 3% BSA. Achten Sie darauf, alle Überstand zu aspirieren und zu verwerfen.
- Fügen Sie 5 l Desonstmedium mit dem Kernfleck DAPI hinzu.
- Verwenden Sie eine P20-Pipette, um 5 l der SBNET Sphäroide von Schritt 4.12 auf einen Glasschlitten zu übertragen und mit einem Deckelschlupf abzudichten.
- Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den 10x, 20x oder 40x Objektiven auf.
5. SBNET Sphäroide Charakterisierung durch Immunhistochemie (IHC)
- Übertragen Sie SBNET Sphäroide von der Kulturplatte auf ein 1,5 ml Rohr mit einer P1000 Pipette.
- Zentrifuge bei 1.500 x g für 1 min und entfernen Sie den Überstand.
- Fix SBNET Spheroide durch Zugabe von 500 l von 10% Formalin in das Rohr von Schritt 5.2 und inkubieren bei Raumtemperatur für 2-5 Tage vor Paraffin einbetten und schneiden 4 'm dicke Sphäroidabschnitte.
- Deparaffinieren, rehydrieren und verwenden Sie wärmeinduzierte Epitop-Retrieval in Antigen Retrieval Solution bei pH 9 durch Erhitzen auf 97 °C für 20 min mit der 3-in-1 automatisierten Diaverarbeitungsstation, um Dias für die Antikörperinkubation vorzubereiten.
- Blockrutschen und Inkubation mit primären Antikörpern gegen SYP10 bei einer Verdünnung von 1/100 für 15 min, CgA11 bei einer Verdünnung von 1/800 für 15 min und SSTR212 bei einer Verdünnung von 1/5.000 für 30 min.
- Inkubieren Sie mit dem sekundären Antikörper-Erkennungssystem für 15 min für die Anti-SYP- und CgA-Färbung und 30 min für Anti-SSTR2-Färbung. Nehmen Sie Bilder mit einem 400x Objektiv auf.
6. Behandlung von SBNET-Organoiden mit Rapamycin
- Lösen Sie Rapamycin in DMSO auf, um eine 10 mM Stofflösung zu erhalten.
- Bereiten Sie SBNET Kulturmedium mit DMSO (z.B. 1 ml SBNET Kulturmedium + 1 l DMSO) und SBNET Kulturmedium mit 10 M Rapamycin (z. B. 1 ml SBNET Kulturmedium + 1 l von 10 ml Rapamycin-Stammlösung) vor.
- Übertragen Sie 200 L-Medien mit SBNET-Kulturmedium mit DMSO oder 10 M Rapamycin in SBNET-Sphäroidkulturen.
- SBNET-Sphäroide 5 Tage lang im 37 °C-Inkubator inkubieren.
- Fügen Sie 1 M Ethidium-Homodimer hinzu und brüten Sie 30 min. Entfernen Sie das Medium, das Ethidium-Homodimer enthält, waschen Sie es mit 200 L PBS und übertragen Sie 200 L PBS auf jeden Brunnen.
- Nehmen Sie Mikroskopiebilder von SBNET Sphäroiden mit und ohne medikamentöse Behandlung mit dem roten Filterwürfel mit den 10x, 20x oder 40x Objektiven eines Fluoreszenzmikroskops.
HINWEIS: Tote Zellen, die mit Ethidium homodimer gefärbt sind, erscheinen rot mit dem roten Filterwürfel G eines handelsüblichen Mikroskops (Tabelle der Materialien). Alternativ kann das Signal mit einem Spektralphotometer bei 535 nm Anregung und 624 nm Emission erfasst werden.
7. Aufteilen von SBNET Sphäroiden
HINWEIS: Dies geschieht für die Erweiterung und für den Austausch mit anderen Forschern.
- Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um das ECM mechanisch zu brechen und das ECM mit SBNET Sphäroiden in ein steriles 1,5 ml-Rohr zu saugen.
- Zentrifuge bei 1.000 x g bei 4 °C, entfernen Sie alle Überstand und legen Sie die Röhre auf Eis.
- Fügen Sie 2-4x das Volumen des neuen ECM in das Pellet. Mischen Sie das neue ECM mit den alten ECM- und SBNET-Sphäroiden, indem Sie 10x nach oben und unten pfeifen. Vermeidung von Luftblasen.
- Übertragen Sie 5-20 l des ECM- und SBNET-Sphäroid-Gemischs auf eine neue Platte und ermöglichen Sie eCM eine Erstarrung.
- Abdeckung mit neuem SBNET Medium und Transfer zum Inkubator. Die Wiedereinziehungsrate beträgt etwa 95 bis 100%.
- Für den Versand von SBNET Sphäroiden in ein anderes Labor, übertragen Sie SBNET Sphäroide mit neuem ECM auf einen T25-Kolben und lassen Sie ECM festigen.
- Füllen Sie den T25-Kolben mit SBNET Sphäroid-Medium, schrauben Sie die Kappe fest, und bereiten Sie das Versandpaket vor.
- Entfernen Sie nach dem Empfang einer SBNET-Sphäroidkultur das Kulturmedium, und führen Sie Schritt 7.1 bis 7.5 aus, um SBNET-Sphäroide wieder in die Kultur zurückzubringen.
8. Kryospeicher und Wiederherstellung von SBNET Sphäroiden
- Übertragen Sie SBNET Sphäroide von 5-10 kleinen Brunnen auf ein 15 ml Rohr. Zentrifuge bei 500 x g für 15 min bei 4 °C, Überstand entfernen, im Gefriermedium (90% FBS + 10% DMSO) wieder aufsetzen, in einem Zellgefrierbehälter lagern und bei -80 °C platzieren.
- Transfer in den flüssigen Stickstoff für längere Lagerung.
- Um SBNET Spheroide wiederherzustellen, legen Sie die gefrorene Durchstechflasche auf Eis und warten Sie, bis der Inhalt vollständig aufgetaut ist. Invertieren Sie die Röhre und legen Sie sie wieder auf Eis, um den Auftauvorgang zu beschleunigen.
- Sobald die Probe aufgetaut ist, in eine vorgekühlte Zentrifuge geben und 10 min bei 1.000 x g drehen.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Sphäroide im ECM wieder auf. Halten Sie die Röhre auf Eis, übertragen Sie 20 L auf eine neue Platte und warten Sie, bis das ECM erstarrt.
- Übertragen Sie 200 l SBNET-Kulturmedium mit 10 M ROCK-Inhibitor (Y-27632)13 und übertragen Sie sie in den Inkubator.
- Lassen Sie SBNET Spheroide erholen und wachsen für 1 Woche. Entfernen Sie das alte Kulturmedium, füllen Sie es mit 200 L SBNET-Kulturmedium auf und kehren Sie zum Inkubator zurück.
- Lassen Sie SBNET Spheroide weiter wachsen.
HINWEIS: Es dauert mindestens 1 Woche, bis sich schnell wachsende Sphäroide nach der Kryokonservierung zu erholen beginnen13. SBNET Sphäroide brauchen mindestens 2-4 Wochen, um mit dem Wachstum zu beginnen. Viele SBNET-Zellen sterben innerhalb der ersten 2 Wochen und die Überlebensrate liegt unter 10%. Da dies ein sehr zeitaufwändiger und ertragsarmer Prozess ist, ist es besser, mit anderen Forschern SBNET Sphäroide in Kulturkolben zu teilen (wie in Schritt 7 beschrieben). Kryostorage und Wiederherstellung sollten nur im Falle einer bakteriellen Kontamination als Backup-Plan verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Es gibt derzeit nur 2 SBNET Zelllinien etabliert und veröffentlicht2,3,4,5 und sie sind nicht leicht verfügbar für viele Forscher. Hier schlagen wir vor, SBNET als Sphäroide im ECM zu kultitoben und dies als alternatives Modell zur Untersuchung der SBNET-Arzneimittelempfindlichkeit zu verwenden. Patienten-abgeleiteter Tumor aus einem SBNET, der zur Leber metastasiert wurde, verdaut wurde, um SBNET-Zellen freizusetzen, und mit flüssigem ECM gemischt wurde, um eine SBNET-Sphäroidkultur zu etablieren (Abbildung 1A). Der Ki-67 dieses SBNET betrug 4,3%. Obwohl SBNET Sphäroide eine langsame Wachstumsrate haben, kann ihr Wachstum durch mikroskopische Bildgebung überwacht werden (Abbildung 1A). Es dauert etwa 14 Tage, bis sich SBNET Spheroide verdoppeln, wenn die Kulturmedien einmal pro Woche gewechselt werden (Abbildung 1B). Nach 14 Tagen in der Kultur werden SBNET Sphäroide nicht größer. Stattdessen trennen sich einige SBNET-Zellen zu einem benachbarten Speicherort und bilden neue Sphäroide. Um die SBNET-Sphäroidkultur zu propagieren, ernten Sie das ECM mit SBNET-Sphäroiden und setzen Sie sie in eine neue Kulturplatte mit neuem Kulturmedium (Schritt 7) zurück.
Um zu bestätigen, dass die organoiden Kulturen SBNET-Zellen enthalten, beschreiben wir eine einfache und schnelle Methode, um die Sphäriden für SBNET-Marker wie Synaptophysin, Chromogranin A und den Somatostatin-Rezeptor Typ 2 (SSTR2) mit Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) zu färben ( Schritt 4). Unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch gegen Synaptophysin, Chromogranin A und SSTR2 verwendet wurden, zeigten unsere IF-Daten, dass diese Marker im Zytoplasma und in der Membran von SBNET-Zellen lokalisiert sind(Abbildung 2A, in grün) nach 1 oder 9 Monaten in Kultur (Figure 2B ). Um die Spezifität der SYP-, CgA- und SSTR2-Antikörper zu gewährleisten, führten wir die gleichen Färbeverfahren an einer Organoidlinie aus Bauchspeicheldrüsentumoren durch, die sYP, CgA oder SSTR2 (Abbildung 2C) nicht ausdrücken, da kein grünes Signal erkannt wurde. Der Hauptvorteil dieses SBNET Sphäroid IF-Experiments ist, dass es innerhalb von 4 h durchgeführt werden kann und ähnliche Färbeinformationen wie die Immunhistochemie (IHC; Abbildung 3). Wir stellen ein Protokoll für die Ausführung von IHC der SBNET Spheroide in Schritt 5 zur Verfügung.
SBNET als Sphäroide zu kultivieren ist eine wertvolle Technik zur Identifizierung von Medikamenten, die das SBNET-Wachstum hemmen können. Als Beweis des Prinzips behandelten wir SBNET Sphäroide 5 Tage lang mit Rapamycin, einem mTOR-Hemmer, einer Klasse von Medikamenten, die häufig zur Behandlung von NETs8verwendet werden. Im Vergleich zu unserem Kontroll-SBNET-Sphäroid bildete das mit Rapamycin behandelte Sphäroid eine traubenartige Struktur und wurde apoptotisch oder nekrotisch (Abbildung 4A-D). Sterbende Zellen können mit Ethidium homodimer detektiert werden, um DNA und RNA zu färben und ein leuchtend rotes Signal zu erzeugen14. Dieser Farbstoff kann nicht in die Zellmembran lebender Zellen eindringen.
Abbildung 1: Patienten-abgeleitete neuroendokrine Kleindarmtumoren (SBNETs), die in extrazellulärer Matrix (ECM) als Sphäroide angebaut werden. (A) Isolierung von Tumorzellen aus einem resezierten SBNET und Kultur durch Mischen mit ECM. Maßstabsbalken stellt 100 m (B) Oberfläche von SBNET Sphäroiden in Bezug auf die Anzahl der Tage in der Kultur quantifiziert mit ImageJ. Die Daten wurden von SBNET Sphäroiden von 1 Patient gewonnen und werden als mittlerer Bereich dargestellt . Standardfehler des Mittelwerts. Die Oberfläche von 30 bis 60 Sphäroiden wurde für jeden Zeitpunkt gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Immunfluoreszenz (IF) Färbung von SBNET Sphäroiden. IF Färbung von SBNET Sphäroiden nach (A) 1 Monat in der Kultur und (B) 9 Monate in der Kultur. (C) IF Färbung von Bauchspeicheldrüsentumororganoiden, die SBNET-Marker nicht als Negativkontrollen ausdrücken. Tumorsphäride wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit Antikörpern gegen Synaptophysin (SYP) bei 1/600 Verdünnung, Chromogranin A (CgA) bei 1/400 Verdünnung und Somatostatinrezeptor 2 (SSTR2) bei 1/400 gefärbt. IF-Bilder wurden mit 100 ms, 200 ms und 400 ms Belichtungszeit für SYP-, CgA- und SSTR2-Färbung mit den 10x-, 20x- oder 40x-Objektiven aufgenommen. Die Maßstabsleiste steht für 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Immunohistochemie (IHC) Färbung von SBNET Sphäroiden. Formalin-feste und paraffin-eingebettete SBNET-Sphäroide wurden mit (A) SYP, (B) CgA und (C) SSTR2 Antikörpern deparaffiniert, rehydriert, blockiert und gebeizt. Die Bilder wurden mit dem 400x-Objektiv aufgenommen. Die Maßstabsleiste steht für 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Verwendung von SBNET Sphäroiden für Arzneimitteltests. (A) Helles Feldbild von SBNET Sphäroiden, die 5 Tage lang mit DMSO behandelt wurden. (B) Bild von SBNET Sphäroiden, die mit DMSO behandelt und mit Ethidium homodimer (Ethidium H) gefärbt sind. (C) Helles Feldbild eines toten SBNET Sphäroids, das nach der Behandlung mit 10 M Rapamycin für 5 Tage eine traubenartige Struktur bildet. (D) Totes SBNET Sphäroid mit Ethidium H gefärbt erscheint als rote Punkte. Bilder von Ethidium H Färbung wurden mit dem roten Filterwürfel bei 100 ms Belichtungszeit aufgenommen. Die Maßstabsleiste steht für 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Wachstumsmedien oder -lösungen | komposition |
| Waschmedium | DMEM mit 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% Glutamin |
| SBNET Kulturmedium | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamin + 10 mM Nicotinamid + 10 g/ml Insulin |
| Antikörperpuffer | 2,5% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumazid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid |
| Gefriermedium | 90% FBS + 10% DMSO |
| Menschliches Leberstammzellisolationsmedium | DMEM/F12 , 1% Pen/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Supplement, 1/100 N2 Supplement, 1 mM N-Acetylcystein, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM Nicotinamid, 10 uM Forskolin, 5uM A83-01 |
| Humanes Pankreasstammzellisolationsmedium | DMEM/F12 , 1% Pen/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Ergänzung, 1/100 N2 Beilage, 1 mM N-Acetylcystein, 200 ng/mL Rspo 1, 25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM Nicotinamid, 10 uM forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
Tabelle 1. Liste der Wachstumsmedien und -lösungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor-3D-Kulturen sind zu einer wertvollen Ressource für präklinische Arzneimitteltests geworden15. Verschiedene Tumororganoid-Biobanken wurden vor kurzem aus Brustkrebs und Prostatakrebs Tumoren16,17etabliert. In dieser Studie bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur SBNET als Sphäroide und eine einfache und schnelle Methode, um die Sphäroidkulturen für NET-Marker durch Immunfluoreszenz zu validieren und die Wirkstoffempfindlichkeit zu testen. Aus unserer Erfahrung können SBNET Sphäroide in verschiedenen Kulturmedien wachsen. Sie wachsen etwas schneller in Stammzellmedien für menschliche Bauchspeicheldrüse oder Leberisolation, die wir aus zuvor veröffentlichten Protokollenangepasst 9. Wir haben uns entschieden, die SBNETs in DMEM/F12 Medium zu züchten, ergänzt mit Insulin und Nicotinamid, da dies kostengünstiger ist als Stammzellmedien. Die Erhöhung des Anteils des fetalen Rinderserums ist eine weitere Strategie, um das Wachstum von SBNET Organoidkulturen zu fördern; Dies würde jedoch auch die Gesamtkosten für die Kulturpflege erhöhen.
Die Durchführung von IF-Färbung und Bildgebung mit einer fluoreszierenden Mikroskopie mit den 10x, 20x oder 40x Objektiven ist eine schnelle und einfache Methode, um die Expression von SBNET-Markern zu testen. Es gibt jedoch keine klar definierte Lokalisierung im Vergleich zu IHC (Abbildung 2, Abbildung 3). Die IF-Daten zeigten beispielsweise, dass die Membranlokalisierung von SSTR2 schwer zu erkennen ist. Wir entdecken hauptsächlich das zytosolische SSTR2, das zuvor berichtet wurde18. Um eine bessere Lokalisierung der Markerproteine zu erreichen, empfehlen wir die Verwendung von IF und konfokaler Mikroskopie. Insgesamt ist IF eine nützliche Methode, um SBNET-Marker schnell zu bestätigen. Unsere Antikörper (Anti-SYP, Anti-CgA, Anti-SSTR2) reagierten nicht mit den negativen Kontrollorganoiden, die im IF-Experiment nicht SYP, CgA oder SSTR2 (Abbildung 2C) ausdrücken. Dieser Hinweis, dass die fluoreszierenden Signale, die wir entdeckt haben, spezifisch für SBNET Sphäroide sind.
Um die Ausbeute von SBNET Sphäroiden zu erhöhen, sind die entscheidenden Schritte dieses Protokolls während des Zellfiltrationsschritts (Schritt 2.2) und das Mischen des SBNET mit dem flüssigen ECM zur Aliquotierung in Gewebekulturplatten (Schritt 2.8). Achten Sie darauf, die Zellsiebmembran und das Sammelrohr mit Medien zu bedecken, um zu verhindern, dass die SBNET-Zellen am Kunststoff kleben. Flüssiges ECM wird sich schnell verfestigen, wenn es nicht auf Eis gelegt wird. Achten Sie darauf, einen kleinen Eisbehälter in der Gewebekulturhaube zu haben, um die ECM- und SBNET-Zellen kalt zu halten.
Die Einschränkung dieser Technik ist die langsame Wachstumsrate der SBNET Sphäroide. Experimente müssen effizient geplant werden und die Verwendung einer überschüssigen Menge an SBNET-Sphäroiden zu vermeiden. Eine weitere Einschränkung ist die langsame Erholung nach dem Einfrieren Tauwetter. Es dauert mehr als 1 Monat nach dem Auftauen für die SBNET Sphäroide zu wachsen beginnen. Um diese Einschränkung zu überwinden, empfehlen wir, SBNET Spheroide kontinuierlich in Kulturen zu erhalten und sie bei Bedarf zu spalten (Schritt 7). Auch nach 9 Monaten in der Kultur behalten die SBNET Spheroide die Expression von SBNET-Markern bei (Abbildung 2B).
Obwohl die 3D-Kultur von SBNET-Sphäroiden arbeitsintensiver ist als die traditionelle 2D-Kultur anderer Krebszelllinien, ist sie ein äußerst wertvolles Modell für die In-vitro-Kultur von SBNET, da viele SBNET-Forscher keinen Zugang zu den vorhandenen Zelllinien haben. Mit diesem Protokoll können Wissenschaftler und Kliniker SBNET Sphäroidkulturen aus resezierten Tumoren herstellen und mit anderen Laboratorien teilen. Darüber hinaus könnten die SBNET-Sphäroide möglicherweise verwendet werden, um SBNET-Patienten-abgeleitete Xenograft-Mausmodelle zu erstellen. Insgesamt können die hier vorgestellten Techniken für die Kultivierung, Charakterisierung und Durchführung von Arzneimitteltests anderer NETs wie Pankreas- oder Lungen-NETs angepasst werden. Beachten Sie, dass die Wachstumsrate der Organoide zwischen den verschiedenen Arten von NETs und Patientenproben variieren wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien P50 CA174521 (an J.R. Howe und A.M. Bellizzi) unterstützt. P.H. Ear ist Träger des P50 CA174521 Career Enhancement Program Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
