Summary
Nevroendokrine svulster (NETs) stammer fra Nevroendokrine celler av Neural Crest. De er langsom voksing og utfordrende å kulturen. Vi presenterer en alternativ strategi for å vokse garn fra tynntarmen ved å dyrking dem som spheroids. Disse spheroids har liten tarmen NET markører og kan brukes til narkotika testing.
Abstract
Små tarm Nevroendokrine svulster (SBNETs) er sjeldne kreftformer stammer fra enterochromaffin celler i tarmen. Forskning på dette feltet har vært begrenset fordi svært få pasienter avledet SBNET cellelinjer har blitt generert. Godt differensiert SBNET celler er langsom vekst og er vanskelig å spre. De få cellelinjer som er etablert er ikke lett tilgjengelig, og etter gang i kulturen kan ikke fortsette å uttrykke egenskapene til NET celler. Generere nye cellelinjer kan ta mange år siden SBNET celler har en lang dobling tid og mange berikelse skritt er nødvendig for å eliminere raskt dele kreft-assosiert fibroblaster. For å overvinne disse begrensningene, har vi utviklet en protokoll til kultur SBNET celler fra kirurgisk fjernet svulster som spheroids i ekstracellulære matrise (ECM). ECM danner en 3-dimensjonal matrise som omslutter SBNET celler og etterligner tumor mikro-miljøet for å la SBNET celler til å vokse. Her har vi karakterisert vekstraten til SBNET spheroids og beskrev metoder for å identifisere SBNET markører ved hjelp av immunofluorescence mikroskopi og immunhistokjemi for å bekrefte at spheroids er Nevroendokrine tumorceller. I tillegg har vi brukt SBNET spheroids for testing av cytotoksisitet av Rapamycin.
Introduction
Små tarm Nevroendokrine svulster (SBNETs) stammer fra enterochromaffin celler i tynntarmen. Selv SBNETs er generelt kjent for å vokse langsomt, de vanligvis metastase til leveren1. Mens kirurgisk fjerning eller tumor ablasjon kan vurderes i mange tilfeller, gjentakelse er nesten universell, og derfor medisinsk terapi spiller en viktig rolle i ledelsen. Enorm innsats har blitt investert for å generere nye SBNET cellelinjer for narkotika testing. Men det har vært svært liten suksess. Bare 6 SBNET cellelinjer (krj-I, CND2, GOT1, vrang-STS, L-m, H-STS) har blitt rapportert2,3,4,5; og dessverre en cellelinje ikke lenger uttrykker NET markører6 og tre andre SBNET celle Lines (krj-I, L-STS, H-STS) var fast bestemt på å være avledet fra transformert lymphoblasts i stedet for Nets7. For å akselerere identifisering av legemidler for målretting SBNETs, alternative metoder for in vitro narkotika testing er nødvendig.
Her tar vi nytte av tilgjengeligheten av resected SBNETs og har etablert en måte å kultur disse pasient-avledet SBNETs som spheroids vokser i ECM. Det overordnede målet med dette manuskriptet er å beskrive en metode til kultur SBNET som en tredimensjonal (3D) kultur og skissere prosedyrer for å karakterisere disse spheroids for oppbevaring av SBNET markører ved immunofluorescence farging og immunhistokjemi.
I tillegg viser vi hvordan disse SBNET spheroids kan brukes til å teste effekten av Rapamycin, et anti-kreft stoff for NETs8. Begrunnelsen bak denne protokollen er å utvikle en ny metode for å vokse SBNET celler in vitro og bruke dem for narkotika testing. Fordelen med denne teknikken over den tradisjonelle metoden for å etablere en SBNET cellelinje er at 3D-kulturer av SBNETs kan raskt bli innhentet og narkotika testing kan gjøres innen 3 uker. SBNET-spheroids kan potensielt brukes som en modell for utføring av stoff skjermer i vitro for å identifisere nye legemidler for SBNET-pasienter. Siden SBNET cellelinjer ikke er allment tilgjengelige, kan 3D-kulturer av SBNET-spheroids tjene som en ny in vitro-modell for å studere SBNETs og kan deles blant forskere i felten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med humant Nevroendokrine tumor prøvene har blitt godkjent av University of Iowa Hospital og klinikker IRB komité (Protokollnummer 199911057). En liste over alt materiale og utstyr er beskrevet i materialfortegnelsen. En liste over vekst medier og viktige løsninger finnes i tabell 1.
1. liten tarm Nevroendokrine tumor (SBNET) samling og celle dissosiasjon
- Få resected pasienten SBNET prøver etter tumor vev bekreftelse fra kirurgisk patologi Core.
- Skjær SBNETs i 5 mm terninger og oppbevar i 25 mL DMEM/F12 medium i et konisk rør for transport til laboratoriet.
- Overfør svulster i DMEM inneholder 1% FBS, 1% penicillin/Streptomycin (pen/strep), 1% glutamin (vask medium) og ruge i denne vask medium i 15 min.
- Overfør svulster til en ny tallerken og hakke svulster til mindre enn 1 mm stykker ved hjelp av sterile buede saks.
- Overfør hakket vev til en ny 50 mL rør som inneholder 25 mL vask medium.
- Sentrifuger prøven ved 500 x g i 15 min ved 4 ° c.
- Kast supernatanten og resuspend pellets i 10 mL vaske medium som inneholder kollagenase (100 U/mL) og DNase (0,1 mg/mL).
- La fordøyelsen av hakket svulster oppstår i en 37 ° c inkubator med langsom risting (50 RPM) for 1,5 h.
2. kultur SBNETs som tumor spheroids i ECM
- Etter fordøyelsen er fullført (trinn 1,8), sentrifuge ved 500 x g i 15 min ved 4 ° c, kast supernatanten og resuspend pellet i 15 ml Wash medium.
- Plasser et celle sil 70 μm oppå et nytt 50 mL rør og Overfør 10 mL av vaske mediet over celle sil. Virvel vask medium for å dekke siden av plastrør for å hindre at netto celler stikker til siden av plastrør.
- Filtrer celle fjæringen gjennom celle sil.
- Sentrifuger ved 500 x g i 15 min ved 4 ° c, kast supernatanten, resuspend pellet i 200 ΜL av Wash medium (totalt volum er ~ 250 μL) og legg det på is.
- Overføring 5 μL av celler til 500-μL av vask medium (1/100 fortynnings faktor). Bruk de fortynnede cellene for celle telling ved hjelp av en hemocytometer for å få antall celler per milliliter. Multipliser med 100 for å korrigere for fortynning faktor.
- Multipliser antall celler per mL oppnådd i trinn 2,5 av det totale volumet av celler i suspensjon innhentet i trinn 2,4 (~ 250 μL).
- Sentrifuger ved 500 x g i 15 min ved 4 ° c, kast supernatanten og resuspend cellene i flytende ECM (1 x 106 celler/ml) og hold på isen.
- Overfør 5-20 μL av SBNET-spheroids i ECM til en 96-brønn plate og la væsken ECM stivne ved å plassere platen i en 37 ° c inkubator i 5 minutter.
- Tilsett 200 μL av SBNET kultur medium (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PENN/STREP + 1% glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 μg/mL insulin) til hver brønn på 96-brønn platen som inneholder SBNET-spheroids i ECM.
- Alternativt, kultur SBNET organoids i Stamcelle Media ligner på det som tidligere har blitt beskrevet for dyrking av enten menneskelig lever eller bukspyttkjertelen organoids9 og oppført i tabellen av materialer.
- Bytt Media hver 5-7 dager.
3. kvantifisering av SBNET spheroid størrelse ved hjelp av ImageJ
- Ta 5-10 bilder av SBNET spheroids på dag 1, 4, 7, 14, 23 og 97 av kulturen ved hjelp av et 10x mål.
- Åpne lagrede bilder i ImageJ. Gå til analyser -fanen, Velg alternativet Angi målenheter og sett en hake på område alternativet.
- Bruk det ovale markeringsverktøyet fra verktøylinjen til å generere en ellipsoiden eller sirkel rundt et godt fokusert spheroid.
- Gå til analyser -fanen og velg mål -alternativet. Gjenta trinn 3,4 og 3,5 for å få areal måling fra 25-50 SBNET spheroids. Verdiene angis i piksel firkant.
- Konverter piksel området til μm2 ved å dele størrelsen på hver piksel med lengden på hver piksel til μm Omregningsfaktor for de mikroskopi bildene.
Merk: SBNET celler vokser hovedsakelig som spheroids og en gang som ellipsoider.
4. karakterisering av SBNETS spheroids av immunofluorescence
- Overfør organoids vokst i ECM til en 1,5 mL tube ved hjelp av en P1000 pipette.
- Sentrifuger på 1 500 x g for 1 min og fjern supernatanten.
- Vask organoid kulturen ved å tilsette 1 mL PBS, bland, sentrifuger på 1 500 x g i 1 min og fjern supernatanten.
- Fest organoids ved å tilsette 500 μL av 4% paraformaldehyde og ruge i 15 min.
- Vask kulturen to ganger med 1 mL PBS.
- Permeabilize kulturen ved å legge 500 μL av PBS + 3% BSA + 0,1% Triton X 100 i 5 min.
- Vask deretter tre ganger med 1 mL PBS + 3% BSA.
- Ruge for 1 time med primære antistoffer mot synaptophysin (SYP)10 ved 1/600 fortynning eller kromogranin A (CgA)11 og SOMATOSTATIN reseptor 2 (SSTR2)12 ved 1/400 fortynning i antistoff buffer (2,5% storfe serum albumin, 0,1% natrium Natriumazid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumklorid).
Merk: Bruk 300 μL eller mer av antistoff oppløsning per slange. - Vask tre ganger med 1 mL PBS + 3% BSA.
- Ruge med sekundære antistoffer koplet til FITC ved 1/500 fortynning i antistoff buffer for 1 time. Bruk 300 μL eller mer av antistoff oppløsning per rør.
- Vask 3 ganger med 1 mL PBS + 3% BSA. Sørg for å aspirer og forkaste alle supernatanten.
- Tilsett 5 μL festemiddel som inneholder den kjernefysiske flekken DAPI.
- Bruk en P20 pipette til å overføre 5 μL av SBNET spheroids fra trinn 4,12 til et glass lysbilde og forsegle med en cover slip.
- Ta bilder ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med 10x, 20x eller 40x mål.
5. SBNET spheroids karakterisering av immunhistokjemi (IHC)
- Overfør SBNET-spheroids fra kultur platen til en 1,5 mL slange ved hjelp av en P1000 pipette.
- Sentrifuger på 1 500 x g for 1 min og fjern supernatanten.
- Fix SBNET spheroids ved å legge 500 μL av 10% formalin til røret fra trinn 5,2 og ruge ved romtemperatur i 2-5 dager før parafin embedding og kuttet 4 μm tykke spheroid seksjoner.
- Deparaffinize, rehydrate, og bruk varme-indusert epitope gjenfinning i antigen henting løsning ved pH 9 ved oppvarming til 97 ° c i 20 min ved hjelp av 3-i-1 automatisert lysbilde behandlingstasjon for å forberede lysbilder for antistoff inkubasjons.
- Blokker lysbilder og ruge med primære antistoffer mot SYP10 ved en 1/100 fortynning i 15 min, CgA11 ved a 1/800 fortynning i 15 min, og SSTR212 ved en 1/5000 fortynning i 30 min.
- Ruge med det sekundære antistoff deteksjonssystemet i 15 minutter for anti-SYP og CgA farging og 30 min for anti-SSTR2 farging. Ta bilder ved hjelp av en 400x målsetting.
6. behandling av SBNET organoids med Rapamycin
- Oppløse Rapamycin i DMSO for å få en 10 mM lagerløsning.
- Forbered SBNET kultur medium med DMSO (f. eks, 1 mL SBNET kultur medium + 1 μL av DMSO) og SBNET kultur medium med 10 μM Rapamycin (f. eks, 1 mL SBNET kultur medium + 1 μL av 10 mM Rapamycin lagerløsning).
- Overfør 200 μL medium med SBNET kultur medium med DMSO eller 10 μM Rapamycin til SBNET spheroid kulturer.
- Ruge SBNET spheroids i 5 dager i 37 ° c inkubator.
- Tilsett 1 μM med etidiumbromid homodimer og ruge i 30 min. Fjern mediet som inneholder etidiumbromid homodimer, vask med 200 μL av PBS, og Overfør 200 μL av PBS til hver brønn.
- Ta mikroskopi bilder av SBNET spheroids med og uten legemiddelbehandling ved hjelp av den røde filter kuben med 10x, 20x eller 40x mål av et fluorescerende mikroskop.
Merk: døde celler beiset med Etidiumbromid homodimer vises som rødt ved hjelp av den røde filteret kuben G av et kommersielt tilgjengelig mikroskop (tabell av materialer). Alternativt kan signalet fanges opp ved hjelp av en spektrofotometer ved 535 NM eksitasjon og 624 NM utslipp.
7. deling av SBNET-spheroids
Merk: Dette gjøres for utvidelse og for deling med andre forskere.
- Bruk en P1000 pipette for mekanisk brudd på ECM og aspirer ECM med SBNET spheroids til et sterilt 1,5 mL rør.
- Sentrifuger ved 1 000 x g ved 4 ° c, Fjern alle supernatanten og plasser slangen på is.
- Tilsett 2-4X volumet av nye ECM til pellet. Bland den nye ECM med den gamle ECM-og SBNET-spheroids ved å pipettering opp og ned 10x. Unngå å innføre luftbobler.
- Overfør 5-20 μL av ECM-og SBNET-spheroids blandingen til en ny plate og la ECM stivne.
- Dekk med nye SBNET medium og overføre til inkubator. Utvinningsgraden er omtrent 95 til 100%.
- For frakt SBNET spheroids til en annen Lab, overføre SBNET spheroids med nye ECM til en T25 kolbe og tillate ECM å stivne.
- Fyll T25 kolbe med SBNET spheroid medium, skru på hetten tett, og forberede forsendelsen pakken.
- Ved mottak av en SBNET spheroid kultur, fjerne kulturen medium og utføre trinn 7,1 til 7,5 å sette SBNET spheroids tilbake i kultur.
8. Cryostorage og gjenvinning av SBNET spheroids
- Overfør SBNET-spheroids fra 5-10 små brønner til et 15 mL rør. Sentrifuger ved 500 x g i 15 min ved 4 ° c, Fjern supernatanten, resuspend i frysing medium (90% FBS + 10% DMSO), Oppbevar i en celle fryseboks, og plasser denne ved-80 ° c.
- Overfør til flytende nitrogen for lengre lagring.
- For å gjenopprette SBNET spheroids, plasser det frosne hetteglasset på is og vent til innholdet er helt tint. Inverter røret og re-plass på isen for å fremskynde tine prosessen.
- Når prøven er tint, plassert inne i en pre-kjølt sentrifuge og spinne på 1 000 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten og resuspend spheroids i ECM. Hold røret på isen, overføre 20 μL til en ny plate, og vente på ECM å stivne.
- Overføring 200 μL av SBNET kultur medium med 10 μM ROCK-inhibitor (Y-27632)13 og overføring til inkubator.
- Tillat SBNET spheroids å gjenopprette og vokse i 1 uke. Fjern det gamle kultur mediet, fyll på med 200 μL av SBNET kultur medium og gå tilbake til inkubator.
- Tillat at SBNET-spheroids fortsetter å vokse.
Merk: det tar minst 1 uke for raskt voksende spheroids å begynne å komme etter kryonisk bevaring13. SBNET spheroids tar minimum 2-4 uker å begynne å vokse. Mange SBNET celler vil dø i løpet av de første 2 ukene og overlevelsesraten er mindre enn 10%. Siden dette er en svært tidkrevende og lav utbytte prosess, er det bedre å dele med andre forskere SBNET spheroids i kultur flasker (som beskrevet i trinn 7). Cryostorage og gjenoppretting skal bare brukes som reserveplan i tilfelle det oppstår en bakteriell forurensning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er for tiden bare 2 SBNET cellelinjer etablert og publisert2,3,4,5 og de er ikke lett tilgjengelig for mange forskere. Her foreslår vi å kultur SBNET som spheroids i ECM og bruke dette som en alternativ modell for å studere SBNET narkotika følsomhet. Pasient-avledet tumor fra en SBNET som metastasized til leveren ble samlet inn, fordøyd å løslate SBNET celler, og blandet med flytende ECM for å etablere en SBNET spheroid kultur (figur 1A). KI-67 i denne SBNET var 4,3%. Selv om SBNET spheroids har en langsom vekst, kan deres vekst overvåkes ved mikroskopisk bildebehandling (figur 1a). Det tar ca. 14 dager for SBNET spheroids å doble i størrelse når kultur mediene endres en gang i uken (figur 1B). Etter 14 dager i kultur, SBNET spheroids ikke øke i størrelse. I stedet vil noen SBNET celler distansere til en nærliggende plassering og danne nye spheroids. Å spre SBNET spheroids kulturen, høste ECM som inneholder SBNET spheroids og reseed dem i ny kultur plate med nytt kultur medium (trinn 7).
For å bekrefte at de organoid kulturene inneholder SBNET-celler, beskriver vi en enkel og rask metode for å farge spheroids for SBNET markører som synaptophysin, kromogranin A og somatostatin reseptor type 2 (SSTR2) ved hjelp av immunofluorescence (IF) mikroskopi ( Trinn 4). Ved hjelp av antistoffer spesifikke mot synaptophysin, kromogranin A og SSTR2, våre hvis data viste at disse markørene er lokalisert i cytoplasma og ved membranen av SBNET celler (figur 2A, i grønt) etter 1 eller 9 måneder i kultur (Fdelig 2b ). For å sikre spesifisitet av SYP, CgA og SSTR2 antistoffer, utførte vi de samme farge prosedyrene på en organoid linje fra bukspyttkjertel svulst som ikke uttrykker ikke SYP, CgA eller SSTR2 (figur 2C) da ingen grønt signal ble oppdaget. Den største fordelen med dette SBNET spheroid IF eksperimentet er at det kan utføres innen 4 timer og gir lignende fargeinformasjon som immunhistokjemi (IHC; Figur 3). Vi tilbyr en protokoll for å utføre IHC av SBNET-spheroids i trinn 5.
Dyrking SBNET som spheroids er en verdifull teknikk for å identifisere medikamenter som kan hemme SBNET vekst. Som et bevis på prinsippet behandlet vi SBNET spheroids med Rapamycin i 5 dager, en mTOR-hemmer, en klasse av legemidler som vanligvis brukes til å behandle NETs8. I forhold til vår kontroll SBNET spheroid, den Rapamycin-behandlede spheroid dannet en drue-lignende struktur og ble apoptotisk eller nekrotisk (Figur 4a-D). Dying celler kan oppdages ved hjelp Etidiumbromid homodimer å flekken DNA og RNA og generere en lys rødt signal14. Dette fargestoffet kan ikke trenge gjennom cellemembranen av levende celler.
Figur 1: pasient-avledet små tarm Nevroendokrine svulster (SBNETs) dyrket i EKSTRACELLULÆRE matrise (ECM) som spheroids. (A) isolering av tumorceller fra en resected SBNET og satt i kultur ved å blande med ECM. Scale bar representerer 100 μm. (B) areal på SBNET spheroids med hensyn til antall dager i kultur kvantifisert ved hjelp av ImageJ. Data ble innhentet fra SBNET spheroids av 1 pasient og er representert som gjennomsnittet området ± standard feil av gjennomsnittet. Areal på 30 til 60 spheroids ble målt for hvert tids punkt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immunofluorescence (IF) farging av SBNET-spheroids. IF farging av SBNET spheroids etter (A) 1 måned i kultur og (B) 9 måneder i kulturen. (C) hvis farging av bukspyttkjertel tumor organoids som ikke uttrykker SBNET markører som negative kontroller. Tumor spheroids ble løst i 4% paraformaldehyde og beiset bruker antistoffer mot synaptophysin (SYP) ved 1/600 fortynning, kromogranin A (CgA) ved 1/400 fortynning, og somatostatin reseptor 2 (SSTR2) ved 1/400. IF-bilder ble tatt på 100 MS, 200 MS og 400 MS eksponeringstid for SYP, CgA og SSTR2 farging, henholdsvis ved hjelp av 10x, 20x eller 40x mål. Scale bar representerer 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: immunhistokjemi (IHC) farging av SBNET-spheroids. Formalin-faste og parafin-embedded SBNET spheroids seksjoner ble deparaffinized, rehydrert, blokkert og farget med (A) SYP, (B) CgA, og (C) SSTR2 antistoffer. Bildene ble tatt med 400x mål. Scale bar representerer 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bruke SBNET spheroids for narkotika testing. (A) Bright felt bilde av SBNET spheroids behandlet med DMSO i 5 dager. (B) bilde av SBNET spheroids behandlet med DMSO og beiset med etidiumbromid Homodimer (etidiumbromid H). (C) Bright felt bilde av en død SBNET spheroid forming drue-lignende struktur etter behandling med 10 μM av Rapamycin i 5 dager. (D) Dead SBNET spheroid beiset med etidiumbromid H vises som røde prikker. Bilder av Etidiumbromid H flekker ble tatt ved hjelp av den røde filteret kuben på 100 MS eksponeringstid. Scale bar representerer 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vekst Media eller løsning | Sammensetning |
| Vask medium | DMEM inneholdende 1% FBS, 1% PENN/STREP, 1% glutamin |
| SBNET kultur medium | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PENN/STREP + 1% glutamin + 10 mM nikotinamid + 10 μg/mL insulin |
| Antistoff buffer | 2,5% storfe serum albumin, 0,1% natrium Natriumazid, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumklorid |
| Fryse medium | 90% FBS + 10% DMSO |
| Human lever stilk cellen isolasjon medium | DMEM/F12, 1% penn/strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 tillegg, 1/100 N2-tillegg, 1 mM N-acetylcysteine, 200 ng/mL RSPO 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nikotinamid, 10 uM-Forskolin, 5uM A83-01 |
| Menneskelige bukspyttkjertel stamcelleisolasjon medium | DMEM/F12, 1% penn/strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 tillegg, 1/100 N2-tillegg, 1 mM N-acetylcysteine, 200 ng/mL RSPO 1, 25 ng/mL noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nikotinamid, 10 uM-Forskolin, 5uM A83-01, 3 uM PGE-2 |
Tabell 1. Liste over vekst Media og løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor 3D kulturer har blitt en verdifull ressurs for prekliniske narkotika testing15. Ulike tumor organoid biobanker har nylig blitt etablert fra brystkreft og prostata kreftsvulster16,17. I denne studien, gir vi en detaljert protokoll til kultur SBNET som spheroids og en enkel og rask metode for å validere spheroid kulturer for NET markører ved immunofluorescence og teste narkotika følsomhet. Fra vår erfaring, SBNET spheroids kan vokse i ulike kultur medier. De vokser litt raskere i Stamcelle medier for menneskelig bukspyttkjertel eller lever isolasjon som vi tilpasset fra tidligere publiserte protokoller9. Vi valgte å dyrke SBNETs i DMEM/F12 medium supplert med insulin og nikotinamid fordi dette er rimeligere enn Stamcelle Media. Øke prosentandelen av Foster storfe serum er en annen strategi for å fremme veksten av SBNET organoid kulturer; men dette vil også øke den totale kostnaden for kultur vedlikehold.
Utføre IF farging og bildebehandling med en fluorescerende mikroskopi med 10x, 20x eller 40x mål er en rask og enkel metode for å teste for uttrykket SBNET markører. Det gir imidlertid ikke en veldefinert lokalisering i forhold til IHC (figur 2, Figur 3). Hvis dataene for eksempel viste at membranen lokalisering av SSTR2 er vanskelig å oppdage. Vi oppdager i hovedsak cytosolic SSTR2, som tidligere har blitt rapportert18. For å få en bedre lokalisering av markøren proteiner, anbefaler vi at du bruker IF og konfokalmikroskopi mikroskopi. Samlet sett er IF en nyttig metode for raskt å bekrefte SBNET markører. Våre antistoffer (anti-SYP, anti-CgA, anti-SSTR2) ikke reagerer på kryss med negativ kontroll organoids som ikke uttrykker SYP, CgA, eller SSTR2 (figur 2C) i IF eksperimentet. Dette forslaget at fluorescerende signaler som vi oppdaget er spesifikke for SBNET spheroids.
For å øke avkastningen av SBNET-spheroids, er de kritiske trinnene i denne protokollen under celle Filtreringstrinnet (trinn 2,2) og blander SBNET med væsken ECM for aliquoting i vevs kultur plater (trinn 2,8). Sørg for å dekke cellen sil membran og samlingen rør med Media for å hindre at SBNET cellene stikker til plasten. Liquid ECM vil raskt stivne hvis ikke plassert på isen. Sørg for å ha en liten is beholder i vevet kultur panseret for å holde ECM og SBNET celler kaldt.
Begrensningen av denne teknikken er langsom vekstrate på SBNET spheroids. Eksperimenter må planlegges på en effektiv måte og unngå å bruke overflødig mengde av SBNET-spheroids. En annen begrensning er langsom gjenoppretting etter fryse tine. Det tar over 1 måned etter tine for SBNET spheroids å begynne å vokse. For å overkomme denne begrensningen foreslår vi at du kontinuerlig opprettholder SBNET-spheroids i kulturer og deler dem etter behov (trinn 7). Selv etter 9 måneder i kultur, SBNET spheroids fortsatt opprettholde uttrykk for SBNET markører (figur 2B).
Selv om 3D-kulturen i SBNET spheroids er mer arbeidsintensiv enn tradisjonell 2D-kultur av andre kreftcelle linjer, er det en svært verdifull modell for in vitro-kulturen i SBNET fordi mange SBNET forskere ikke har tilgang til eksisterende cellelinjer. Med denne protokollen kan forskere og klinikere etablere SBNET spheroid kulturer fra resected svulster og dele dem med andre laboratorier. I tillegg kan SBNET-spheroids potensielt brukes til å etablere SBNET pasient avledede xenograft musemodeller. Samlet sett kan teknikkene som presenteres her være tilpasset for dyrking, karakteriserer og utføring av narkotika testing av andre garn som bukspyttkjertel eller lunge garn. Merk at organoids vekst vil variere mellom de ulike typene garn og pasientprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P50 CA174521 (til Jr Howe og A.M. Bellizzi). P.H. Ear er en mottaker av P50 CA174521 karriere Enhancement program prisen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines - P-STS, L-STS, H-STS - derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line--letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
