Summary
Los tumores neuroendocrinos (NET) se originan a partir de células neuroendocrinas de la cresta neural. Son de crecimiento lento y desafiantes para la cultura. Presentamos una estrategia alternativa para cultivar NETs desde el intestino delgado cultándolos como esferoides. Estos esferoides tienen marcadores de red intestinal pequeña y se pueden utilizar para pruebas de drogas.
Abstract
Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) son cánceres raros que se originan a partir de células enterocromafina del intestino. La investigación en este campo ha sido limitada porque se han generado muy pocas líneas celulares SBNET derivadas de pacientes. Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y son difíciles de propagar. Las pocas líneas de celda que se han establecido no están fácilmente disponibles, y después del tiempo en el cultivo puede no seguir expresando características de las celdas NET. La generación de nuevas líneas celulares podría tardar muchos años ya que las células SBNET tienen un tiempo de duplicación largo y se necesitan muchos pasos de enriquecimiento para eliminar los fibroblastos asociados al cáncer que se dividen rápidamente. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un protocolo para cultivar células SBNET de tumores extirpados quirúrgicamente como esferoides en la matriz extracelular (ECM). El ECM forma una matriz tridimensional que encapsula las células SBNET e imita el microambiente tumoral para permitir que las células SBNET crezcan. Aquí, caracterizamos la tasa de crecimiento de los esferoides de SBNET y describimos métodos para identificar marcadores SBNET utilizando microscopía de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica para confirmar que los esferoides son células tumorales neuroendocrinas. Además, utilizamos esferoides SBNET para probar la citotoxicidad de la rapamicina.
Introduction
Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) se originan en las células enterocromafina del intestino delgado. Aunque los SBNET son generalmente conocidos por crecer lentamente, comúnmente hacen metástasis en el hígado1. Si bien la extirpación quirúrgica o la ablación tumoral se pueden considerar en muchos casos, la recurrencia es casi universal y, por lo tanto, la terapia médica desempeña un papel importante en el manejo. Se han invertido enormes esfuerzos para generar nuevas líneas celulares SBNET para pruebas de drogas. Sin embargo, ha habido muy poco éxito. Sólo se han notificado 6 líneas de celda SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-STS, L-STS, H-STS)2,3,4,5; y desafortunadamente una línea celular ya no expresa los marcadores NET6 y otras tres líneas celulares SBNET (KRJ-I, L-STS, H-STS) se determinó que se derivan de linfoblastos transformados en lugar de NETs7. Con el fin de acelerar la identificación de medicamentos para la focalización de los SBNET, se necesitan métodos alternativos para las pruebas de drogas in vitro.
Aquí, aprovechamos la disponibilidad de SBNET resecados y hemos establecido una manera de cultivar estos SBNET derivados del paciente como esferoides que crecen en ECM. El objetivo general de este manuscrito es describir un método para cultivar SBNET como una cultura tridimensional (3D) y esbozar procedimientos para caracterizar estos esferoides para la retención de marcadores SBNET por tinción de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica.
Además, demostramos cómo estos esferoides SBNET se pueden utilizar para probar el efecto de la rapamicina, un fármaco contra el cáncer para neTs8. La razón detrás de este protocolo es desarrollar un nuevo método para cultivar células SBNET in vitro y usarlas para pruebas de drogas. La ventaja de esta técnica sobre el método tradicional de establecer una línea celular SBNET es que los cultivos 3D de SBNET se pueden obtener rápidamente y las pruebas de drogas se pueden hacer dentro de 3 semanas. Los esferoides de SBNET podrían utilizarse potencialmente como modelo para realizar pantallas de medicamentos in vitro para identificar nuevos fármacos para pacientes con SBNET. Dado que las líneas celulares SBNET no están ampliamente disponibles, los cultivos 3D de esferoides SBNET pueden servir como un nuevo modelo in vitro para el estudio de los SBNET y pueden compartirse entre los científicos en el campo.
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Protocol
Todos los experimentos con muestras de tumores neuroendocrinos humanos han sido aprobados por el comité IRB de hospitales y clínicas de la Universidad de Iowa (número de protocolo 199911057). En la Tabla de materialesse describe una lista de todos los materiales y equipos. En la Tabla 1se encuentra una lista de medios de crecimiento y soluciones clave.
1. Recogida de tumor neuroendocrino del intestino delgado (SBNET) y disociación celular
- Obtener muestras de SBNET del paciente resecadas después de la confirmación de los tejidos tumorales del Núcleo de Patología Quirúrgica.
- Cortar sBNET en cubos de 5 mm y almacenar en 25 ml de medio DMEM/F12 en un tubo cónico para el transporte al laboratorio.
- Transferir los tumores en DMEM que contienen 1% FBS, 1% penicilina/estreptomicina (Pen/Strep), 1% de glutamina (medio de lavado) e incubar en este medio de lavado durante 15 min.
- Transfiere los tumores a un nuevo plato y los tumores de picado a trozos de menos de 1 mm utilizando tijeras curvas estériles.
- Transfiera los tejidos picados a un nuevo tubo de 50 ml que contenga 25 ml de medio de lavado.
- Centrifugar la muestra a 500 x g durante 15 min a 4oC.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda los pellets en 10 ml de medio de lavado que contenga colagenasa (100 U/ml) y DNase (0,1 mg/ml).
- Permitir que la digestión de los tumores picados se produzca en una incubadora de 37oC con agitación lenta (50 rpm) durante 1,5 h.
2. Cultura de los SBNET como esferoides tumorales en ECM
- Una vez finalizada la digestión (paso 1.8), centrífuga a 500 x g durante 15 min a 4oC, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 15 ml de Wash Medium.
- Coloque un colador de celda de 70 m encima de un nuevo tubo de 50 ml y transfiera 10 ml del medio de lavado sobre el colador de la célula. Gire el medio de lavado para cubrir el lado del tubo de plástico para evitar que las células NET se peguen al lado del tubo de plástico.
- Filtrar la suspensión celular a través del colador celular.
- Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 oC, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 200 oL de medio de lavado (el volumen total es de 250 ml) y colocarlo sobre hielo.
- Transfiera 5 ml de células a 500 ml de medio de lavado (factor de dilución 1/100). Utilice las células diluidas para el recuento celular utilizando un hemocitómetro para obtener el número de células por mililitro. Multiplique por 100 para corregir el factor de dilución.
- Multiplique el número de células por ml obtenidas en el paso 2.5 por el volumen total de células en suspensión obtenido en el paso 2.4 (a 250 ol).
- Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4oC, desechar el sobrenadante y resuspender las células en ECM líquido (1 x 106 células/ml) y mantenerlas en hielo.
- Transfiera 5-20 l de esferoides SBNET en ECM a una placa de 96 pocillos y permita que el ECM líquido se solidifique colocando la placa en una incubadora de 37 oC durante 5 min.
- Añadir 200 l de medio de cultivo SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 g/ml de insulina) a cada pocto de la placa de 96 pocillos que contiene los esferoides SBNET en ECM.
- Alternativamente, cultivo sexistas SBNET en medios de células madre similares a lo que se ha descrito anteriormente para el cultivo de hígado humano o organoides pancreáticos9 y enumerados en la Tabla de Materiales.
- Cambie los medios cada 5-7 días.
3. Cuantificación del tamaño del esferoide SBNET utilizando ImageJ
- Tome 5-10 imágenes de esferoides de SBNET en los días 1, 4, 7, 14, 23 y 97 de la cultura utilizando un objetivo 10x.
- Abra las imágenes guardadas en ImageJ. Vaya a la pestaña Analizar, seleccione la opción Establecer medidas y active la opción Area.
- Utilice la herramienta de selección ovalada de la barra de herramientas para generar un elipsoide o un círculo alrededor de un esferoide bien enfocado.
- Vaya a la pestaña Analizar y seleccione la opción Medir. Repita los pasos 3.4 y 3.5 para obtener la medición de área de 25-50 esferoides SBNET. Los valores se proporcionan en el cuadrado de píxel.
- Convierta el área de píxeles a2 dividiendo el tamaño de cada píxel con la longitud de cada píxel al factor de conversión de las imágenes de microscopía.
NOTA: Las células SBNET crecen principalmente como esferoides y en algún momento como elipsoides.
4. Caracterización de los esferoides SBNETS por inmunofluorescencia
- Transfiera los organoides cultivados en ECM a un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta P1000.
- Centrifugar a 1.500 x g durante 1 min y quitar el sobrenadante.
- Lavar el cultivo organoide añadiendo 1 ml de PBS, mezclar, centrifugar a 1.500 x g durante 1 min y quitar el sobrenadante.
- Fije los organoides añadiendo 500 éL de 4% de paraformaldehído e incubar durante 15 min.
- Lave el cultivo dos veces con 1 ml de PBS.
- Permeabilizar el cultivo mediante la adición de 500 éL de PBS + 3% BSA + 0.1% Triton X 100 durante 5 min.
- Luego lavar tres veces con 1 mL de PBS + 3% De BSA.
- Incubar durante 1 h con anticuerpos primarios contra la sinaptofisina (SYP)10 a 1/600 de dilución o cromogranina A (CgA)11 y el receptor 2 de somatostatina (SSTR2)12 a 1/400 de dilución en tampón de anticuerpos (2,5% albúmina sérica bovina, 0,1% de sodio azida, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM de cloruro de sodio).
NOTA: Utilice 300 ml o más de solución de anticuerpos por tubo. - Lavar tres veces con 1 mL de PBS + 3% de BSA.
- Incubar con anticuerpos secundarios acoplados a FITC a 1/500 de dilución en tampón de anticuerpos durante 1 h. Utilice 300 ml o más de solución de anticuerpos por tubo.
- Lavar 3 veces con 1 mL de PBS + 3% de BSA. Asegúrese de aspirar y desechar todo el sobrenadante.
- Añadir 5 l de medio de montaje que contenga la mancha nuclear DAPI.
- Utilice una pipeta P20 para transferir 5 l de los esferoides SBNET del paso 4.12 a un portaobjetos de vidrio y sellar con un resbalón de la cubierta.
- Tome imágenes utilizando un microscopio fluorescente utilizando los objetivos 10x, 20x o 40x.
5. Caracterización de esferoides SBNET por inmunohistoquímica (IHC)
- Transfiera los esferoides SBNET de la placa de cultivo a un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta P1000.
- Centrifugar a 1.500 x g durante 1 min y quitar el sobrenadante.
- Arreglar los esferoides de SBNET añadiendo 500 l de formalina del 10% al tubo desde el paso 5.2 e incubar a temperatura ambiente durante 2-5 días antes de la incrustación de parafina y cortar secciones de esferoides de espesor de 4 m.
- Deparafina, rehidrata y usa la recuperación de epítopos inducidapor por calor en la Solución de Recuperación de Antígenos a pH 9 calentando a 97oC durante 20 min utilizando la estación de procesamiento de diapositivas automatizada 3 en 1 para preparar diapositivas para la incubación de anticuerpos.
- Bloquee los portaobjetos e incubar con anticuerpos primarios contra SYP10 a una dilución de 1/100 durante 15 min, CgA11 a una dilución de 1/800 durante 15 minutos y SSTR212 a una dilución de 1/5.000 durante 30 min.
- Incubar con el sistema secundario de detección de anticuerpos durante 15 min para la tinción anti-SYP y CgA y 30 min para la tinción anti-SSTR2. Tome fotografías utilizando un objetivo de 400x.
6. Tratamiento de organoides SBNET con rapamicina
- Disolver la rapamicina en DMSO para obtener una solución de stock de 10 mM.
- Preparar el medio de cultivo SBNET con DMSO (p. ej., 1 ml de medio de cultivo SBNET + 1 l de DMSO) y medio de cultivo SBNET con 10 m de rapamicina (por ejemplo, 1 ml de medio de cultivo SBNET + 1 l de solución de stock de rapamicina de 10 mM).
- Transfiera medios de 200 l con medio de cultivo SBNET con DMSO o rapamicina de 10 m a cultivos de esferoides De SBNET.
- Incubar esferoides SBNET durante 5 días en una incubadora de 37oC.
- Añadir 1 m de homodímero e incubar durante 30 min. Retire el medio que contenga homodímero de etidio, lave con 200 ml de PBS y transfiera 200 ml de PBS a cada poca.
- Tome imágenes de microscopía de esferoides SBNET con y sin tratamiento farmacológico utilizando el cubo de filtro rojo con los objetivos 10x, 20x o 40x de un microscopio fluorescente.
NOTA: Las células muertas teñidas con Ethidium homodimer aparecen como rojas utilizando el cubo de filtro rojo G de un microscopio disponible comercialmente(Tabla de materiales). Alternativamente, la señal se puede capturar utilizando un espectrofotómetro a 535 nm de excitación y 624 nm de emisión.
7. Dividir los esferoides sBNET
NOTA: Esto se hace para la expansión y para compartir con otros investigadores.
- Utilice una pipeta P1000 para romper mecánicamente el ECM y aspirar el ECM con esferoides SBNET a un tubo estéril de 1,5 ml.
- Centrifugar a 1.000 x g a 4oC, retirar todo el sobrenadante y colocar el tubo sobre hielo.
- Añadir 2-4x el volumen del nuevo ECM al pellet. Mezcle el nuevo ECM con los antiguos esferoides ECM y SBNET pipeteando 10veceros. Evitar introducir burbujas de aire.
- Transfiera 5-20 l de la mezcla de esferoides ECM y SBNET a una placa nueva y permita que ECM se solidifique.
- Cubrir con nuevo medio SBNET y transferir a la incubadora. La tasa de recuperación es de aproximadamente 95 a 100%.
- Para enviar esferoides SBNET a otro laboratorio, transfiera los esferoides SBNET con el nuevo ECM a un matraz T25 y permita que ECM se solidifique.
- Llene el matraz T25 con medio esferoide SBNET, atornille la tapa firmemente y prepare el paquete de envío.
- Al recibir una referencia cultural esferoide SBNET, quite el medio de referencia cultural y realice los pasos 7.1 a 7.5 para volver a colocar los esferoides de SBNET en la referencia cultural.
8. Crioalmacenamiento y recuperación de esferoides SBNET
- Transfiera los esferoides SBNET de 5-10 pozos pequeños a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 500 x g durante 15 min a 4 oC, eliminar el sobrenadante, resuspender en medio de congelación (90% FBS + 10% DMSO), almacenar en un recipiente de congelación celular, y colocarlo en -80 oC.
- Transfiera al nitrógeno líquido para un almacenamiento más largo.
- Para recuperar los esferoides de SBNET, coloque el vial congelado sobre hielo y espere hasta que el contenido esté completamente descongelado. Invierta el tubo y vuelva a colocarlo en hielo para acelerar el proceso de descongelación.
- Una vez descondezcada la muestra, se coloca dentro de una centrífuga preenfriada y gira a 1.000 x g durante 10 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los esferoides en ECM. Mantenga el tubo en hielo, transfiera 20 l a una placa nueva y espere a que el ECM se solidifique.
- Transferir 200 l de medio de cultivo SBNET con 10 m de inhibidor de ROCK (Y-27632)13 y transferirlo a la incubadora.
- Permita que los esferoides de SBNET se recuperen y crezcan durante 1 semana. Retire el medio de cultivo antiguo, reponga con 200 ml de medio de cultivo SBNET y vuelva a la incubadora.
- Permita que los esferoides de SBNET sigan creciendo.
NOTA: Los esferoides de rápido crecimiento tardan al menos 1 semana en empezar a recuperarse después de la criopreservación13. Los esferoides de SBNET tardan un mínimo de 2-4 semanas en empezar a crecer. Muchas células SBNET morirán dentro de las primeras 2 semanas y la tasa de supervivencia es inferior al 10%. Dado que se trata de un proceso muy lento y de bajo rendimiento, es mejor compartir con otros investigadores esferoides SBNET en matraces de cultivo (como se describe en el paso 7). El crioalmacenamiento y la recuperación solo deben utilizarse como un plan de respaldo en caso de que se produzca una contaminación bacteriana.
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Representative Results
Actualmente sólo hay 2 líneas celulares SBNET establecidas y publicadas2,3,4,5 y no están fácilmente disponibles para muchos investigadores. Aquí, proponemos cultivar SBNET como esferoides en ECM y utilizar esto como un modelo alternativo para estudiar la sensibilidad a los medicamentos SBNET. Se recogió un tumor derivado del paciente de un SBNET que hizo metástasis en el hígado, se digiere para liberar células SBNET y se mezcló con ECM líquido para establecer un cultivo esferoide SBNET(Figura 1A). El Ki-67 de este SBNET fue del 4,3%. Aunque los esferoides de SBNET tienen una tasa de crecimiento lenta, su crecimiento puede ser monitoreado por imágenes microscópicas(Figura 1A). Los esferoides SBNET tardan aproximadamente 14 días en duplicar su tamaño cuando el medio de referencia cultural se cambia una vez a la semana(Figura 1B). Después de 14 días en cultivo, los esferoides SBNET no aumentan de tamaño. En su lugar, algunas celdas SBNET se disociarán a una ubicación vecina y formarán nuevos esferoides. Para propagar el cultivo de esferoides SBNET, coseleele el ECM que contiene esferoides de SBNET y vuelva a sembrarlos en una nueva placa de cultivo con un nuevo medio de cultivo (paso 7).
Para confirmar que los cultivos organoides contienen células SBNET, describimos un método simple y rápido para manchar los esferoides para los marcadores SBNET como sinaptofisina, cromogranina A y el receptor de somatostatina tipo 2 (SSTR2) utilizando la microscopía de inmunofluorescencia (IF) ( Paso 4). Utilizando anticuerpos específicos contra la sinaptofisina, la cromogranina A y SSTR2, nuestros datos IF mostraron que estos marcadores están localizados en el citoplasma y en la membrana de las células SBNET(Figura 2A,en verde) después de 1 o 9 meses en cultivo (Freigure 2B ). Para garantizar la especificidad de los anticuerpos SYP, CgA y SSTR2, realizamos los mismos procedimientos de tinción en una línea organoidedería del tumor del páncreas que no expresa SYP, CgA o SSTR2(Figura 2C)que no se detectó ninguna señal verde. La principal ventaja de este experimento IF esferoide SBNET es que se puede realizar dentro de 4 h y da información de tinción similar a la inmunohistoquímica (IHC; Figura 3). Proporcionamos un protocolo para realizar IHC de los esferoides SBNET en el paso 5.
La cultuización de SBNET como esferoides es una técnica valiosa para identificar fármacos que pueden inhibir el crecimiento de SBNET. Como prueba de principio, tratamos esferoides de SBNET con rapamicina durante 5 días, un inhibidor de mTOR, una clase de medicamentos comúnmente utilizados para tratar losNETs 8. En comparación con nuestro esferoide SBNET de control, el esferoide tratado con rapamicina formó una estructura similar a la uva y se convirtió en apoptotico o necrótico(Figura 4A-D). Las células moribundas se pueden detectar utilizando Ethidium homodimer para manchar ADN y ARN y generar una señal roja brillante14. Este tinte no puede penetrar la membrana celular de las células vivas.
Figura 1: Tumores neuroendocrinos de intestino pequeño derivados del paciente (SBNET) cultivados en matriz extracelular (ECM) como esferoides. (A) Aislamiento de células tumorales de un SBNET resecado y puesto en cultivo mezclando con ECM. La barra de escala representa 100 m.(B) Superficie de esferoides De SBNET con respecto al número de días en cultivo cuantificado mediante ImageJ. Los datos se obtuvieron de esferoides De SBNET de 1 paciente y se representan como el área media - error estándar de la media. La superficie de 30 a 60 esferoides se midió para cada punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Influorescencia (IF) tinción de esferoides De BBNET. SI la tinción de esferoides SBNET después de (A) 1 mes en cultivo y (B) 9 meses en cultivo. (C) SI la tinción de organoides tumorales del páncreas que no expresan marcadores SBNET como controles negativos. Los esferoides tumorales se fijaron en 4% de paraformaldehído y se mancharon utilizando anticuerpos contra la sinaptofisina (SYP) a 1/600 de dilución, cromogranina A (CgA) a 1/400 de dilución, y el receptor 2 de somatostatina (SSTR2) a 1/400. SI las imágenes se tomaron a 100 ms, 200 ms y 400 ms de tiempo de exposición para la tinción SYP, CgA y SSTR2, respectivamente utilizando los objetivos 10x, 20x o 40x. La barra de escala representa 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inmunohistoquímica (IHC) tinción de esferoides de SBNET. Las secciones de esferoides SBNET fijas y incrustadas en parafina de formalina se desparatinaron, rehidrataron, bloquearon y mancharon con (A) SYP, (B) CgA y (C) anticuerpos SSTR2. Las imágenes se tomaron utilizando el objetivo 400x. La barra de escala representa 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Uso deesferoides SBNET para pruebas de drogas. (A) Imagen de campo brillante de esferoides SBNET tratados con DMSO durante 5 días. (B) Imagen de los esferoides SBNET tratados con DMSO y teñidos con Ethidium homodimer (Ethidium H). (C) Imagen de campo brillante de un esferoide SBNET muerto formando una estructura similar a una uva después del tratamiento con 10 m de rapamicina durante 5 días. (D) El esferoide SBNET muerto teñido con Ethidium H aparece como puntos rojos. Las imágenes de la tinción Ethidium H se tomaron utilizando el cubo de filtro rojo a 100 ms de tiempo de exposición. La barra de escala representa 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medios de crecimiento o solución | Composición |
| Medio de lavado | DMEM que contiene 1% FBS, 1% PEN/STREP, 1% Glutamina |
| Medio de cultivo SBNET | DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamina + 10 mM de nicotinamida + 10 g/ml de insulina |
| Búfer de anticuerpos | 2.5% albúmina sérica bovina, 0,1% azida sódica, 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM de cloruro sódico |
| Medio de congelación | 90% FBS + 10% DMSO |
| Medio de aislamiento de células madre hepáticas humanas | DMEM/F12 , 1% Pluma/Strep, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Suplemento, 1/100 N2 Suplemento, 1 mM N-acetilcisteína, 200 ng/mL Rspo 1, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM nicotinamida, 10 uM forskoline, 5uM A83-01 |
| Medio de aislamiento de células madre pancreáticas humanas | DMEM/F12 , 1% Pluma/Estreptococo, 1% GlutaMAX, 10 mM HEPES, 1/50 B27 Suplemento, 1/100 N2 Suplemento, 1 mM N-acetilcisteína, 200 ng/mL Rspo 1, 25 ng/mL Noggin, 50ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF10, 10 mM de nicotinamida, 10 uM forskoline, 5uM A83-01, 3 uM PGE2 |
Tabla 1. Lista de medios de crecimiento y solución.
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Discussion
Los cultivos 3D tumorales se han convertido en un recurso valioso para las pruebas de fármacos preclínicos15. Recientemente se han establecido varios biobancos organoides tumorales a partir de tumores de cáncer de mama y de cáncer de próstata16,17. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el cultivo de SBNET como esferoides y un método simple y rápido para validar los cultivos de esferoides para marcadores NET por inmunofluorescencia y pruebando la sensibilidad a los fármacos. Desde nuestra experiencia, los esferoides SBNET pueden crecer en diversos medios de cultivo. Crecen un poco más rápido en medios de células madre para páncreas humano o aislamiento hepático que adaptamos de los protocolos publicados anteriormente9. Elegimos cultivar los SBNET en medio DMEM/F12 complementados con insulina y nicotinamida porque esto es menos costoso que los medios de células madre. Aumentar el porcentaje de suero bovino fetal es otra estrategia para promover el crecimiento de los cultivos organoides de SBNET; sin embargo, esto también aumentaría el costo total para el mantenimiento de la cultura.
Realizar la tinción IF y la toma de imágenes con una microscopía fluorescente utilizando los objetivos 10x, 20x o 40x es un método rápido y sencillo para probar la expresión marcadores SBNET. Sin embargo, no da una localización bien definida en comparación con IHC(Figura 2, Figura 3). Por ejemplo, los datos IF mostraron que la localización de la membrana de SSTR2 es difícil de detectar. Detectamos principalmente el SSTR2 citosólico, que se ha notificado previamente18. Para obtener una mejor localización de las proteínas marcadoras, recomendamos el uso de IF y microscopía confocal. En general, IF es un método útil para confirmar rápidamente los marcadores SBNET. Nuestros anticuerpos (anti-SYP, anti-CgA, anti-SSTR2) no reaccionaron cruzadamente con los organoides de control negativo que no expresan SYP, CgA o SSTR2(Figura 2C)en el experimento IF. Esta sugerencia de que las señales fluorescentes que detectamos son específicas de los esferoides SBNET.
Para aumentar el rendimiento de los esferoides De SBNET, los pasos críticos de este protocolo son durante el paso de filtración celular (paso 2.2) y la mezcla del SBNET con el ECM líquido para alícuota en placas de cultivo de tejido (paso 2.8). Asegúrese de cubrir la membrana del colador celular y el tubo de recogida con medios para evitar que las células SBNET se peguen al plástico. La ECM líquida se solidifique rápidamente si no se coloca sobre hielo. Asegúrese de tener un pequeño recipiente de hielo en la campana de cultivo de tejido para mantener las células ECM y SBNET frías.
La limitación de esta técnica es la tasa de crecimiento lento de los esferoides SBNET. Los experimentos deben planificarse de manera eficiente y evitar el uso de una cantidad excesiva de esferoides SBNET. Otra limitación es la recuperación lenta después del deshielo de congelación. Se tarda más de 1 mes después de descongelar para que los esferoides SBNET comiencen a crecer. Para superar esta limitación, sugerimos mantener continuamente los esferoides SBNET en las culturas y dividirlos según sea necesario (paso 7). Incluso después de 9 meses en cultivo, los esferoides SBNET siguen manteniendo la expresión de marcadores SBNET(Figura 2B).
Aunque el cultivo 3D de esferoides De SBNET es más laborioso que el cultivo 2D tradicional de otras líneas celulares cancerosas, es un modelo extremadamente valioso para el cultivo in vitro de SBNET porque muchos investigadores de SBNET no tienen acceso a las líneas celulares existentes. Con este protocolo, científicos y médicos pueden establecer cultivos esferoides DeBNET a partir de tumores resecados y compartirlos con otros laboratorios. Además, los esferoides SBNET podrían utilizarse potencialmente para establecer modelos de ratón xenoinjerto según el paciente SBNET. En general, las técnicas presentadas aquí se pueden adaptar para el cultivo, caracterización y realización de pruebas de drogas de otros NETs como pancreáticos o pulmón. Tenga en cuenta que la tasa de crecimiento de los organoides variará entre los diferentes tipos de NET y las muestras de pacientes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH P50 CA174521 (a J.R. Howe y A.M. Bellizzi). P.H. Ear ha recibido el premio P50 CA174521 Career Enhancement Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
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