Rapida fabbricazione di dispositivi microfluidici personalizzati per applicazioni di ricerca e didattiche
Summary
Qui presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare dispositivi microfluidici personalizzati con un minimo investimento finanziario e temporale. L’obiettivo è facilitare l’adozione di tecnologie microfluidiche nei laboratori di ricerca biomedica e negli ambienti educativi.
Abstract
I dispositivi microfluidici consentono la manipolazione di fluidi, particelle, cellule, organi di microdimensioni o organismi in canali che vanno dalle scale nano-submillimetri. Un rapido aumento dell’uso di questa tecnologia nelle scienze biologiche ha spinto alla necessità di metodi accessibili a un’ampia gamma di gruppi di ricerca. Gli attuali standard di fabbricazione, come l’incollaggio PDMS, richiedono tecniche litografiche e di incollaggio costose e dispendiose in termini di tempo. Un’alternativa praticabile è l’uso di attrezzature e materiali che sono facilmente accessibili, richiedono competenze minime e consentono la rapida iterazione dei progetti. In questo lavoro descriviamo un protocollo per la progettazione e la produzione di PET-laminati (PETL), dispositivi microfluidici che sono economici, facili da fabbricare e consumano molto meno tempo per generare rispetto ad altri approcci alla tecnologia microfluidica. Sono costituiti da fogli di pellicola legati termicamente, in cui canali e altre caratteristiche sono definiti utilizzando una taglierina artigianale. I PETL risolvono sfide tecniche specifiche sul campo, riducendo drasticamente gli ostacoli all’adozione. Questo approccio facilita l’accessibilità dei dispositivi microfluidici sia in contesti di ricerca che educativi, fornendo una piattaforma affidabile per nuovi metodi di indagine.
Introduction
La microfluidica consente il controllo dei fluidi su piccole scale, con volumi che vanno dai microlitri (1 x 10-6 L) ai picoliri (1 x 10-12 L). Questo controllo è stato reso possibile in parte grazie all’applicazione di tecniche di microfabbricazione prese in prestito dall’industria deimicroprocessori 1. L’uso di reti di micro-dimensioni di canali e camere permette all’utente di sfruttare i fenomeni fisici distinti caratteristici di piccole dimensioni. Ad esempio, su scala micrometrica, i fluidi possono essere manipolati utilizzando il flusso laminare, dove le forze viscose dominano le forze inerziali. Di conseguenza, il trasporto diffuso diventa la caratteristica prominente della microfluidica e può essere studiato quantitativamente e sperimentalmente. Questi sistemi possono essere adeguatamente compresi utilizzando le leggi di Fick, la teoria del movimento browniano, l’equazione termica e/o le equazioni Dier-Stokes, che sono importanti derivazioni nei campi della meccanica dei fluidi e dei fenomeni di trasporto2.
Poiché molti gruppi nelle scienze biologiche studiano sistemi complessi a livello microscopico, originariamente si pensava che i dispositivi microfluidici avrebbero avuto un impatto immediato e significativo sulle applicazioni di ricerca in biologia2,3. Ciò è dovuto al fatto che la diffusione è dominante nel trasporto di piccole molecole attraverso le membrane o all’interno di una cellula, e le dimensioni delle cellule e dei microrganismi sono una corrispondenza ideale per sistemi e dispositivi sub-millimetrici. Pertanto, c’era un potenziale significativo per migliorare il modo in cui viene condotta la sperimentazione cellulare e molecolare. Tuttavia, l’ampia adozione delle tecnologie microfluidiche da parte dei biologi è rimasta indietro rispetto alle aspettative4. Una semplice ragione per la mancanza di trasferimento tecnologico può essere i confini disciplinari che separano ingegneri e biologi. La progettazione e la fabbricazione di dispositivi personalizzati sono rimaste appena al di fuori delle capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca biologici, rendendoli dipendenti da competenze e strutture esterne. La mancanza di familiarità con le potenziali applicazioni, i costi e il tempo necessario per l’iterazione della progettazione sono anche ostacoli significativi per i nuovi utenti. È probabile che queste barriere abbiano avuto l’effetto di interrompere l’innovazione e prevenire la diffusa applicazione della microfluidica per affrontare le sfide nelle scienze biologiche.
Un esempio: dalla fine degli anni ’90 la fotolitografia morbida è stata il metodo di scelta per la fabbricazione di dispositivi microfluidici. La PDMS (polydimethylsiloxane, un polimero organico a base di silicone) è un materiale ampiamente utilizzato a causa delle sue proprietà fisiche, come la trasparenza, la deformabilità e la biocompatibilità5. La tecnica ha riscosso un grande successo, con dispositivi lab-on-a-chip e organ-on-a-chip continuamente sviluppati su questa piattaforma6. La maggior parte dei gruppi che lavorano su queste tecnologie, tuttavia, si trovano nei reparti di ingegneria o hanno forti legami con loro4. La litografia di solito richiede camere pulite per la fabbricazione di stampi e attrezzature di incollaggio specializzate. Per molti gruppi, questo rende i dispositivi PDMS standard meno ideali a causa dei loro costi di capitale e lead time, in particolare quando è necessario apportare modifiche di progettazione ripetute. Inoltre, la tecnologia è per lo più inaccessibile al biologo medio e agli studenti senza accesso a laboratori di ingegneria specializzati. È stato proposto che, affinché i dispositivi microfluidici siano ampiamente adottati, devono imitare alcune delle qualità dei materiali comunemente utilizzati dai biologi. Ad esempio, il polistirene utilizzato per la coltura cellulare e i bioasi sono economici, usa e getta e sono suscettibili alla produzione di massa. Al contrario, la produzione industriale di microfluidica basata su PDMS non è mai stata realizzata a causa della sua morbidezza meccanica, dell’instabilità del trattamento superficiale e della permeabilità del gas5. A causa di queste limitazioni, e con l’obiettivo di risolvere le sfide tecniche utilizzando dispositivi personalizzati costruiti “in-house”, descriviamo un metodo alternativo che utilizza xurografia7,8,9 protocolli e laminazione termica. Questo metodo può essere adottato con poco capitale e investimenti di tempo.
I PETL sono fabbricati con pellicola in polietilene terephthalate (PET), rivestita con l’acetato di etilene-vinile termoadesivo (EVA). Entrambi i materiali sono ampiamente utilizzati nei prodotti di consumo, sono biocompatibili e sono prontamente disponibili al minimo costo10. La pellicola PET/EVA può essere ottenuta sotto forma di sacchetti o rotoli di laminazione. Utilizzando una fresa artigianale controllata dal computer che si trova comunemente nei negozi di hobbyo o artigianato, i canali sono tagliati da un singolo foglio di pellicola per definire l’architettura del dispositivo11. I canali vengono quindi sigillati applicando strati aggiuntivi di pellicola (o vetro) che vengono incollati utilizzando un laminatore termico (ufficio) (Figura 1A). Perforati, vengono aggiunti paraurti in vinile autoadesivi per facilitare l’accesso ai canali. I tempi di fabbricazione vanno da 5 a 15 min, il che consente una rapida iterazione di progettazione. Tutte le attrezzature e i materiali utilizzati per realizzare i PETL sono accessibili commercialmente e convenienti (<350 USD di costo di partenza, rispetto alle migliaia di USD per la litografia). Pertanto, i PETL forniscono una nuova soluzione a due problemi principali posti dalla microfluidica convenzionale: convenienza ed efficacia temporale (vedere PDMS/PETL confronto nelle tabelle supplementari 1, 2).
Oltre a fornire ai ricercatori l’opportunità di progettare e fabbricare i propri dispositivi, i PETL possono essere facilmente adottati in classe perché sono semplici e intuitivi da usare. I PETL possono essere inclusi nei programmi di scuola superiore e universitaria8, dove vengono utilizzati per aiutare gli studenti a comprendere meglio i concetti fisici, chimici e biologici, come la diffusione, il flusso laminare, la micromixing, la sintesi delle nanoparticelle, la formazione di gradienti e la chemiotassi.
In questo lavoro illustriamo il flusso di lavoro complessivo per la fabbricazione di chip PETL modello con diversi livelli di complessità. Il primo dispositivo viene utilizzato per facilitare l’imaging di cellule e micro-organi in una piccola camera. Il secondo, più complesso dispositivo è costituito da diversi strati e materiali, ed è utilizzato per la ricerca in meccanobiologia9. Infine, abbiamo costruito un dispositivo che mostra diversi concetti di fluidodinamica (messa a fuoco idrodinamica, flusso laminare, trasporto diffuso e micromixing) per scopi educativi. I progetti di flusso di lavoro e dispositivi qui presentati possono essere facilmente adattati per una vasta gamma di scopi sia nel campo della ricerca che in quello della classe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre la microfluidica è sempre più presente nella serie di laboratori di tutto il mondo, il ritmo di adozione è stato deludente, data la potenziale del suo impatto positivo16. Il basso costo e l’elevata efficienza della fabbricazione di dispositivi microfluidici sono essenziali per accelerare l’adozione di questa tecnologia nel laboratorio di ricerca medio. Il metodo qui descritto utilizza più strati di pellicola per creare dispositivi bi e tre dimensionali a una frazione del tempo e dei cos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro in questo manoscritto è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (NSF) (Grant No. CBET-1553826) (e supplemento DI ROA associato) e il National Institutes of Health (NIH) (Grant No. R35GM124935) a J.e. Ringraziamo Jenna Sjoerdsma e Basar Bilgiàer per aver fornito cellule di mammiferi e protocolli di coltura e Fabio Sacco per l’assistenza con cifre supplementari.
Materials
| Biopsy punch (1mm) | Miltex | 33-31AA | Optional, replaces rotary tool set up |
| Blunt needles | Janel, Inc. | JEN JG18-0.5X-90 | Remove plastic and attach to Tygon tubing |
| Coverslips | Any | 24 x 60 mm are preferred | |
| Cutting Mat and blades | Silhouette America or Nicapa | www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats | Re-use/Disposables |
| Double-sided tape | Scotch/3M | 667 | Small amounts, any width or brand |
| PEEK tubing | IDEX/any | 1581L | Different configurations available. Consider using Tygon tubing intead, if not already using PEEK |
| PET/EVA thermal laminate film | Scotch/3M & Transcendia | TP3854-200,TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet | 3 – 6 mil (mil = 1/1000 inch) laminating pouches or rolls. |
| PVC film – Cling Wrap | Glad / Any | Food wrapping | |
| Rotary tool-drill | Dremel/Any | 200-121 or other | 1/32 and 3/64" drill bits from Dremel recommended |
| Rubber Roller | Speedball | 4126 | To facilitate adhesion, any brand will work |
| Scissors & tweezers | Any | Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Cole-Parmer –# UX-07387-12 | Quality brands are recommended |
| Silhouette CAMEO Craft cutter | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T | Preferred craft cutter |
| Silhouette Studio software | Silhouette America | www.silhouetteamerica.com/software | Controls the craft cutter and provides drawing tools (free download MAC and PC) |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus or New Era | 70-4504 or NE-300 | Pumps are ideal, pipettes or burettes can be used. |
| Syringes | Any | 1-3mL | |
| Thermal laminator | Scotch/3M | TL906 | Standard home/office model |
| Tygon tubing (E-3603) | Cole-Parmer | EW-06407-70 | Use with blunt needle tips |
| Vinyl furniture bumpers | DerBlue/3M/ Everbilt | Clear, self-adhesive (6 x 2 mm and 8 x 3 mm) | Round bumpers are recommended |
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