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Genetics

Dissection des muscles de vol de melanogaster de Drosophila pour des approches d'Omics

Published: October 17, 2019 doi: 10.3791/60309
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich
* These authors contributed equally

Summary

Le muscle de vol de Drosophila est un modèle puissant pour étudier la régulation transcriptionnelle, l'épissage alternatif, le métabolisme, et la mécanobiologie. Nous présentons un protocole pour la dissection du muscle de vol fluorescent-étiqueté des chiots vivants pour produire des échantillons fortement enrichis idéaux pour la protéomique et le séquençage profond. Ces échantillons peuvent offrir des aperçus mécanistes importants dans divers aspects du développement musculaire.

Abstract

Le muscle de vol de Drosophila est un modèle puissant pour étudier divers processus tels que la régulation transcriptionnelle, l'épissage alternatif, le métabolisme, et la mécanobiologie, qui influencent tous le développement de muscle et la myofibrillogenesis. Les données d'Omics, telles que celles générées par la spectrométrie de masse ou le séquençage profond, peuvent fournir des aperçus mécanistes importants dans ces processus biologiques. Pour de telles approches, il est utile d'analyser des échantillons spécifiques aux tissus afin d'augmenter à la fois la sélectivité et la spécificité des empreintes digitales des mics. Ici nous présentons un protocole pour la dissection du muscle de vol fluorescent-étiqueté des chiots vivants pour produire des échantillons fortement enrichis de muscle pour des applications d'omics. Nous décrivons d'abord comment disséquer les muscles de vol aux premiers stades pupal (lt;48 h après la formation de puparium [APF]), lorsque les muscles sont discernables par l'étiquetage des protéines fluorescentes vertes (GFP). Nous décrivons ensuite comment disséquer les muscles des puupae tardives (aPF) ou des adultes, lorsque les muscles se distinguent sous un microscope disséquant. Le protocole vidéo d'accompagnement rendra ces dissections techniquement exigeantes plus accessibles aux communautés de recherche sur les muscles et la drosophile. Pour les applications d'ARN, nous éduquons la quantité et la qualité de l'ARN qui peut être isolé à différents moments et avec des approches différentes. Nous montrons en outre que Bruno1 (Bru1) est nécessaire pour un changement temporel dans la chaîne lourde de myosine (Mhc) épissage, démontrant que les muscles disséqués peuvent être utilisés pour l'ARNm-Seq, la spectrométrie de masse, et la transcription inverse polymérase réaction en chaîne (RT-PCR) Applications. Ce protocole de dissection aidera à promouvoir des analyses d'omics spécifiques aux tissus et peut être généralement appliqué pour étudier de multiples aspects biologiques de la myogenèse.

Introduction

Les technologies modernes d'omique fournissent des perspicacités importantes dans le développement de muscle et les mécanismes sous-jacents aux désordres humains de muscle. Par exemple, l'analyse des données transcriptomiques combinée à la vérification génétique et biochimique dans les modèles animaux a révélé que la perte du facteur dépissage RBM20 provoque une cardiomyopathie dilatée due à la régulation d'un réseau cible de plus de 30 sarcomères gènes précédemment associés à une maladie cardiaque, y compris la titine1,2,3.

Dans un deuxième exemple, des études de la culture cellulaire, des modèles animaux, et les patients humains ont montré que la dystrophie myotonique est causée par une perturbation de la régulation de l'ARN due à la séquestration de Muscleblind (MBNL) et l'upregulation de CELF14,5. La dynamique inter-réglementaire et temporelle entre MBNL et CELF1 (également appelé CUGBP1 ou Bruno-Like 2) aide à expliquer les modèles d'épissage embryonnaire persistants dans les patients myotoniques de dystrophie. En outre, le vaste réseau de cibles mal réglementées aide à expliquer la nature complexe de la maladie4,6,7,8. La majorité de ces études utilisent des approches omics dans les organismes modèles génétiques pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la maladie musculaire humaine. En outre, ils soulignent l'importance de comprendre d'abord l'expression génétique spécifique temporelle et tissulaire, la modification des protéines et les modèles métaboliques dans les muscles sains pour comprendre les altérations des muscles malades ou vieillissants.

Drosophila melanogaster est un autre organisme modèle génétique bien établi. La structure du sarcoque ainsi que les composants individuels de sarcore sont fortement conservés des mouches aux vertébrés4,9,10, et les muscles de vol indirects (IFM) sont devenus un modèle puissant à étudier multiples aspects du développement musculaire11,12. Tout d'abord, les muscles de vol fibrillaire sont fonctionnellement et morphologiquement distincts des muscles tubulaires du corps11,13, permettant l'étude des mécanismes de développement spécifiques de type musculaire. Des facteurs de transcription, y compris Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd), et Homothorax (Hth)15 ont été identifiés comme régulateurs du destin fibrillaire. En outre, en aval de Salm, l'homolog CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) dirige un programme d'épissage spécifique au fibrillaire16,17.

Deuxièmement, les IFM sont un modèle important pour comprendre le processus de myogenèse elle-même, de la fusion myoblast et l'attachement myotube à la myofibrillogénèse et la maturation sarcomere9,18,19. Troisièmement, la génétique de Drosophila permet l'étude des contributions par les protéines individuelles, les domaines de protéine, et les isoformes de protéine à la formation de sarcome, à la fonction, et aux propriétés biophysiques20,21,22 ,23. Enfin, des modèles IFM ont été développés pour l'étude de multiples troubles musculaires humains, tels que la dystrophie myotonique, myopathies myofibrillaires, troubles dégénératifs musculaires, actinopathies, etc.24,25,26 ,27, et ont fourni des informations importantes sur les mécanismes de la maladie et les thérapies potentielles28,29,30. Ainsi, Drosophila est un modèle utile pour répondre à de nombreuses questions ouvertes dans le domaine de la myogenèse, y compris les mécanismes de la transcription spécifique de type musculaire, l'épissage, et la régulation de la chromatine, ainsi que le rôle du métabolisme dans le développement musculaire. L'application des technologies modernes d'omique, en particulier en combinaison avec la grande variété d'essais génétiques, biochimiques et biologiques cellulaires disponibles dans Drosophila, a le potentiel de faire progresser considérablement la compréhension des muscles développement, le vieillissement et la maladie.

IfMs sont les plus grands muscles de la mouche, couvrant près de 1 mm sur toute la longueur du thorax chez les adultes31,32. Cependant, cette petite taille génère le défi d'obtenir suffisamment d'échantillons pour appliquer les technologies d'omique dans Drosophila d'une manière spécifique de type tissu. En outre, les IFM font partie de la musculature adulte qui se forme pendant les stades pupal. Les myoblastes fusionnent pour former des myotubes, qui se fixent aux tendons autour de 24 h après la formation de puparium (APF) et subissent une étape de compactage nécessaire pour initier la myofibrillogénèse autour de 30 h APF (Figure 1A-D)18,33, 34.

Les myofibres se développent alors pour s'étendre sur toute la longueur du thorax, avec des myofibrils subissant une phase initiale de croissance concentrée sur l'addition de sarcoque jusqu'à environ 48 h APF, puis la transition à une phase de maturation, dans laquelle les sarcoques se développent dans la longueur et la largeur et sont remodelé pour établir l'extensible-activation par 72 h APF (Figure 1A-D)32,35. L'arrivée de la maturation des fibres est au moins partiellement contrôlée par Salm et E2F32,36,37, et plusieurs isoformes de protéines sarques spécifiques à l'IFM dont l'épissage est contrôlé par Bru1 sont incorporés au cours de cette phase16,17. Les mouches matures s'éclosent de 90 à 100 h APF. Cela signifie que pour étudier le développement musculaire, IFM doit être isolé avec suffisamment de quantité, de qualité et de pureté à partir de plusieurs points de temps pupal pour faciliter l'analyse en utilisant des approches omics.

Plusieurs protocoles pour la dissection de l'IFM ont été publiés. Bien que ces protocoles fonctionnent bien pour leurs applications prévues, aucun n'est idéal pour les approches omics. Les protocoles qui préservent la morphologie d'IFM pour l'immunofluorescence des IFM pupal et adultes19,isolent les fibres IFM pour l'évaluation mécanique31,ou utilisent la microdissection de l'IFM pupal des cryosections38 sont trop spécialisés et le temps et main-d'œuvre pour obtenir raisonnablement des quantités suffisantes de tissu IFM pour les applications d'omics. D'autres protocoles ont été développés pour la dissection rapide de l'IFM38,39, ne s'appliquent donc pas aux stades pupal, et utilisent des tampons qui ne sont pas idéaux ou peuvent être incompatibles avec, par exemple, l'isolement de l'ARN. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles approches pour isoler les IFM pupal pour les applications de biochimie ou d'omique.

Ici, nous présentons un protocole pour la dissection de l'IFM pendant les stades pupal qui a été utilisé avec succès pour l'analyse de l'ARNm-Seq de 16 h APF jusqu'aux stades adultes16,32. Le protocole utilise une étiquette de protéine fluorescente verte (GFP) pour identifier les IFM à tous les stades du développement pupal et adulte, permettant la dissection vivante sous un microscope fluorescent de dissection. L'approche est moins laborieuse, avec un débit plus élevé que les protocoles de dissection IFM existants. Cela permet l'isolement rapide et la cryoconservation des échantillons, générant suffisamment de matériel après plusieurs tours de dissection pour les approches omics ainsi que pour la transcription inverse standard réaction en chaîne de polymérase (RT-PCR) ou de l'ouest de la perte.

Nous présentons le protocole en deux parties, démontrant comment disséquer rapidement les IFM avant 48 h APF (pendant la métamorphose précoce, lorsque les attachements IFM sont plus ténus) et après 48 h APF (lorsque le plan du corps pupal et les pièces jointes IFM sont bien définis). Nous démontrons que nous pouvons isoler l'ARN de haute qualité des IFM disséqués à tout moment et présenter des données sur différentes approches de l'isolement de l'ARN et de la transcription inversée. Enfin, nous démontrons l'application du protocole de dissection à l'ARNm-Seq, à la spectrométrie de masse et à la RT-PCR en utilisant l'homologramme CELF1 Bruno1 à titre d'exemple. Nous montrons une mauvaise expression des isoformes de protéine de sarcoque dans les données protéomiques de Bruno1 mutant IFM et examinons la régulation de Bruno1 de l'événement d'épissage C-terminal de la chaîne lourde de Myosin (Mhc). Ces résultats illustrent comment les données d'omique peuvent fournir une compréhension plus profonde des phénomènes biologiques, complétant des expériences génétiques et biochimiques.

Protocol

1. Mise en scène des Pupae

  1. Élever les mouches du génotype désiré en bouteilles (Figure 1E). Soit faire un nouveau flip du stock de dissection ou définir une croix avec au moins 20 mouches vierges femelles. Maintenir les bouteilles jusqu'à ce que les mouches commencent à se pupair.
  2. Recueillir les pré-pupae à l'aide d'un pinceau mouillé et le transférer dans du papier filtre mouillé dans un plat Petri de 60 mm (Figure 1F).
  3. Sexe des chiots, la collecte du sexe approprié pour l'expérience (Figure 1G). Les mâles sont identifiés par la présence de testicules, qui apparaissent comme des boules translucides dans la pua autrement opaque.
  4. Étiquetez le plat Petri avec l'heure, la date et le génotype, puis vieillissez les pulétes à l'étape désirée (Figure 1H).
    REMARQUE: Maintenir les croisements/stocks et les pupae d'âge dans un incubateur à température contrôlée (c.-à-d. 25 ou 27 oC pour les croisements d'ARNi, car l'augmentation de l'activité de Gal4 à des températures plus élevées augmente l'efficacité de knock-down40). Assurez-vous que l'humidité est suffisamment élevée pour que les chiots ne se dessèchent pas lorsqu'ils vieillissent plusieurs jours.

2. Dissection IFM Avant 48 h APF

  1. Assembler l'équipement nécessaire, y compris deux #5 des forceps de qualité biologique, une pipette, des pointes de pipette, de la glace sèche et (pour les échantillons d'ARN) un réactif d'isolement (voir Tableau des matériaux). De plus, refroidissez les plats de dissection noir (voir Tableau des matériaux),1x tampon salin tampon tampon tampon tampon tampon tampon de phosphate (PBS) et 1,5 mL tubes microcentrifuge sur la glace.
  2. À l'aide d'un pinceau mouillé, transférer les puques mises en scène dans un plat de dissection noir rempli d'environ deux tiers de PBS froid 1x(figure 2A,B). Passez à un microscope fluorescent disséquant.
    REMARQUE: Utilisez autant de pupas que peut être disséqué dans une fenêtre de 30 minutes. Selon l'expérience, cela va de 3 à 15 pupae. Voir Méthodes supplémentaires pour discuter des alternatives aux plats de dissection noir.
  3. À l'aide de #5 forceps, poussez l'une des pupes au fond d'un plat noir de dissection et ajustez le zoom du microscope et concentrez-vous pour voir clairement la pupe(figure 2C).
  4. Saisissez l'antérieur de la pupa avec un forceps (Figure 2D), puis piquer les pupae avec une seule pointe des autres forceps légèrement décalédans dans l'abdomen, juste derrière le thorax. Cela maintient la pupa en place et empêche les IFM de se déplacer dans l'abdomen (Figure 2E).
    REMARQUE: Commencez à chronométrer la durée de la dissection à partir de ce point, dès que l'intégrité du pupal est perturbée. Utilisez une longueur définie de dissection (par exemple 20 à 30 min) pour minimiser la mort musculaire et les changements transcriptomiques et protéomiques associés. Disséquer autant de mouches que possible dans cette période de temps.
  5. À l'aide des premiers forceps, retirez la moitié antérieure du boîtier pupal (Figure 2F).
  6. Utilisez les mêmes forceps pour pincer les pupae exposées juste derrière le thorax, et séparer l'abdomen du thorax (Figure 2G).
  7. À l'aide des forceps, presser doucement la partie antérieure du thorax (pour le FPA de 35 h) ou ouvrir le thorax pour exposer les IFM étiquetés fluorescents (figure 2H). Les IFM se détachent facilement de l'épiderme, car les attaches tendineuses aux premiers moments sont fragiles. Jeter la carcasse restante à l'aide de forceps pour la pousser de l'autre côté du plat.
  8. Les étapes répétitives 2.3-2.7, disséquent les chiots supplémentaires.
  9. Recueillir les fibres IFM avec des forceps et les organiser en un tas au fond du plat noir disséquant(Figure 2I,J). Enlevez les débris en les poussant hors du champ de vision à l'aide de forceps.
    REMARQUE: Avec la pratique, les pointes de forceps peuvent être mises à proximité sans se toucher. Cette technique peut être utilisée pour saisir lâchement les IFM sans les détruire. Les autres méthodes incluent pousser ou soulever doucement les IFM avec une seule pointe ou des forceps complètement fermés, ou prendre de la graisse ou d'autres tissus avec l'IFM et enlever la graisse telle que décrite à l'étape 2.10.
  10. Contrôle de la qualité de l'échantillon musculaire IFM, en utilisant les forceps pour enlever les muscles non-IFM, graisse, cuticule, etc de l'échantillon (Figure 2K,L).
    REMARQUE: Avec Mef2-Gal4, IFM est étiqueté plus fortement que les autres types de muscles aux premiers moments (Figure 2K,K'), permettant l'élimination des muscles de saut et des muscles larvaires en fonction de l'intensité de la fluorescence et de la forme musculaire. Les tissus gras et cuticules sont différents et ne sont pas étiquetés par une étiquette de fluorescence spécifique aux muscles (Figure 2K,K'). Voir la section de discussion pour les autres lignes Gal4 qui étiquette IFM.
  11. À l'aide d'une pointe de pipette coupée, transférer la pile d'IFM dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml rempli de 250 l de 1x PBS réfrigéré(figure 2M-O). Passez immédiatement à l'article 4.
    REMARQUE: Les échantillons d'IFM peuvent être perdus simplement en s'accrochant au côté de la pointe de la pipette. Pipetting tampon de haut en bas plusieurs fois avant de recueillir IFMs peut rendre les conseils standard moins collant, et siliconé ou perfluoroalkoxy (PFA) conseils (voir tableau des matériaux) avec des tensions de surface plus faibles peuvent aider à prévenir la perte de l'échantillon.

3. Dissection IFM Après 48 h APF

  1. Assembler l'équipement nécessaire, y compris deux puniteurs de qualité biologique #5, des ciseaux fins, des lames standard de microscope en verre, du ruban adhésif double, une pipette, des pointes de pipette, de la glace sèche et (pour les applications d'ARN) un réactif d'isolement (voir Tableau des matériaux). Refroidir les tubes 1x PBS et microcentrifuge sur la glace.
  2. À l'aide d'un pinceau légèrement mouillé, transférer les pupae mises en scène sur une bande de ruban adhésif recto-verso monté sur une lame de microscope(figure 3A). Placer les chiots dans une ligne orientée dans la même orientation (ventrale vers le bas et antérieure vers le bas de la glissière).
    REMARQUE: Veillez à ne pas utiliser trop d'eau sur le pinceau ou le filtre, ou les chiots ne colleront pas bien. Si les chiots ne collent pas, séchez-les en les transférant d'abord sur un filtre sec ou du papier de soie. Montez autant de pupae que l'on peut disséquer dans une fenêtre de 30 minutes, idéalement 10 pupae.
  3. Retirer la pua du pupal. Utilisez des forceps pour taquiner et ouvrir le boîtier pupal au-dessus des spiracles antérieurs (Figure 3B).
  4. Faites glisser doucement une paire de forceps dorsally vers le postérieur, coupant le boîtier pupal au fur et à mesure que les forceps se déplacent(figure 3B'). Veillez à ne pas rompre la pua sous-jacente. Libérez la pua de l'étui ouvert et transférez-la immédiatement à une goutte de 1x PBS sur une deuxième lame de microscope(Figure 3B), C).
  5. Répétez les étapes 3.3 et 3.4 pour toutes les pupae dans la ligne, puis mettez la glissière de ruban à double bâton de côté.
  6. À l'aide de ciseaux fins, couper l'abdomen de la pupa loin du thorax et le pousser dans une pile séparée(Figure 3D,D'). Répéter l'opération pour les pupae restantes.
    REMARQUE: Commencez à chronométrer la durée de la dissection avec l'étape 3.6, dès que l'intégrité du pupal est perturbée. Disséquez autant de mouches que possible dans 20-30 min pour empêcher la mort cellulaire et les changements transcriptomiques et protéomiques associés. Lors de la dissection de 1 d adultes ou de pupae de 90 h, il est souvent pratique pour les étapes ultérieures d'enlever en outre la tête avec les ciseaux fins.
  7. À l'aide d'un papier de soie, retirer la majorité du 1x PBS (généralement nuageux avec graisse en suspension) ainsi que la pile d'abdomens (figure 3E). Ajouter une goutte de PBS 1x frais et réfrigéré aux thoraxes restants.
  8. Utilisez les ciseaux pour couper le thorax en deux (Figure 3F,F') en coupant de la tête vers le bas de l'axe longitudinal du corps en un seul mouvement. Alternativement, si la tête a été enlevée, insérez d'abord les ciseaux où la tête était attachée et coupez la moitié supérieure du thorax longitudinalement entre les IFM. Ensuite, couper le côté ventral du thorax avec une deuxième coupe dans la même orientation.
  9. Répétez les étapes 3.7 et 3.8 pour que toutes les pupae soient disséquées, générant un tas d'hémisections thorax près du centre de la diapositive. Assurez-vous qu'il y a suffisamment de PBS 1x réfrigéré sur la glissière afin que les hémisections ne se dessèchent pas.
    REMARQUE: Après 48 h APF, les IFM sont assez grandes pour être visibles sous un microscope de dissection standard à l'œil formé. À ce stade du protocole, les muscles munis d'une étiquette fluorescente peuvent être déplacés vers une portée de dissection fluorescente pour faciliter l'identification de l'IFM ou à des fins d'entraînement, mais ce n'est pas nécessaire.
  10. Disséquer les IFM du thorax. Isoler l'une des hémisections à l'aide des #5 forceps (Figure 3G,H). Insérez délicatement les extrémités d'un forceps au-dessus et au-dessous du milieu des IFM(figure 3G',H'). Tout en maintenant les premiers forceps encore, utilisez des ciseaux fins pour couper une extrémité de l'IFM loin de la cuticule et des tendons. Ensuite, coupez l'autre extrémité de l'IFM à l'abri de la cuticule(figure 3G',H'').
    REMARQUE: Selon l'orientation du thorax après la première coupe IFM, il est utile de faire pivoter le thorax à 180 degrés afin que la deuxième coupe IFM soit plus facile à effectuer.
  11. Retirez le faisceau IFM du thorax avec des forceps (Figure 3G'',H''''), le transférant au bord de la bulle PBS pour utiliser la tension de l'eau pour le maintenir en place (Figure 3I). Poussez la carcasse de l'autre côté de la glissière. Répétez l'opération pour les hémisections thorax restantes, générant une collection d'IFM disséqués.
    REMARQUE: Si les IFM ne restent pas dans un tas soigné, retirez une partie du 1x PBS avec un tissu. Veillez à ne pas laisser tous les PBS s'évaporer, et assurez-vous que les IFM et les hemithoraxes disséqués restent couverts par un tampon.
  12. Après avoir disséqué toutes les IFM, effectuez rapidement un contrôle de qualité sur le muscle disséqué. À l'aide de #5 forceps, enlever tout muscle de saut ou fragments de cuticule qui ont pu se trouver dans l'échantillon(figure 3J-K'').
    REMARQUE: Le muscle de saut semble différent de l'IFM. Si disséquer le muscle étiqueté Mef2-Gal4 sous fluorescence, le muscle de saut a une fluorescence plus faible et une forme et une texture différentes. Sous une lumière normale, il apparaît presque translucide alors que les IFM sont d'un jaune opaque et laiteux(figure 3J-J',K).
  13. À l'aide de la tension de l'eau, capturez (mais ne squishpas) les IFM disséqués entre une paire de forceps (figure 3L). Transférer les IFM dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml prérempli de 250 l de 1x PBS réfrigéré(figure 3M). Procédez immédiatement à l'article 4.
    REMARQUE: Lorsque les pointes de forceps sont apportées à proximité les unes des autres et soulevées d'une solution tampon, la tension de l'eau provoque une bulle de tampon à capturer entre les pointes de forceps. Si les IFM sont également présents dans cette bulle, ils peuvent être sortis de la solution et facilement transférés dans un autre réceptacle rempli de mémoire tampon. Il est important de presser les forceps pour amener les pointes les uns près de l'autre sans se toucher, pour éviter de macérer le tissu capturé dans la bulle tampon.

4. Pelleter et préserver l'échantillon IFM

  1. Pelleter les IFM en centrifugeant le tube microcentrifuge de 1,5 ml pendant 3 à 5 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse de table (Figure 4A,B).
  2. Retirez le tampon à l'aide d'une pointe de pipette (Figure 4C).
  3. Pour les applications d'ARN, resuspendre le granule IFM dans 50 à 100 l du tampon d'isolement de l'ARN souhaité (voir Tableau des matériaux, Figure 4D). Dans le cas contraire, passez à l'étape 4.4.
    REMARQUE: Les IFM peuvent être congelés à sec après l'étape 4.2 pour les préparations de spectrométrie de masse ou l'isolement de l'ARN avec des kits commerciaux (voir les résultats représentatifs). Pour les applications d'ARN, de meilleurs résultats sont obtenus en reconpendant et en gelant immédiatement la pastille IFM dans un tampon d'isolement.
  4. Congeler l'échantillon sur la glace sèche ou le gel de rupture dans l'azote liquide (Figure 4E). Conserver à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour les étapes suivantes dans la préparation de l'échantillon pour l'analyse en aval.
    REMARQUE: Après la cryoconservation, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs mois avant d'être traités pour une étude en aval.

Representative Results

Les protocoles de dissection présentés ci-dessus sont utiles pour générer des échantillons enrichis d'IFM à partir de 16 h après la formation de puparium (APF) jusqu'au stade adulte. Disséqué échantillons de muscle de vol peuvent être utilisés pour de multiples applications, et ont jusqu'à présent été appliquéavec succès pour RT-PCR4,17, RNA-Seq16,32, ChIP36,37, western 14,41 et des expériences de spectrométrie de masse (voir ci-dessous). Pour aider les utilisateurs potentiels à se disséquer pour des applications basées sur l'ARN, nous présentons d'abord nos résultats en soulignant des considérations importantes spécifiquement pour l'isolement de l'ARN des IFM. Pour démontrer plus largement l'utilité de nos protocoles de dissection, nous illustrons ensuite certaines des applications possibles en utilisant nos données sur la protéine liant l'ARN Bruno1.

Le protocole de dissection IFM produit de l'ARN de haute qualité

Il est important de déterminer le nombre de mouches à disséquer à l'avance, car l'ARNm codant ne représente que 1 à 5 % de l'ARNtotal 42. Nous avons obtenu en moyenne 24 à 9 ng d'ARN total par mouche à partir de l'IFM disséqué à partir de 1 d adultes(figure 4F et figure supplémentaire 1A), avec des rendements généralement en augmentation avec l'expérience. Ce rendement de l'ARN total par mouche est relativement constant, fluctuant autour de 25 ng pour l'IFM disséqué à 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF et 90 h APF(figure 4F et figure supplémentaire 1B,D,E). Ces observations reflètent également tout ARN isolé de la contamination des graisses, tendons, trachée ou d'autres types de cellules, qui peuvent être plus élevés dans les échantillons isolés à partir de moments plus tôt. Ainsi, nous avons obtenu de l'IFM de 50 mouches et nous avons obtenu de 50 mouches et nous avons généralement disséqué l'IFM de 100 à 150 mouches pour générer 3 g d'ARN total pour les échantillons d'ARN-Seq.

La méthode d'isolement de l'ARN affecte la quantité et la qualité de l'ARN récupéré, et nous encourageons les utilisateurs à valider leur approche d'isolement. Par exemple, alors que l'isolement à l'aide de la méthode 1 produit en moyenne 1143 à 465 ng d'ARN total de l'IFM à partir de 50 mouches adultes de 1 d, l'isolement avec divers kits commerciaux donne entre 186 et 8 ng à 1261 à 355 ng d'ARN total(figure 4G et Figure supplémentaire 1C). L'ARN isolé des kits commerciaux est généralement de bonne qualité (Figure 4H et Figure supplémentaire 1F), mais de faibles récupérations suggèrent que l'ARN peut ne pas être efficacement éludé des colonnes. L'intégrité de l'ARN peut également être compromise par l'utilisation d'un kit comme cela a été fait dans la méthode 2 (Figure 4H, deuxième parcelle), probablement en raison de la constitution tampon et des traitements thermiques, conduisant à une fragmentation sévère qui peut avoir un impact sur les expériences en aval.

Il est également important d'observer une technique appropriée sans RNase lors de l'isoler et de manipuler des échantillons d'ARN. Bien que les cycles de gel-dégel et une incubation de température ambiante de 4 h n'aient pas d'impact spectaculaire sur les profils d'intégrité de l'ARN, même de petites quantités de RNase entraînent une dégradation rapide de l'ARN(Méthode 4I et Méthodes supplémentaires). Les utilisateurs sont toujours encouragés à travailler sur la glace et à limiter le gel-dégel pour prévenir l'hydrolyse et la fragmentation de l'ARN. Cela n'a pas été détecté ici, mais la prévention de la contamination par la RNase en utilisant des pointes de filtre et des tampons traités par LE DEPC est absolument essentielle.

L'efficacité de la transcription inversée a également un impact sur le succès des applications en aval. Nous avons obtenu des résultats fiables avec deux des trois kits commerciaux RT que nous avons testés, qui amplifient tous deux de fortes bandes RT-PCR pour le gène ribosomal rp49 (Figure 4J). Cependant, RT Kit #2 peut être plus sensible pour la détection des transcriptions à faible expression, car nous avons obtenu des bandes plus fortes pour la protéine de liaison de l'ARN bru1 pour les trois répliques biologiques (Figure 4J). Pris ensemble, ces résultats illustrent que l'ARN de haute qualité peut être isolé des IFM disséqués avec cette procédure.

Les IFM disséqués produisent des données de haute qualité sur l'ARNm-Seq et la protéomique

En utilisant IFM disséqué selon le protocole ci-dessus à 30 h APF, 72 h APF et de 1 d mouches adultes, nous avons déjà montré que la protéine de liaison de l'ARN et CELF1-homologue Bruno1 (Bru1, Arrestation, Aret) contrôle une voie d'épissage spécifique à l'IFM en aval de la facteur de transcription Spalt major (Salm)16. IFMs de mutants null ainsi que les mouches avec muscle spécifique bruno1 RNAi (bru1-IR) afficher des défauts de croissance sarcore, mauvaise régulation de l'activité de la myosine et finalement l'hypercontraction et la perte de fibres musculaires16,17 . Ci-dessous, nous démontrons l'utilité des IFM disséqués pour la spectrométrie de masse protéome entier et montrons que plusieurs des changements d'expression que nous avons observés au niveau de l'ARN sont également évidents sur le niveau de protéine. Nous soulignons en outre un événement spécifique d'épissage développemental dans Mhc qui s'est avéré être réglé par Bruno1, illustrant que l'ARNm-Seq et RT-PCR des IFM disséqués peuvent être utilisés pour démontrer la régulation des événements alternatifs d'épissage.

Selon la qualité et la profondeur de la bibliothèque, les données de l'ARNm-Seq peuvent être analysées au niveau des unités génétiques (la moyenne des comptes de lecture sur tous les exons d'un gène), des exons individuels ou des jonctions d'épissage. les données de l'ARNm-Seq provenant des IFM bru1-IR par rapport au type sauvage montrent de faibles changements d'expression au niveau de l'unité génétique16 (figure 5A). À 72 h APF, il y a déjà une tendance pour les gènes sarcoques tels que la protéine LIM musculaire à 60A [Mlp60A], l'actine 57B [Act57B], la protéine spécifique aux muscles 300 kDa [Msp300], ou Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]] qui sont importantes pour le développement musculaire approprié à être régulé dans muscle bru1-IR (Figure 5A et tableau supplémentaire 1). Cependant, nous avons montré précédemment qu'au niveau des exons individuels, il y a une downregulation beaucoup plus forte des isoformes spécifiques de gène de sarcoque16,suggérant la fonction principale de Bruno1 est de commander l'épissage alternatif (tableau supplémentaire 1 ).

En utilisant la spectrométrie de masse entièrement protéome sur les IFM disséqués, nous pouvons montrer une régulation similaire sur le niveau de protéine(Figure 5B et tableau supplémentaire 2). Sur les 1 895 groupes de peptides détectés, 524 (28 %) d'entre eux sont mal réglementés dans Bru1M2 mutant IFM chez 1 d adultes (Tableau supplémentaire 2). On observe également une régulation de la teneur en protéines Strn-Mlck et Mlp60A, correspondant à des observations au niveau de la transcription dans nos données de l'ARNm-Seq. Malgré le nombre limité de peptides de base de données qui cartographient des isoformes protéiques spécifiques (voir Méthodes supplémentaires pour les détails d'analyse), pour les protéines sarcoques Tropomyosin e (Tm1), confirmées (up/TnT), Mhc, bent (bt/projectin) et Paramyosin (Prm) nous observer l'upregulation des peptides d'un isoforme et la dérégulation d'un autre (figure 5B), confirmant nos observations précédentes de réglementation similaire sur le niveau d'ARN16. Ceci démontre que les IFM disséqués sont utiles pour les applications d'ARNm-Seq et de protéomique.

Comme un autre exemple de la façon dont les données d'omique peuvent compléter les approches traditionnelles pour améliorer et étendre la perspicacité biologique, nous avons choisi de se concentrer sur l'épissage au c-terminus de Mhc. Une ligne de piège protéique précédemment caractérisée appelée weeP26 est insérée dans l'intron final du Mhc43,44 (voir Méthodes supplémentaires pour l'emplacement exact). weeP26 contient un accepteur d'épissage solide et est incorporé dans vraisemblablement toutes les transcriptions Mhc (figure 5C). Cependant, la protéine étiquetée GFP dans l'IFM est incorporée dans deux « points » de chaque côté de la ligne M, tandis que dans le muscle de jambe, elle incorpore uniformément à travers la ligne M et faiblement à travers les filaments épais (figure 5E). Orfanos et Sparrow ont montré ces « points » sous forme d'IFM en raison d'un commutateur isoforme Mhc développemental : l'isoforme de Mhc exprimé avant 48 h APF est étiqueté GFP comme inserts d'exon weeP26 dans le cadre de lecture ouvert, tandis que le Mhc isoforme exprimé après 48 h APF n'est pas étiqueté, comme l'exon weeP26 est inclus en aval du codon d'arrêt dans le 3'-UTR44.

Nos données mRNA-Seq nous ont permis de caractériser plus en détail l'expression isoforme C-terminal Mhc. Alors que deux terminaisons différentes Mhc ont été signalés43,44, nos données arrna-Seq et l'annotation actuelle Flybase (FB2019-02) suggèrent qu'il existe en fait trois événements d'épissage alternatif possible au Mhc C-terminus (Exon 34-35, 34-36, ou 34-37) (Figure 5C), ce qui est confirmé par RT-PCR (figure 5D). weeP26 GFP est inséré dans l'intron entre Exon 36 et 37; ainsi, comme les isoformes Exon 34-35 et Exon 34-36 contiennent des codons d'arrêt, GFP ne peut traduire que dans l'isoforme Exon 34-37 (résultant en Exon 34-GFP-37). Nous pourrions en outre voir la régulation temporelle et spatiale de tous les isoformes Mhc. En IFM, nous observons un changement d'isoforme Mhc de l'Exon 34-37 à l'Exon 34-35 entre 30 h APF et 48 h APF (Figure 5C,D,F) à 27 oC, même si ce n'est pas encore visible par immunofluorescence à 48 h APF (Figure 5E). Les jambes expriment déjà un mélange d'Exon 34-37 et D'Exon 34-35 à 30 h APF, et par 72 h APF exprimer les trois isoformes Mhc (Figure 5D,F). Le muscle adulte de saut (TDT) exprime également chacun des trois isoformes de Mhc (figure 5F), suggérant ceci est généralement vrai pour les muscles somatiques tubulaires. Ainsi, nos données mRNA-Seq permettent d'étendre les résultats précédents en réduisant le délai pour le commutateur isoforme Mhc dans l'IFM et en caractérisant l'utilisation d'isoformes Mhc dans les muscles tubulaires.

La régulation isoforme de Mhc dans le salm et le bru1 mutant IFM ont alors été examinées. Dans les deux cas, nous avons constaté une mauvaise réglementation de l'eieP26. Les IFM mutants de Salm ne parviennent pas à compléter le commutateur développemental dans l'expression isoforme de Mhc et les modèles d'épissage de jambe de phénocopie aux étapes postérieures, y compris le gain de l'événement exon 34-36 (figure 5F). Ceci est d'accord avec les résultats précédents que la perte de Salm a comme conséquence une transformation presque complète de destin de l'IFM au muscle tubulaire16. Bru1-IR et bru1 mutant IFM, semblable à salm-/- IFM, conserve l'événement exon 34-37 épissage à travers les stades adultes (Figure 5E,F), résultant en un weeP26 GFP modèle d'étiquetage ressemblant à muscle de la jambe, mais il ne gagne pas l'événement Exon 34-36. Cela suggère que Bruno1 est nécessaire dans IFM pour contrôler au moins partiellement le commutateur de développement dans l'épissage alternatif Mhc, mais il indique que d'autres facteurs d'épissage sont également mal réglementés dans le salm-/-contexte. En outre, cet exemple illustre comment les données RT-PCR et mRNA-Seq de l'IFM disséqué peuvent être utiles pour acquérir une compréhension plus profonde des mécanismes d'épissage développementaux et des défauts morphologiques observés.

Figure 1
Figure 1: Développement et mise en scène ifM des chiots. (A) Schématique du développement d'IFM à 24 h APF, 32 h APF, 48 h APF, 72 h APF, et 1 d adultes montrant le compactage des muscles de vol (vert) à 32 h APF et la croissance subséquente de fibre pour remplir le thorax. Les tendons sont gris foncé. (B) Images confocales d'IFM fixes de dissections de livres ouverts (24 h, 32 h, 48 h)19 ou hémisections thorax (72 h, 1 jour) tachées d'actine (rhodamine phalloidin, magenta) et GFP (vert). (C,D) Images de la fluorescence de GFP dans les chiots vivants illustrant la morphologie intacte d'IFM de la ligne de vol de dissection dans le plan dorsal (C) ou latéral (D). Les astérisques marquent l'emplacement de l'IFM. (E) Pour se préparer aux dissections, les stocks de mouches doivent être retournés ou les croisements réglés 3 à 4 jours à l'avance. (F) Les prepupae sont sélectionnés par leur couleur blanche (pointes de flèche jaunes) et isolés à l'aide d'un pinceau mouillé (F',F''). (G) Les préupes doivent être sexués pour séparer les femelles des mâles en fonction de la présence de testicules qui apparaissent comme des boules translucides postérieurement situées (astérisques jaunes). (H) Les pupae sont vieillis sur du papier filtre mouillé dans des plats de 60 mm. Barres d'échelle de 100 m (B), 1 cm (C,D,E,H), 1 mm (F,F'',G). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Dissection des IFM avant 48 h APF. (A) Ajout d'un tampon PBS 1x à un plat de dissection noir avec une pipette de transfert. (B) Transfert de chiots mis en scène à l'aide d'un pinceau. (C) Sous un microscope fluorescent de dissection pour visualiser GFP, pousser doucement la pupe au fond d'un plat de dissection utilisant #5 forceps (décrits en gris). Le « X » d'un cercle désigne le mouvement dans l'image. (D,E) Saisie des pupae antérieurement (D), puis piquer les pupae juste derrière le thorax (E). Dash dans un cercle ne dénote aucun mouvement. (F,G) Tirer avec les forceps antérieurs (flèche) pour enlever le cas pupal (F), puis l'ablation de l'abdomen (G). (H) Répétition de C-G pour plusieurs chiots. Les lignes pointillées jaunes sont numérotées indiquant les chiots contributifs. (I, J) Utilisation des forceps (I) pour isoler les IFM des tissus environnants (J). Le point dans un cercle indique le mouvement hors de la page. (K,L) Enlèvement des contaminants, y compris les muscles gras et saut (TDT) (K) pour générer un échantillon d'IFM propre (L). TDT a une expression GFP plus faible et une forme différente de celle des fibres IFM (K'). (M,N,O) Utilisation d'une pointe de pipette coupée (M) pour recueillir les IFM disséqués (N) et son transfert vers un tube microcentrifuge (O). Barres d'échelle de 1 cm (A,B,M,O), 1 mm (C-G), 500 m (H-L,N). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Dissection des IFM après 48 h APF. (A) Alignement des pupae sur du ruban adhésif double. (B) Retrait des pupe de l'étui pupal en ouvrant antérieurement (B), coupant le cas doralement (B'), et soulevant la pupe (B''). Les symboles de cercle représentaient la même figure que la figure 2. (C) Transfert de chiots en tampon. (D) Enlèvement de l'abdomen en coupant avec des ciseaux (flèches doubles jaunes) et la séparation des thoraxes (D'). (E, F) Ajout d'un tampon propre (E), puis coupe de thoraxes en deux longitudinalement (F,F'). (G,H) Les dissections peuvent être effectuées sous la lumière blanche (G) ou la fluorescence pour visualiser le GFP (H); coupe des IFM d'un côté (G'), puis de l'autre côté (G''); sortir du thorax avec des forceps (décrits en gris) (G'''). (I,J,K) Collecte des IFM dans le tampon (I) et suppression du cordon nerveux ventral contaminant (VNC), de l'intestin et du muscle de saut (TDT) (J) pour générer un échantillon d'IFM propre (K). TDT a une expression GFP plus faible et une forme différente de celle des fibres IFM (J',' K'). (L,M) Utilisation de forceps pour transférer les IFM (L) dans un tube de microcentrifuge (M). Barres d'échelle de 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D',F-L). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Détails de préservation de l'IFMet d'isolement de l'ARN. (A) IFMs sont granulés par centrifugation pendant 5 min à 2000 x g. (B) Pellet IFM (flèche) et granule sous fluorescence (B'). (C) Enlèvement de tous les tampons avec une pointe de pipette. (D) Pour l'extraction de l'ARN, la suspension des granulés dans le tampon d'isolement. Cette étape peut être ignorée pour congeler à sec les IFM disséqués. (E) Congélation de l'échantillon dans l'azote liquide ou sur la glace sèche et stockage à -80 oC. Barres d'échelle de 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) Nanogrammes (ng) de l'ARN total de l'IFM disséqué obtenu par mouche à 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF, et 1 d adulte. Barres d'erreur - SD. (G) ARN total isolé de l'IFM disséqué à partir de 50 mouches adultes de 1 d utilisant différentes méthodes d'extraction. Barres d'erreur - SD. (H) Les traces représentatives pour analyser l'intégrité de l'ARN après différentes méthodes d'extraction. Les bandes ribosomal courent juste en dessous de 2000 nucléotides (nt) et la bande de marqueur à 25 nt. Traces supplémentaires disponibles dans la figure supplémentaire 1. (I) Traces représentatives d'un échantillon d'ARN fraîchement isolé (en haut), d'un échantillon congelé 25x sur de la glace sèche (deuxième parcelle), d'un échantillon laissé pendant 4 h sur le banc (troisième parcelle) et d'un échantillon traité avec rNase A (parcelle inférieure). Notez la dégradation complète de l'ARN lors de l'ajout de RNase A. (J) gel RT-PCR à partir de kits comme étiqueté pour bru1 et rp49. L'intensité relative de la bande de bru1 normalisée par rapport à rp49 est tracée ci-dessous. Barres d'erreur -SEM (t-testnon apparié, p 0,0119). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Application de dissections IFM pour étudier la fonction Bruno1 dans l'épissage alternatif. (A) Parcelle volcanique de données de l'ARNm-Seq (unité génétique) des IFM disséqués à 72 h APF. Les gènes qui sont significativement différenciés entre bru1-IR et l'IFM de type sauvage (padj lt; 0.05, abs (log2FC) -gt;1.5) sont montrés en bleu, et les gènes non significatifs en gris. Les protéines Sarcore sont mises en évidence en rouge, et certains gènes sont étiquetés. (B) La parcelle volcanique de spectrométrie de masse protéome entière résulte de 1 d IFM adultes. Les protéines significativement différentes entre les mutants bruM2et wildtype (FDR lt; 0,05) sont indiquées dans les protéines bleues et non significatives en gris. Les protéines sarcomériques sont mises en évidence en rouge. Les peptides correspondant aux gènes (A) sont étiquetés en rouge. Les ensembles de peptides cartographiant différents isoformes de la même protéine sont étiquetés dans la même couleur. (C) Schéma du c-terminus de Mhc illustrant des isoformes distincts de transcription et l'emplacement d'insertion du piège de gène weeP26 (voir Méthodes supplémentaires pour le point d'insertion). Les amorces RT-PCR sont désignées comme lignes noires au-dessus des transcriptions. Lire les comptes par kilobase par million de bases (RPKM) de l'ARNm-Seq sont indiqués pour les IFM disséqués à partir de wildtype à 30 h APF (orange) et 72 h APF (rouge), de bru1-IR (bleu) et salm-/- (cyan) à 72 h APF et de jambe entière (verte) à 72 h APF . (D) RT-PCR avec amorces contre Mhc montrant le commutateur isoforme dans IFM entre 30 h APF et plus tard timepoints. L'événement d'épissage d'Exon 34-35 est seulement faiblement observé dans l'IFM mutant deM3ou dans la jambe adulte. (E) Images confocales de la localisation weeP26 GFP dans les sarcores IFM de type sauvage à 48 h APF et 90 h APF par rapport à 90 h APF muscle de jambe. Barres d'échelle de 1 m. (F) Quantification de la jonction d'épissure à partir des données de l'ARNm-Seq pour les génotypes et les points de temps tels qu'ils sont étiquetés. Les lectures de jonction sont présentées comme le rapport d'un événement d'épissage spécifique (Exon 34 à 35 en gris, 34 à 36 en violet et 34 à 37 en vert) au nombre total d'événements partageant le donneur d'épissage exon 34. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Figure 1
Figure supplémentaire 1 : (A,B,C) ARN yields from samples of the same genotype dissected by the same researcher in the same week. Après que tous les échantillons aient été disséqués, l'ARN a été isolé et mesuré le même jour. (A) Nanogrammes (ng) de l'ARN total obtenu à partir de dissections IFM par mouche adulte de 1 d. Barres d'erreur - SEM. (B) ARN total obtenu à partir de l'IFM disséqué par mouche à 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF et 1 d adulte. (C) ARN total isolé de l'IFM disséqué à partir de 50 mouches adultes de 1 d en utilisant différentes méthodes d'extraction. (D) Concentrations totales d'ARN par mouche des jambes disséquées, du muscle de saut (TDT) et de l'IFM. Plus d'ARN est obtenu à partir des plus grandes IFMs. Barres d'erreur - SD. (E) Concentrations totales d'ARN par mouche d'IFM disséquées à partir de contrôles par rapport aux ARN ou aux échantillons mutants à 30 h APF, 72 h APF et 1 d adulte. Pour les mutants, w1118 a été utilisé comme contrôle wildtype. Les données mutantes sont compilées à partir de bru1-IR, salm-/- et d'un autre mutant de protéine liant l'ARN. Notez que pour ces manipulations, les rendements d'ARN sont diminués dans 1 d adulte en raison de l'atrophie musculaire et la perte, de sorte que plus de mouches doivent être disséquées pour obtenir des quantités suffisantes pour les approches omics. Barres d'erreurs - SD. (F) Traces supplémentaires montrant l'intégrité de l'ARN pour les méthodes d'isolement de l'ARN montrées dans la figure 4G et dans la figure supplémentaire 1C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplemental Methods
Méthodes complémentaires: Une description détaillée des méthodes et des réactifs utilisés tout au long du texte et, en particulier, pour générer les données présentées dans la figure 1A-D, Figure 4F-K, Figure 5, Tableau supplémentaire1, et Tableau supplémentaire 2. Ces données motivent le protocole de dissection et démontrent son utilité pour l'isolement d'ARN, l'ARNm-Seq, RT-PCR, et la protéomique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Relatif à la figure 5 et aux paragraphes associés au texte principal
Nom de l'onglet Résumé des données
Protéines Sarcomere Liste des gènes sarcoques de Spletter et coll. Elife 2018; Ici, nous énumérons le nom actuel de FBgn et de gène.
Unités de gènes SP-DESeq2-72h À l'aide des données de Spletter et coll. EMBO Rep 2015, nous avons examiné spécifiquement les gènes du sarcome ressurflat dans les données de l'ARNm-Seq à 72 h APF. Il s'agit de l'analyse DESeq2 détectant l'expression différentielle sur le niveau de l'unité génétique entre le contrôle (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma croisé à w1118) et Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Les lignes surlignées en jaune sont des gènes régulés vers le haut ou vers le bas (au-dessus/en dessous d'un seuil de log2FC-abs(1.5)). Ces données sont la pare-dessus joude rouge de la figure 5A. Pour chaque gène sarcome, nous fournissons des informations d'identification, le log2FC de DESeq2, la valeur P et la valeur P ajustée, ainsi que le nombre d'expressions normalisées DESeq2.
SP exon-DEXSeq-72h À l'aide des données de Spletter et coll. EMBO Rep 2015, nous avons examiné spécifiquement l'utilisation d'exons de gènes sarcoques dans les données de l'ARNm-Seq à 72 h APF. Il s'agit de l'analyse DEXSeq détectant l'utilisation différentielle d'exons entre le contrôle (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma croisé à w1118) et Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Les lignes surlignées en jaune sont des exons réglementés vers le haut ou vers le bas (au-dessus/en dessous d'un seuil de log2FC-abs(1.5)). Nous fournissons des informations d'identification d'exon et de gène, le log2FC de DEXSeq, la valeur de P et la valeur p ajustée, aussi bien qu'une liste des transcriptions associées.
Veuillez noter que de nombreux gènes montrent la régulation d'un ou de plusieurs exons dans l'analyse DEXSeq, souvent avec des valeurs log2FC élevées et de faibles valeurs P/ajustement de la valeur P, tandis qu'une liste limitée de gènes montre des changements à 72 h APF. Cela soutient un fort effet de perte de Bruno sur la réglementation de l'épissage alternatif.

Tableau supplémentaire 1 : Tableau de 72 h données de l'ARNm-Seq APF pour les protéines sarcoques identifiant les gènes exprimés différemment(via DESeq2) et les exons (via DEXSeq) dans bru1-IR vs. wildtype IFMs.

Relatif à la figure 5B et aux paragraphes associés dans le texte principal
Nom de l'onglet Résumé des données
Sortie de Perséus Il s'agit d'une feuille de calcul de données traitées présentant les données de spectrométrie de masse utilisées pour générer la figure 5B. Les échantillons D'IFM proviennent de mouches de 1 d de contrôle adulte (w1118) et mutantes (bruno1-M2). Les colonnes importantes sont les valeurs d'intensité transformées pour chacune des 4 répliques pour chaque échantillon, la statistique et la signification des tests t, les iD peptidiques et les noms génétiques correspondants et les ID Flybase. Signifance a été calculé à l'aide de paramètres standard dans Persée (FDR-lt;05). Il y a 1859 protéines/peptides détectés, dont 524 (28%) sont significativement différents entre les échantillons.
Déréglementation Ce sont TOUS les 252 protéines/peptides de la production de Persée qui sont régulés dans l'IFM mutant bruno1-M2. Comme les ID Flybase et les noms de gènes sont obsolètes, nous fournissons en outre l'ID génétique Flybase actuel et le nom du gène.
Régulé Ce sont TOUS les 272 protéines/peptides de la production de Persée qui sont régulés dans l'IFM mutant bruno1-M2. Comme les ID Flybase et les noms de gènes sont obsolètes, nous fournissons en outre l'ID génétique Flybase actuel et le nom du gène.
Veuillez noter que les protéines de sarcomere mises en évidence en rouge dans la figure 5B sont présentes dans les listes ci-dessus. La liste des gènes considérés comme faisant partie du sarcore est disponible dans l'un des onglets du tableau supplémentaire 1.

Tableau supplémentaire 2 : Tableau des données entières de spectrométrie de masse de protéome de 1 d adulte identifiant les protéines et les isoformes différentiels exprimés dans le mutant deMum2 contre. IFM de type sauvage.

Discussion

Dans ce protocole, nous présentons la technique de base pour disséquer les IFM de Drosophila des chiots précoces et tardifs pour l'isolement en aval des protéines, de l'ADN, de l'ARN ou d'autres macromolécules. Le protocole peut être facilement adapté pour disséquer l'IFM des mouches adultes. Nous démontrons l'utilité de notre protocole de dissection pour les applications d'ARNm, de protéomique et de RT-PCR. Avec l'amélioration continue des technologies d'omique pour permettre l'analyse des échantillons avec moins de matériel de départ et des concentrations d'entrée plus faibles, ces dissections deviendront probablement valables pour de nombreuses applications supplémentaires. Comme les IFM sont un modèle établi pour les myopathies humaines4,24 et le développement spécifique de type musculaire9,12, nous envisageons, par exemple, des métabolomiques enrichis en IFM, des enquêtes sur la conformation de chromatine via 3C ou 4C, épissage de l'évaluation du réseau via les interactions CLiP ou phospho-protéomique de la myofibrillogénèse.

Il est important de considérer que ces dissections produisent un échantillon enrichi pour l'IFM au lieu d'un échantillon IFM pur. Ceci est inévitable en raison de l'innervation de neurone moteur, des attachements de tendon et de l'invasion trachéale des fibres de muscle. L'analyse bioinformatique peut être utilisée pour identifier les gènes ou les protéines enrichis en IFM, mais d'autres expériences sont nécessaires pour démontrer qu'ils sont en fait spécifiques à l'IFM. La pureté de l'échantillon peut être astopique à l'aide de marqueurs publiés spécifiques aux tissus tels que Stripe45 (tendon), Act79B4,44 (muscle tubulaire), Act88F15 (IFM), ou syb46 (spécifique neuronal). Il est peut-être possible d'utiliser de tels marqueurs pour normaliser les ensembles de données au contenu spécifique à l'IFM, mais les utilisateurs sont avertis que les changements temporels dans l'expression des gènes utilisés pour la normalisation, par exemple des gènes spécifiques à l'IFM ou de la tubuline, peuvent biaiser une telle approche.

Des méthodes d'étiquetage spécifiques aux tissus génétiquement codés, par exemple le marquage EC47,48 ou l'étiquetage PABP49,50 pour l'isolage de l'ARN ont été développés ces dernières années, ce qui peut aider à obtenir un échantillon d'ARN spécifique aux tissus. Cependant, le marquage EC nécessite une alimentation constante des mouches47 et n'est donc pas applicable pendant les stades pupal. La sensibilité et l'exhaustivité des transcriptomes étiquetés PABP peuvent avoir des limites51. Les approches FACS pour isoler les fibres musculaires individuelles sont compliquées par la grande taille et la nature syncytiale des IFM. INTACT52,53 approches de style peuvent être appliquées pour isoler des compartiments sous-cellulaires spécifiques des IFM, ce qui peut s'avérer utile pour isoler les populations pures de noyaux OU mitochondries IFM. Les dissections manuelles sont toujours la norme actuelle pour obtenir le tissu IFM intact pour la plupart des applications en aval.

La qualité de l'échantillon dépend de plusieurs étapes critiques du processus de dissection. Les dissections sont techniquement exigeantes, avec la vitesse de dissection et la pureté de l'échantillon augmentant avec l'expérience. La disséchation pendant de courtes périodes (20 à 30 min) dans un tampon réfrigéré sans détergent et le gel immédiat aide à préserver l'intégrité de l'échantillon, comme cela a été observé précédemment pour l'isolement du tendon de souris54. Les IFM peuvent être congelés à sec avec succès après avoir retiré tout tampon de la pastille, mais plus précisément pour l'isolement de l'ARN, les échantillons de congélation dans le tampon d'isolement ont tendance à produire de meilleurs résultats. Les IFM de jusqu'à 20 dissections distinctes sont combinées avant l'isolement de l'ARN ou des protéines, ce qui permet d'intensifier et de recueillir suffisamment de matériel, même à partir de premiers moments ou mutants16,32, pour l'analyse en aval.

Pour les applications d'ARN, l'étape la plus critique peut être l'isolement de l'ARN lui-même. L'isolement de guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (méthode 1 ci-dessus) surpasse la plupart des kits commerciaux examinés et, comme mentionné précédemment, est considérablement moins cher55. La variabilité observée dans les rendements d'isolement de l'ARN avec les kits commerciaux est en accord avec les observations précédentes56,57. Nous ajoutons en outre du glycogène pendant les précipitations d'isopropanol pour aider à récupérer tout l'ARN. Au-delà du rendement de l'ARN, il est important de vérifier l'intégrité de l'ARN pour s'assurer que l'échantillon n'a pas été fragmenté ou dégradé au cours des processus de dissection et d'isolement. Il est également essentiel de travailler sans RNase. Enfin, le choix de RT-kit peut avoir un impact sur la sensibilité du processus de transcription inversée. Bien qu'ils ne soient pas souvent discutés en détail, tous ces points influent sur la qualité de l'échantillon DE l'IFM et sur les données obtenues à partir des demandes en aval.

Plusieurs modifications importantes distinguent le protocole des protocoles de dissection IFM existants. Bien qu'un protocole détaillé de dissection pour l'immunofluorescence d'IFM existe19,ce protocole présente une approche différente aux dissections pupal qui permet l'isolement plus rapide du tissu d'IFM. Cela permet la collecte de grandes quantités de tissu IFM (relativement parlant) avec des temps de dissection limités pour prévenir les changements de protéome ou de transcriptome. D'autres protocoles décrivent la dissection de l'IFM adulte pour visualiser la coloration gFP dans les myofibrils individuels39 ou pour la coloration des muscles larvaires de corps-mur58,mais ils n'abordent pas la dissection aux stades pupal ou pour l'isolement de l'ARN ou de la protéine. Cette approche est également distincte du protocole existant pour la microdissection des IFM pupal à partir de cryosections38, qui peut générer un échantillon plus pur IFM, mais est plus laborieux et produit moins de matériel. Par rapport à d'autres protocoles de dissection IFM adultes rapides38,39, IFMs sont isolés dans la mémoire tampon PBS sans détergent pour limiter l'induction du stress et d'autres changements majeurs d'expression.

L'avancée clé de ce protocole est l'inclusion d'un journaliste fluorescent en direct, permettant l'isolement des IFM au début du pupal. Nous utilisons normalement Mef2-GAL459 conduite soit UAS-CD8::GFP ou UAS-GFP::Gma60. Cela permet l'étiquetage différentiel de l'IFM (les muscles de vol sont plus fortement étiquetés et de forme différente que les autres muscles pupal) ainsi que la performance des manipulations basées sur GAL4-UAS, par exemple des expériences de sauvetage ou d'ARNi. Il est également possible de combiner Mef2-GAL4 avec baignoire-GAL80ts pour éviter la létalité précoce associée à l'ARNi ou avec UAS-Dcr2 pour augmenter l'efficacité de l'ARNi40.

Il ya d'autres pilotes GAL4 ou GFP-lignes disponibles qui varient dans la spécificité de type musculaire, le modèle d'expression temporelle, et la force du conducteur19,61 qui peuvent être utilisés au lieu de Mef2-GAL4. Par exemple, Act88F-GAL4 est d'abord exprimé autour de 24 h APF, de sorte qu'il ne peut pas être utilisé pour des délais plus tôt; cependant, il étiquette fortement IFM et peut être utile pour éviter la létalité précoce RNAi-associée. Lui-GFP ou Act88F-GFP étiquette IFM, encore une fois avec des restrictions temporelles, mais ils évitent la dépendance GAL4 de l'expression des marqueurs et peuvent être utiles en combinaison avec un fond mutant d'intérêt. Des listes d'autres lignes de marqueurs possibles sont disponibles19. Il convient également de noter que l'utilisation de transgènes et le système GAL4/UAS peut causer des artefacts d'expression génique, il est donc important d'utiliser des contrôles appropriés, par exemple la ligne de conducteur franchie à la souche de fond de type sauvage, de sorte que ces artefacts sont vraisemblablement la même chose dans tous les échantillons.

Avec la vidéo d'accompagnement, ce protocole détaillé vise à rendre la dissection pupal IFM plus accessible et de promouvoir l'utilisation d'approches omics pour étudier le développement musculaire. Le couplage de la puissance de la génétique de Drosophila et de la biologie cellulaire avec la biochimie et les essais d'omics accessibles par l'IFM disséqué a le potentiel de faire progresser la compréhension mécaniste de la myogenèse et de la fonction musculaire. De futures études liant les observations au niveau des systèmes de la régulation du transcriptome et du protéome aux extrants métaboliques et fonctionnels fourniront une meilleure compréhension du développement spécifique de type musculaire et de la pathogénie des troubles musculaires.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à Andreas Ladurner et Frank Schnorrer pour leur généreux soutien. Nous remercions Sandra Esser pour son excellente assistance technique et Akanksha Roy d'avoir généré les données de spectrométrie de masse. Nous reconnaissons les centres boursiers Bloomington et Vienne pour la fourniture de mouches. Nous remercions le Core Facility Bioimaging pour son aide en imagerie confocale et le Zentrallabor f'r Proteinanalytik pour l'analyse d'échantillons de spectrométrie de masse, tous deux au Centre biomédical LMU (Martinsried, DE). Notre travail a été soutenu par le Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), le Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) de l'Université Ludwig-Maximilians de Munich (MLS), le Frederich-Bauer Stiftung (MLS) et l'International Max École de recherche Planck (EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4 cm x 4 cm
Black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
Black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
Blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
Chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
Confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
Confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
Double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
Glycogen Invitrogen 10814-010
Image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
Microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80 mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
Normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
Rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
Slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
Statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm

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Génétique Numéro 152 Drosophila biologie du développement muscle de vol indirect dissection vivante développement pupal spectrométrie de masse ARN-Seq isolement de l'ARN Bruno1 épissage alternatif
Dissection des muscles de vol <em>de melanogaster de Drosophila</em> pour des approches d'Omics
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Kao, S. Y., Nikonova, E.,… More

Kao, S. Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).

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