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Genetics

Omics दृष्टिकोण के लिए Drosophila मेलेनोगैस्टर उड़ान मांसपेशियों का विच्छेदन

Published: October 17, 2019 doi: 10.3791/60309
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich
* These authors contributed equally

Summary

Drosophila उड़ान मांसपेशियों ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है, वैकल्पिक splicing, चयापचय, और mechanobiology. हम लाइव प्यूपा से फ्लोरोसेंट लेबल उड़ान मांसपेशियों के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए अत्यधिक समृद्ध नमूने proteomics और गहरी अनुक्रमण के लिए आदर्श उत्पन्न करने के लिए. इन नमूनों मांसपेशियों के विकास के विभिन्न पहलुओं में महत्वपूर्ण मशीनी अंतर्दृष्टि की पेशकश कर सकते हैं.

Abstract

Drosophila उड़ान मांसपेशियों ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, वैकल्पिक splicing, चयापचय, और mechanobiology, जो सभी मांसपेशियों के विकास और myofibrillogenesis को प्रभावित के रूप में विविध प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है. Omics डेटा, ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री या गहरी अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न उन के रूप में, इन जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. ऐसे दृष्टिकोणों के लिए, यह ऊतक-विशिष्ट नमूनों का विश्लेषण करने के लिए दोनों चयनात्मकता और omics उंगलियों के निशान की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए फायदेमंद है. यहाँ हम omics अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक समृद्ध मांसपेशियों के नमूने उत्पन्न करने के लिए लाइव प्यूपा से फ्लोरोसेंट लेबल उड़ान मांसपेशियों के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम पहले वर्णन कैसे जल्दी pupal चरणों में उड़ान की मांसपेशियों को विभाजित करने के लिए (lt;48 एच प्यूपरियम गठन के बाद [APF]), जब मांसपेशियों हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबलिंग द्वारा स्पष्ट कर रहे हैं. हम तो वर्णन कैसे देर से प्यूपा से मांसपेशियों को विभाजित करने के लिए (gt; 48 एच एपीएफ) या वयस्कों, जब मांसपेशियों को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत भेद कर रहे हैं. साथ वीडियो प्रोटोकॉल इन तकनीकी रूप से dissections और अधिक व्यापक रूप से मांसपेशियों और Drosophila अनुसंधान समुदायों के लिए सुलभ की मांग कर देगा. आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, हम आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता परख करते हैं जिसे अलग-अलग समय बिंदुओं पर और विभिन्न दृष्टिकोणों के साथ अलग-अलग किया जा सकता है। हम आगे बताते हैं कि Bruno1 (Bru1) मायोसिन भारी श्रृंखला में एक अस्थायी बदलाव के लिए आवश्यक है (Mhc) splicing, प्रदर्शन है कि विच्छेदित मांसपेशियों MRNA-सेक, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) अनुप्रयोगों. इस विच्छेदन प्रोटोकॉल ऊतक विशेष omics विश्लेषण को बढ़ावा देने में मदद मिलेगी और आम तौर पर मायोजेनेसिस के कई जैविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

आधुनिक omics प्रौद्योगिकियों मांसपेशियों के विकास और मानव मांसपेशी विकारों अंतर्निहित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. उदाहरण के लिए, पशु मॉडलों में आनुवंशिक और जैव रासायनिक सत्यापन के साथ संयुक्त ट्रांसक्रिप्टोमिक्स डेटा के विश्लेषण से पता चला है कि 30 से अधिक सार्कोमर के लक्ष्य नेटवर्क के विनियमन के कारण स्पेलिंग कारक आरबीएम 20 की हानि फैली हुई कार्डियोमायोपैथी का कारण बनती है। पहले हृदय रोग से जुड़े जीन , जिसमें टिटिन1,2,3शामिल हैं .

एक दूसरे उदाहरण में, सेल संस्कृति से अध्ययन, पशु मॉडल, और मानव रोगियों से पता चला है कि मायोटोनिक dystrophy Muscleblind (MBNL) के अलगाव और CELF14,5के विनियमन के कारण आरएनए विनियमन में एक व्यवधान के कारण होता है. MBNL और CELF1 के बीच पार नियामक और लौकिक गतिशीलता (भी CUGBP1 या ब्रूनो की तरह कहा जाता है 2) मायोटोनिक dystrophy रोगियों में लगातार भ्रूण splicing पैटर्न समझाने में मदद. इसके अतिरिक्त, गलत विनियमित लक्ष्यों का बड़ा नेटवर्क रोग की जटिल प्रकृति4,6,7,8की व्याख्या करने में मदद करता है . इस तरह के अध्ययनों के बहुमत आनुवंशिक मॉडल जीवों में omics दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए मानव मांसपेशियों की बीमारी अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए. इसके अलावा, वे रोगग्रस्त या उम्र बढ़ने की मांसपेशियों में परिवर्तन को समझने के लिए स्वस्थ मांसपेशियों में पहली समझ अस्थायी और ऊतक प्रकार विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन संशोधन, और चयापचय पैटर्न के महत्व पर प्रकाश डाला.

Drosophila मेलेनोगैस्टर एक और अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक मॉडल जीव है. सार्कोमयर के साथ-साथ व्यक्तिगत सार्कोमयर घटकों की संरचना मक्खियों से कशेरुकियों के लिए अत्यधिक संरक्षित हैं4,9,10, और अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियों (IFMs) का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बन गए हैं पेशी विकास के कई पहलू11,12. सबसे पहले, फाइब्रिलर उड़ान की मांसपेशियों को कार्यात्मक और ट्यूबलर शरीर की मांसपेशियों से आकृतिबद्ध रूप से अलग कर रहे हैं11,13,मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट विकास तंत्र की जांच की अनुमति. स्पैल्ट मेजर (सलम)14,एक्सट्राडेंटिकल (एक्सड) और होमोथोरेक्स (एचथ)15 सहित ट्रांसक्रिप्शन कारकों की पहचान फाइब्रिलर भाग्य नियामकों के रूप में की गई है। इसके अतिरिक्त, सालम के बहाव, CELF1 homlog Bruno1 (Bru1, Aret) एक तंतुकाकार-विशिष्ट splicing कार्यक्रम16,17निर्देशित करता है.

दूसरा, IFMs मायोजेनेसिस की प्रक्रिया को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल हैं, मायोब्लास्ट संलयन और मायोट्यूब लगाव से मायोब्रिलोजेनेसिस और सार्कोमर परिपक्वता9,18,19. तीसरा, Drosophila आनुवंशिकी व्यक्तिगत प्रोटीन, प्रोटीन डोमेन द्वारा योगदान की जांच की अनुमति देता है, और प्रोटीन isoforms सार्कोमकेर गठन करने के लिए, समारोह, और जैव भौतिक गुण20,21,22 ,23. अंत में, IFM मॉडल कई मानव मांसपेशी विकारों के अध्ययन के लिए विकसित किया गया है, इस तरह के मायोटोनिक dystrophy के रूप में, मायोफिरिल मायोपैथी, मांसपेशी अपक्षयी विकार, actinopathies, आदि24,25,26 27, और रोग तंत्र और संभावित चिकित्सा28,29,30के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की है . इस प्रकार, Drosophila एक उपयोगी मॉडल के लिए myogenesis क्षेत्र में कई खुले सवालों का पता है, मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट प्रतिलेखन के तंत्र सहित, जोड़, और क्रोमैटिन विनियमन, साथ ही मांसपेशियों के विकास में चयापचय की भूमिका के लिए. आधुनिक omics प्रौद्योगिकियों के आवेदन, विशेष रूप से आनुवंशिक, जैव रासायनिक और सेल जैविक परख Drosophilaमें उपलब्ध की विस्तृत विविधता के साथ संयोजन में, नाटकीय रूप से मांसपेशियों की समझ अग्रिम करने की क्षमता है विकास, उम्र बढ़ने, और रोग.

IFMs मक्खी में सबसे बड़ी मांसपेशियों रहे हैं, वयस्कों में छाती की पूरी लंबाई में लगभग 1 मिमी फैले31,32. हालांकि, इस छोटे आकार के एक ऊतक प्रकार विशिष्ट तरीके से Drosophila में omics प्रौद्योगिकियों लागू करने के लिए पर्याप्त नमूना प्राप्त करने की चुनौती उत्पन्न करता है. इसके अलावा, IFMs वयस्क पेशी का हिस्सा है कि pupal चरणों के दौरान गठन किया है. मायोब्लास्ट्स मायोट्यूब बनाने के लिए फ्यूज होता है, जो प्यूपरियम गठन (एपीएफ) के बाद 24 एच के आसपास कण्डरा को संलग्न करता है और 30 एच एपीएफ के आसपास मायोब्रिलोजेनेसिस शुरू करने के लिए आवश्यक एक संहनन चरण से गुजरना पड़ता है (चित्र 1ए-डी)18,33, 34.

मायोफाइबर्स तो छाती की पूरी लंबाई अवधि के लिए बढ़ने के लिए, myofibrills के बारे में 48 एच एपीएफ तक सार्कोमर इसके अलावा पर ध्यान केंद्रित एक प्रारंभिक विकास चरण के दौर से गुजर के साथ, और फिर एक परिपक्वता चरण में संक्रमण, जिसमें sarcomeres लंबाई और चौड़ाई में वृद्धि और कर रहे हैं 72 ज एपीएफ द्वारा खिंचाव सक्रियण स्थापित करने के लिए फिर से तैयार किया गया (चित्र 1ए -डी)32,35. फाइबर परिपक्वता की शुरुआत कम से कम आंशिक रूप से सालम और E2F32,36,37, और एकाधिक IFM-विशिष्ट सार्कोमर प्रोटीन आइसोफॉर्म जिसका splicing द्वारा नियंत्रित किया जाता है द्वारा नियंत्रित किया जाता है इस के दौरान शामिल किया जाता है चरण16,17. परिपक्व मक्खियों 90-100 एच एपीएफ से eclose. इसका मतलब यह है कि मांसपेशियों के विकास का अध्ययन करने के लिए, IFM के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ अलग किया जाना है, गुणवत्ता, और कई pupal timepoints से शुद्धता omics दृष्टिकोण का उपयोग कर विश्लेषण की सुविधा के लिए.

IFM विच्छेदन के लिए कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किया गया है। जबकि इन प्रोटोकॉल उनके इच्छित अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, कोई भी omics दृष्टिकोण के लिए आदर्श होते हैं. प्रोटोकॉल है कि प्यूपल और वयस्क IFMs19के इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए IFM आकृति विज्ञान की रक्षा , यांत्रिक मूल्यांकन के लिए IFM फाइबर को अलग31, या cryosections38 से प्यूपल IFM के microdissection का उपयोग भी विशेष और समय और कर रहे हैं omics अनुप्रयोगों के लिए उचित IFM ऊतक की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए गहन श्रम. अन्य प्रोटोकॉल विशेष रूप से वयस्क IFM38,39के तेजी से विच्छेदन के लिए विकसित किया गयाहै,इस प्रकार pupal चरणों के लिए लागू नहीं हैं, और बफ़र्स कि आदर्श नहीं हैं या के साथ असंगत हो सकता है का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, आरएनए अलगाव. इस प्रकार, जैव रसायन या omics अनुप्रयोगों के लिए प्यूपल IFM को अलग करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने की आवश्यकता है.

यहाँ हम pupal चरणों है कि वयस्क चरणों16,32के माध्यम से 16 एच एपीएफ से MRNA-सेक विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है के दौरान IFM के विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. प्रोटोकॉल एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबल को रोजगार के लिए pupal और वयस्क विकास के सभी चरणों में IFMs की पहचान, एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जीना विच्छेदन की अनुमति. दृष्टिकोण कम श्रम गहन है, मौजूदा IFM विच्छेदन प्रोटोकॉल की तुलना में एक उच्च थ्रूपुट के साथ. यह तेजी से अलगाव और नमूनों के cryopservation की अनुमति देता है, omics दृष्टिकोण के लिए विच्छेदन के कई दौर के बाद पर्याप्त सामग्री पैदा करने के साथ ही मानक रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) या पश्चिमी सोख्ता के लिए.

हम प्रोटोकॉल को दो भागों में प्रस्तुत करते हैं, यह प्रदर्शित करते हैं कि 48 एच एपीएफ से पहले IFMs को तेजी से कैसे विभाजित किया जाए (शुरुआती कायापलट के दौरान, जब IFM अनुलग्नक अधिक कठोर होते हैं) और 48 एच एपीएफ के बाद (जब प्यूपल बॉडी प्लान और IFM अनुलग्नक अच्छी तरह से परिभाषित होते हैं)। हम प्रदर्शित करते हैं कि हम सभी timepoints पर विच्छेदन IFMs से उच्च गुणवत्ता आरएनए को अलग कर सकते हैं और आरएनए अलगाव और रिवर्स प्रतिलेखन के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों पर डेटा वर्तमान. अंत में, हम एक उदाहरण के रूप में CELF1 homolog Bruno1 का उपयोग कर MRNA-सेक, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और RT-PCR करने के लिए विच्छेदन प्रोटोकॉल के आवेदन का प्रदर्शन. हम ब्रूनो1 उत्परिवर्ती आई.एफ.एम. से प्रोटीओमिक्स डेटा में सार्कोमर प्रोटीन आइसोफॉर्म्स की गलत अभिव्यक्ति दिखाते हैं और मायोसिन भारी श्रृंखला(एमएचसी)के सी-टर्मिनल जोड़ घटना के ब्रूनो1 विनियमन की जांच करते हैं। इन परिणामों से यह स्पष्ट होता है कि ओमिक्स डेटा किस प्रकार जैविक परिघटनाओं की गहरी समझ प्रदान कर सकता है, जो आनुवंशिक और जैव रासायनिक प्रयोगों का पूरक है।

Protocol

1. प्यूपा मचान

  1. वांछित जीनोटाइप की मक्खियाँ बोतलों में उठाएं (चित्र 1ई) या तो विच्छेदन शेयर का एक ताजा फ्लिप बनाने के लिए या कम से कम 20 महिला कुंवारी मक्खियों के साथ एक क्रॉस सेट. बोतलों को बनाए रखें जब तक मक्खियों को प्यूरेट करना शुरू न हो जाए।
  2. एक गीला तूलिका के साथ पूर्व प्यूपी लीजिए और 60 मिमी पेट्री डिश में गीला फिल्टर पेपर में स्थानांतरित करें (चित्र 1च)।
  3. प्रयोग के लिए उपयुक्त लिंग एकत्र करना , प्यूपा को सेक्स करना (चित्र 1जी)। नर testes, जो अन्यथा अपारदर्शी प्यूपा में पारदर्शी गेंदों के रूप में दिखाई देते हैं की उपस्थिति से पहचाने जाते हैं.
  4. पेट्री डिश को समय, तिथि और जीनोटाइप के साथ लेबल करें, फिर प्यूपा को वांछित अवस्था में आयु दें (चित्र 1ज)।
    नोट: तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर में क्रॉस/स्टॉक और आयु प्यूपा बनाए रखें (यानी, आरएनएई क्रॉस के लिए 25 डिग्री सेल्सियस या 27 डिग्री सेल्सियस, उच्च तापमान पर वृद्धि हुई Gal4 गतिविधि के रूप में नॉक-डाउन दक्षता40बढ़ जाती है)। सुनिश्चित करें कि आर्द्रता पर्याप्त रूप से अधिक है इसलिए कई दिनों की उम्र बढ़ने पर प्यूपा सूख न जाए।

2. IFM विच्छेदन 48 एच एपीएफ से पहले

  1. दो #5 जीव विज्ञान ग्रेड forceps, एक pipette, pippette युक्तियाँ, सूखी बर्फ, और (RNA नमूने के लिए) अलगाव अभिकर्मक सहित आवश्यक उपकरण इकट्ठा (सामग्री की तालिकादेखें). इसके अलावा, ठंडा काले विच्छेदन व्यंजन (सामग्री की मेजदेखें), 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) बफर, और बर्फ पर 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब.
  2. एक गीली तूलिका का उपयोग करके, एक काले विच्छेदन व्यंजन में प्यूपा का स्थानांतरण किया जाता है जो लगभग दो-तिहाई ठंड 1x पीबीएस के साथ भरा हुआ है (चित्र 2ए, बी)। एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप के लिए ले जाएँ.
    नोट: एक 30 मिनट के समय खिड़की के भीतर विच्छेदन किया जा सकता है के रूप में कई प्यूपा के रूप में प्रयोग करें। अनुभव के आधार पर, यह 3-15 प्यूपा से लेकर होता है। काले विच्छेदन व्यंजनों के लिए विकल्प की चर्चा के लिए पूरक तरीके देखें.
  3. #5 संदंश का प्रयोग करके प्यूपा में से एक को काले विच्छेदन के बर्तन के नीचे धकेलदें और सूक्ष्मदर्शी ज़ूम को समायोजित करें और प्यूपा को स्पष्ट रूप से देखने के लिए ध्यान केंद्रित करें(चित्र 2ब्)।
  4. एक संदंश के साथ प्यूपा के पूर्ववर्ती को पकड़ें (चित्र 2D),फिर प्यूपा को छाती के ठीक पीछे, पेट में थोड़ा-थोड़ा ऑफ-सेंटर के अन्य संदंश के एक सिरे से प्रहार करें। यह प्यूपा को जगह में रखता है और आई.एम.एस. को उदर में जाने से रोकता है (चित्र 2म्)
    नोट: इस बिंदु से विच्छेदन की लंबाई के समय शुरू, जैसे ही प्यूपल अखंडता बाधित है. विच्छेदन की एक परिभाषित लंबाई का उपयोग करें (उदाहरण के लिए 20-30 मिनट) मांसपेशियों की मौत और जुड़े transcriptomic और proteomic परिवर्तन को कम करने के लिए. समय की इस अवधि में संभव के रूप में कई मक्खियों के रूप में विच्छेदन.
  5. पहले संदंश का प्रयोग करके प्यूपल केस के पूर्ववर्ती भाग को हटा दें (चित्र 2च)।
  6. छाती के ठीक पीछे उजागर प्यूपा को चुटकी लेने के लिए एक ही संदंश का प्रयोग करें, और पेट को वक्ष से अलग करें (चित्र 2ग)।
  7. संदंश का प्रयोग करके, छाती के पूर्ववर्ती भाग को धीरे से निचोड़ें (lt;35 h APF के लिए) या वक्ष को खोलने के लिए फ्लोरोसेंटलेबल IFMs (चित्र 2H) को बेनकाब करने के लिए। IFMs आसानी से बाह्य त्वचा से अलग हो जाएगा, के रूप में जल्दी timepoints पर कण्डरा संलग्नक नाजुक हैं. शेष शव को डिश के विपरीत दिशा में धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करके छोड़ ें।
  8. दोहराव चरण 2-3-2-7, अतिरिक्त प्यूपा को विच्छेदित करते हैं।
  9. आईएफएम फाइबर को संदके के साथ एकत्र कीजिए और उन्हें काले विच्छेदन डिश के तल पर एक ढेर में व्यवस्थित करें (चित्र 2I,J)। बलके उपयोग करके इसे दृश्य के क्षेत्र से बाहर धकेलकर किसी भी मलबे को निकालें।
    नोट: अभ्यास के साथ, forceps युक्तियाँ एक दूसरे को छूने के बिना करीब निकटता में लाया जा सकता है. इस तकनीक को ढीला उन्हें नष्ट करने के बिना IFMs हड़पने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक तरीकों धीरे धक्का या एक टिप या पूरी तरह से बंद संदंश के साथ IFMs उठाने, या IFM के साथ कुछ वसा या अन्य ऊतक लेने और चरण 2.10 में वर्णित के रूप में वसा को हटाने में शामिल हैं.
  10. गुणवत्ता नियंत्रण IFM मांसपेशी नमूना, नमूने से गैर IFM मांसपेशियों, वसा, क्यूटिकल, आदि को दूर करने के लिए forceps का उपयोग कर (चित्र 2K,L).
    नोट: Mef2-Gal4 के साथ, IFM जल्दी timepoints पर अन्य मांसपेशी प्रकार की तुलना में अधिक दृढ़ता से लेबल है (चित्र 2K, K'),कूद मांसपेशियों और लार्वा की मांसपेशियों को हटाने की अनुमति फ्लोरोसेंट तीव्रता और मांसपेशियों के आकार के आधार पर. वसा और क्यूटिकल ऊतक अलग दिखते हैं और मांसपेशियों-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल द्वारा लेबल नहीं किए जाते हैं (चित्र 2K, K')। अन्य Gal4 लाइनों कि लेबल IFM के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
  11. एक क्लिप्ड पिपेट टिप का उपयोग करके, IFMs के ढेर को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जो 250 डिग्री सेल्सियस पीबीएस से भरा हुआ है (चित्र 2एम-ओ)। धारा 4 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    नोट: IFM नमूने बस pippette टिप के पक्ष से चिपके हुए द्वारा खो दिया जा सकता है. IFMs इकट्ठा करने से पहले बफर ऊपर और नीचे कई बार पाइपिंग मानक युक्तियाँ कम चिपचिपा बना सकते हैं, और सिलिकॉनीकृत या perfluoraloxy (PFA) युक्तियाँ (सामग्री की तालिकादेखें) कम सतह तनाव के साथ नमूना हानि को रोकने में मदद कर सकते हैं.

3. IFM विच्छेदन के बाद 48 ज एपीएफ

  1. जीव विज्ञान ग्रेड बल के दो #5, ठीक कैंची, मानक कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड, डबल छड़ी टेप, पिपेट, पिपेट युक्तियाँ, सूखी बर्फ, और (RNA अनुप्रयोगों के लिए) अलगाव अभिकर्मक सहित आवश्यक उपकरण इकट्ठा (सामग्री की तालिकादेखें).। बर्फ पर 1x पीबीएस और microcentrifuge ट्यूबों ठंडा.
  2. हल्के गीले तूलिका का उपयोग करके, मंचित प्यूपा को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर लगाए गए द्वि-पक्षीय चिपचिपा टेप की पट्टी में स्थानांतरित करें (चित्र 3ए)। प्यूपा को एक ही अभिविन्यास में उन्मुख रेखा में रखें (नीचे और अग्रकाल स्लाइड के तल की ओर)।
    नोट: तूलिका या फिल्टर पर बहुत अधिक पानी का उपयोग न करने के लिए सावधान रहें, या प्यूपा अच्छी तरह से नहीं रहेगा। यदि प्यूपा चिपक नहीं है, उन्हें पहले एक सूखी फिल्टर या ऊतक कागज में स्थानांतरित करके सूखी. माउंट के रूप में कई प्यूपा के रूप में एक 30 मिनट समय खिड़की के भीतर विच्छेदन किया जा सकता है, आदर्श रूप से 10 प्यूपा.
  3. प्यूपा को प्यूपा से हटा दें। बल का प्रयोग अलग-अलग चिढ़ाने के लिए करें और पूर्वकाल स्पाइराकल्स के ऊपर प्यूपल केस को खोलें (चित्र 3ठ) ।
  4. पुपल के सम्प के रूप में बल को काटने के लिए बल की एक जोड़ी को धीरे-धीरे पीछे की ओर स्लाइड करें (चित्र 3ठ)। अंतर्निहित प्यूपा को टूटना नहीं सावधान रहें। खोले गए मामले से प्यूपा को मुक्त करें और इसे तुरंत एक दूसरी माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 1x पीबीएस की एक बूंद में स्थानांतरित कर दें (चित्र 3ठ", ब्)।
  5. लाइन में सभी प्यूपा के लिए चरण 3.3 और 3.4 दोहराएँ, फिर डबल-स्टिक टेप स्लाइड को एक तरफ सेट करें।
  6. ठीक कैंची का उपयोग करके, प्यूपा के पेट को छाती से दूर काट कर एक अलग ढेर में धकेल दें (चित्र 3डी, डी')। शेष प्यूपा के लिए दोहराएँ.
    नोट: चरण 3.6 के साथ विच्छेदन की लंबाई के समय के समय शुरू, जैसे ही प्यूपल अखंडता बाधित है. सेल मौत और संबद्ध ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटीओमिक परिवर्तनों को रोकने के लिए 20-30 मिनट में संभव के रूप में कई मक्खियों को अलग करें। जब विच्छेदन 1 d वयस्कों या gt;90 h प्यूपा, यह अक्सर बाद में कदम के लिए सुविधाजनक है अतिरिक्त ठीक कैंची के साथ सिर को दूर करने के लिए.
  7. एक ऊतक कागज का उपयोग करना, 1x पीबीएस के बहुमत को हटा दें (आम तौर पर निलंबित वसा के साथ बादल) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पेट के ढेर (चित्र 3ई). शेष thoraxes के लिए ताजा, ठंडा 1x पीबीएस की एक बूंद जोड़ें.
  8. कैंची का प्रयोग करें एक ही गति में अनुदैर्घ्य शरीर अक्ष नीचे सिर से काटने के द्वारा आधा में वक्ष में कटौती करने के लिए (चित्र 3एफ, एफ)। वैकल्पिक रूप से, अगर सिर हटा दिया गया है, पहले कैंची जहां सिर संलग्न किया गया था डालने और IFMs के बीच छाती longitudinly के शीर्ष आधे में कटौती. फिर, एक ही अभिविन्यास में एक दूसरी कटौती के साथ छाती के अधर पक्ष में कटौती.
  9. सभी प्यूपा को विच्छेदित करने के लिए चरण 3.7 और 3.8 दोहराएँ, जिससे स्लाइड के केंद्र के निकट वक्ष हेमीक्टकेण्डों का ढेर उत्पन्न हो जाता है। सुनिश्चित करें कि स्लाइड पर पर्याप्त ठंडा 1x PBS है ताकि अर्धखंड सूख न जाएँ।
    नोट: 48 एच एपीएफ के बाद, IFMs प्रशिक्षित आंखों के लिए एक मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई देने के लिए पर्याप्त बड़े हैं। प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर, एक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ मांसपेशियों को IFM पहचान में या प्रशिक्षण प्रयोजनों के लिए सहायता करने के लिए एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन गुंजाइश के लिए ले जाया जा सकता है, लेकिन यह आवश्यक नहीं है.
  10. IFMs को छाती से अलग करें। #5 संदंश का उपयोग करते हुए अर्धखंडों में से एक को अलग करें (चित्र 3जी, एच)। IFMs के मध्य के ऊपर और नीचे एक बल के सुझावों को धीरे से सम्मिलित करें (चित्र 3G',H')). पहले संदंश अभी भी पकड़े हुए, क्यूटिकल और टेंडन से दूर आईबीएम के एक छोर को काटने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें। फिर, क्यूटिकल से मुक्त IFM के दूसरे छोर को काटें (चित्र 3G', H'')।
    नोट: पहली IFM कटौती के बाद छाती के उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है, यह छाती 180 डिग्री बारी बारी से इतना है कि दूसरा IFM कटौती करने के लिए आसान है उपयोगी है.
  11. हथ' के साथ छाती से IFM बंडल निकालें (चित्र 3G',H''), इसे पीबीएस बुलबुले के किनारे पर स्थानांतरित करने के लिए पानी के तनाव का उपयोग करने के लिए इसे जगह में पकड़ ( चित्र3I). शव को स्लाइड के विपरीत दिशा में धकेलें। शेष छाती अर्धखंडों के लिए दोहराएँ, विच्छेदन IFMs का एक संग्रह पैदा.
    नोट: यदि IFMs एक साफ ढेर में नहीं रहना है, एक ऊतक के साथ 1x पीबीएस के कुछ हटा दें. सावधान रहें कि सभी पीबीएस वाष्पित न हों, और यह सुनिश्चित करें कि विच्छेदित आई.एफ.एम.एस. और अर्धावर्त बफर द्वारा कवर रहें।
  12. सभी IFMs विच्छेदन के बाद, जल्दी से विच्छेदन मांसपेशियों पर एक गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन. #5 बलप का उपयोग करके, किसी भी कूद मांसपेशी या क्यूटिकल टुकड़े को हटा दें जो नमूने में अपना रास्ता मिल सकता है (चित्र 3J-K')।
    नोट: कूद मांसपेशी IFM से अलग दिखाई देता है. यदि fluorscence के तहत Mef2-Gal4 लेबल मांसपेशियों विच्छेदन, कूद मांसपेशियों एक कमजोर फ्लोरोसेंट और एक अलग आकार और बनावट है. सामान्य प्रकाश के अंतर्गत, यह लगभग पारदर्शी प्रतीत होता है जबकि IFMs एक अपारदर्शी, दूधिया पीला(चित्र 3J-J',K) हैं।
  13. जल तनाव का उपयोग करके, कब्जा करना (लेकिन नहीं स्क्विश) बलप्स की एक जोड़ी के बीच विच्छेदित IFMs (चित्र 3ल). IFMs को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जो पहले से भरे हुए 250 डिग्री सेल्सियस पीबीएस (चित्र 3म) के साथ भरे हुए हैं। धारा 4 के साथ तुरंत आगे बढ़ें।
    नोट: जब forceps युक्तियाँ एक दूसरे की निकटता में लाया जाता है और एक बफर समाधान से बाहर उठाया, पानी के तनाव बबने का एक बुलबुला का कारण बनता है forceps सुझावों के बीच कब्जा कर लिया. IFMs भी इस बुलबुले में मौजूद हैं, तो वे समाधान से बाहर उठाया जा सकता है और आसानी से एक और बफर से भरे गोदाम में स्थानांतरित. यह एक दूसरे को छूने के बिना एक दूसरे के पास सुझाव लाने के लिए forceps निचोड़ करने के लिए महत्वपूर्ण है, बफर बुलबुला में कब्जा कर लिया ऊतक macerating से बचने के लिए.

4. गोली और IFM नमूना संरक्षण

  1. एक टेबल-टॉप सेंट्रीफ्यूज में 3-5 मिनट 2,000 x ग्राम पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सेंट्रीफ्यूगिंग करके IFMs को गोली मारिए (चित्र 4ए,बी)।
  2. पिपेट टिप ( चित्र4ग) का उपयोग करके बफर निकालें.
  3. आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, वांछित आरएनए पृथक्केश बफर के 50-100 े ल में आईएफएम गोली को पुन: स्फूर्त करें (सामग्री की सारणीदेखें, चित्र 4ड) । अन्यथा, चरण 4.4 पर आगे बढ़ें.
    नोट: IFMs बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री की तैयारी या वाणिज्यिक किट के साथ आरएनए के अलगाव के लिए कदम 4.2 के बाद सूखी-फ्रोज़न किया जा सकता है (प्रतिनिधि परिणाम देखें). आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, बेहतर परिणाम तुरंत ressssssssssssऔर अलगाव बफर में IFM गोली ठंड से प्राप्त कर रहे हैं.
  4. शुष्क बर्फ पर प्रतिदर्श को फ्रीज करें या तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज करें (चित्र 4इ)। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक downstream विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी में बाद के चरणों के लिए तैयार है.
    नोट: क्रायोप्रेक्षण के बाद, नमूने डाउनस्ट्रीम जांच के लिए प्रसंस्करण से पहले कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

Representative Results

ऊपर प्रस्तुत विच्छेदन प्रोटोकॉल वयस्क चरण तक प्यूपरियम गठन (एपीएफ) के बाद 16 एच से IFM समृद्ध नमूने उत्पन्न करने के लिए उपयोगी होते हैं। dissected उड़ान मांसपेशियों के नमूने कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अब तक सफलतापूर्वक आरटी-पीसीआर4,17,आरएनए-सेक16,32,ChIP36,37, पश्चिमी के लिए आवेदन किया गया है सोख्ता14,41 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोग (नीचे देखें).। आरएनए-आधारित अनुप्रयोगों के लिए विच्छेदन करने वाले संभावित उपयोगकर्ताओं की मदद करने के लिए, हम पहले IFMs से आरएनए के अलगाव के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण विचारों पर प्रकाश डालते हुए हमारे परिणाम प्रस्तुत करते हैं। अधिक मोटे तौर पर हमारे विच्छेदन प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, हम तो आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन Bruno1 पर हमारे डेटा का उपयोग कर संभव -omics अनुप्रयोगों में से कुछ वर्णन.

IFM विच्छेदन प्रोटोकॉल पैदावार उच्च गुणवत्ता आरएनए

मक्खियों की संख्या को पहले से विभाजित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कोडन एमआरएनए कुल आरएनए42का केवल 1-5% होने का अनुमान है। हमने 1 घ वयस्कों से विभाजित आईएफएम से प्रति मक्खी के औसत 24 डिग्री 9 एनजी प्राप्त किए हैं (चित्र 4च और पूरक चित्र 1क) जिनकी पैदावार आमतौर पर अनुभव के साथ बढ़ती है। प्रति मक्खी कुल आरएनए की यह उपज अपेक्षाकृत स्थिर है, आईएफएम के लिए लगभग 25 एनजी के आसपास उतार-चढ़ाव 16 एच एपीएफ, 24 एच एपीएफ, 30 एच एपीएफ, 48 एच एपीएफ, 72 एच एपीएफ और 90 एच एपीएफ (चित्रा 4एफ और पूरक चित्रा 1बी, डी, ई) में विभाजित है। ये प्रेक्षण वसा, कण्डरा, श्वासनली या अन्य कोशिका प्रकारको दूषित होने से पृथक किसी भी आरएनए को भी प्रतिबिंबित करते हैं, जो पहले के समयबिंदुसे अलग नमूनों में अधिक हो सकता है। इस प्रकार, हमने आईएफएम से कुल आरएनए का 50 मक्खियों से प्राप्त किया और सामान्यतया IFM को 100$150 मक्खियों से अलग कर के लिए उत्पन्न किया और आरएनए-सेक नमूनों के लिए कुल आरएनए का 3 $g।

आरएनए अलगाव की विधि मात्रा और बरामद आरएनए की गुणवत्ता को प्रभावित करता है, और हम उपयोगकर्ताओं को उनके अलगाव दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं। उदाहरण के लिए, जबकि विधि 1 का उपयोग कर अलगाव 50 1 d वयस्क मक्खियों से IFM से कुल आरएनए के 465 एनजी औसत पर उत्पादन करता है, विभिन्न वाणिज्यिक किट के साथ अलगाव 186 से कहीं भी पैदावार - 8 एनजी करने के लिए 1261 - 355 एनजी कुल आरएनए के ( चित्र 4 जी औरचित्र 4जी और पूरक चित्र 1C). वाणिज्यिक किटों से पृथक आरएनए सामान्यतया अच्छी गुणवत्ता का होता है (चित्र 4एच और पूरक चित्र 1 एफ) लेकिन कम वसूलियों से पता चलता है कि आरएनए को स्तंभों से कुशलता पूर्वक नहीं हटाया जा सकता है। आरएनए अखंडता भी विधि 2 में किया के रूप में एक किट के उपयोग से समझौता किया जा सकता है (चित्र 4एच, दूसरी साजिश), बफर संविधान और गर्मी उपचार के कारण होने की संभावना है, गंभीर विखंडन है कि बहाव प्रयोगों को प्रभावित कर सकते हैं के लिए अग्रणी.

आरएनए नमूनों को अलग-थलग और संभालते समय उचित RNase-मुक्त तकनीक का निरीक्षण करना भी महत्वपूर्ण है। यद्यपि फ्रीज-थॉ व चक्र और 4 एच कमरे के तापमान ऊष्मायन नाटकीय रूप से आरएनए अखंडता प्रोफाइल को प्रभावित नहीं करते हैं, यहां तक कि RNase की छोटी मात्रा में तेजी से आरएनए गिरावट का कारण बनती है (चित्र 4I और पूरक तरीके)। उपयोगकर्ताओं को अभी भी बर्फ पर काम करते हैं और आरएनए हाइड्रोलिसिस और विखंडन को रोकने के लिए फ्रीज-थॉम सीमा करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। यह यहाँ नहीं पाया गया था, लेकिन फ़िल्टर युक्तियों और DEPC उपचार बफ़र्स का उपयोग करके RNase संदूषण को रोकने बिल्कुल आवश्यक है.

रिवर्स प्रतिलेखन की दक्षता भी डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सफलता को प्रभावित करती है। हम तीन वाणिज्यिक आरटी किट हम परीक्षण के दो के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किया है, जो दोनों ribosomal जीन rp49 के लिए मजबूत आरटी-पीसीआर बैंड बढ़ाना (चित्र 4J). तथापि, आरटी किट #2 कम-एक्सप्रेस्ड ट्रांसक्रिप्ट्स का पता लगाने के लिए अधिक संवेदनशील हो सकती है, क्योंकि हमने सभी तीन जैविक प्रतिकृतियों के लिए आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन ब्रू1 के लिए मजबूत बैंड प्राप्त किए हैं (चित्र 4ज)। एक साथ लिया, इन परिणामों को दर्शाता है कि उच्च गुणवत्ता आरएनए IFMs से अलग किया जा सकता है इस प्रक्रिया के साथ विच्छेदन.

dissected IFMs उच्च गुणवत्ता MRNA-सेक और प्रोटीओमिक्स डेटा का उत्पादन

30 एच एपीएफ, 72 एच एपीएफ और 1 डी वयस्क मक्खियों से ऊपर प्रोटोकॉल के अनुसार IFM विच्छेदन का उपयोग करना, हम पहले से पता चला है कि आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन और CELF1-होमोलॉग Bruno1 (Bru1, Arrest, Aret) एक IFM-विशिष्ट splicing मार्ग के बहाव को नियंत्रित करता है प्रतिलेखन कारक Spalt प्रमुख (सालम)16| नल उत्परिवर्ती से IFMs के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मांसपेशियों के साथ मक्खियों-विशिष्ट bruno1 RNAi (bru1-IR) प्रदर्शन sarcomere विकास दोष, मायोसिन गतिविधि के misregulation और अंततः अति संकुचन और मांसपेशियों फाइबर की हानि16,17 . नीचे हम पूरे proteome मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए विच्छेदन IFMs की उपयोगिता का प्रदर्शन और पता चलता है कि अभिव्यक्ति परिवर्तन हम आरएनए स्तर पर मनाया के कई भी प्रोटीन स्तर पर स्पष्ट कर रहे हैं. हम आगे Mhc में एक विशिष्ट विकासात्मक जोड़ घटना है कि Bruno1 द्वारा विनियमित पाया गया पर प्रकाश डाला, illustrating कि MRNA-सेक और आरटी-पीसीआर विच्छेदन IFMs से वैकल्पिक जोड़ घटनाओं के विनियमन को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

पुस्तकालय की गुणवत्ता और गहराई के आधार पर, MRNA-सेक डेटा जीन इकाइयों के स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता है (एक जीन के सभी exons पर पढ़ने की गिनती औसत), व्यक्तिगत exons, या जोड़ जंक्शनों. वाइल्डटाइप की तुलना में ब्रू1-आईआर आईएफएमएस के MRNA-सेक डेटा जीन इकाई स्तर16 पर अभिव्यक्ति में कमजोर परिवर्तन दर्शाता है(चित्र 5ए)। 72 एच एपीएफ में, 60A [Mlp60A], actin 57B [Act57B], मांसपेशी-विशिष्ट प्रोटीन 300 kDa [Msp300], या स्ट्रेचिन-Mlck [स्ट्रेन-Mlck] जैसे सारकोम जीन के लिए पहले से ही एक प्रवृत्ति है जो उचित मांसपेशी विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। bru1-IR पेशी (चित्र 5A और पूरक तालिका 1)। हालांकि, हम पहले से पता चला है कि व्यक्तिगत exons के स्तर पर, वहाँ विशिष्ट सार्कोमेयर जीन isoforms16की एक बहुत मजबूत downregation है , Bruno1 के प्रमुख समारोह का सुझाव वैकल्पिक splicing को नियंत्रित करने के लिए है (पूरक तालिका 1 ).

विच्छेदन IFMs पर पूरे-प्रोटीओम मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके, हम प्रोटीन स्तर पर इसी तरह के विनियमन दिखा सकते हैं (चित्र 5बी और पूरक सारणी 2)। पता चला 1,895 पेप्टाइड समूहों में से, 524 (28%) उनमें से ब्रू1एम2 उत्परिवर्ती आईएफएम में 1 घ वयस्कों (पूरक सारणी 2) में गलत विनियमित किया जाता है। दोनों Strn-Mlck और Mlp60A प्रोटीन के डाउनरेगुलेशन भी मनाया जाता है, हमारे MRNA-सेक डेटा में प्रतिलिपि स्तर पर टिप्पणियों मिलान. डेटाबेस पेप्टाइड्स की सीमित संख्या है कि विशिष्ट प्रोटीन isoforms के लिए नक्शा के बावजूद (विश्लेषण विवरण के लिए पूरक तरीके देखें), sarcomere प्रोटीन Tropomyosin 1 (Tm1), को बरकरार रखा (अप/ एक समरूप से पेप्टाइडों के अपनियमन का निरीक्षण करें और दूसरे के विनियमन (चित्र 5ख) ने आरएनए स्तर16पर इसी प्रकार के विनियमन के हमारे पिछले प्रेक्षणों की पुष्टि की . यह प्रदर्शित करता है कि विच्छेदित IFMs दोनों MRNA-सेक और proteomics अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी होते हैं।

कैसे omics डेटा बढ़ाने के लिए और जैविक अंतर्दृष्टि का विस्तार करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण पूरक कर सकते हैं की एक और उदाहरण के रूप में, हम Mhcके सी टर्मिनस में splicing पर ध्यान केंद्रित करने का फैसला किया. एक पहले की विशेषता प्रोटीन जाल लाइन weeP26 कहा जाता है Mhc43,44 के अंतिम intron में डाला जाता है (सही स्थान के लिए पूरक तरीके देखें). weeP26 में एक मजबूत जोड़ स्वीकारकर्ता होता है और इसे संभवतः सभी Mhc प्रतिलिपियों में शामिल किया जाता है (चित्र 5ग) तथापि, आईएफएम में लेबल प्रोटीन को एम-लाइन के दोनों ओर दो "डॉट्स" में शामिल किया गया है, जबकि पैर की मांसपेशी में, यह समान रूप से एम-लाइन के पार और मोटे फिलामेंट के पार कमजोर रूप से शामिल है (चित्र 5ई)। Orfanos और गौरैया एक विकासात्मक Mhc आइसोफॉर्म स्विच के कारण IFM रूप में इन "डॉट्स" से पता चला: Mhc आइसोफॉर्म 48 एच एपीएफ से पहले व्यक्त GFP है के रूप में लेबल weeP26 exon खुले पढ़ने के फ्रेम में सम्मिलित करता है, जबकि Mhc isoform के बाद व्यक्त 48 h APF unlabeled है, के रूप में weeP26 exon 3'-UTR44में बंद codon के बहाव शामिल है.

हमारे MRNA-सेक डेटा हमें अधिक विस्तार में सी-टर्मिनल Mhc आइसोफॉर्म अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए अनुमति दी। जबकि दो अलग Mhc समाप्ति43,44की सूचना दी गई है , हमारे MRNA-सेक डेटा और वर्तमान Flybase एनोटेशन (FB2019 ]02) सुझाव है कि वहाँ वास्तव में तीन संभव वैकल्पिक splice घटनाओं Mhc में कर रहे हैं सी-टर्मिनस (एक्सन 34-35, 34-36, या 34-37) (चित्र 5ब्), जिसकी पुष्टि आरटी-पीसीआर (चित्र 5डी) द्वारा की जाती है। weeP26 GFP Exon 36 और 37 के बीच intron में डाला जाता है; इस प्रकार, के रूप में दोनों Exon 34-35 और Exon 34-36 isoforms रोक codons होते हैं, GFP केवल Exon 34-37 आइसोफॉर्म में अनुवाद कर सकते हैं (Exon 34-GFP-37 में परिणाम). हम आगे सभी Mhc आइसोफॉर्म्स के लौकिक और स्थानिक विनियमन दोनों देख सकते हैं। IFM में, हम Exon 34-37 से Exon 34-35 के बीच 30 h APF और 48 h APF (चित्र 5C, D,F) 27 डिग्री सेल्सियस पर एक Mhc आइसोफॉर्म स्विच निरीक्षण, भले ही यह अभी तक 48 एच एपीएफ पर इम्यूनोफ्लोरिस द्वारा दिखाई नहीं दे रहा है (चित्र 5ई) . पैर पहले से ही 30 एच एपीएफ पर Exon 34-37 और Exon 34-35 का एक मिश्रण व्यक्त करते हैं, और 72 एच एपीएफ द्वारा सभी तीन Mhc isoforms एक्सप्रेस (चित्र 5डी, एफ)। वयस्क कूद मांसपेशी (TDT) भी सभी तीन Mhc isoforms व्यक्त करता है (चित्र 5एफ), सुझाव है कि यह ट्यूबलर दैहिक मांसपेशियों के लिए आम तौर पर सच है. इस प्रकार, हमारे MRNA-सेक डेटा IFM में Mhc आइसोफॉर्म स्विच के लिए समय सीमा को कम करने और ट्यूबलर मांसपेशियों में Mhc आइसोफॉर्म उपयोग की विशेषता द्वारा पिछले निष्कर्षों के विस्तार की अनुमति देते हैं.

इसके बाद सालम और ब्रू1 उत्परिवर्ती आईएनएम में Mhc आइसोफॉर्म विनियमन की जांच की गई। दोनों ही मामलों में, हमने वीपी26के गलत विनियमन को देखा। सालम उत्परिवर्ती IFMs Mhc आइसोफॉर्म अभिव्यक्ति और phenocopy पैर splicing पैटर्न में बाद के चरणों में विकास स्विच को पूरा करने में विफल, Exon 34-36 घटना के लाभ सहित (चित्र 5एफ). यह पिछले निष्कर्षों से सहमत है कि सालम की हानि ट्यूबलर मांसपेशियों16के लिए IFM के एक लगभग पूर्ण भाग्य परिवर्तन में परिणाम है. Bru1-IR और bru1 उत्परिवर्ती IFM, सालम के समान -/- IFM, वयस्क चरणों के माध्यम से Exon 34-37 जोड़ घटना को बरकरार रखता है (चित्र 5ई, एफ), पैर की मांसपेशियों के समान एक weeP26 GFP लेबलिंग पैटर्न में जिसके परिणामस्वरूप, लेकिन यह Exon 34-36 घटना हासिल नहीं करता है. यह पता चलता है कि Bruno1 IFM में आवश्यक है कम से कम आंशिक रूप से Mhc वैकल्पिक splicing में विकासात्मक स्विच को नियंत्रित करने के लिए, लेकिन यह इंगित करता है कि अतिरिक्त splicing कारकों को भी salm- / इसके अलावा, इस उदाहरण दिखाता है कि कैसे आरटी-पीसीआर और MRNA-सेक डेटा विभाजित IFM से विकासात्मक splicing तंत्र की गहरी समझ पाने में मूल्यवान हो सकता है और मनाया morphological दोष.

Figure 1
चित्र 1: आई एफ एम विकास और प्यूपा का मंचन। (ए) 24 एच एपीएफ, 32 एच एपीएफ, 48 एच एपीएफ, 72 एच एपीएफ, और 1 डी वयस्कों में आई एफएम विकास की योजना , जो कि 32 एच एपीएफ पर उड़ान की मांसपेशियों (हरी) और बाद में फाइबर वृद्धि को छाती को भरने के लिए दिखाती है। टेंडन गहरे भूरे रंग के होते हैं। (B)खुली पुस्तक विच्छेदन (24 ज, 32 ज, 48 ज)19 या वक्ष हेमीसेक्शन (72 ज, 1 दिन) से स्थिर IFMs के confocal छवियों actin के लिए दाग (rhodamine phaloidin, मैजंटा) और GFP (हरा). (सी, डी) पृष्ठीय (सी) या पार्श्व (डी) विमान में विच्छेदन मक्खी लाइन के बरकरार IFM आकृति विज्ञान illustrating लाइव प्यूपा में GFP फ्लोरोसेंट की छवियाँ. Asterisks चिह्न IFM स्थान. (ई) विच्छेदन के लिए तैयार करने के लिए, मक्खी स्टॉक फ़्लिप किया जाना चाहिए या पार सेट 3-4 दिन पहले. (च) तैयारी का चयन उनके सफेद रंग (पीले तीर के सिर) द्वारा किया जाता है और एक गीले रंग की तूलिका (एफ', एफ') का उपयोग करके अलग-थलग किया जाता है। (छ) पूर्वापी को पुरुषों से मादाओं को पीछे स्थित पारदर्शी बॉल्स (पीले तारांकन) के रूप में प्रकट होने वाले परीक्षणों की उपस्थिति के आधार पर पुरुषों से अलग करने के लिए यौन संबंध बनाने चाहिए। (एच) Pupae 60 मिमी व्यंजन में गीला फिल्टर कागज पर आयु वर्ग के हैं. स्केल बार - 100 डिग्री मी (बी), 1 सेमी (सी, डी, ई, एच), 1 मिमी (एफ, एफ', जी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: 48 एच एपीएफ से पहले IFMs का विच्छेदन। (ए) एक स्थानांतरण पिपेट के साथ एक काले विच्छेदन डिश के लिए 1x पीबीएस बफर के अलावा। (बी) एक तूलिका का उपयोग करके चरणबद्ध प्यूपा का स्थानांतरण। (ग)जीएफपी की कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत, प्यूपा को #5 संदंश (ग्रे में रेखांकित) का उपयोग करते हुए विच्छेदन डिश के नीचे तक कोमल धक्का देना। वृत्त में "X" प्रतिबिंब में गति को निर्दिष्ट करता है। (डी, ई) प्यूपा की पूर्वकाल (डी) की ग्रास्पिंग, फिर छाती (ई) के ठीक पीछे प्यूपा की पोकिंग। वृत्त में डैश कोई गति को दर्शाता है। (एफ, जी) प्यूपल केस (एफ) को हटाने के लिए पूर्ववर्ती संदंश (तीर) के साथ खींच, फिर पेट (जी) को हटाने। (एच) कई प्यूपा के लिए सी-जी की पुनरावृत्ति। पीला डॉटेड रेखाएं योगदान प्यूपा को दर्शाने वाली गिने हुई होती हैं। (मैं, जम्मू) आसपास के ऊतकों (जे) से IFMs को अलग करने के लिए forceps का उपयोग (मैं).। वृत्त में बिंदु पृष्ठ से बाहर गति को निर्दिष्ट करता है। (के, एल) वसा और कूद (TDT) मांसपेशियों सहित contaminants को हटाने (कश्मीर) एक साफ IFM नमूना उत्पन्न करने के लिए (एल). TDT कम GFP अभिव्यक्ति और IFM फाइबर(K')की तुलना में एक अलग आकार है. (एम, एन, ओ) विचरित आईएफएम (एन) को एकत्र करने के लिए एक क्लिप्ड पिपेट टिप (एम) का उपयोग और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (ओ) में इसके स्थानांतरण। स्केल बार - 1 सेमी (ए, बी, एम, ओ), 1 मिमी (सी-जी), 500 डिग्री मीटर (एच-एल, एन)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: 48 एच एपीएफ के बाद IFMs का विच्छेदन। (क)प्यूपा को डबल स्टिक टेप पर संरेखित करना। (बी) पूर्वकाल (बी) खोलकर प्यूपा से प्यूपा को हटाना , केस को डोर्सली (बी') में काटकर और प्यूपा (बी' )को निकालना । वृत्त प्रतीकों चित्र 2के रूप में एक ही प्रतिनिधित्व किया. (ग) प्यूपा को बफर में स्थानांतरित करना। (घ) कैंची (पीले डबल तीर ) और थोरैक्स(डी)से अलग करके पेट को हटाना . (ई, एफ) साफ बफर (ई) के अलावा, तो आधे longitudinally में thoraxes के काटने (एफ, एफ '). (जी, एच) विच्छेदन सफेद प्रकाश (जी) या फ्लोरोसेंट के तहत किया जा सकता है GFP कल्पना करने के लिए (एच); एक तरफ IFMs की काटने (G'), तो दूसरी तरफ (G''); संदंश के साथ छाती से बाहर उठाने (ग्रे में रेखांकित) (G'''). (मैं, जे, कश्मीर) बफर में IFMs का संग्रह (मैं) और contaminating अधर तंत्रिका कॉर्ड को हटाने (VNC), आंत, और कूद मांसपेशियों (TDT) (जे) एक साफ IFM नमूना उत्पन्न करने के लिए (कश्मीर). TDT कम GFP अभिव्यक्ति और IFM फाइबर की तुलना में एक अलग आकार है (J'', K'). (एल, एम) आईएफएम (एल) को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (एम) में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग। स्केल बार्स - 1 सेमी (ए, ई, एम), 1 मिमी (बी-डी,एफ-एल)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: आई.एम.एम. संरक्षण और आरएनए अलगाव विवरण. (क) IFMs को 2000 x gपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा छकाया जाता है . (ख) आई.बी.एम. गोली (तीर) और फ्लोरोसेंट के अंतर्गत गोली (बी)। (सी) एक पिपेट टिप के साथ सभी बफर को हटाना। (छ)आरएनए निष्कर्षण के लिए पृथक्सरन बफर में गोली का पुन: निलंबन। इस चरण को ड्राई-फ्रीज विच्छेदित IFMs पर छोड़ दिया जा सकता है. (ई) तरल नाइट्रोजन में अथवा शुष्क बर्फ तथा भंडारण पर -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिदर्श को मुक्त करना। स्केल बार - 10 सेमी (ए), 1 मिमी (बी, बी'), 1 सेमी (सी, डी, ई)। (च)संविक्षिप् त आईएफएम से कुल आरएनए के नैनोग्राम (एनजी) 16 एच एपीएफ, 24 एच एपीएफ, 30 एच एपीएफ, 48 एच एपीएफ, 72 एच एपीएफ, 90 एच एपीएफ, और 1 डी वयस्क पर प्रति मक्खी प्राप्त की। त्रुटि सलाखों ] SD. (G) IFM से अलग कुल आरएनए अलग अलग निष्कर्षण विधियों का उपयोग कर 50 1 d वयस्क मक्खियों से अलग. त्रुटि सलाखों ] एसडी (एच) प्रतिनिधि अंश विभिन्न निष्कर्षण विधियों के बाद आरएनए अखंडता परख करने के लिए। राइबोसोमल बैंड 2000 न्यूक्लियोटाइड्स (एनटी) के ठीक नीचे और 25 एन टी पर मार्कर बैंड पूरक चित्र 1में उपलब्ध अतिरिक्त निशान ों को चलाते हैं। (मैं) एक ताजा अलग आरएनए नमूना (ऊपर), सूखी बर्फ (दूसरा भूखंड) पर एक नमूना फ्रीज-thawed 25x के प्रतिनिधि निशान, एक नमूना बेंच पर 4 एच के लिए छोड़ दिया (तीसरा साजिश), और एक नमूना RNase ए (नीचे साजिश) के साथ इलाज किया. नोट RNase ए (जे) आरटी-पीसीआर जेल के अलावा पर आरएनए की पूरी गिरावट bru1 और rp49के लिए लेबल के रूप में किट से . bru1 बैंड rp49 के खिलाफ सामान्यीकृत के रिश्तेदार तीव्रता नीचे साजिश रची है. त्रुटि पट्टियाँ ] SEM (अयुग्मित t-परीक्षण, p $ 0.0119). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: वैकल्पिक splicing में ब्रूनो1 समारोह की जांच करने के लिए IFM विच्छेदन के आवेदन. (क)आईएफएम से एम.आर.ए.ए.-सेक डाटा (जीन इकाई) का ज्वालामुखी भूखंड 72 एच एपीएफ में विभाजित किया गया है। जीन है कि काफी अंतर bru1-IR और wildtype IFM के बीच विनियमित कर रहे हैं (पैडज और lt; 0.05, abs(लॉग2एफसी) और 1.5) नीले रंग में दिखाए जाते हैं, और ग्रे में गैर महत्वपूर्ण जीन. सारकोमयर प्रोटीन लाल रंग में हाइलाइट किए जाते हैं, और चुनिंदा जीनों को लेबल किया जाता है। (बी)पूरे प्रोटीओम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के ज्वालामुखी साजिश 1 डी वयस्क IFMs से परिणाम. प्रोटीन ब्रू एम2म्यूटेंट और वाइल्डटाइप (एफडीआर और 0.05) के बीच काफी अलग हैं, ग्रे में नीले, गैर महत्वपूर्ण प्रोटीन में दिखाए जाते हैं। सारकोमेरिक प्रोटीन लाल रंग में हाइलाइट किए जाते हैं। पेप्टाइड्स (ए) में जीनों के लिए इसी लाल रंग में लेबल हैं. पेप्टाइड्स मानचित्रण के सेट एक ही प्रोटीन के विभिन्न isoforms करने के लिए एक ही रंग में लेबल रहे हैं. (ग) एम एच सी के सी-टर्मिनस की योजना जिसमें विशिष्ट प्रतिलिपि समरूप और वीईपी26 जीन ट्रैप के निवेश स्थान का चित्रण किया गया है (निवेश बिंदु के लिए पूरक तरीके देखें)। आरटी-पीसीआर प्राइमर को ट्रांसक्रिप्ट्स के ऊपर काली रेखाओं के रूप में निरूपित किया जाता है। MRNA-सेक से प्रति किलोबेस प्रति किलोबेस (RPKM) की गणना 30 एच एपीएफ (नारंगी) और 72 एच एपीएफ (लाल), ब्रू1-आईआर (नीला) और सालमसे 72 एच एपीएफ पर और पूरे पैर (हरी) से 72 एच एपीएफ पर और पूरे पैर (हरी) से 72 एच एपीएफ पर दिखाई जाती है। . (डी) एमएचसी के खिलाफ प्राइमर के साथ आरटी-पीसीआर 30 एच एपीएफ और बाद के टाइमपॉइंट के बीच आईएफएम में आइसोफॉर्म स्विच दिखा रहा है। Exon 34-35 जोड़ घटना केवल कमजोर ब्रूM3उत्परिवर्ती IFM में या वयस्क पैर में मनाया जाता है. (ई) weeP26 GFP स्थानीयकरण के Confocal छवियों जंगली प्रकार IFM sarcomeres में 48 एच एपीएफ और 90 एच एपीएफ की तुलना में 90 एच एपीएफ पैर मांसपेशियों. स्केल बार्स $ 1 डिग्री उ. (च) splice संधि परिमाणीकरण से MRNA-सेक डेटा के लिए जीनोटाइप्स और timepoints के लिए लेबल के रूप में. जंक्शन पढ़ता एक विशिष्ट जोड़ घटना के अनुपात के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (एक्सन 34 ग्रे में 35, बैंगनी में 34 से 36, और हरे रंग में 34 से 37) exon 34 जोड़ दाता बांटने की कुल संख्या घटनाओं के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Figure 1
अनुपूरक चित्र 1: (ए, बी, ब्) आरएनए उसी जीनोटाइप के नमूनों से पैदावार करता है जो एक ही शोधकर्ता द्वारा एक ही सप्ताह में विभाजित किया जाता है। सभी नमूनों को विच्छेदित करने के बाद, आरएनए को अलग किया गया और उसी दिन मापा गया। (क) आई.एफ.एम. से प्राप्त कुल आरएनए के नैनोग्राम (ग) प्रति 1 घ वयस्क मक्खी के विच्छेदन। त्रुटि सलाखों - SEM. (बी) कुल आरएनए 30 एच एपीएफ, 48 एच एपीएफ, 72 एच एपीएफ और 1 डी वयस्क पर प्रति मक्खी विच्छेदित IFM से प्राप्त की। (ग) विभिन्न निष्कर्षण विधियों का उपयोग करके 50 1 घ वयस्क मक्खियों से अलग किए गए आईएफएम से पृथक कुल आरएनए। (घ)प्रति फ्लाई विच्छेदित पैरों, जंप पेशी (टीडीटी) और आई.एम.एम. अधिक आरएनए बड़े IFMs से प्राप्त किया जाता है. त्रुटि सलाखों - एसडी (ई) IFM के मक्खी प्रति कुल आरएनए सांद्रता RNAi या उत्परिवर्ती नमूने की तुलना में 30 एच एपीएफ, 72 एच एपीएफ और 1 डी वयस्क पर नियंत्रण से अलग. म्यूटेंट के लिए, w1118 wildtype नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. उत्परिवर्ती डेटा bru1-IR,सालम से संकलित कर रहे हैं -/- और एक और आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन उत्परिवर्ती. ध्यान दें कि इन जोड़तोड़ के लिए, आरएनए पैदावार में कमी कर रहे हैं 1 d वयस्क मांसपेशियों शोष और हानि के कारण, तो अधिक मक्खियों omics दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए विच्छेदन की जरूरत है. त्रुटियाँ बारों - एसडी (एफ) चित्र 4जी में और पूरक चित्र 1सीमें दर्शाए गए आरएनए अलगाव विधियों के लिए आरएनए अखंडता को दर्शाने वाले अतिरिक्त अंश . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Methods
पूरक तरीके: संपूर्ण पाठ में प्रयुक्त विधियों और अभिकर्मकों का विस्तृत विवरण और विशेष रूप से चित्र 1A-Dमें दर्शाए गए डेटा को जनरेट करने के लिए चित्र 4F-K, चित्र 5, पूरक तालिका1,और अनुपूरक तालिका 2| ये डेटा विच्छेदन प्रोटोकॉल को प्रेरित करते हैं और आरएनए अलगाव, MRNA-सेक, आरटी-पीसीआर, और प्रोटीओमिक्स के लिए अपनी उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

मुख्य पाठ में चित्र 5 और संबद्ध अनुच्छेदों से संबंधित
टैब का नाम डेटा सारांश
सारकोम प्रोटीन्स Spletter एट अल Elife 2018 से सार्कोमयर जीन की सूची; यहाँ हम वर्तमान FBgn और जीन नाम की सूची.
एसपी जीन इकाइयों [DESeQ2]72h Spletter एट अल EMBO प्रतिनिधि 2015 से डेटा का उपयोग करते हुए, हम 72 एच एपीएफ पर MRNA-सेक डेटा में सार्कोमरे जीन पर विशेष रूप से देखा। यह नियंत्रण के बीच जीन इकाई स्तर पर अंतर अभिव्यक्ति का पता लगाने DESeQ2 विश्लेषण से है (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma w1118 को पार कर गया) और Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. पीले रंग में हाइलाइट की गई पंक्तियाँ संकेतरूपित रूप से ऊपर या नीचे विनियमित जीन हैं (log2FC की एक सीमा के ऊपर/नीचे(1.5))। ये आंकड़े चित्र 5क में लाल डॉट ओवरले हैं। प्रत्येक sarcomere जीन के लिए, हम पहचानकर्ता जानकारी प्रदान करते हैं, DESeQ2 से log2FC, पी मूल्य और समायोजित पी मूल्य, साथ ही DESeQ2 सामान्यीकृत अभिव्यक्ति मायने रखता है.
एसपी exon[DEXSe]72h Spletter एट अल EMBO प्रतिनिधि 2015 से डेटा का उपयोग करना, हम 72 एच APF पर MRNA-सेक डेटा में sarcomere जीन exon उपयोग पर विशेष रूप से देखा. यह नियंत्रण के बीच अंतर exon उपयोग का पता लगाने DEXSeQ विश्लेषण से है (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma w1118 को पार कर गया) और Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. पीले रंग में हाइलाइट की गई पंक्तियाँ signficantly ऊपर या नीचे विनियमित exons हैं (ऊपर / log2FC की एक सीमा के नीचे (1.5)). हम exon और जीन पहचानकर्ता जानकारी प्रदान करते हैं, DEXSeQ से log2FC, P मान और समायोजित P मान, साथ ही संबद्ध प्रतिलिपि की एक सूची.
कृपया ध्यान दें कि कई जीन DEXSeQ विश्लेषण में एक या एक से अधिक exons के विनियमन दिखाने के लिए, अक्सर उच्च log2FC मूल्यों और कम पी मूल्य के साथ / यह वैकल्पिक splicing के विनियमन पर ब्रूनो के नुकसान का एक मजबूत प्रभाव का समर्थन करता है.

पूरक सारणी 1: 72 एच एपीएफ MRNA-सेक डेटा के लिए सारकोमियर प्रोटीन की पहचान करने वाले अंतर रूप से व्यक्त जीनों की पहचान (DESeQ2के माध्यम से ) और exons (DEXEQके माध्यम से ) ब्रू1-आईआर बनामवाइल्डटाइप IFMs.

मुख्य पाठ में चित्र 5B और संबद्ध अनुच्छेदों से संबंधित
टैब का नाम डेटा सारांश
पर्सियस आउटपुट यह एक प्रसंस्कृत डेटा स्प्रेडशीट है जो चित्र 5B उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा को प्रस्तुत करता है। IFM नमूने 1 डी वयस्क नियंत्रण (w1118) और उत्परिवर्ती (bruno1-M2) मक्खियों से कर रहे हैं. महत्वपूर्ण कॉलम प्रत्येक नमूने के लिए 4 प्रतिकृतियों में से प्रत्येक के लिए रूपांतरित तीव्रता मान हैं, टी-परीक्षण सांख्यिकी और महत्व, पेप्टाइड आईडी और इसी जीन नाम और Flybase IDs. Signifance Perseus में मानक सेटिंग्स का उपयोग कर गणना की गई थी (FDR और lt;.05). पता चला है 1859 प्रोटीन/ नमूनों के बीच काफी अलग हैं.
नीचे विनियमित ये सभी 252 प्रोटीन / पेप्टाइड्स पर्सियस उत्पादन से हैं जो ब्रूनो1-एम2 उत्परिवर्ती आईएफएम में कम विनियमित हैं। के रूप में Flybase आईडी और जीन नाम पुराने हो चुके हैं, हम इसके अलावा वर्तमान Flybase जीन आईडी और जीन नाम प्रदान करते हैं.
अनियंत्रित ये सभी 272 प्रोटीन / पेप्टाइड्स पर्सियस उत्पादन से हैं जो ब्रूनो1-एम2 उत्परिवर्ती आईएफएम में विनियमित हैं। के रूप में Flybase आईडी और जीन नाम पुराने हो चुके हैं, हम इसके अलावा वर्तमान Flybase जीन आईडी और जीन नाम प्रदान करते हैं.
कृपया ध्यान दें कि चित्र 5ख में लाल रंग में हाइलाइट किए गए सार्कोयर प्रोटीन उपरोक्त सूचियों में मौजूद हैं। सारकोम के भाग माने जाने वाले जीनों की सूची अनुपूरक तालिका 1 में एक टैब में उपलब्ध है।

पूरक सारणी 2: पूरे प्रोटीओम मास-स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा की तालिका 1 घ वयस्क की पहचान अंतर रूप से व्यक्त प्रोटीन और प्रोटीन समरूप ब्रूएम 2उत्परिवर्ती बनाममें। वाइल्डटाइप IFMs.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रोटीन, डीएनए, आरएनए या अन्य मैक्रो अणुओं के डाउनस्ट्रीम अलगाव के लिए प्रारंभिक और देर से चरण प्यूपा से Drosophila IFMs विच्छेदन करने के लिए बुनियादी तकनीक प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल आसानी से वयस्क मक्खियों से IFM विच्छेदन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हम MRNA-सेक, प्रोटीओमिक्स और आरटी-पीसीआर अनुप्रयोगों के लिए हमारे विच्छेदन प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं। omics प्रौद्योगिकियों के निरंतर सुधार के साथ कम शुरू सामग्री और कम इनपुट सांद्रता के साथ नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए, इन विच्छेदन की संभावना कई अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए मूल्यवान हो जाएगा. के रूप में IFMs मानव myopathies4,24 और मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट विकास9,12के लिए एक स्थापित मॉडलहैं,हम कल्पना, उदाहरण के लिए, IFM समृद्ध metabolomics, क्रोमैटिन रचना की जांच 3C या 4C के माध्यम से, CLiP बातचीत या मायोफिब्रिलोजेनेसिस के फॉस्फो-प्रोटीओमिक्स के माध्यम से नेटवर्क मूल्यांकन का छिड़काव।

यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि इन विच्छेदन एक शुद्ध IFM नमूने के बजाय IFM के लिए समृद्ध नमूना का उत्पादन. यह मोटर न्यूरॉन innervation, कण्डरा संलग्नक और मांसपेशी फाइबर के श्वासनली आक्रमण के कारण अपरिहार्य है. Bioinformatics विश्लेषण IFM समृद्ध जीन या प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन आगे प्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए कि वे वास्तव में IFM-विशिष्ट हैं की आवश्यकता है. नमूना शुद्धता ऐसे धारी45 (टेन्डन), Act79B4,44 (ट्यूबलर मांसपेशी), Act88F15 (IFM), या syb46 (न्यूरॉन विशिष्ट) के रूप में प्रकाशित ऊतक-विशिष्ट मार्करों का उपयोग कर परख किया जा सकता है। IFM-विशिष्ट सामग्री के लिए डेटासेट को सामान्य करने के लिए ऐसे मार्कर का उपयोग करना संभव हो सकता है, लेकिन उपयोगकर्ताओं को चेतावनी दी जाती है कि सामान्यीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले जीनों की अभिव्यक्ति में अस्थायी परिवर्तन, IFM-विशिष्ट जीन या ट्यूबुलिन के उदाहरण के लिए, इस तरह के दृष्टिकोण को पूर्वाग्रह कर सकते हैं।

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ऊतक-विशिष्ट लेबलिंग विधियाँ, उदाहरण के लिए EC-टैगिंग47,48 या PABP-लेबलिंग49,50 आरएनए को अलग करने के लिए हाल के वर्षों में विकसित किया गया है, जो वास्तव में प्राप्त करने में मदद कर सकता है ऊतक-विशिष्ट आरएनए नमूना. हालांकि, ईसी-टैगिंग के लिए मक्खियों को लगातार खिलाने की आवश्यकता होती है47 और इस प्रकार प्यूपल चरणों के दौरान लागू नहीं होता है। PABP-लेबल ट्रांसक्रिप्टम की संवेदनशीलता और पूर्णता की सीमाएँ51हो सकती हैं. व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर को अलग करने के लिए FACS दृष्टिकोण IFMs के बड़े आकार और syncytial प्रकृति से जटिल हैं. INTACT52,53 शैली दृष्टिकोण IFMs से विशिष्ट subcellular-compartments को अलग करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो IFM नाभिक या mitochondria की शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है. मैनुअल विच्छेदन अभी भी सबसे बहाव अनुप्रयोगों के लिए बरकरार IFM ऊतक प्राप्त करने के लिए वर्तमान मानक हैं.

नमूना गुणवत्ता विच्छेदन प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करता है। विच्छेदन तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं, विच्छेदन गति और नमूना शुद्धता के साथ अनुभव के साथ बढ़ रही है. डिटर्जेंट के बिना ठंडा बफर में समय की छोटी अवधि (20-30 मिनट) के लिए विच्छेदन और तुरंत ठंड नमूना अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है, के रूप में माउस कण्डरा अलगाव54के लिए पहले देखा गया है. IFMs गोली से सभी बफर को हटाने के बाद सफलतापूर्वक सूखी-फ्रोज़न किया जा सकता है, लेकिन विशेष रूप से आरएनए अलगाव के लिए, अलगाव बफर में ठंड के नमूने बेहतर परिणाम का उत्पादन करने के लिए जाता है. अप करने के लिए 20 अलग विच्छेदन से IFMs आरएनए या प्रोटीन अलगाव से पहले संयुक्त कर रहे हैं, स्केलिंग और पर्याप्त सामग्री इकट्ठा करने की अनुमति, यहां तक कि प्रारंभिक timepoints या म्यूटेंटसे 16,32,बहाव विश्लेषण के लिए.

आरएनए अनुप्रयोगों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम आरएनए ही अलगाव हो सकता है. ग्वानिडिनियम थायोसाइनेट-फेनोल-क्लोरोफॉर्म आइसोलेशन (विधि 1 ऊपर) सबसे वाणिज्यिक किट परीक्षण outperforms और, जैसा कि पहले उल्लेख किया, काफी कम महंगाहै 55. आरएनए आइसोलेशन में देखी गई परिवर्तनशीलता वाणिज्यिक किटों के साथ पिछली टिप्पणियों के साथ समझौता करती है56,57. हम आगे सभी आरएनए ठीक करने में मदद करने के लिए आइसोप्रोपेनोल वर्षा के दौरान ग्लाइकोजन जोड़ें। आरएनए उपज के अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए आरएनए अखंडता की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि विच्छेदन और अलगाव प्रक्रियाओं के दौरान नमूना खंडित या निम्नीकृत नहीं किया गया है। यह भी RNase मुक्त काम करने के लिए आवश्यक है. अंत में, आरटी-किट का चुनाव रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया की संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकता है। जबकि अक्सर विस्तार से चर्चा नहीं, इन बिंदुओं के सभी IFM नमूना की गुणवत्ता और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों से प्राप्त डेटा को प्रभावित करते हैं.

कई महत्वपूर्ण संशोधन प्रोटोकॉल को मौजूदा IFM विच्छेदन प्रोटोकॉल से अलग सेट करते हैं. हालांकि IFM इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक विस्तृत विच्छेदन प्रोटोकॉल मौजूदहै 19, इस प्रोटोकॉल pupal विच्छेदन है कि IFM ऊतक के और अधिक तेजी से अलगाव की अनुमति देता है के लिए एक अलग दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. यह IFM ऊतक की बड़ी मात्रा के संग्रह की अनुमति देता है (relatively बोल) सीमित विच्छेदन समय के साथ proteome या transcriptome परिवर्तन को रोकने के लिए. अन्य प्रोटोकॉल व्यक्तिगत myofibrills39 में GFP धुंधला visualizing के लिए वयस्क IFM के विच्छेदन का वर्णन या लार्वा शरीर की दीवार की मांसपेशियों के धुंधला के लिए58, लेकिन वे pupal चरणों में विच्छेदन पता नहीं है या आरएनए या प्रोटीन के अलगाव के लिए. यह दृष्टिकोण भी cryosections38से pupal IFMs के microdissection के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल से अलग है, जो एक शुद्ध IFM नमूना उत्पन्न कर सकते हैं, लेकिन अधिक श्रम गहन है और कम सामग्री का उत्पादन. अन्य तेजी से वयस्क IFM विच्छेदन प्रोटोकॉल की तुलना में38,39, IFMs तनाव प्रेरण और अन्य प्रमुख अभिव्यक्ति परिवर्तन को सीमित करने के लिए डिटर्जेंट के बिना पीबीएस बफर में अलग कर रहे हैं.

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण अग्रिम एक जीवित, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के शामिल किए जाने, जल्दी pupal चरणों में IFMs के अलगाव की अनुमति है. हम मानक रूप से उपयोग Mef2-GAL459 ड्राइविंग या तो UAS-CD8::GFP या UAS-GFP::Gma60| यह IFM के अंतर लेबलिंग की अनुमति देता है (उड़ान की मांसपेशियों को और अधिक दृढ़ता से लेबल और अन्य प्यूपल मांसपेशियों की तुलना में अलग आकार) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से GAL4-UAS आधारित जोड़तोड़ के प्रदर्शन, उदाहरण के लिए बचाव या RNAi प्रयोगों. यह भी संभव है Mef2-GAL4 टबके साथ गठबंधन करने के लिए -GAL80ts RNAi-संबद्ध जल्दी घातकता से बचने के लिए या UAS-Dcr2 के साथ RNAi दक्षता40में वृद्धि करने के लिए.

अतिरिक्त GAL4 ड्राइवर या GFP-लाइनों उपलब्ध है कि मांसपेशियों में भिन्नता प्रकार विशिष्टता, लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न, और ड्राइवर ताकत19,61 कि Mef2-GAL4 के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, Act88F-GAL4 पहले 24 h APF के आसपास व्यक्त की है, तो यह पहले timepoints के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है; हालांकि, यह दृढ़ता से IFM लेबल और RNAi-संबद्ध जल्दी घातकता से बचने के लिए उपयोगी हो सकता है. उसे-GFP या Act88F-GFP लेबल IFM, फिर से अस्थायी प्रतिबंध के साथ, लेकिन वे मार्कर अभिव्यक्ति की GAL4 निर्भरता से बचने और ब्याज की एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ संयोजन में उपयोगी हो सकता है. अन्य संभावित मार्कर रेखाओं की सूचियाँ19उपलब्ध हैं। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि transgenes और GAL4/UAS प्रणाली का उपयोग जीन अभिव्यक्ति कलाकृतियों का कारण हो सकता है, तो यह उचित नियंत्रण का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए ड्राइवर लाइन जंगली प्रकार पृष्ठभूमि तनाव को पार कर, ताकि ऐसी कलाकृतियों संभवतः कर रहे हैं सभी नमूनों में एक ही.

साथ वीडियो के साथ, इस विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए प्यूपल IFM विच्छेदन और अधिक सुलभ बनाने के लिए और मांसपेशियों के विकास का अध्ययन करने के लिए omics दृष्टिकोण के उपयोग को बढ़ावा देने के उद्देश्य. जैव रसायन और omics के साथ Drosophila आनुवंशिकी और कोशिका जीव विज्ञान की शक्ति युग्मन विच्छेदन IFM के माध्यम से सुलभ assays मायोजेनेसिस और मांसपेशियों के समारोह के यंत्रवादी समझ अग्रिम करने की क्षमता है. चयापचय और कार्यात्मक outputs के लिए transcriptome और proteome विनियमन के सिस्टम स्तर टिप्पणियों को जोड़ने के भविष्य के अध्ययन मांसपेशियों के प्रकार विशिष्ट विकास और मांसपेशियों के विकारों के रोगजनन की एक गहरी समझ प्रदान करेगा.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम उदार समर्थन के लिए एंड्रियास Ladurner और फ्रैंक Schnorrer के आभारी हैं. हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और Akanksha रॉय मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा उत्पन्न करने के लिए सैंड्रा Esser धन्यवाद. हम मक्खियों प्रदान करने के लिए Bloomington और वियना स्टॉक केन्द्रों स्वीकार करते हैं. हम confocal इमेजिंग के साथ मदद के लिए कोर सुविधा Bioimaging धन्यवाद और जेस्पस्पेक्ट्रोमेट्री नमूनों के विश्लेषण के लिए zentrallabor f]r Proteinanalytik, दोनों LMU बायोमेडिकल सेंटर में (Martinsried, डे). हमारे काम ड्यूश Forschungs Gemeinschaft (एमएलएस, एसपी 1662/3-1), लुडविग-Maximilians-यूनिवर्सिटी मोंचेन (एमएलएस), फ्रेडरिक-Bauer Stiftung (एमएलएस), और अंतर्राष्ट्रीय मैक्स में एकीकृत प्रोटीन विज्ञान म्यूनिख (CIPSM) के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था प्लैंक रिसर्च स्कूल (एन.एन.)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4 cm x 4 cm
Black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
Black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
Blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
Chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
Confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
Confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
Double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
Glycogen Invitrogen 10814-010
Image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
Microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80 mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
Normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
Rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
Slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
Statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm

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Kao, S. Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).

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