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Genetics

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Published: October 17, 2019 doi: 10.3791/60309
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich
* These authors contributed equally

Summary

Il muscolo di volo della Drosophila è un modello potente per studiare la regolazione trascrizionale, lo splicing alternativo, il metabolismo e la meccanobiologia. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del muscolo di volo con etichettafluere fluorescente dalle pupe vive per generare campioni altamente arricchiti ideali per la proteomica e il sequenziamento profondo. Questi campioni possono offrire importanti approfondimenti meccanicistici su diversi aspetti dello sviluppo muscolare.

Abstract

Il muscolo di volo della Drosophila è un potente modello per studiare processi diversi come la regolazione trascrizionale, lo splicing alternativo, il metabolismo e la meccanobiologia, che influenzano tutti lo sviluppo muscolare e la mioribrillogenesi. I dati omici, come quelli generati dalla spettrometria di massa o dal sequenziamento profondo, possono fornire importanti informazioni meccanicistiche su questi processi biologici. Per tali approcci, è utile analizzare campioni specifici dei tessuti per aumentare sia la selettività che la specificità delle impronte digitali omiche. Qui presentiamo un protocollo per la dissezione del muscolo di volo fluorescente dalle pupe vive per generare campioni muscolari altamente arricchiti per applicazioni omiche. Descriviamo innanzitutto come sezionare i muscoli di volo nelle prime fasi puiche (<48 h dopo la formazione del puparium [APF]), quando i muscoli sono distinguibili dall'etichettatura delle proteine fluorescenti verdi (GFP). Descriviamo quindi come sezionare i muscoli delle pupe tardive (>48 h APF) o degli adulti, quando i muscoli sono distinguibili al microscopio dissezioso. Il protocollo video di accompagnamento renderà queste dissezioni tecnicamente impegnative più ampiamente accessibili alle comunità di ricerca muscolari e della Drosophila. Per le applicazioni dell'RNA, esaminiamo la quantità e la qualità dell'RNA che può essere isolata in diversi momenti temporali e con approcci diversi. Dimostriamo inoltre che Bruno1 (Bru1) è necessario per uno spostamento temporale nello splicing della catena pesante della miosina(Mhc),dimostrando che i muscoli sezionati possono essere utilizzati per mRNA-Seq, spettrometria di massa e reazione a catena di trascrittorione inversa (RT-PCR) Applicazioni. Questo protocollo di dissezione contribuirà a promuovere analisi omiche specifiche dei tessuti e può essere generalmente applicato per studiare molteplici aspetti biologici della miogenesi.

Introduction

Le moderne tecnologie omiche forniscono importanti informazioni sullo sviluppo muscolare e sui meccanismi alla base dei disturbi muscolari umani. Ad esempio, l'analisi dei dati relativi alla trascrittomica combinata con la verifica genetica e biochimica nei modelli animali ha rivelato che la perdita del fattore di giunzione RBM20 causa cardiomiopatia dilatata a causa della sua regolamentazione di una rete target di oltre 30 sarcomere geni precedentemente associati a malattie cardiache, tra cui titin1,2,3.

In un secondo esempio, studi di coltura cellulare, modelli animali e pazienti umani hanno dimostrato che la distrofia miotonica è causata da un'interruzione della regolazione dell'RNA a causa del sequestro di Muscleblind (MBNL) e dall'upregulation di CELF14,5. Le dinamiche interregolatorie e temporali tra MBNL e CELF1 (chiamate anche CUGBP1 o Bruno-Like 2) aiutano a spiegare i persistenti modelli di giunzione embrionale nei pazienti con distrofia miotonica. Inoltre, la vasta rete di bersagli malregolamentati aiuta a spiegare la natura complessa della malattia4,6,7,8. La maggior parte di questi studi utilizza approcci omici negli organismi modello genetico per comprendere i meccanismi alla base della malattia muscolare umana. Inoltre, evidenziano l'importanza di comprendere prima l'espressione genica temporale e tissutale specifica, la modificazione delle proteine e i modelli metabolici nel muscolo sano per comprendere le alterazioni nel muscolo malato o invecchiamento.

La Drosophila melanogaster è un altro organismo modello genetico ben consolidato. La struttura del sarcomero e dei singoli componenti sarcomeri sono altamente conservati dalle mosche ai vertebrati4,9,10, e i muscoli indiretti di volo (IFM) sono diventati un potente modello da studiare molteplici aspetti dello sviluppo muscolare11,12. In primo luogo, i muscoli di volo fibrillar sono funzionalmente e morfologicamente distinti dai muscoli tubolari del corpo11,13, consentendo lo studio di meccanismi di sviluppo specifici di tipo muscolare. Fattori di trascrizione tra cui Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd) e Homothorax (Hth)15 sono stati identificati come regolatori del destino fibrillare. Inoltre, a valle di Salm, l'omologa CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) dirige un programma di giunzione specifico per fibrillare16,17.

In secondo luogo, gli IFM sono un modello importante per comprendere il processo stesso della miogenesi, dalla fusione del mioblasto e l'attaccamento del miotubo alla miofibrillogenesi e alla maturazione sarcomere9,18,19. In terzo luogo, la genetica della Drosophila consente di studio i contributi di singole proteine, domini proteici e isoforme proteiche alla formazione, alla funzione e alle proprietà biofisiche20,21,22 ,23. Infine, sono stati sviluppati modelli IFM per lo studio di molteplici disturbi muscolari umani, come distrofia miotonica, miocellio, disturbi degenerativi muscolari, actinopatie, ecc.24,25,26 ,27, e hanno fornito importanti informazioni sui meccanismi della malattia e sulle potenziali terapie28,29,30. Così, la Drosophila è un modello utile per affrontare molte questioni aperte nel campo della miogenesi, compresi i meccanismi di trascrizione specifica di tipo muscolare, splicing e regolazione della cromatina, così come al ruolo del metabolismo nello sviluppo muscolare. L'applicazione delle moderne tecnologie omiche, in particolare in combinazione con l'ampia varietà di analisi biologiche genetiche, biochimiche e cellulari disponibili in Drosophila,ha il potenziale per far progredire drasticamente la comprensione dei muscoli sviluppo, invecchiamento e malattia.

Gli IFM sono i muscoli più grandi della mosca, che si estende per quasi 1 mm su tutta la lunghezza del torace negli adulti31,32. Tuttavia, questa piccola dimensione genera la sfida di ottenere un campione sufficiente per applicare le tecnologie omiche nella Drosophila in modo specifico. Inoltre, gli IFM fanno parte della muscolatura adulta che si forma durante le fasi pupali. I mioblasti si fondono per formare miotubi, che si attaccano ai tendini circa 24 h dopo la formazione del puparium (APF) e subiscono un passo di compattazione necessario per avviare la miofibrillogenesi intorno a 30 h APF (Figura 1A-D)18,33, 34.

Le miofibre poi crescono fino a coprire l'intera lunghezza del torace, con miofibrille in fase di crescita iniziale focalizzata sull'aggiunta di sarcomero fino a circa 48 h APF, per poi passare a una fase di maturazione, in cui i sarcomecomeres crescono in lunghezza e larghezza e sono rimodellato per stabilire l'attivazione dell'estensione di 72 h APF (Figura 1A-D)32,35. L'insorgenza della maturazione della fibra è controllata almeno in parte da Salm ed E2F32,36,37,e molteplici isoforme proteiche sarcomere specifiche IFM la cui giunzione è controllata da Bru1 sono incorporate durante questo fase16,17. Le mosche mature schiudono da 90-100 h APF. Ciò significa che per studiare lo sviluppo muscolare, IFM deve essere isolato con sufficiente quantità, qualità e purezza da più tempi pupali per facilitare l'analisi utilizzando approcci omici.

Sono stati pubblicati diversi protocolli per la dissezione IFM. Sebbene questi protocolli funzionino bene per le applicazioni previste, nessuno è ideale per gli approcci omici. I protocolli che conservano la morfologia IFM per immunofluorescenza degli IFM pupali e adulti19, isolano le fibre IFM per la valutazione meccanica31o utilizzano la microdissezione dell'IFM pupalo da criosezioni38 sono troppo specializzati e manodopera per ottenere ragionevolmente quantità sufficienti di tessuto IFM per applicazioni omiche. Altri protocolli sono stati sviluppati per la rapida dissezione di IFM38,39 , specificamente adulti,39, quindi non sono applicabili alle fasi puidiche e utilizzano buffer che non sono ideali o possono essere incompatibili con, ad esempio, l'isolamento dell'RNA. Pertanto, è necessario sviluppare nuovi approcci per isolare l'IFM pupalo per applicazioni biochimiche o omiche.

Qui presentiamo un protocollo per la dissezione di IFM durante le fasi pupali che è stato utilizzato con successo per l'analisi mRNA-Seq da 16 h APF attraverso gli stadi adulti16,32. Il protocollo impiega un'etichetta verde di proteine fluorescenti (GFP) per identificare gli IFM in tutte le fasi dello sviluppo pupa e adulto, consentendo la dissezione dal vivo al microscopio di dissezione fluorescente. L'approccio è meno laborioso, con una velocità effettiva superiore rispetto ai protocolli di dissezione IFM esistenti. Ciò consente un rapido isolamento e crioconservazione dei campioni, generando abbastanza materiale dopo diversi cicli di dissezione per gli approcci omici nonché per la reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa standard (RT-PCR) o gonfiore occidentale.

Vi presentiamo il protocollo in due parti, dimostrando come sezionare rapidamente IFM sia prima di 48 h APF (durante la metamorfosi precoce, quando gli allegati IFM sono più tenui) e dopo 48 h APF (quando il piano del corpo pupali e gli allegati IFM sono ben definiti). Dimostriamo che possiamo isolare l'RNA di alta qualità dagli IFM sezionati in tutti i momenti e presentare i dati sui diversi approcci all'isolamento dell'RNA e alla trascrizione inversa. Infine, dimostriamo l'applicazione del protocollo di dissezione a mRNA-Seq, spettrometria di massa e RT-PCR usando l'omologa CELF1 Bruno1 come esempio. Mostriamo la mancata espressione delle isoforme proteiche sarcomere nei dati proteomici di Bruno1 mutant IFM ed esaminiamo la regolazione Bruno1 dell'evento di giunzione del terminale C della catena pesante Myosin (Mhc). Questi risultati illustrano come i dati omici possono fornire una comprensione più profonda dei fenomeni biologici, integrando esperimenti genetici e biochimici.

Protocol

1. Staging pupae

  1. Sollevare le mosche del genotipo desiderato in bottiglie (Figura 1E). O fare un nuovo capovolgimento del brodo di dissezione o impostare una croce con almeno 20 mosche vergini femminili. Mantenere le bottiglie fino a quando le mosche iniziano a pupate.
  2. Raccogliere pre-pupae con un pennello bagnato e trasferire su carta da filtro bagnata in una parabola Petri da 60 mm (Figura 1F).
  3. Sesso le pupe, raccogliendo il genere appropriato per l'esperimento(Figura 1G). I maschi sono identificati dalla presenza di testicoli, che appaiono come palle traslucide nella pupa altrimenti opaca.
  4. Etichettare il piatto Petri con l'ora, la data e il genotipo, quindi invecchiare le pupe fino allo stadio desiderato (Figura 1H).
    NOT: Mantenere croci/stock e pupe di età in un'incubatrice a temperatura controllata (cioè 25 o 27 gradi centigradi per le croci di RNAi, poiché l'aumento dell'attività Gal4 a temperature più elevate aumenta l'efficienza di abbattimento40). Assicurarsi che l'umidità sia sufficientemente elevata in modo che le pupe non si asciughino quando invecchiano per diversi giorni.

2. Dissezione IFM Prima di 48 h APF

  1. Assemblare le attrezzature necessarie, tra cui due pinze di grado di biologia #5, una pipetta, punte pipette, ghiaccio secco e (per campioni di RNA) reagente di isolamento (vedere Tabella dei materiali). Inoltre, raffreddare piatti di sezionare nero (vedi Tabella dei materiali), 1x buffer salina con tampone salina con tamponamenti di fosfato (PBS) e tubi di microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.
  2. Utilizzando un pennello bagnato, trasferire le pupe in scena in un piatto di dissezione nero riempito circa due terzi con 1x PBS freddo (Figura 2A,B). Passare a un microscopio di dissecazione fluorescente.
    NOT: Utilizzare il maggior numero di pupe come può essere sezionato all'interno di un 30 min intervallo di tempo. A seconda dell'esperienza, questo varia da 3 a 15 pupe. Vedere Metodi supplementari per la discussione delle alternative ai piatti neri che si disiziono.
  3. Utilizzando #5 pinze, spingere una delle pupe sul fondo di una parabola nera e regolare lo zoom del microscopio e la messa a fuoco per vedere chiaramente la pupa (Figura 2C).
  4. Afferrare l'anteriore della pupa con una pinze (Figura 2D), quindi colpire le pupe con una sola punta delle altre pinze leggermente fuori centro nell'addome, appena dietro il torace. Questo mantiene la pupa in posizione e impedisce agli IFM di muoversi nell'addome (Figura 2E).
    NOT: Iniziare la temporizzazione della lunghezza della dissezione da questo punto, non appena l'integrità pupale viene interrotta. Utilizzare una lunghezza definita della dissezione (ad esempio 20-30 min) per ridurre al minimo la morte muscolare e i cambiamenti trascrittomici e proteomici associati. Dissezionare il maggior numero possibile di mosche in questo periodo di tempo.
  5. Utilizzando le prime pinze, rimuovere la metà anteriore della custodia pupal (Figura 2F).
  6. Utilizzare le stesse pinze per pizzicare le pupe esposte appena dietro il torace e separare l'addome dal torace (Figura 2G).
  7. Utilizzando le pinze, spremere delicatamente la parte anteriore del torace (per l'APF di <35 h) o strappare il torace per esporre gli IFM fluorescenti (Figura 2H). Gli IFM si staccano facilmente dall'epidermide, poiché gli attacchi tendini nei primi tempi sono fragili. Scartare la carcassa rimanente usando le pinze per spingerlo sul lato opposto del piatto.
  8. Ripetendo i passaggi 2.3–2.7, sezionare le pupe aggiuntive.
  9. Raccogliere le fibre IFM con pinze e organizzarle in una pila nella parte inferiore del piatto di dissezione nera (Figura 2I,J). Rimuovere eventuali detriti spingendolo fuori dal campo visivo utilizzando pinze.
    NOT: Con la pratica, le punte delle pinze possono essere portate in prossimità senza toccarsi a vicenda. Questa tecnica può essere utilizzata per afferrare liberamente gli IFM senza distruggerli. I metodi alternativi includono spingere delicatamente o sollevare gli IFM con una sola punta o pinze completamente chiuse, o prendere del grasso o altro tessuto con IFM e rimuovere il grasso come descritto al punto 2.10.
  10. Controllo di qualità del campione muscolare IFM, utilizzando le pinze per rimuovere i muscoli non IFM, grasso, cuticola, ecc dal campione (Figura 2K, L).
    NOT: Con Mef2-Gal4, IFM è etichettato più fortemente di altri tipi di muscolo nei primi tempi (Figura 2K, K'),consentendo la rimozione dei muscoli del salto e dei muscoli larvali in base all'intensità di fluorescenza e alla forma muscolare. Il tessuto grasso e cuticolario ha un aspetto diverso e non sono etichettati con un'etichetta di fluorescenza specifica per il muscolo (Figura 2K, K'). Vedere la sezione discussione per altre righe Gal4 che etichettano IFM.
  11. Utilizzando una punta di pipetta tagliata, trasferire la pila di IFM in un tubo di microcentrismo di 1,5 mL riempito con 250 -L di 1x pbx(Figura 2M-O). Procedere immediatamente alla sezione 4.
    NOT: I campioni IFM possono essere persi semplicemente attaccandosi al lato della punta della pipetta. Il bufferttamento su e giù più volte prima di raccogliere IFM può rendere le punte standard meno appiccicose e le punte siliconizzate o perfluoroalkoxy (CLA)con tensioni superficiali più basse possono aiutare a prevenire la perdita del campione.

3. Dissezione IFM dopo 48 h APF

  1. Assemblare le attrezzature necessarie, tra cui due pinze di grado #5, forbici fini, vetrini standard al microscopio in vetro, nastro adesivo, pipetta, punte di pipetta, ghiaccio secco e (per applicazioni di RNA) reagente di isolamento (vedere Tabella dei materiali). Raffreddare i tubi 1x PBS e microcentrifuga sul ghiaccio.
  2. Utilizzando un pennello leggermente bagnato, trasferire le pupe in scena in una striscia di nastro adesivo a due lati montato su un vetrino al microscopio (Figura 3A). Posizionare le pupe in una linea orientata nello stesso orientamento (ventrale verso il basso e anteriore verso la parte inferiore della diapositiva).
    NOT: Fare attenzione a non usare troppa acqua sul pennello o sul filtro, altrimenti le pupe non si attaccano bene. Se le pupe non si attaccano, asciugarle prima trasferendole su un filtro asciutto o su carta velina. Montare il maggior numero di pupe come può essere sezionato all'interno di una finestra di tempo di 30 min, idealmente pupe da 10 dollari.
  3. Rimuovere la pupa dalla custodia del pupali. Utilizzare pinze per prendere in giro e aprire il caso pupali sopra gli spiracoli anteriori (Figura 3B).
  4. Far scorrere delicatamente un paio di pinze dorsalmente verso il posteriore, tagliando la cassa pupa mentre le pinze si muovono (Figura 3B '). Fare attenzione a non rompersi la pupa sottostante. Liberare la pupa dalla custodia aperta e trasferirla immediatamente a una goccia di 1x PBS su un secondo vetrino (Figura 3B",C).
  5. Ripetere i passaggi 3.3 e 3.4 per tutte le pupe della linea, quindi impostare la diapositiva a doppio nastro da parte.
  6. Utilizzando le forbici fini, tagliare l'addome della pupa lontano dal torace e spingerlo in un mucchio separato (Figura 3D,D'). Ripetere l'operazione per le pupe rimanenti.
    NOT: Iniziare a cronometrare la lunghezza della dissezione con il passaggio 3.6, non appena l'integrità pupa viene interrotta. Disseziona il maggior numero possibile di mosche in 20-30 min per prevenire la morte cellulare e i cambiamenti trascrittomici e proteomici associati. Quando si seziona 1 d adulti o >90 h pupae, è spesso conveniente per i passaggi successivi per rimuovere ulteriormente la testa con le forbici fini.
  7. Utilizzando una carta velina, rimuovere la maggior parte del 1x PBS (generalmente nuvoloso con grasso sospeso) così come la pila di addome (Figura 3E). Aggiungere una goccia di 1x PBS fresco e refrigerato ai restanti thoraxes.
  8. Utilizzare le forbici per tagliare il torace a metà (Figura 3F,F')tagliando dalla testa lungo l'asse longitudinale del corpo in un unico movimento. In alternativa, se la testa è stata rimossa, inserire prima le forbici in cui la testa era attaccata e tagliare la metà superiore del torace longitudinalmente tra gli IFM. Quindi, tagliare il lato ventrale del torace con un secondo taglio nello stesso orientamento.
  9. Ripetere i passaggi 3.7 e 3.8 per tutte le pupe da sezionare, generando una pila di emisezioni torace vicino al centro della diapositiva. Assicurarsi che sul vetrino sia presente 1x PBS sufficiente affinché le emisezioni non si asciughino.
    NOT: Dopo 48 h APF, gli IFM sono abbastanza grandi da essere visibili al microscopio standard di sezionamento all'occhio allenato. A questo punto del protocollo, i muscoli con un'etichetta fluorescente possono essere spostati in un ambito di dissezione fluorescente per facilitare l'identificazione IFM o per scopi di allenamento, ma ciò non è necessario.
  10. Dissezionare gli IFM fuori dal torace. Isolare una delle emisezioni utilizzando le pinze #5 (Figura 3G,H). Inserire delicatamente le punte di una pinza sopra e sotto il centro degli IFM (Figura 3G',H'). Tenendo le prime pinze ancora, utilizzare forbici sottili per tagliare un'estremità del IFM lontano dalla cuticola e tendini. Quindi, tagliare l'altra estremità del IFM libero dalla cuticola (Figura 3G'',H'').
    NOT: A seconda dell'orientamento del torace dopo il primo taglio IFM, è utile ruotare il torace di 180 gradi in modo che il secondo taglio IFM sia più facile da eseguire.
  11. Rimuovere il fascio IFM dal torace con pinze (Figura 3G''',H'''),trasferendolo al bordo della bolla PBS per utilizzare la tensione dell'acqua per tenerlo in posizione (Figura 3I). Spingere la carcassa sul lato opposto del vetrino. Ripetere l'operazione per gli altri emisezioni toraciche, generando una raccolta di IFM sezionati.
    NOT: Se gli IFM non rimangono in una pila ordinata, rimuovere parte del 1x PBS con un tessuto. Fare attenzione a non far evaporare tutti i PBS e assicurarsi che gli IFM e gli emithoraxes sezionati rimangano coperti da tamponamento.
  12. Dopo aver sezionato tutti gli IFM, eseguire rapidamente un controllo di qualità sul muscolo sezionato. Utilizzando #5 forceps, rimuovere eventuali frammenti di jump muscle o cuticle che potrebbero aver trovato la loro strada nel campione (Figura 3J-K'').
    NOT: Il muscolo di salto appare diverso da IFM. Se si dissigella Mef2-Gal4 etichettato muscolo sotto fluorescenza, salto muscolare ha una fluorescenza più debole e una forma e una consistenza diversa. Sotto la luce normale, appare quasi traslucido mentre gli IFM sono un giallo opaco e lattiginoso(Figura 3J-J',K).
  13. Utilizzando la tensione dell'acqua, catturare (ma non schiacciare) gli IFM sezionati tra una coppia di pinze (Figura 3L). Trasferire gli IFM in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL pre-riempito con 250 - L di 1x PBS refrigerato(Figura 3M). Procedere immediatamente con la sezione 4.
    NOT: Quando le punte di pinzetta vengono portate in prossimità l'una dell'altra e sollevate da una soluzione tampone, la tensione dell'acqua provoca la cattura di una bolla di tampone tra le punte delle pinze. Se gli IFM sono presenti anche in questa bolla, possono essere sollevati dalla soluzione e facilmente trasferiti in un altro recipiente riempito da buffer. È importante spremere le pinze per portare le punte l'una vicino all'altra senza toccarsi l'un l'altro, per evitare di macerare il tessuto catturato nella bolla tampone.

4. Pellet e conservazione del campione IFM

  1. Pellet l'IFM centrifugando il tubo di microcentrifuga da 1,5 mL per 3-5 min a 2.000 x g in una centrifuga da tavolo (Figura 4A,B).
  2. Rimuovere il buffer utilizzando una punta pipetta (Figura 4C).
  3. Per le applicazioni di RNA, risospendere il pellet IFM in 50-100 - L del buffer di isolamento RNA desiderato (vedere Tabella dei materiali, Figura 4D). In caso contrario, procedere al passaggio 4.4.
    NOT: Gli IFM possono essere congelati a secco dopo il passaggio 4.2 per preparazioni di spettrometria di massa o l'isolamento dell'RNA con kit commerciali (vedi risultati rappresentativi). Per le applicazioni di RNA, si ottengono risultati migliori rinviando immediatamente e congelando il pellet IFM nel buffer di isolamento.
  4. Congelare il campione sul ghiaccio secco o congelare lo snap in azoto liquido (Figura 4E). Conservare a -80 gradi centigradi fino a quando non si è pronti per i passaggi successivi nella preparazione del campione per l'analisi a valle.
    NOT: Dopo la crioconservazione, i campioni possono essere conservati per diversi mesi prima dell'elaborazione per l'indagine a valle.

Representative Results

I protocolli di dissezione presentati sopra sono utili per generare campioni arricchiti da IFM da 16 h dopo la formazione del puparium (APF) fino allo stadio adulto. Campioni di muscolo volo dissected possono essere utilizzati per più applicazioni, e sono stati finora applicati con successo per RT-PCR4,17, RNA-Seq16,32, ChIP36,37, Western 14,41 e esperimenti di spettrometria di massa (vedi sotto). Per aiutare i potenziali utenti a analizzare le applicazioni basate sull'RNA, presentiamo innanzitutto i nostri risultati evidenziando importanti considerazioni specifiche per l'isolamento dell'RNA dagli IFM. Per dimostrare più ampiamente l'utilità dei nostri protocolli di dissezione, illustriamo poi alcune delle possibili applicazioni –omics utilizzando i nostri dati sulla proteina legante l'RNA Bruno1.

Il protocollo di dissezione IFM produce RNA di alta qualità

È importante determinare il numero di mosche da sezionare in anticipo, poiché si stima che l'mRNA di codifica costituisca solo l'1-5% dell'RNA totale42. Abbiamo ottenuto in media 24 x 9 ng di RNA totale per volo da IFM sezionato da 1 d adulti (Figura 4F e Figura supplementare 1A), con rese in genere in aumento con l'esperienza. Questo rendimento di RNA totale per mosca è relativamente costante, oscillando intorno ai 25 ng per IFM sezionato a 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF e 90 h APF(Figura 4F e Figura supplementare 1B,D,E). Queste osservazioni riflettono anche qualsiasi RNA isolato da grasso, tendine, trachea o altri tipi di cellule, che possono essere più elevati in campioni isolati da tempi precedenti. Così, abbiamo ottenuto >1 g di RNA totale da IFM da 50 mosche e tipicamente sezionato IFM da 100-150 mosche per generare >3 g di RNA totale per i campioni di RNA-Seq.

Il metodo di isolamento dell'RNA influisce sulla quantità e la qualità dell'RNA recuperato e incoraggiamo gli utenti a convalidare il loro approccio di isolamento. Ad esempio, mentre l'isolamento mediante il metodo 1 produce in media 1143 - 465 ng di RNA totale da IFM da 50 1 d mosche adulte, isolamento con vari kit commerciali produce ovunque da 186 - 8 ng a 1261 - 355 ng di RNA totale (Figura 4G e Figura supplementare 1C). L'RNA isolato dai kit commerciali è generalmente di buona qualità (Figura 4H e Figura supplementare 1F),ma bassi recuperi suggeriscono che l'RNA potrebbe non essere eluito in modo efficiente dalle colonne. L'integrità dell'RNA può essere compromessa anche dall'uso di un kit come fatto nel metodo 2(Figura 4H, secondo grafico), probabilmente a causa della costituzione del buffer e dei trattamenti termici, portando a una grave frammentazione che può influenzare gli esperimenti a valle.

È anche importante osservare una corretta tecnica senza RNase quando si isolano e si maneggiano campioni di RNA. Anche se i cicli di congelamento-disgelo e un'incubazione di temperatura ambiente 4 h non influiscono drammaticamente sui profili di integrità dell'RNA, anche piccole quantità di RNase portano a una rapida degradazione dell'RNA (Figura 4I e Metodi supplementari). Gli utenti sono ancora incoraggiati a lavorare sul ghiaccio e limitare il congelamento-scongelamento per prevenire l'idrolisi e la frammentazione dell'RNA. Questo non è stato rilevato qui, ma prevenire la contaminazione da RNase utilizzando punte di filtro e buffer trattati con DEPC è assolutamente essenziale.

L'efficienza della trascrizione inversa influisce anche sul successo delle applicazioni a valle. Abbiamo ottenuto risultati affidabili con due dei tre kit RT commerciali che abbiamo testato, che amplificano entrambe le forti bande RT-PCR per il gene ribosomico rp49 (Figura 4J). Tuttavia, il kit RT #2 può essere più sensibile per il rilevamento di trascrizioni a bassa espressione, poiché abbiamo ottenuto bande più forti per la proteina bru1 che lega l'RNA per tutte e tre le repliche biologiche (Figura 4J). Nel loro insieme, questi risultati dimostrano che l'RNA di alta qualità può essere isolato dagli IFM sezionati con questa procedura.

Gli IFM tesi producono dati mRNA-Seq e proteomici di alta qualità

Utilizzando IFM sezionato secondo il protocollo di cui sopra a 30 h APF, 72 h APF e da 1 d mosche adulte, abbiamo precedentemente mostrato che la proteina legante all'RNA e CELF1-omologue Bruno1 (Bru1, Arresto, Aret) controlla un percorso di giunzione specifico ifM a valle del trascrittore fattore Spalt maggiore (Salm)16. Gli IFM di mutanti nulli e mosche con bruno1 RNAi specifici per i muscoli (bru1-IR) mostrano difetti di crescita sarcomero, disregolazione dell'attività della miosina e, infine, ipercontrazione e perdita di fibre muscolari16,17 . Qui di seguito dimostriamo l'utilità degli IFM sezionati per l'intera spettrometria di massa del proteoma e mostriamo che molti dei cambiamenti di espressione che abbiamo osservato a livello di RNA sono evidenti anche a livello proteico. Sottolineiamo ulteriormente uno specifico evento di giunzione dello sviluppo in Mhc che è stato trovato per essere regolato da Bruno1, dimostrare che mRNA-Seq e RT-PCR da IFM sezionati possono essere utilizzati per dimostrare la regolazione degli eventi di giunzione alternativi.

A seconda della qualità e della profondità della biblioteca, i dati mRNA-Seq possono essere analizzati a livello di unità genetiche (media dei conteggi di lettura su tutti gli esoni di un gene), singoli esoni o giunzioni splice. I dati mRNA-Seq provenienti da IFM bru1-IR rispetto ai wildtype mostrano deboli cambiamenti nell'espressione sul livello16 dell'unità genica (Figura 5A). A 72 h APF, c'è già una tendenza per i geni sarcomere come la proteina lim muscolare a 60A [Mlp60A], actin 57B [Act57B], proteina muscolo-specifica 300 kDa [Msp300], o Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]) che sono importanti per un corretto sviluppo muscolare per essere downregulated in muscolo bru1-IR (Figura 5A e Tabella supplementare 1). Tuttavia, abbiamo dimostrato in precedenza che a livello di singoli esoni, c'è una downregolazione molto più forte delle isoforme specifiche del gene sarcomere16, suggerendo che la funzione principale di Bruno1 è quella di controllare lo splicing alternativo(Tabella supplementare 1 ).

Utilizzando la spettrometria di massa intero proteoma su IFM sezionati, possiamo mostrare una regolazione simile a livello di proteine (Figura 5B e Tabella supplementare 2). Dei 1.895 gruppi di peptidi rilevati, 524 (28%) di loro sono mal regolati in Bru1M2 mutante IFM in 1 d adulti (tabella supplementare 2). Si osserva anche la downregolazione della proteina Strn-Mlck e Mlp60A, che corrispondano alle osservazioni a livello di trascrizione nei nostri dati mRNA-Seq. Nonostante il numero limitato di peptidi del database che mappano a specifiche isoforme proteiche (vedi Metodi supplementari per i dettagli di analisi), per le proteine sarcomere Tropomyosin 1 (Tm1), confermate (up/TnT), Mhc, piegate (bt/projectin) e Paramyosin (Prm) osservare l'asunzione dei peptidi da un'isoformazione e la downregolazione di un altro (Figura 5B), confermando le nostre precedenti osservazioni di una regolamentazione simile a livello di RNA16. Questo dimostra che gli IFM sezionati sono utili sia per le applicazioni mRNA-Seq che proteomica.

Come ulteriore esempio di come i dati omici possono integrare gli approcci tradizionali per migliorare ed estendere l'intuizione biologica, abbiamo scelto di concentrarci sullo splicing al CapoC di Mhc. Una linea di trappola proteica precedentemente caratterizzata chiamata weeP26 viene inserita nell'intron finale di Mhc43,44 (vedi Metodi supplementari per la posizione esatta). weeP26 contiene un forte accettatore di giunzione ed è incorporato presumibilmente in tutte le trascrizioni Mhc (Figura 5C). Tuttavia, la proteina etichettata GFP in IFM è incorporata in due "punti" su entrambi i lati della linea M, mentre nel muscolo della gamba, si incorpora uniformemente attraverso la linea M e debolmente attraverso i filamenti spessi (Figura 5E). Orfanos e Sparrow hanno mostrato questi "punti" in forma IFM a causa di un interruttore isoforme Mhc dello sviluppo: l'isoformazione Mhc espressa prima di 48 h APF è etichettata gFP come inserti esone weeP26 nel telaio a lettura aperta, mentre il Mhc isoform espresso dopo 48 h APF è senza etichetta, come l'esone weeP26 è incluso a valle del codon stop nel 3'-UTR44.

I nostri dati mRNA-Seq ci hanno permesso di caratterizzare l'espressione isoforme Mhc del terminale C in modo più dettagliato. Mentre due diverse terminazioni Mhc sono state segnalate43,44, i nostri dati mRNA-Seq e l'annotazione Flybase corrente (FB2019_02) suggeriscono che ci sono in realtà tre possibili eventi di giunzione alternativa al Mhc C-terminus (Exon 34-35, 34-36 o 34-37) (Figura 5C), confermato da RT-PCR (Figura 5D). weeP26 GFP è inserito nell'intron tra Exon 36 e 37; così, poiché entrambi gli isoformi Exon 34-35 ed Exon 34-36 contengono stop codons, GFP può essere tradotto solo nell'isoforme Exon 34-37 (risultando in Exon 34-GFP-37). Potremmo inoltre vedere sia la regolazione temporale che quella spaziale di tutte le isoforme Mhc. In IFM, osserviamo un interruttore isoforme Mhc da Exon 34-37 a Exon 34-35 tra 30 h APF e 48 h APF (Figura 5C,D,F) a 27 gradi centigradi, anche se questo non è ancora visibile da immunofluorescenza a 48 h APF (Figura 5E). Le gambe esprimono già una miscela di Exon 34-37 ed Exon 34-35 a 30 h APF, e da 72 h APF esprimere tutti e tre gli isoformi Mhc (Figura 5D,F). Adult jump muscle (TDT) esprime anche tutti e tre gli isoformi Mhc (Figura 5F), suggerendo che questo è generalmente vero per i muscoli somatici tubolari. Pertanto, i nostri dati mRNA-Seq consentono l'estensione dei risultati precedenti restringendo il lasso di tempo per l'interruttore isoforme Mhc in IFM e caratterizzando l'uso dell'isoformazione Mhc nei muscoli tubolari.

Sono state quindi esaminate le regolazioni isoformi Mhc in Salm e bru1 mutant ifM mutate. In entrambi i casi, abbiamo visto una cattiva regolamentazione del weeP26. Gli IFM mutanti di Salm non riescono a completare l'interruttore dello sviluppo nell'espressione isoforme di Mhc e nei modelli di giunzione delle gambe di fenocopia nelle fasi successive, incluso il guadagno dell'evento Exon 34-36 (Figura 5F). Questo è d'accordo con i risultati precedenti che la perdita di Salm si traduce in una trasformazione del destino quasi completa di IFM in muscolo tubolare16. Bru1-IR e bru1 mutante IFM, simile a salm-/- IFM, mantiene l'evento di giunzione Exon 34-37 attraverso stadi adulti (Figura 5E, F), con conseguente un modello di etichettatura WeeP26 GFP simile al muscolo della gamba, ma non ottiene l'evento Exon 34-36. Ciò suggerisce che Bruno1 è necessario in IFM per controllare almeno parzialmente l'interruttore di sviluppo nello splicing alternativo Mhc, ma indica che ulteriori fattori di giunzione sono regolati in modo non corretto nel contesto salm-/-. Inoltre, questo esempio illustra come i dati RT-PCR e mRNA-Seq provenienti da IFM sezionati possano essere utili per ottenere una comprensione più profonda dei meccanismi di giunzione dello sviluppo e dei difetti morfologici osservati.

Figure 1
Figura 1: Sviluppo IFM e messa in scena delle pupe. (A) Schematico dello sviluppo IFM a 24 h APF, 32 h APF, 48 h APF, 72 h APF e 1 d adulti che mostrano la compattazione dei muscoli di volo (verde) a 32 h APF e la successiva crescita della fibra per riempire il torace. I tendini sono in grigio scuro. (B) Immagini confocali di IFM fissi da dissezioni libro aperto (24 h, 32 h, 48 h)19 o emisezioni torace (72 h, 1 giorno) macchiate per atto (phalloidina di rhodamine, magenta) e GFP (verde). (C,D) Immagini di fluorescenza GFP in pupe vive che illustrano la morfologia IFM intatta della linea di volo di svenire nel piano dorsale (C) o laterale (D). Gli asterischi indicano la posizione IFM. (E) Per prepararsi alle dissezioni, gli stock di mosca devono essere capovolti o le croci fissate 3-4 giorni di anticipo. (F) Le prepupae sono selezionate in base al colore bianco (punte di freccia gialle) e isolate utilizzando un pennello bagnato (F', F''). (G) Le prepupae dovrebbero essere sottoposte a sessuaazione per separare le femmine dai maschi in base alla presenza di testicoli che appaiono come palline traslucide localizzate in posteriore (asterischi gialli). (H) Le pupe sono invecchiate su carta da filtro bagnata in piatti da 60 mm. Barre di scala: 100 m (B), 1 cm (C,D,E,H), 1 mm (F, F'',G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dissezione degli IFM prima di 48 h APF. (A) Aggiunta di 1x tampone PBS a un piatto nero dissettivo con una pipetta di trasferimento. (B) Trasferimento delle pupe in scena con un pennello. (C) Sotto un microscopio di dissemare fluorescente per visualizzare la GFP, delicata spinta della pupa sul fondo di un piatto di dissezione utilizzando #5 pinze (delineate in grigio). La "X" in un cerchio denota il movimento nell'immagine. (D,E) Afferramento delle pupe anteriormente (D), quindi frugando delle pupe appena dietro il torace (E). Il trattino in un cerchio non indica alcun movimento. (F,G) Tirando con le pinze anteriori (freccia) per rimuovere la custodia pupa (F), quindi la rimozione dell'addome (G). (H) Ripetizione di C-G per diversi pupa. Le linee gialle tratteggiate sono numerate che indicano le pupe. (I, J) Uso delle pinze (I) per isolare gli IFM dal tessuto circostante (J). Il punto in un cerchio indica il movimento fuori dalla pagina. (K, L) Rimozione di contaminanti tra cui grassi e salto (TDT) muscoli (K) per generare un campione IFM pulito (L). TDT ha un'espressione GFP inferiore e una forma diversa rispetto alle fibre IFM (K'). (M,N,O) Uso di una punta di pipetta tagliata (M) per raccogliere IFM sezionati (N) e il suo trasferimento in un tubo di microcentrismo (O). Barre di scala: 1 cm (A,B,M,O), 1 mm (C-G), 500 m (H-L,N). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Dissezione degli IFM dopo 48 h APF. (A) Allineamento delle pupe su nastro adesivo. (B) Rimozione delle pupe dalla cassa pupali aprendo anteriormente (B), tagliando il caso dorsalmente (B'), e sollevando la pupa (B'). I simboli cerchio rappresentavano la stessa figura 2. (C) Trasferimento delle pupe nel buffer. (D) Rimozione dell'addome mediante taglio con forbici (doppie frecce gialle) e separazione dai thoraxes (D'). (E, F) Aggiunta di tampone pulito (E), quindi taglio di thoraxes a metà longitudinalmente (F,F'). (G,H) Le dissezioni possono essere eseguite sotto luce bianca (G) o fluorescenza per visualizzare il GFP (H); taglio degli IFM da un lato (G'), poi dall'altro lato (G''); sollevamento dal torace con pinze (delineate in grigio) (G''''). (I,J,K) Raccolta di IFM nel buffer (I) e rimozione del cordone nervoso ventrale contaminante (VNC), intestino e muscolo di salto (TDT) (J) per generare un campione IFM pulito (K). TDT ha un'espressione GFP inferiore e una forma diversa rispetto alle fibre IFM (J''', K'). (L,M) Uso di pinze per trasferire gli IFM (L) in un tubo di microcentrità (M). Barre di scala: 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D', F-L). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Dettagli sullaconservazione IFM e sull'isolamento dell'RNA. (A) Gli IFM sono pelleta dalla centrifuga per 5 min a 2000 x g. (B) Pellet IFM (freccia) e pellet sotto fluorescenza (B'). (C) Rimozione di tutto il buffer con una punta di pipetta. (D) Per l'estrazione dell'RNA, la sospensione del pellet nel buffer di isolamento. Questo passaggio può essere saltato per congelare a secco gli IFM sezionati. (E) Congelamento del campione in azoto liquido o su ghiaccio secco e stoccaggio a -80 gradi centigradi. Barre di scala: 10 cm (A), 1 mm (B,B'), 1 cm (C,D,E). (F) I nanogrammi (ng) dell'RNA totale da IFM sezionato ottenuto per mosca a 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF e 1 d adulto. Barre di errore - SD. (G) RNA totale isolato da IFM sezionato da mosche adulte 50 1 d utilizzando diversi metodi di estrazione. Barre di errore - SD. (H) Rappresentante tracce per formulare l'integrità dell'RNA dopo diversi metodi di estrazione. Le bande ribosomiche corrono appena sotto 2000 nucleotidi (nt) e la banda marcatore a 25 nt. Tracce aggiuntive disponibili nella Figura supplementare 1. (I) Tracce rappresentative di un campione di RNA appena isolato (in alto), di un campione congelato 25x sul ghiaccio secco (secondo appezzamento), di un campione lasciato a piedi per 4 h sulla panchina (terzo terreno) e di un campione trattato con RNase A (grafico in basso). Nota la degradazione completa dell'RNA al momento dell'aggiunta del gel RT-PCR RNase A.(J)dai kit etichettati per bru1 e rp49. L'intensità relativa della banda bru1 normalizzata rispetto a rp49 è tracciata di seguito. Barre di errore: SEM (nonaccoppiato t -test, p - 0,0119). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Applicazione di dissezioni IFM per studiare la funzione Bruno1 nello splicing alternativo. (A) Grafico vulcanico dei dati mRNA-Seq (unità genica) degli IFM sezionati a 72 h aPF. I geni regolati in modo significativo tra bru1-IR e IFM wildtype (padj < 0.05, abs(log2FC) >1.5) sono mostrati in blu e i geni non significativi in grigio. Le proteine Sarcomere sono evidenziate in rosso e i geni selezionati sono etichettati. (B) Il plotone vulcanico dell'intera spettrometria di massa proteoma deriva da IFM adulti da 1 d. Le proteine significativamente diverse tra i brummut M2e i wildtype (FDR < 0,05) sono mostrati in blu, proteine non significative in grigio. Le proteine sareriche sono evidenziate in rosso. I peptidi corrispondenti ai geni in (A) sono etichettati in rosso. Set di peptidi che mappano a diverse isoforme della stessa proteina sono etichettati nello stesso colore. (C) Schema del capoC di Mhc che illustra le isoforme tradite distinte e la posizione di inserimento della trappola genica weeP26 (vedere Metodi supplementari per il punto di inserimento). I primer RT-PCR sono indicati come linee nere sopra le trascrizioni. I conteggi di lettura per kilobase per milione di basi (RPKM) da mRNA-Seq sono mostrati per IFM sezionati dal wildtype a 30 h APF (arancione) e 72 h APF (rosso), da bru1-IR (blu) e salma-/- (ciano) a 72 h APF e da gamba intera (verde) a 72 h APF . (D) RT-PCR con primer contro Mhc che mostrano l'interruttore isoforme in IFM tra 30 h APF e orari successivi. L'evento di giunzione Exon 34-35 è osservato solo debolmente in IFM mutante M3bruo o nella gamba adulta. (E) Immagini confocali della localizzazione WeeP26 GFP in sarcomere IFM wildtype a 48 h APF e 90 h APF rispetto a9h APF muscolo della gamba. Barre di scala - 1 m. (F) Quantificazione giunzione giunzione giunzione dai dati mRNA-Seq per i genotipi e i momenti come etichettati. Le letture di giunzione sono presentate come il rapporto tra un evento specifico di giunzione (Exon 34 a 35 in grigio, 34 a 36 in viola e 34 a 37 in verde) e il numero totale di eventi che condividono il donatore di giunzioni exon 34. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemental Figure 1
Figura supplementare 1: (A, B, C) la resa di RNA da campioni dello stesso genotipo sezionati dallo stesso ricercatore nella stessa settimana. Dopo che tutti i campioni sono stati sezionati, l'RNA è stato isolato e misurato lo stesso giorno. (A) Nanogrammi (ng) di RNA totale ottenuti dalle dissezioni IFM per 1 d mosca adulta. Barre di errore - SEM. (B) RNA totale ottenuto da IFM sezionato per mosca a 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF e 1 d adulto. (C) RNA totale isolato dall'IFM sezionato da mosche adulte da 50 1 d con diversi metodi di estrazione. (D) Concentrazioni totali di RNA per mosca da zampe sezionate, muscoli di salto (TDT) e IFM. Più RNA si ottiene dai più grandi IFM. Barre di errore - SD. (E) Concentrazioni totali di RNA per volo di IFM sezionate dai controlli rispetto agli RNAi o ai campioni mutanti a 30 h APF, 72 h APF e 1 d adulto. Per i mutanti, w1118 è stato utilizzato come controllo wildtype. I dati mutanti sono raccolti da bru1-IR, salm-/- e un altro mutante proteico che lega l'RNA. Si noti che per queste manipolazioni, i rendimenti dell'RNA sono diminuiti in 1 d adulto a causa dell'atrofia muscolare e della perdita, quindi più mosche devono essere sezionate per ottenere quantità sufficienti per gli approcci omici. Barre degli errori - SD. (F) Tracce aggiuntive che mostrano l'integrità dell'RNA per i metodi di isolamento dell'RNA illustrati nella Figura 4G e nella figura supplementare 1C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplemental Methods
Metodi supplementari: Una descrizione dettagliata dei metodi e dei reagenti utilizzati in tutto il testo e, in particolare, per generare i dati illustrati nella Figura 1A-D, Figura 4F-K, Figura 5,Tabella supplementare 1e Tabella supplementare 2. Questi dati motivano il protocollo di dissezione e dimostrano la sua utilità per l'isolamento dell'RNA, mRNA-Seq, RT-PCR e proteomica. Fare clic qui per scaricare questo file.

Relativo alla figura 5 e ai paragrafi associati nel testo principale
Nome scheda Riepilogo dei dati
Proteine Sarcomere Elenco dei geni sarcomere di Spletter et al. Qui elenchiamo l'attuale FBgn e il nome del gene.
Unità geniche SP_DESeq2_72h Utilizzando i dati di Spletter et al. EMBO Rep 2015, abbiamo esaminato specificamente i geni sarcomere nei dati mRNA-Seq a 72 h APF. Questo è dall'analisi DESeq2 che rileva l'espressione differenziale sul livello dell'unità genica tra il controllo (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma attraversato a w1118) e Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Le righe evidenziate in giallo sono indicante i geni regolati in alto o in basso (sopra/sotto una soglia di log2FC-abs(1.5)). Questi dati sono la sovrapposizione del punto rosso in Figura 5A. Per ogni gene sarcomere, forniamo informazioni sull'identificatore, il log2FC da DESeq2, il valore P e il valore P regolato, nonché i conteggi delle espressioni normalizzate DESeq2.
SP exon_DEXSeq_72h Utilizzando i dati di Spletter et al. EMBO Rep 2015, abbiamo esaminato specificamente l'uso di esoni genici sarcomere nei dati mRNA-Seq a 72 h APF. Questo è dall'analisi DEXSeq che rileva l'uso differenziale di esoni tra il controllo (Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma attraversato a w1118) e Mef2-Gal4, UAS-GFM-Gma x Bruno1-IR. Le righe evidenziate in giallo sono indicante esone regolato (sopra/sotto una soglia di log2FC-abs(1.5)). Forniamo informazioni sull'esone e sull'identificatore genetico, il log2FC da DEXSeq, il valore P e il valore P regolato, nonché un elenco di trascrizioni associate.
Si prega di notare che molti geni mostrano la regolazione di uno o più esoni nell'analisi DEXSeq, spesso con valori log2FC elevati e bassi valori P/valore P, mentre un elenco limitato di geni mostra cambiamenti a 72 h APF. Ciò sostiene un forte effetto di perdita di Bruno sulla regolazione dello splicing alternativo.

Tabella supplementare 1: Tabella dei dati 72 h APF mRNA-Seq per le proteine sarcomere che identificano geni espressi in modo differenziale (tramite DESeq2) ed esoni (tramite DEXSeq) in BRU1-IR vs. IFM wildtype.

In relazione alla figura 5B e ai paragrafi associati nel testo principale
Nome scheda Riepilogo dei dati
Uscita Perseo Questo è un foglio di calcolo di dati elaborati che presenta i dati di spettrometria di massa utilizzati per generare Figura 5B. I campioni IFM provengono da 1 d adulto di controllo (w1118) e mosche mutanti (bruno1-M2). Colonne importanti sono i valori di intensità trasformati per ciascuno dei 4 replicati per ogni campione, la statistica e il significato del test t, gli ID peptide e i nomi genici corrispondenti e gli ID Flybase. La firma è stata calcolata utilizzando le impostazioni standard in Perseus (FDR<.05). Sono state rilevate 1859 proteine/peptidi, di cui 524 (28%) sono significativamente diversi tra i campioni.
Downregulated Queste sono TUTTE le 252 proteine/peptidi della produzione di Perseo che sono downregolate nella mutante IFM bruno1-M2. Poiché gli ID Flybase e i nomi genici sono obsoleti, forniamo inoltre l'ID genico e il nome gene di Flybase.
Upregulated Queste sono TUTTE le 272 proteine/peptidi della produzione di Perseo che sono aumentate nell'IFM mutante bruno1-M2. Poiché gli ID Flybase e i nomi genici sono obsoleti, forniamo inoltre l'ID genico e il nome gene di Flybase.
Si prega di notare che le proteine sarcomere evidenziate in rosso nella figura 5B sono presenti negli elenchi di cui sopra. L'elenco dei geni considerati parte del sarcomere è disponibile in una delle schede della Tabella supplementare 1.

Tabella supplementare 2: Tabella dei dati di spettrometria di massa del proteoma intero da 1 d adulti che identificano le proteine e le isoforme proteiche espresse in modo bruM2mutante vs. tipo selvatico IFM.

Discussion

In questo protocollo, presentiamo la tecnica di base per sezionare gli IFM della Drosophila dalle pupe in fase avanzata e tardiva per l'isolamento a valle di proteine, DNA, RNA o altre macromolecole. Il protocollo può essere facilmente adattato per sezionare IFM da mosche adulte. Dimostriamo l'utilità del nostro protocollo di dissezione per applicazioni mRNA-Seq, proteomica e RT-PCR. Con il continuo miglioramento delle tecnologie omiche per consentire l'analisi di campioni con meno materiale di partenza e concentrazioni di ingresso inferiori, queste dissezioni diventeranno probabilmente preziose per molte applicazioni aggiuntive. Poiché gli IFM sono un modello consolidato per le miopatie umane4,24 e sviluppo specifico di tipo muscolare9,12, prevediamo, ad esempio, metabolomica arricchita di IFM, indagini sulla conformazione della cromatina tramite 3C o 4C, splicing network evaluation via CLiP interazioni o fosfo-proteomica della miofibrillogenesi.

È importante considerare che queste dissezioni producono un campione arricchito per IFM invece di un campione IFM puro. Questo è inevitabile a causa dell'innervazione del neurone motorio, degli attacchi tendini e dell'invasione tracheale delle fibre muscolari. L'analisi bioinformatica può essere utilizzata per identificare geni o proteine arricchite da IFM, ma sono necessari ulteriori esperimenti per dimostrare che sono in realtà specifici di IFM. La purezza del campione può essere analisi utilizzando marcatori specifici del tessuto pubblicati come Stripe45 (tend), Act79B4,44 (muscolo tubolare), Act88F15 (IFM) o syb46 (specifico neuronale). Potrebbe essere possibile utilizzare tali marcatori per normalizzare i set di dati in base al contenuto specifico di IFM, ma gli utenti sono avvertiti che i cambiamenti temporali nell'espressione dei geni utilizzati per la normalizzazione, ad esempio dei geni specifici di IFM o della tubulina, possono pregiudicare tale approccio.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di etichettatura specifica del tessuto codificati geneticamente, ad esempio l'etichettatura CE47,48 o49,50 per isolare l'RNA, il che può contribuire a campione di RNA specifico del tessuto. Tuttavia, il marcatura CE richiede l'alimentazione costante delle mosche47 e pertanto non è applicabile durante le fasi pupali. La sensibilità e la completezza dei trascrittomi con etichetta PABP possono avere limitazioni51. Gli approcci FACS per isolare le singole fibre muscolari sono complicati dalle grandi dimensioni e dalla natura sinciziale degli IFM. INTACT52,53 approcci di stile possono essere applicati per isolare specifici compartimenti subcellulari dagli IFM, che possono rivelarsi utili per isolare le popolazioni pure di nuclei IFM o mitocondri. Le dissezioni manuali sono ancora lo standard attuale per ottenere tessuto IFM intatto per la maggior parte delle applicazioni a valle.

La qualità del campione dipende da diversi passaggi critici del processo di dissezione. Le dissezioni sono tecnicamente impegnative, con la velocità di dissezione e la purezza del campione che aumenta con l'esperienza. Il dissezione per brevi periodi di tempo (20-30 min) in tamponamento refrigerato senza detersivo e congelo immediato aiuta a preservare l'integrità del campione, come è stato osservato in precedenza per l'isolamento del tendine del topo54. Gli IFM possono essere congelati a secco dopo aver rimosso tutto il buffer dal pellet, ma in particolare per l'isolamento dell'RNA, il congelamento dei campioni nel buffer di isolamento tende a produrre risultati migliori. Gli IFM da un massimo di 20 dissezioni separate vengono combinate prima dell'isolamento dell'RNA o delle proteine, consentendo il ridimensionamento e la raccolta di materiale sufficiente, anche dai primi tempi o mutanti16,32, per l'analisi a valle.

Per le applicazioni dell'RNA, il passo più critico può essere l'isolamento dell'RNA stesso. Il gelidio thiocyanate-phenol-chloroformio (metodo 1 sopra) supera la maggior parte dei kit commerciali testati e, come osservato in precedenza, è considerevolmente meno costoso55. La variabilità osservata nei rendimenti di isolamento dell'RNA con kit commerciali è in accordo con le precedenti osservazioni56,57. Aggiungiamo ulteriormente il glicogeno durante le precipitazioni isopropanolo per aiutare a recuperare tutto l'RNA. Oltre alla resa dell'RNA, è importante verificare l'integrità dell'RNA per garantire che il campione non sia stato frammentato o degradato durante i processi di dissezione e isolamento. È inoltre essenziale lavorare senza RNase. Infine, la scelta di RT-kit può influire sulla sensibilità del processo di trascrizione inversa. Anche se non spesso discusso in dettaglio, tutti questi punti influenzano la qualità del campione IFM e i dati ottenuti dalle applicazioni a valle.

Diverse importanti modifiche distinguono il protocollo dai protocolli di dissezione IFM esistenti. Sebbene esista un protocollo di dissezione dettagliato per l'immunofluorescenza IFM19, questo protocollo presenta un approccio diverso alle dissezioni puupali che consente un più rapido isolamento del tessuto IFM. Ciò consente la raccolta di grandi quantità di tessuto IFM (relativamente parlando) con tempi di dissezione limitati per prevenire cambiamenti di proteoma o trascrittoma. Altri protocolli descrivono la dissezione dell'IFM adulto per visualizzare la colorazione GFP nelle singole miofibrille39 o per la colorazione dei muscoli larvali della parete del corpo58, ma non affrontano la dissezione nelle fasi puiche o per l'isolamento di RNA o proteina. Questo approccio è anche distinto dal protocollo esistente per la microdisezione degli IFM pupali da criosezioni38, che può generare un campione IFM più puro, ma è più laborioso e produce meno materiale. Rispetto ad altri protocolli rapidi di dissezione IFM adulti38,39, IFM sono isolati in PBS buffer senza detersivo per limitare l'induzione dello stress e altre principali modifiche di espressione.

Il progresso chiave di questo protocollo è l'inclusione di un reporter vivo e fluorescente, che consente l'isolamento degli IFM nelle prime fasi pupali. Usiamo standardmente Mef2-GAL459 alla guida UAS-CD8::GFP o UAS-GFP::Gma60. Ciò consente l'etichettatura differenziale di IFM (i muscoli del volo sono più fortemente etichettati e dalla forma diversa rispetto ad altri muscoli pupali) così come le prestazioni delle manipolazioni basate su GAL4-UAS, ad esempio gli esperimenti di salvataggio o RNAi. È anche possibile combinare Mef2-GAL4 con tub-GAL80ts per evitare la letalità precoce associata all'RNAi o con UAS-Dcr2 per aumentare l'efficienza dell'RNAi40.

Sono disponibili driver GAL4 o GFP aggiuntivi che variano in termini di specificità del tipo di muscolo, modello di espressione temporale e forza del driver19,61 che possono essere utilizzati al posto di Mef2-GAL4. Ad esempio, Act88F-GAL4 viene prima espresso intorno a 24 h APF, quindi non può essere utilizzato per timepoint precedenti; tuttavia, etichetta fortemente IFM e può essere utile per evitare la letalità precoce associata all'RNAi. Lui-GFP o Act88F -Etichetta GFPIFM, sempre con restrizioni temporali, ma evitano la dipendenza GAL4 di espressione marcatore e può essere utile in combinazione con un background mutante di interesse. Sono disponibili elenchi di altre possibili linee di marker19. Va anche notato che l'uso di transgeni e del sistema GAL4/UAS può causare artefatti di espressione genica, quindi è importante utilizzare controlli appropriati, ad esempio la linea di guida attraversata per la deformazione di fondo di tipo selvaggio, in modo che tali artefatti siano presumibilmente lo stesso in tutti i campioni.

Con il video di accompagnamento, questo protocollo dettagliato mira a rendere più accessibile la dissezione IFM pulatale e promuovere l'uso di approcci omici per studiare lo sviluppo muscolare. L'accoppiamento del potere della genetica della Drosophila e della biologia cellulare con i saggi di biochimica e omica accessibili attraverso l'IFM sezionato ha il potenziale per far progredire la comprensione meccanicistica della miogenesi e delle funzioni muscolari. Studi futuri che collegano le osservazioni a livello di sistemi della regolazione del trascrittoma e del proteoma alle uscite metaboliche e funzionali forniranno una comprensione più profonda dello sviluppo specifico del tipo muscolare e della patogenesi dei disturbi muscolari.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati ad Andreas Ladurner e Frank Schnorrer per il generoso sostegno. Ringraziamo Sandra Esser per l'eccellente assistenza tecnica e Akanksha Roy per aver generato i dati della spettrometria di massa. Riconosciamo i centri di borsa Bloomington e Vienna per la fornitura di mosche. Ringraziamo il Core Facility Bioimaging per l'aiuto con l'imaging confocale e il Proteinanalytik di .entrallabor per l'analisi dei campioni di spettrometria di massa, entrambi presso il Centro Biomedico LMU (Martinsried, DE). Il nostro lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), dal Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) presso la Ludwig-Maximilians-University M'nchen (MLS), dal Frederich-Bauer Stiftung (MLS) e dall'International Max Scuola di ricerca Planck (EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4 cm x 4 cm
Black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
Black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
Blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
Chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
Confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
Confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
Double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
Glycogen Invitrogen 10814-010
Image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
Microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80 mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
Normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
Rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
Slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
Statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm

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Genetica Numero 152 Drosophila biologia dello sviluppo muscolo di volo indiretto dissezione dal vivo sviluppo pupali spettrometria di massa RNA-Seq isolamento RNA Bruno1 splicing alternativo
Dissezione dei muscoli di volo di <em>Drosophila melanogaster</em> per gli approcci Omics
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Kao, S. Y., Nikonova, E.,… More

Kao, S. Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).

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