Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Disseksjon av Drosophila melanogaster fly musklene for omics tilnærminger

Published: October 17, 2019 doi: 10.3791/60309
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Biomedical Center, Department of Physiological Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich, 2Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), Department of Chemistry, Ludwig-Maximilians-University Munich
* These authors contributed equally

Summary

Drosophila fly muskelen er en kraftfull modell for å studere transcriptional regulering, alternative skjøting, metabolisme, og mechanobiology. Vi presenterer en protokoll for Disseksjon av fluorescerende-merket fly muskelen fra live pupae å generere svært beriket prøver ideell for Proteomikk og dyp-sekvensering. Disse prøvene kan tilby viktig mekanistisk innsikt i ulike aspekter av muskelutvikling.

Abstract

Drosophila Flight muskelen er en kraftfull modell for å studere ulike prosesser som transcriptional regulering, alternative skjøting, metabolisme, og mechanobiology, som alle påvirker muskelutvikling og myofibrillogenesis. Omics data, slik som de som genereres av masse massespektrometri eller dype sekvensering, kan gi viktig mekanistisk innsikt i disse biologiske prosesser. For slike tilnærminger, er det fordelaktig å analysere vev-spesifikke prøver å øke både selektivitet og spesifisitet av omics fingeravtrykk. Her presenterer vi en protokoll for Disseksjon av fluorescerende-merket fly muskelen fra live pupae å generere svært beriket muskel prøver for omics applikasjoner. Vi for det første beskrive hvor å analysere flyreise muskelen for tidlig puppestadiet scener (< 48 h etter puparium formasjon [APF]), når det muskelen er merkes av grønn fluorescerende protein (GFP) merking. Vi så beskrive hvor å analysere muskelen fra sen pupae (> 48 h APF) eller voksen, når muskelen er gjenkjennelig under en dissekere mikroskop. Den med følgende video protokollen vil gjøre disse teknisk krevende dissections mer allment tilgjengelig for muskel-og Drosophila forskningsmiljøer. For RNA-programmer, analysen vi mengden og kvaliteten av RNA som kan isoleres på ulike tidspunkter og med ulike tilnærminger. Vi viser videre at Bruno1 (Bru1) er nødvendig for et timelig skifte i myosin tunge kjeden (MHC) skjøting, viser at dissekert musklene kan brukes til MRNA-SEQ, masse massespektrometri, og omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) Programmer. Denne disseksjon protokollen vil bidra til å fremme vev-spesifikke omics analyser og kan generelt anvendes for å studere flere biologiske aspekter av myogenesis.

Introduction

Moderne omics teknologi gir viktig innsikt i muskelutvikling og mekanismene underliggende menneskelige muskellidelser. For eksempel, analyse av transcriptomics data kombinert med genetisk og biokjemiske verifisering i dyremodeller har avdekket at tap av skjøting faktor RBM20 årsaker utvidede kardiomyopati på grunn av sin regulering av et målnettverk av mer enn 30 sarkomerlengde gener som tidligere er assosiert med hjertesykdom, inkludert titin1,2,3.

I et annet eksempel har studier fra cellekultur, dyremodeller og menneskelige pasienter vist at myotonisk dystrofi skyldes en forstyrrelse i RNA-regulering på grunn av opptak av Muscleblind (MBNL) og oppregulering av CELF14,5. Korset-regulatoriske og timelige dynamikk mellom MBNL og CELF1 (også kalt CUGBP1 eller Bruno-like 2) bidra til å forklare vedvarende embryonale skjøting mønstre i myotonisk dystrofi pasienter. I tillegg bidrar det store nettverket av misregulated mål å forklare komplekse natur av sykdommen4,6,7,8. Et flertall av slike studier benytte omics tilnærminger i genetisk modell organismer å forstå mekanismene underliggende menneskelige muskel sykdom. Videre understreker de viktigheten av første forståelse Temporal og vev-type spesifikke genuttrykk, protein modifikasjon, og metabolske mønstre i sunn muskel å forstå endringer i syke eller aldrende muskel.

Drosophila melanogaster er en annen veletablert genetisk modell organisme. Strukturen av sarkomerlengde så vel som individuelle sarkomerlengde komponenter er svært bevart fra fluer til virveldyr4,10, og den indirekte fly musklene (IFMs) har blitt en kraftig modell for å studere flere aspekter av muskelutvikling11,12. Først fibrillær fly musklene er funksjonelt og morfologisk forskjellig fra rørformede kroppen musklene11,13, tillater gransking av muskel-type spesifikke utviklingsmessige mekanismer. Transkripsjon faktorer inkludert Wolframs store (Salm)14, Extradenticle (EXD), og Homothorax (HTH)15 har blitt identifisert som fibrillær skjebne regulatorer. I tillegg, nedstrøms av Salm, den CELF1 homologe Bruno1 (Bru1, året) dirigerer en fibrillær-spesifikk skjøting program16,17.

For det andre, IFMs er en viktig modell for å forstå prosessen med myogenesis seg selv, fra myoblast fusjon og myotube vedlegg til myofibrillogenesis og sarkomerlengde modning9,18,19. Tredje, Drosophila genetikk tillater gransking av bidrag fra individuelle proteiner, protein domener, og protein isoformene til sarkomerlengde formasjon, funksjon, og Biofysiske egenskaper20,21,22 ,23. Endelig, IFM modeller har blitt utviklet for studiet av flere menneskelige muskellidelser, som myotonisk dystrofi, myofibrillære myopatier, muskel degenerative lidelser, actinopathies, etc.24,25,26 ,27, og har gitt viktig innsikt i sykdoms mekanismer og potensielle terapier28,29,30. Således, Drosophila er en nyttig modell for å løse mange åpne spørsmål i myogenesis feltet, inkludert mekanismer av muskel-type spesifikk transkripsjon, skjøting, og kromatin regulering, samt til rollen som metabolisme i muskelutvikling. Anvendelsen av moderne omics teknologier, spesielt i kombinasjon med det store utvalget av genetiske, biokjemiske og celle biologiske analyser tilgjengelig i Drosophila, har potensial til å dramatisk fremme forståelsen av muskel utvikling, aldring og sykdom.

IFMs er de største musklene i fly, som spenner over nesten 1 mm over hele lengden av thorax i voksne31,32. Imidlertid genererer denne lille størrelsen utfordringen med å skaffe nok prøve å anvende omics teknologier i Drosophila i en vev-type spesifikk måte. Videre er IFMs en del av den voksne muskulaturen som dannes under puppestadiet etapper. Myoblasts sikring å danne myotubes, som festes til sener rundt 24 h etter puparium formasjon (APF) og gjennomgår en komprimerings trinn nødvendig å initiere myofibrillogenesis rundt 30 h APF (figur 1a-D)18,33, i 34.

Den myofibers deretter vokse til span hele lengden av thorax, med myofibrils gjennomgår en innledende vekstfase fokusert på sarkomerlengde tillegg til ca 48 h APF, og deretter overgangen til en modnings fase, der sarcomeres vokse i lengde og bredde og er ombygd for å etablere stretch-aktivering av 72 h APF (figur 1A-D)32,35. Utbruddet av fiber modning er minst delvis kontrollert av Salm og E2F32,36,37, og flere IFM-spesifikke sarkomerlengde protein isoformene hvis skjøting styres av Bru1 er innarbeidet i løpet av denne Phase16,17. Modne fluer Eclose fra 90-100 h APF. Dette betyr at for å studere muskelutvikling, IFM må isoleres med tilstrekkelig mengde, kvalitet og renhet fra flere puppestadiet tidspunkter å forenkle analyse ved hjelp av omics tilnærminger.

Flere protokoller for IFM disseksjon har blitt publisert. Selv om disse protokollene fungerer bra for de tiltenkte applikasjonene, er ingen ideelle for omics tilnærminger. Protokoller som bevarer IFM morfologi for immunofluorescence av puppestadiet og voksne IFMs19, isolere IFM fibre for mekanisk evaluering31, eller utnytte microdissection av puppestadiet IFM fra cryosections38 er for spesialisert og tid og arbeidsintensiv til rimelig å få tilstrekkelige mengder IFM vev for omics applikasjoner. Andre protokoller er utviklet for rask Disseksjon av spesifikt voksen IFM38,39, således ikke gjelder for puppestadiet stadier, og bruke buffere som ikke er ideelle eller kan være uforenlig med for eksempel RNA isolasjon. Dermed er det behov for å utvikle nye tilnærminger for å isolere puppestadiet IFM for biokjemi eller omics applikasjoner.

Her presenterer vi en protokoll for Disseksjon av IFM under puppestadiet stadier som har blitt brukt med hell for mRNA-SEQ analyse fra 16 h APF gjennom voksen etapper16,32. Protokollen sysselsetter en grønn fluorescerende protein (GFP) etikett for å identifisere IFMs på alle stadier av puppestadiet og voksen utvikling, slik at Live disseksjon under et fluorescerende dissekere mikroskop. Tilnærmingen er mindre arbeidskrevende, med en høyere gjennomstrømning enn eksisterende IFM disseksjon protokoller. Dette gir rask isolering og kryonisk bevaring av prøver, genererer nok materiale etter flere runder med disseksjon for omics tilnærminger så vel som for standard omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) eller vestlig blotting.

Vi presentere protokollen i to deler, demonstrere hvordan du raskt analysere IFMs både før 48 h APF (under tidlig forvandling, når IFM vedlegg er mer spinkel) og etter 48 h APF (når puppestadiet kroppen plan og IFM vedlegg er godt definert). Vi viser at vi kan isolere høy kvalitet RNA fra dissekert IFMs på alle tidspunkter og presentere data på ulike tilnærminger til RNA isolasjon og omvendt transkripsjon. Til slutt viser vi anvendelsen av disseksjon protokollen til mRNA-SEQ, Mass massespektrometri, og RT-PCR ved hjelp av CELF1 homologe Bruno1 som et eksempel. Vi viser misexpression av sarkomerlengde protein isoformene i Proteomikk data fra Bruno1 mutant IFM og undersøke Bruno1 regulering av C-terminalen skjøte tilfelle myosin tung kjede (MHC). Disse resultatene illustrerer hvordan omics data kan gi en dypere forståelse av biologiske fenomener, utfyller genetiske og biokjemiske eksperimenter.

Protocol

1. Oppsamling av pupae

  1. Hev fluene av ønsket genotype i flasker (figur 1E). Enten lage en fersk flip av disseksjon lager eller sette et kors med minst 20 kvinnelige jomfru fluer. Oppretthold flasker til fluene begynner å pupate.
  2. Samle pre-pupae med en fuktet pensel og Overfør til fuktet filter papir i en 60 mm Petri parabol (figur 1F).
  3. Sex pupae, samle riktig kjønn for eksperimentet (figur 1G). Hanner er identifisert ved tilstedeværelsen av testiklene, som vises som gjennomskinnelig baller i ellers ugjennomsiktig puppe.
  4. Merk Petri parabolen med tid, dato og genotype, deretter alder pupae til ønsket Stadium (figur 1H).
    Merk: Oppretthold kryss/aksjer og alder pupae i en temperaturstyrt inkubator (dvs. 25 ° c eller 27 ° c for RNAi krysser, som økt Gal4 aktivitet ved høyere temperaturer øker knock-Down effektivitet40). Sørg for at fuktigheten er tilstrekkelig høy, slik pupae ikke tørker ut når aldring flere dager.

2. IFM disseksjon før 48 h APF

  1. Monter nødvendig utstyr inkludert to #5 biologi grade tang, en pipette, pipette tips, tørr is, og (for RNA prøver) isolasjon reagens (se tabell over materialer). I tillegg, chill svart dissekere retter (se tabell over materialer), 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) buffer, og 1,5 ml mikrosentrifugen rør på isen.
  2. Ved hjelp av en fuktet pensel, overføring iscenesatt pupae til en svart dissekere parabolen fylt omtrent to tredjedeler med kaldt 1x PBS (figur 2a, B). Flytt til et fluorescerende dissekere mikroskop.
    Merk: Bruk så mange pupae som kan være dissekert innen en 30 min tid vindu. Avhengig av erfaring, varierer dette fra 3 – 15 pupae. Se supplerende metoder for diskusjon av alternativer til svart dissekere retter.
  3. Ved hjelp av #5 tang, skyver en av pupae til bunnen av en svart dissekere parabolen og justere mikroskopet zoom og fokus for å tydelig se puppe (figur 2C).
  4. Ta tak i fremre av puppe med en tang (figur 2D), og deretter dytte den pupae med et enkelt tips av de andre tang litt off-Center i magen, like bak thorax. Dette holder puppe på plass og hindrer IFMs fra å flytte inn i magen (figur 2E).
    Merk: Begynn timing lengden på disseksjon fra dette punktet, så snart puppestadiet integritet er forstyrret. Bruk en definert lengde på disseksjon (for eksempel 20 – 30 min) for å minimere muskel død og tilknyttede transcriptomic og Proteomikk endringer. Analysere så mange fluer som mulig i denne perioden av tid.
  5. Ved hjelp av den første tang, fjerne den fremre halvdelen av puppestadiet saken (figur 2F).
  6. Bruk samme tang til å klype den eksponerte pupae rett bak thorax, og Skill buken fra thorax (figur 2G).
  7. Bruk tang, klem forsiktig den fremre delen av thorax (for < 35 h APF) eller rip åpne thorax å eksponere fluorescensmerkete merket IFMs (figur 2h). IFMs vil lett løsne fra epidermis, som sene vedlegg ved tidlig tidspunkter er skjøre. Kast den gjenværende stammen ved hjelp av Tang for å skyve den til motsatt side av fatet.
  8. Gjentar skritt 2.3 – 2.7, analysere i tillegg pupae.
  9. Samle IFM fibre med tang og organisere dem i en haug på bunnen av den svarte dissekere parabolen (figur 2I, J). Fjern eventuelle rusk ved å skyve den ut av synsfeltet ved hjelp av tang.
    Merk: Med praksis kan tang tips bringes i umiddelbar nærhet uten å berøre hverandre. Denne teknikken kan brukes til å løst Grip IFMs uten å ødelegge dem. Alternative metoder inkluderer forsiktig skyve eller løfte IFMs med et enkelt tips eller helt lukket pinsett, eller ta litt fett eller annet vev med IFM og fjerne fettet som beskrevet i trinn 2,10.
  10. Kvalitetskontroll av IFM muskel prøven, ved hjelp av Tang for å fjerne ikke-IFM muskler, fett, cuticle, etc. fra prøven (figur 2K, L).
    Merk: Med Mef2-Gal4, IFM er merket sterkere enn andre muskel typer ved tidlig tidspunkter (figur 2k, k '), slik at fjerning av hoppe muskel og larvestadiet muskler basert på fluorescens intensitet og muskel form. Fett og cuticle vev ser annerledes og er ikke merket med en muskel-spesifikk fluorescens etikett (figur 2k, k '). Se diskusjons delen for andre Gal4-linjer som gir navn til IFM.
  11. Ved hjelp av et avkuttet pipette tips, overføre haugen av IFMs inn i en 1,5 mL mikrosentrifugen tube fylt med 250 μL av kjølt 1x PBS (figur 2M-O). Fortsett umiddelbart til seksjon 4.
    Merk: IFM prøver kan gå tapt bare ved å stikke til siden av pipette spissen. Pipettering buffer opp og ned flere ganger før du samler IFMs kan gjøre standard tips mindre klissete, og silikonbehandlet eller perfluoroalkoxy (PFA) tips (se tabell over materialer) med lavere overflate spenninger kan bidra til å forhindre prøve tap.

3. IFM disseksjon etter 48 h APF

  1. Monter nødvendig utstyr inkludert to #5 biologi grade tang, fine saks, standard glass mikroskop lysbilder, dobbel-Stick tape, pipette, pipette tips, tørr is, og (for RNA applikasjoner) isolasjon reagens (se tabell over materialer). Avkjøl 1x PBS og mikrosentrifugen rør på isen.
  2. Bruke en lett fuktet pensel, overføre iscenesatt pupae til en stripe av tosidige klebrig tape montert på et mikroskop lysbilde (Figur 3a). Plasser pupae i en linje som er orientert i samme retning (ventrale ned og fremre mot bunnen av lysbildet).
    Merk: Vær forsiktig så du ikke bruker for mye vann på pensel eller filter, eller pupae vil ikke holde seg godt. Hvis pupae ikke stikker, tørk dem ved først å overføre til et tørt filter eller silkepapir. Mount så mange pupae som kan være dissekert innen en 30 min tid vindu, ideelt ~ 10 pupae.
  3. Fjern puppe fra puppestadiet saken. Bruk tang til å erte fra hverandre og åpne puppestadiet saken over fremre trakeer (Figur 3B).
  4. Skyv forsiktig et par tang dorsalt mot bakre, klippe puppestadiet saken som tang flytte (Figur 3B '). Vær forsiktig så du ikke sprekker den underliggende puppe. Frigjør puppe fra den åpnede saken og umiddelbart overføre den til en dråpe 1x PBS på et annet mikroskop lysbilde (Figur 3B ", C).
  5. Gjenta trinn 3,3 og 3,4 for alle pupae i linjen, og sett deretter dobbel-Stick tape gli til side.
  6. Bruke fine saks, klippe magen av puppe bort fra thorax og skyv den inn i en egen haug (Figur 3d, d '). Gjenta for de resterende pupae.
    Merk: Begynn timing lengden på disseksjon med trinn 3,6, så snart puppestadiet integritet er forstyrret. Analysere så mange fluer som mulig i 20-30 min for å hindre celle død og tilhørende transcriptomic og Proteomikk endringer. Når dissekere 1 d voksne eller > 90 h pupae, er det ofte praktisk for senere trinn for å i tillegg fjerne hodet med den fine saks.
  7. Bruk en silkepapir, fjerne flertallet av 1x PBS (generelt skyet med suspendert fett) samt haug av abdomens (Figur 3E). Legg en dråpe frisk, kjølt 1x PBS til de resterende thoraxes.
  8. Bruk saksen til å kutte thorax i to (Figur 3f, f ') ved å kutte fra hodet ned langsgående kroppen aksen i en enkelt bevegelse. Alternativt, hvis hodet er fjernet, må du først sette inn saksen der hodet var festet og kutte den øverste halvdelen av thorax lengderetningen mellom IFMs. Deretter klippes den ventrale siden av thorax med en andre kuttet i samme retning.
  9. Gjenta trinn 3,7 og 3,8 for alle pupae som skal dissekert, og Generer en haug med thorax hemisections nær midten av lysbildet. Sørg for at det er nok kjølt 1x PBS på lysbildet slik at hemisections ikke tørker ut.
    Merk: Etter 48 h APF, IFMs er store nok til å være synlig under en standard dissekere mikroskop til trent øyet. På dette punktet i protokollen, muskler med et fluorescerende merke kan flyttes til et fluorescerende dissekere omfang for å hjelpe i IFM identifikasjon eller for opplæring, men dette er ikke nødvendig.
  10. Analysere IFMs ut av thorax. Isoler en av hemisections ved hjelp av #5 tang (Figur 3G, H). Sett forsiktig inn tuppen av en pinsett over og under midten av IFMs (Figur 3G ', H '). Mens du holder den første tang fortsatt, bruk fine saks til å kutte den ene enden av IFM bort fra cuticle og sener. Deretter kuttet den andre enden av IFM fri fra cuticle (Figur 3G ' ', H ' ').
    Merk: Avhengig av retningen på thorax etter den første IFM kuttet, er det nyttig å rotere thorax 180 ° slik at den andre IFM kuttet er lettere å utføre.
  11. Fjern IFM Bundle fra thorax med tang (Figur 3G ' ' ', H ' ' '), overføre den til kanten av PBS boblen å bruke vann spenning for å holde den på plass (Figur 3I). Skyv stammen til motsatt side av lysbildet. Gjenta for de resterende thorax hemisections, genererer en samling av dissekert IFMs.
    Merk: Hvis IFMs ikke bo i en pen haug, fjerne noen av 1x PBS med en vev. Vær forsiktig så du ikke la alle PBS fordampe, og sikre at dissekert IFMs og hemithoraxes forblir dekket av buffer.
  12. Etter dissekere alle IFMs, raskt utføre en kvalitetskontroll på dissekert muskelen. Ved hjelp av #5 tang, fjerne eventuelle hoppe muskler eller cuticle fragmenter som kan ha funnet veien inn i prøven (Figur 3J-K ' ').
    Merk: Jump muskelen vises forskjellig fra IFM. Hvis dissekere Mef2-Gal4 merket muskelen under fluorescens, har hoppe muskelen en svakere fluorescens og en annen form og tekstur. Under normal lys, synes det nesten gjennomskinnelig mens IFMs er en ugjennomsiktig, melkeaktig gul (Figur 3J-J ' ', K).
  13. Ved hjelp av vann spenninger, fangst (men ikke squish) den dissekert IFMs mellom et par tang (Figur 3L). Overfør IFMs til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør som er forhåndsutfylt med 250 μL av kjølt 1x PBS (fig. 3M). Fortsett umiddelbart med avsnitt 4.
    Merk: Når pinsett tips er brakt i nærheten av hverandre og løftet ut av en buffer løsning, forårsaker vann spenning en boble av buffer som skal fanges mellom pinsett tips. Hvis IFMs også er til stede i denne boblen, kan de løftes ut av løsningen og enkelt overføres til en annen buffer fylt beholder. Det er viktig å presse pinsett til å bringe tips nær hverandre uten å berøre hverandre, for å unngå macerating vevet fanget i buffer boblen.

4. pellet og bevare IFM sample

  1. Pellet IFMs ved å sentrifugering 1,5 mL mikrosentrifugen rør for 3 – 5 min ved 2 000 x g i en bord topp sentrifuge (Figur 4a, B).
  2. Fjern bufferen ved hjelp av en pipette (Figur 4C).
  3. For RNA-applikasjoner, resuspend IFM pellet i 50 – 100 μL av ønsket RNA isolasjons buffer (se tabell over materialer, Figur 4D). Hvis ikke, går du til trinn 4,4.
    Merk: IFMs kan være tørr frosset etter trinn 4,2 for masse massespektrometri preparater eller isolering av RNA med kommersielle sett (se representative resultater). For RNA-programmer oppnås bedre resultater ved umiddelbart å blanding og fryse IFM pellet i isolasjons buffer.
  4. Frys prøven på tørr is eller smekk fryse i flytende nitrogen (Figur 4E). Oppbevares ved-80 ° c til det er klart for påfølgende trinn i prøve forberedelsene for nedstrøms analyse.
    Merk: Etter kryonisk bevaring, kan prøvene lagres i flere måneder før behandling for nedstrøms etterforskning.

Representative Results

De disseksjon protokollene som presenteres ovenfor er nyttige for å generere IFM-beriket prøver fra 16 h etter puparium formasjon (APF) til voksen scenen. Dissekert fly muskel prøver kan brukes for flere applikasjoner, og har så langt vært med hell søkt om RT-PCR4,17, RNA-SEQ16,32, ChIP36,37, Western blotting14,41 og masse massespektrometri eksperimenter (se nedenfor). For å hjelpe potensielle brukere med å dissekere for RNA-baserte applikasjoner, presenterer vi først våre resultater som fremhever viktige betraktninger spesielt for isolering av RNA fra IFMs. For å vise nytten av våre disseksjon protokoller, illustrerer vi noen av de mulige – omics applikasjonene som bruker våre data på det RNA-bindende proteinet Bruno1.

IFM disseksjon protokoll gir høy kvalitet RNA

Det er viktig å bestemme antall fluer som skal dissekert på forhånd, da koding mRNA anslås å utgjøre bare 1 – 5% av total RNA42. Vi fikk i gjennomsnitt 24 ± 9 ng av total RNA per fly fra IFM dissekert fra 1 d voksne (Figur 4F og supplerende figur 1a), med gir vanligvis øker med erfaring. Denne avkastningen av total RNA per fly er relativt konstant, svinger rundt 25 NG for IFM dissekert ved 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF og 90 h APF (Figur 4F og supplerende figur 1B, D, E). Disse observasjonene reflekterer også enhver RNA isolert fra forurensende fett, sene, luftrør eller andre celletyper, som kan være høyere i prøver isolert fra tidligere tidspunkter. Dermed fikk vi > 1 μg av total RNA fra IFM fra 50 fluer og typisk analysere IFM fra 100 − 150 fluer for å generere > 3 μg av total RNA for RNA-SEQ-prøver.

Metoden for RNA-isolering påvirker mengden og kvaliteten til gjenopprettede RNA, og vi oppfordrer brukere til å validere sin isolasjons tilnærming. For eksempel, mens isolasjon ved hjelp av metode 1 produserer i gjennomsnitt 1143 ± 465 ng av total RNA fra IFM fra 50 1 d voksen fluer, isolasjon med ulike kommersielle kits gir alt fra 186 ± 8 ng til 1261 ± 355 ng av total RNA (Figur 4G og Supplerende figur 1C). RNA isolert fra kommersielle kits er generelt av god kvalitet (Figur 4H og supplerende figur 1F), men lave gjenoppretting tyder på at RNA ikke kan være effektivt eluert fra kolonnene. RNA-integritet kan også bli kompromittert ved bruk av et sett som gjort i metode 2 (Figur 4H, Second plot), sannsynligvis på grunn av buffer konstitusjon og varme behandlinger, noe som fører til alvorlig fragmentering som kan påvirke nedstrøms eksperimenter.

Det er også viktig å observere riktig RNase-fri teknikk ved isolering og håndtering av RNA-prøver. Selv om fryse-tine sykluser og en 4 h romtemperatur inkubasjons ikke dramatisk påvirke RNA integritet profiler, selv små mengder RNase føre til rask RNA degradering (Figur 4I og supplerende metoder). Brukere oppfordres fortsatt til å arbeide på isen og begrense fryse-tine for å hindre RNA hydrolyse og fragmentering. Dette ble ikke oppdaget her, men hindrer RNase forurensning ved hjelp av filter tips og DEPC-behandlet buffere er helt avgjørende.

Effektiviteten av omvendt transkripsjon påvirker også suksessen til nedstrøms programmer. Vi oppnådde pålitelige resultater med to av tre kommersielle RT-sett vi testet, som begge forsterker sterke RT-PCR-bånd for ribosomal Gene rp49 (Figur 4J). Imidlertid kan RT kit #2 være mer følsom for påvisning av lav-uttrykt transkripsjoner, som vi fikk sterkere bånd for RNA-binding protein bru1 for alle tre biologiske replikerer (Figur 4J). Til sammen illustrerer disse resultatene at RNA-er av høy kvalitet kan isoleres fra IFMs-dissekert med denne prosedyren.

Dissekert IFMs produserer høykvalitets mRNA-SEQ og Proteomikk data

Bruke IFM dissekert henhold til ovennevnte protokollen ved 30 h APF, 72 h APF og fra 1 d voksen fluer, vi tidligere viste at RNA-binding protein og CELF1-homolog Bruno1 (Bru1, arrest, året) styrer en IFM-spesifikk skjøting sti nedstrøms av transkripsjon faktor Wolframs store (Salm)16. IFMs fra null mutanter samt fluer med muskel-spesifikke bruno1 RNAi (bru1-IR) display sarkomerlengde vekst defekter, misregulation av myosin aktivitet og til slutt hypercontraction og tap av muskelfibre16,17 . Nedenfor viser vi nytten av dissekert IFMs for hele proteom masse massespektrometri og viser at flere av uttrykket endringene vi observert på RNA-nivået er også tydelig på protein nivå. Vi ytterligere markere en bestemt utviklingsmessige skjøte hendelse i MHC det ble funnet å være regulert av Bruno1, illustrerer at MRNA-SEQ og RT-PCR fra dissekert IFMs kan brukes til å demonstrere regulering av alternative skjøte hendelser.

Avhengig av bibliotekets kvalitet og dybde, kan mRNA-SEQ-data analyseres på nivået av gen enheter (gjennomsnittlig lesing teller over alle exoner av et gen), individuelle exoner, eller skjøte knutepunkter. mRNA-SEQ-data fra bru1-IR- IFMs sammenlignet med wildtype viser svake endringer i uttrykket på gen enhetsnivå16 (figur 5A). På 72 h APF, det er allerede en trend for sarkomerlengde gener som muskel LIM protein på 60A [Mlp60A], utgangen 57B [Act57B], muskel-spesifikke protein 300 kDa [Msp300], eller Stretchin-Mlck [Strn-Mlck]) som er viktige for riktig muskelutvikling å være downregulated i bru1-IR muskel (figur 5A og supplerende tabell 1). Men vi har vist tidligere at på nivået av individuelle exoner, det er en mye sterkere downregulation av spesifikke sarkomerlengde genet isoformene16, antyder den viktigste funksjonen til Bruno1 er å kontrollere alternative skjøting (supplerende tabell 1 ).

Ved bruk av hel proteom masse massespektrometri på dissekert IFMs, kan vi vise lignende regulering på protein nivået (figur 5B og tilleggs tabell 2). Av de 1 895 peptid gruppene oppdaget, 524 (28%) av dem er misregulated i Bru1m2 mutant IFM i 1 d voksne (supplerende tabell 2). Downregulation av både Strn-Mlck og Mlp60A-proteinet er også observert, samsvarende observasjoner på transkripsjon nivå i våre mRNA-SEQ data. Til tross for begrenset antall database peptider som kart til bestemte protein isoformene (se supplerende metoder for analyse detaljer), for Sarkomerlengde proteiner Tropomyosin 1 (Tm1), opprettholdt (opp/TNT), MHC, bøyd (BT/projectin) og Paramyosin (prm) vi observere oppregulering av peptider fra en isoformen og downregulation av en annen (figur 5B), bekrefter våre tidligere observasjoner av lignende regulering på RNA nivå16. Denne beviser det dissekert IFMs er nyttig for begge to mRNA-SEQ og Proteomikk søknadene.

Som et ytterligere eksempel på hvordan omics data kan utfylle tradisjonelle tilnærminger for å forbedre og utvide biologisk innsikt, valgte vi å fokusere på skjøting på C-Terminus av MHC. En tidligere karakterisert protein felle linje kalt weeP26 er satt inn i den endelige Intronets opprinnelse av MHC43,44 (se supplerende metoder for nøyaktig plassering). weeP26 inneholder en sterk skjøte Acceptor og er innlemmet i antagelig alle MHC transkripsjoner (figur 5C). Imidlertid er GFP merket protein i IFM innlemmet i to "prikker" på hver side av M-line, mens i beinet muskel, inkorporerer det jevnt over M-line og svakt over tykke filamenter (figur 5E). Orfanos og Sparrow viste disse "prikker" i IFM form på grunn av en utviklingsmessige MHC isoformen bytte: den MHC isoformen uttrykt før 48 h APF er GFP-merket som weeP26 ekson setter inn i den åpne lese rammen, mens MHC isoformen uttrykt etter 48 h APF er umerkede, som weeP26 ekson er inkludert nedstrøms av stopp Codon i 3 '-UTR44.

Våre mRNA-SEQ data tillot oss å karakterisere C-terminal MHC isoformen uttrykk i større detalj. Mens to ulike MHC oppsigelser har blitt rapportert43,44, vår mRNA-SEQ data og nåværende flybase merknad (FB2019_02) tyder på at det er faktisk tre mulige alternative skjøte hendelser på MHC C-Terminus (ekson 34-35, 34-36 eller 34-37) (figur 5C), som bekreftes av RT-PCR (figur 5D). weeP26 GFP settes inn i Intronets opprinnelse mellom ekson 36 og 37; Således, idet begge to ekson 34-35 og ekson 34-36 isoformene inneholde opphøre kodon, GFP kanne bare oversatt inne det ekson 34-37 isoformen (resulterer inne ekson 34-GFP-37). Vi videre kunne se både timelig og romlig regulering av alle MHC isoformene. I IFM, observerer vi en MHC isoformen bytte fra ekson 34-37 til ekson 34-35 mellom 30 h APF og 48 h APF (figur 5C, D, F) ved 27 ° c, selv om dette ennå ikke er synlig ved Immunofluorescence på 48 h APF (figur 5E). Legs allerede uttrykke en blanding av ekson 34-37 og ekson 34-35 ved 30 h APF, og ved 72 h APF uttrykke alle tre MHC isoformene (figur 5D, F). Voksen hoppe muskel (TDT) uttrykker også alle tre MHC isoformene (figur 5F), antyder dette er generelt sant for rørformede somatiske muskler. Således, våre mRNA-SEQ data tillate forlengelsen av foregående resultater av innsnevring tidsrammen for det MHC isoformen skru av inne IFM og karakteriserer MHC isoformen bruk inne rør muskelen.

MHC isoformen regulering i Salm og bru1 mutant IFM ble deretter undersøkt. I begge tilfeller så vi misregulation av weeP26. Salm mutant IFMs mislykkes å fullføre utviklingsmessige bryteren i MHC isoformen uttrykk og phenocopy etappe skjøting mønstre på senere stadier, inkludert gevinst på ekson 34-36 hendelsen (figur 5F). Dette er enig med tidligere funn som tap av Salm resultater i en nesten komplett skjebne transformasjon av IFM til rørformede muskel16. Bru1-IR og Bru1 mutant IFM, ligner Salm-/- IFM, beholder ekson 34-37 skjøte hendelsen gjennom voksen stadier (figur 5E, F), noe som resulterer i en weeP26 GFP merking mønster ligner beinet muskel, men det får ikke ekson 34-36 hendelsen. Dette tyder på at Bruno1 er nødvendig i IFM å minst delvis kontrollere utviklingsmessige bryteren i MHC alternativ skjøting, men det indikerer at ytterligere skjøting faktorer er også misregulated i Salm-/-kontekst. Videre illustrerer dette eksempelet hvordan RT-PCR og mRNA-SEQ data fra dissekert IFM kan være verdifullt i å få en dypere forståelse av utviklingsmessige skjøting mekanismer og observerte morfologiske defekter.

Figure 1
Figur 1: IFM utvikling og regi av pupae. (A) SKJEMATISK av IFM utvikling på 24 h apf, 32 h apf, 48 h APF, 72 h APF, og 1 d voksne viser komprimering av fly musklene (grønn) på ~ 32 h APF og påfølgende fiber vekst å fylle thorax. Sener er i mørk grå. (B) konfokalmikroskopi bilder av faste IFMs fra åpen bok dissections (24 h, 32 h, 48 h)19 eller thorax hemisections (72 h, 1 dag) beiset for utgangen (rhodamine phalloidin, magenta) og GFP (grønn). (C, D) Bilder av GFP fluorescens i live pupae illustrerer intakt IFM morfologi av disseksjon fly linje i rygg (C) eller lateral (D) flyet. Stjernene markerer IFM plassering. (E) for å forberede for dissections, fly aksjer bør vendes eller krysser satt 3-4 dager i forveien. (F) Prepupae velges med den hvite fargen (gule pilspisser) og isoleres ved hjelp av en fuktet pensel (f ', f '). (G) Prepupae bør sexed å skille kvinner fra menn basert på tilstedeværelsen av testiklene som vises som posteriort ligger gjennomskinnelig baller (gule stjerner). (H) pupae er i alderen på fuktet filter papir i 60 mm retter. Skala stolper = 100 μm (B), 1 cm (C, D, E, H), 1 mm (F, F ' ', G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Disseksjon av IFMs før 48 h APF. (A) tillegg av 1x PBS buffer til en svart dissekere parabol med en overføring pipette. (B) overføring av iscenesatt pupae ved hjelp av en pensel. (C) under et fluorescerende dissekere mikroskop for å visualisere GFP, milde skyve av puppe til bunnen av en dissekere parabolen bruker #5 tang (skissert i grått). "X" i en sirkel betegner bevegelse inn i bildet. (D, E) Fatte av pupae anteriort (D), deretter poking av pupae rett bak thorax (E). Dash i en sirkel betyr ingen bevegelse. (F, G) Trekke med fremre tang (pil) for å fjerne puppestadiet saken (F), deretter fjerning av magen (G). (H) gjentakelse av C-G for flere puppe. Gule stiplede linjer er nummerert som bidrar pupae. (I, J) Bruk av Tang (I) for å isolere IFMs fra omkringliggende vev (J). Prikk i en sirkel betegner bevegelse ut av siden. (K, L) Fjerning av forurensninger inkludert fett og hoppe (TDT) muskler (K) for å generere en ren IFM sample (L). TDT har lavere GFP uttrykk og en annen form enn IFM fibre (K '). (M, N, O) Bruk av en avkuttet pipette spissen (M) for å samle dissekert IFMs (N) og dens overføring til en mikrosentrifugen Tube (O). Skala stolper = 1 cm (A, B, M, O), 1 mm (C-G), 500 μm (H-L, N). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Disseksjon av IFMs etter 48 h APF. (A) justering av pupae på dobbel pinne tape. (B) fjerning av pupae fra puppestadiet tilfelle ved å åpne anteriort (b), kutte dorsalt (b') og løfte ut puppe (b ' '). Sirkel symbolene representerte det samme som figur 2. (C) overføring av pupae til buffer. (D) fjerning av magen ved å kutte med saks (gule doble piler) og separasjon fra Thoraxes (d'). (E, F) Tilsetning av ren buffer (E), deretter skjæring av thoraxes i halv lengderetningen (f, f '). (G, H) Dissections kan utføres under hvitt lys (G) eller fluorescens å visualisere GFP (H); kutting av IFMs på den ene siden (G '), deretter den andre siden (G ' '); løfte ut av thorax med tang (skissert i grått) (G ' ' '). (I, J, K) Innsamling av IFMs i buffer (I) og fjerning av forurensende ventrale nerve ledningen (VNC), gut, og hoppe muskel (TDT) (J) for å generere en ren IFM sample (K). TDT har lavere GFP uttrykk og en annen form enn IFM fibre (J ' ', K '). (L, M) Bruk av Tang for å overføre IFMs (L) til en mikrosentrifugen Tube (M). Skala stolper = 1 cm (A, E, M), 1 mm (B-D, F-L). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: informasjon om bevaring av IFM og RNA-isolasjon. (A) IFMs er pelleted av sentrifugering for 5 min på 2000 x g. (B) IFM pellet (pil) og pellet under fluorescens (b '). (C) fjerning av alle buffer med en pipette spissen. (D) for RNA-ekstraksjon, blanding av pellet i isolasjons buffer. Dette trinnet kan hoppes til tørr-fryse dissekert IFMs. (E) frysing av prøven i flytende nitrogen eller på tørr is og lagring ved-80 ° c. Skala stolper = 10 cm (A), 1 mm (B, B '), 1 cm (C, D, E). (F) Nanograms (ng) av total RNA fra dissekert IFM innhentet per fly ved 16 h APF, 24 h APF, 30 h apf, 48 h apf, 72 h apf, 90 h APF, og 1 d voksen. Feilfelt = SD. (G) totalt RNA ISOLERT fra IFM dissekert fra 50 1 d voksen fluer bruke ulike utvinning metoder. Feil stolper = SD. (H) representative spor til analyse RNA-integritet etter ulike utvinningsmetoder. De ribosomal bandene kjører like under 2000 nukleotider (NT) og markøren bandet på 25 NT. ytterligere spor tilgjengelig i supplerende figur 1. (I) representative spor av en FERSK isolert RNA-prøve (øverst), en prøve fryse-tint 25x på tørr is (andre plott), en prøve til venstre for 4 timer på benken (tredje plott), og et utvalg behandlet med RNase a (nederst plot). Merk fullstendig degradering av RNA ved tilsetning av RNase A. (J) RT-PCR gel fra kits som merket for bru1 og rp49. Den relative intensiteten av bru1 bandet normalisert mot rp49 er plottet nedenfor. Feil stolper = SEM (ikke-sammenkoblet t-test, p = 0,0119). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: anvendelse av IFM dissections å undersøke Bruno1 funksjon i alternativ skjøting. (A) vulkanen tomten av MRNA-SEQ data (Gen enhet) fra IFMs dissekert på 72 h APF. Gener som er signifikant differensielt regulert mellom bru1-IR og wildtype IFM (padj < 0,05, ABS (log2FC) > 1.5) er vist i blått, og ikke-signifikante gener i grått. Sarkomerlengde proteiner er uthevet i rødt, og utvalgte gener er merket. (B) vulkan tomten av hele proteom masse massespektrometri resultater fra 1 d voksen IFMs. Proteiner signifikant forskjellig mellom brum2MUTANTER og wildtype (FDR < 0,05) er vist i blått, nonsignificant proteiner i grått. Sarcomeric proteiner er uthevet i rødt. Peptider som tilsvarer gener i (A) er merket med rødt. Sett med peptider kartlegging til ulike isoformene av samme protein er merket i samme farge. (C) ordningen av C-Terminus av MHC illustrerer distinkte transkripsjon isoformene og innsetting plassering av WeeP26 genet fellen (se supplerende metoder for innsettingspunkt). RT-PCR-primere er merket som svarte linjer over transkripsjoner. Lese teller per kilobase per million baser (RPKM) fra mRNA-SEQ er vist for IFMs dissekert fra wildtype for 30 h APF (appelsin) og 72 h APF (rød), fra bru1-IR (blåfarge) og Salm-/- (cyan) for 72 h APF og fra hele ben (grønn) for 72 h APF . (D) RT-PCR med primere mot MHC viser isoformen bryteren i IFM mellom 30 h APF og senere tidspunkter. Den ekson 34-35 skjøte hendelsen er bare svakt observert i bruM3mutant IFM eller i voksen beinet. (E) konfokalmikroskopi bilder av weeP26 GFP lokalisering i wildtype IFM SARCOMERES på 48 h APF og 90 h APF SAMMENLIGNET med 90 h APF beinet muskel. Skala stolper = 1 μm. (F) skjøte Junction kvantifisering fra MRNA-SEQ-data for genotyper og tidspunkter som merket. Junction leser presenteres som forholdet mellom en bestemt skjøte hendelse (ekson 34 til 35 i grått, 34 til 36 i lilla, og 34 til 37 i grønt) til totalt antall hendelser som deler ekson 34 skjøte donor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: (A, B, C) RNA gir fra prøver av samme genotype dissekert av samme forsker i samme uke. Etter at alle prøvene var dissekert, ble RNA isolert og målt samme dag. (A) Nanograms (ng) av total RNA innhentet fra IFM dissections per 1 d voksen fly. Feil stolper = SEM. (B) total RNA innhentet fra dissekert IFM per fly ved 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF og 1 d voksen. (C) total RNA isolert fra IFM dissekert fra 50 1 d voksen fluer ved hjelp av ulike utvinning metoder. (D) total RNA konsentrasjoner per fly fra dissekert Ben, hoppe muskel (TDT) og IFM. Mer RNA oppnås fra de større IFMs. Feilfelt = SD. (E) total RNA konsentrasjoner per fly av IFM dissekert fra Kontroller sammenlignet med RNAi eller mutant prøver på 30 h apf, 72 h APF og 1 d voksen. For mutanter ble w1118 brukt som wildtype kontroll. Mutant data er kompilert fra bru1-IR, Salm-/- og en annen RNA-bindende protein mutant. Merk at for disse manipulasjoner, er RNA rentene redusert i 1 d voksen på grunn av muskel atrofi og tap, slik at flere fluer må dissekert for å oppnå tilstrekkelige mengder for omics tilnærminger. Feil stolper = SD. (F) ytterligere spor som viser RNA-INTEGRITET for RNA isolasjons metodene vist i Figur 4G og i supplerende figur 1C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Methods
Supplerende metoder: En detaljert beskrivelse av metodene og reagensene som brukes i hele teksten, og i særdeleshet for å generere dataene som vises i figur 1A-D, Figur 4F-K, figur 5, supplerende tabell 1og Tilleggs tabell 2. Disse dataene motiverer disseksjon protokollen og demonstrerer dens nytte for RNA-isolering, mRNA-SEQ, RT-PCR og Proteomikk. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Relatert til figur 5 og tilhørende avsnitt i hoved teksten
Navn på fane Sammendrag av data
Sarkomerlengde proteiner Liste over sarkomerlengde gener fra Spletter et al. devig 2018; Her har vi en liste over gjeldende FBgn og gen navn.
SP-genet units_DESeq2_72h Bruke data fra Spletter et al. EMBO rep 2015, vi så spesielt på sarkomerlengde gener i mRNA-SEQ data på 72 h APF. Dette er fra DESeq2 analyse oppdage differensial uttrykk på genet enhet nivå mellom kontroll (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA krysset til w1118) og Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. Rader uthevet i gult er signficantly opp eller ned regulerte gener (over/under en terskel på log2FC = ABS (1.5)). Disse dataene er det røde prikk overlegget i figur 5A. For hvert sarkomerlengde gen gir vi identifikasjonsinformasjon, log2FC fra DESeq2, P-verdi og justert P-verdi, i tillegg til DESeq2 normalisert uttrykks antall.
SP exon_DEXSeq_72h Bruke data fra Spletter et al. EMBO rep 2015, vi så spesielt på sarkomerlengde gen ekson bruk i mRNA-SEQ data på 72 h APF. Dette er fra DEXSeq analyse oppdage differensial ekson bruk mellom kontroll (Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA krysset til w1118) og Mef2-Gal4, UAS-GFM-GMA x Bruno1-IR. Rader uthevet i gult er signficantly opp eller ned regulert exoner (over/under en terskel på log2FC = ABS (1.5)). Vi gir ekson og gen ID informasjon, log2FC fra DEXSeq, P verdi og justert P verdi, samt en liste over tilknyttede transkripsjoner.
Vær oppmerksom på at mange gener viser regulering av en eller flere exoner i DEXSeq analyse, ofte med høy log2FC verdier og lav P verdi/justere P verdier, mens en begrenset liste over gener viser endringer på 72 h APF. Dette støtter en sterk effekt av tap av Bruno på regulering av alternative skjøting.

Tilleggs tabell 1: tabell over 72 h APF mRNA-SEQ-data for sarkomerlengde proteiner som identifiserer differensielt uttrykte gener (via DESeq2) og exoner (via DEXSeq) i bru1-IR vs. wildtype IFMs.

Relatert til figur 5B og tilknyttede avsnitt i hoved teksten
Navn på fane Sammendrag av data
Perseus utgang Dette er en bearbeidet data regneark som presenterer massen massespektrometri data som brukes til å generere figur 5B. IFM prøvene er fra 1 d voksen kontroll (w1118) og mutant (bruno1-m2) fluer. Viktige kolonner er transformert intensitet verdier for hver av de 4 replikerer for hver prøve, t-test statistikk og betydning, peptid IDer og tilsvarende gen navn og flybase IDer. Signifance ble beregnet ved hjelp av standardinnstillinger i Perseus (FDR <. 05). Det oppdages 1859 proteiner/peptider, hvorav 524 (28%) er signifikant forskjellig mellom prøvene.
Downregulated Disse er alle 252 proteiner/peptider fra Perseus output som er downregulated i bruno1-m2 mutant IFM. Ettersom flybase-ID-er og gen navnene er utdaterte, gir vi i tillegg gjeldende flybase-gen-ID og gen navn.
Upregulated Disse er alle 272 proteiner/peptider fra Perseus output som er upregulated i bruno1-m2 mutant IFM. Ettersom flybase-ID-er og gen navnene er utdaterte, gir vi i tillegg gjeldende flybase-gen-ID og gen navn.
Vær oppmerksom på at sarkomerlengde proteiner uthevet i rødt i figur 5B er til stede i listene ovenfor. Listen over gener som betraktes som en del av sarkomerlengde er tilgjengelig i en av kategoriene i supplerende tabell 1.

Tilleggs tabell 2: tabell over hele proteom masse massespektrometri data fra 1 d voksen som identifiserer differensielt uttrykte proteiner og protein isoformene i brum2mutant vs. wildtype IFMs.

Discussion

Inne denne protokollen, vi gave det grunn-teknikk å analysere Drosophila IFMs fra tidlig og sen-scene pupae for nedstrøms isolasjon av PROTEIN, DNA, RNA eller annet makromolekyler. Protokollen kan enkelt tilpasses til å analysere IFM fra voksen fluer. Vi viser nytten av vår disseksjon-protokoll for mRNA-SEQ-, Proteomikk-og RT-PCR-applikasjoner. Med kontinuerlig forbedring av omics teknologier for å muliggjøre analyse av prøver med mindre Start materiale og lavere inn data konsentrasjoner, vil disse dissections trolig bli verdifulle for mange tilleggsprogrammer. Som IFMs er en etablert modell for Human myopatier4,24 og muskel-type spesifikk utvikling9,12, vi ser for eksempel, IFM-beriket Plantemetabolomikk, undersøkelser av kromatin konformasjon via 3C eller 4C, skjøting nettverks evaluering via CLiP interaksjoner eller fosfat-Proteomikk av myofibrillogenesis.

Det er viktig å tenke på at disse dissections produsere en prøve beriket for IFM stedet for en ren IFM prøve. Dette er uunngåelig på grunn av motorisk Nevron innervasjon, sene vedlegg og tracheal invasjon av muskelfibre. Bioinformatikk analyse kan brukes til å identifisere IFM beriket gener eller proteiner, men ytterligere eksperimenter er nødvendig for å demonstrere at de faktisk er IFM-spesifikke. Sample renhet kan være analyseres ved hjelp av publiserte vev-spesifikke markører som stripe45 (sene),Act79B 4,44 (rørformede muskelen), Act88F15 (IFM), eller Syb46 (neuronal spesifikke). Det kan være mulig å bruke slike markører for å normalisere datasett til IFM-spesifikt innhold, men brukere advares om at timelige endringer i uttrykk for gener som brukes til normalisering, for eksempel av IFM-spesifikke gener eller tubulin, kan være en slik tilnærming.

Genetisk kodet vev-spesifikke merkings metoder, for eksempel EC-tagging47,48 eller PABP-merking49,50 for å isolere RNA har blitt utviklet i de senere år, noe som kan bidra til å oppnå en virkelig av en vevs spesifikk RNA-prøve. Men EC-merking krever konstant mating av fluer47 og dermed ikke er aktuelt under puppestadiet stadier. Følsomheten og fullstendigheten av PABP-merket transcriptomes kan ha begrensninger51. FACS tilnærminger for å isolere enkelte muskelfibre er komplisert av den store størrelsen og syncytial natur IFMs. Intakt52,53 stil tilnærminger kan brukes til å isolere spesifikke subcellulære-rom fra IFMs, som kan være nyttig for å isolere rene populasjoner av IFM kjerner eller mitokondrier. Manuell dissections er fortsatt gjeldende standard for å oppnå intakt IFM vev for de fleste nedstrøms applikasjoner.

Prøvekvaliteten avhenger av flere kritiske trinn i disseksjon prosessen. Dissections er teknisk krevende, med disseksjon hastighet og prøve renhet som øker med erfaring. Dissekere for korte perioder (20-30 min) i kjølt buffer uten vaskemiddel og umiddelbart frysing bidrar til å bevare prøve integritet, som har vært observert tidligere for musen sene isolasjon54. IFMs kan med hell tørr-frosset etter fjerner alle buffer fra pellet, men spesielt for RNA isolasjon, fryser prøver i isolasjon buffer har en tendens til å gi bedre resultater. IFMs fra opptil 20 separate dissections kombineres før RNA eller protein isolering, slik at skalering opp og samle nok materiale, selv fra tidlig tidspunkter eller mutanter16,32, for nedstrøms analyse.

For RNA-programmer kan det mest kritiske trinnet være isolering av RNA-en selv. Guanidiniumklorid ammoniumthiocyanat – fenol-kloroform isolering (metode 1 ovenfor) overgår de fleste kommersielle settene som er testet og, som tidligere nevnt, er betydelig rimeligere55. Variasjonen observert i RNA isolering gir med kommersielle kits er i overensstemmelse med tidligere observasjoner56,57. Vi legger ytterligere glykogen under isopropanol nedbør for å hjelpe gjenopprette alle RNA. Utover RNA-utbyttet er det viktig å verifisere RNA-integriteten for å sikre at prøven ikke har blitt fragmentert eller degradert under disseksjon-og isolasjons prosessene. Det er også viktig å jobbe RNase-Free. Endelig, valg av RT-Kit kan påvirke følsomheten til den omvendte transkripsjon prosessen. Selv om det ikke ofte diskutert i detalj, alle disse punktene påvirke kvaliteten på IFM prøven og data innhentet fra nedstrøms applikasjoner.

Flere viktige modifikasjoner sette protokollen bortsett fra eksisterende IFM disseksjon protokoller. Selv om en detaljert disseksjon protokoll for IFM immunofluorescence eksisterer19, denne protokollen presenterer en annen tilnærming til puppestadiet dissections som gjør at mer rask isolering av IFM vev. Dette gjør det mulig samling av store mengder IFM vev (relativt sett) med begrenset disseksjon ganger for å hindre proteom eller transcriptome endringer. Andre protokoller beskriver Disseksjon av voksen IFM for visualisering GFP farging i individuelle myofibrils39 eller for farging av larvestadiet Body-wall muskler58, men de ikke ta disseksjon på puppestadiet stadier eller for isolering av RNA eller protein. Denne tilnærmingen er også forskjellig fra den eksisterende protokollen for microdissection av puppestadiet IFMs fra cryosections38, som kan generere en renere IFM prøve, men er mer arbeidsintensiv og produserer mindre materiale. I forhold til andre raske voksne IFM disseksjon protokoller38,39, IFMs er isolert i PBS buffer uten vaskemiddel å begrense stress induksjon og andre store uttrykk endringer.

Nøkkelen forhånd i denne protokollen er inkluderingen av en live, fluorescerende reporter, slik isolering av IFMs ved tidlig puppestadiet stadier. Vi Standardly bruke Mef2-GAL459 kjører enten UAS-CD8:: GFP eller UAS-GFP:: GMA60. Dette gjør at differensial merking av IFM (fly musklene er sterkere merket og annerledes formet enn andre puppestadiet muskler) samt ytelse av GAL4-UAS-baserte manipulasjoner, for eksempel redning eller RNAi eksperimenter. Det er også mulig å kombinere Mef2-GAL4 med badekar-GAL80TS å unngå RNAi-assosiert tidlig dødelighet eller med UAS-Dcr2 å øke RNAi effektivitet40.

Der er i tillegg GAL4 sjåførene eller GFP-linjer anvendelig det variere inne muskelen-type spesifisitet, Temporal gjengivelsen mønster, og sjåfør styrke19,61 det kanskje bli brukt istedet for Mef2-GAL4. For eksempel er Act88F-GAL4 først uttrykt rundt 24 h APF, slik at den ikke kan brukes til tidligere tidspunkter; men det sterkt etiketter IFM og kan være nyttig for å unngå RNAi-assosiert tidlig dødelighet. Ham-GFP eller Act88F-GFP Label IFM, igjen med timelige restriksjoner, men de unngår GAL4 avhengighet av markør uttrykk og kan være nyttig i kombinasjon med en mutert bakgrunn av interesse. Lister over andre mulige markerings linjer er tilgjengelige19. Det bør også bemerkes at bruk av transgenes og GAL4/UAS systemet kan forårsake genuttrykk gjenstander, så det er viktig å bruke egnede kontroller, for eksempel sjåføren linjen krysset til vill-type bakgrunn belastning, slik at slike gjenstander er antagelig det samme i alle prøvene.

Med den med følgende videoen, denne detaljerte protokollen tar sikte på å gjøre puppestadiet IFM disseksjon mer tilgjengelig og fremme bruken av omics tilnærminger for å studere muskelutvikling. Kobling kraften i Drosophila genetikk og cellebiologi med biokjemi og omics analyser tilgjengelig gjennom dissekert IFM har potensial til å fremme mekanistisk forståelse av myogenesis og muskel funksjon. Fremtidige studier knytte systemer-nivå observasjoner av transcriptome og proteom regulering til metabolske og funksjonelle utganger vil gi en dypere forståelse av muskel-type spesifikk utvikling og patogenesen av muskellidelser.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for Andreas Ladurner og Frank Schnorrer for generøs støtte. Vi takker Sandra Esser for utmerket teknisk assistanse og Akanksha Roy for generering av massen massespektrometri data. Vi erkjenner Bloomington og Wien lager sentre for å gi fluer. Vi takker Core Facility Bioimaging for hjelp med konfokalmikroskopi Imaging og Zentrallabor für Proteinanalytik for analyse av masse massespektrometri prøver, både på LMU Biomedical Center (Martinsried, DE). Vårt arbeid ble støttet av Deutsche Forschungs gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated protein Science Munich (CIPSM) ved Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS), og den internasjonale Max Planck Research School (EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x High Fidelity (HF) buffer Thermo Fisher F518L
60 mm culture dishes Sigma-Aldrich Z643084-600EA Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Black dissecting dish (glass) Augusta Laborbedarf 42021010 Lymphbecken, black glass, 4 cm x 4 cm
Black silicon dissecting dishes: activated charcoal powder Sigma-Aldrich C9157 Also available from most pharmacies
Black silicon dissecting dishes: Sylgard 184 Sigma-Aldrich 761036 Dishes are made by mixing the Sylgard (~50g) with activated charcoal powder (200 mg) and curing it in Petri dishes (~4 60 mm dishes).
Blue pestle Sigma-Aldrich Z359947-100EA Any pellet pestle that can sterilized, also can be used with a motor-driven grinder
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 Samsung SM-G960F/DS used for photos not taken under a microscope
Chloroform PanReac AppliChem A3691,0500
Confocal microscope, Leica SP8X upright confocal Leica www.leica-microsystems.com
Confocal microscope, Zeiss LSM 780 inverted confocal Zeiss www.zeiss.com
Double stick tape Scotch/3M 3M ID 70005108587 Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
EtOH (100%, RNase free) Sigma-Aldrich 32205-M
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 Leica www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC Leica www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2] Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3] Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4 Bloomington Stock Center BDSC:27390 Fly stock
Fly: salm[1] Bloomington Stock Center 3274 Fly stock
Fly: salm[FRT] Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR Vienna Drosophila Research Center GD41568 Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma Bloomington Stock Center BDSC:31776 Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP Bloomington Stock Center BDSC:5130 Fly stock
Fly: w[1118] Bloomington Stock Center 3605 Fly stock
Fly: weeP26 Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster ChromoTek gba488-100
Glycogen Invitrogen 10814-010
Image processing software, Photoshop CS6 Adobe www.adobe.com
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516-25ML 2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol Life Technologies 15596018 Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit Invitrogen AM1907 TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit Zymo Research R2070S RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System Promega Z6110 We applied the protocol for ‘Purification of RNA from Fibrous Tissues’.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit New England Biolabs T2010G We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 μL of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides Thermo Fisher 12342108 Standard slides, uncharged, 1 mm
Microtome blades PFM Medical 207500003 C35 feather 80 mm
Monarch DNase I New England Biolabs T2004-21
Monarch DNase I Reaction Buffer New England Biolabs T2005-21
Normal goat serum Thermo Fisher 16210072
OneTaq Polymerase New England Biolabs M0480X
Paintbrush Marabu 1910000000 Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS buffer (1x) Sigma-Aldrich P4417 Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips Elemental Scientific ES-7000-0101 Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Fisher F-530XL
Pipette tips Sigma-Aldrich P5161 Universal 200 mL pipette tips
Preomics iST 8x Kit Preomics P.O.00001 peptide preparation kit for mass spectrometry
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher 725500 mass spectrometry was performed at the Protein Analysis Unit of the LMU Biomedical Center
Qubit RNA Assay Kit Life Technologies Q32855
Rhodamine-phalloidin Invitrogen, Molecular Probes 10063052
RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop Thermo Fisher ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer Invitrogen Q33238
RNA Pico Chips Agilent Technologies 5067-1513
RNase A Promega A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758 DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit Invitrogen 18080-044 reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript New England Biolabs E3010S reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit Qiagen 205410 reverse transcription kit
Slide mounting buffer, Vectashield Vector Laboratories H-1200 containing DAPI
Statistical software: GraphPad Prism GraphPad Prism www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel Microsoft Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019
Table-top centrifuge Eppendorf 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes Sigma-Aldrich Z188956 Standard tissue wipes
Transfer pipette Sigma-Aldrich Z350796 Plastic pipette
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284-500ML
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper Sigma-Aldrich 1004-070 Filter paper circles, Grade 4, 70 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rexiati, M., Sun, M., Guo, W. Muscle-Specific Mis-Splicing and Heart Disease Exemplified by RBM20. Genes. 9 (1), 18 (2018).
  2. Guo, W., et al. RBM20, a gene for hereditary cardiomyopathy, regulates titin splicing. Nature Medicine. 18 (5), 766-773 (2012).
  3. Guo, W., et al. Splicing Factor RBM20 Regulates Transcriptional Network of Titin Associated and Calcium Handling Genes in The Heart. International Journal of Biological Sciences. 14 (4), 369-380 (2018).
  4. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Ravichandran, K., Wittner, A., Spletter, M. L. Conserved functions of RNA-binding proteins in muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 110, 29-49 (2019).
  5. Wang, E. T., et al. Dysregulation of mRNA Localization and Translation in Genetic Disease. The Journal of Neuroscience. 36 (45), 11418-11426 (2016).
  6. Wang, E. T., et al. Antagonistic regulation of mRNA expression and splicing by CELF and MBNL proteins. Genome Research. 25 (6), 858-871 (2015).
  7. Kalsotra, A., et al. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20333-20338 (2008).
  8. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. The EMBO Journal. 23 (15), 3103-3112 (2004).
  9. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mechanisms of Development. 144, Pt A 92-101 (2017).
  10. Iwamoto, H. Structure, function and evolution of insect flight muscle. Biophysics. 7, 21-28 (2011).
  11. Schnorrer, F., Dickson, B. J. Muscle building; mechanisms of myotube guidance and attachment site selection. Developmental Cell. 7 (1), 9-20 (2004).
  12. Spletter, M. L., Schnorrer, F. Transcriptional regulation and alternative splicing cooperate in muscle fiber-type specification in flies and mammals. Experimental Cell Research. 321 (1), 90-98 (2014).
  13. Benoist, P., Mas, J. A., Marco, R., Cervera, M. Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene. A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification. Journal of Biological Chemistry. 273 (13), 7538-7546 (1998).
  14. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  15. Bryantsev, A. L., et al. Extradenticle and Homothorax Control Adult Muscle Fiber Identity in Drosophila. Developmental Cell. 23 (3), 664-673 (2012).
  16. Spletter, M. L., et al. The RNA-binding protein Arrest (Bruno) regulates alternative splicing to enable myofibril maturation in Drosophila flight muscle. EMBO Reports. 16 (2), 178-191 (2015).
  17. Oas, S. T., Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Arrest is a regulator of fiber-specific alternative splicing in the indirect flight muscles of Drosophila. The Journal of Cell Biology. 206 (7), 895-908 (2014).
  18. Kim, J. H., Jin, P., Duan, R., Chen, E. H. ScienceDirect Mechanisms of myoblast fusion during muscle development. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 162-170 (2015).
  19. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), San Diego, Calif. 2-14 (2014).
  20. Rai, M., Nongthomba, U., Grounds, M. D. Skeletal Muscle Degeneration and Regeneration in Mice and Flies. Mechanisms of Regeneration. 108, Elsevier Inc. 247-281 (2014).
  21. Swank, D. M., Wells, L., Kronert, W. A., Morrill, G. E., Bernstein, S. I. Determining structure/function relationships for sarcomeric myosin heavy chain by genetic and transgenic manipulation of Drosophila. Microscopy Research and Technique. 50 (6), 430-442 (2000).
  22. de Joussineau, C., Bataillé, L., Jagla, T., Jagla, K. Diversification of muscle types in Drosophila: upstream and downstream of identity genes. Current Topics in Developmental Biology. 98, 277-301 (2012).
  23. Maqbool, T., Jagla, K. Genetic control of muscle development: learning from Drosophila. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 28 (7-8), 397-407 (2008).
  24. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: Emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Seminars in Cell & Developmental Biology. 64, 171-180 (2017).
  25. Haigh, S. E., et al. Drosophila indirect flight muscle specific Act88F actin mutants as a model system for studying congenital myopathies of the human ACTA1 skeletal muscle actin gene. Neuromuscular Disorders. 20 (6), 363-374 (2010).
  26. Batonnet-Pichon, S., et al. Myofibrillar Myopathies: New Perspectives from Animal Models to Potential Therapeutic Approaches. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (1), 1-15 (2017).
  27. Kreipke, R. E., Kwon, Y. V., Shcherbata, H. R., Ruohola-Baker, H. Drosophila melanogaster as a Model of Muscle Degeneration Disorders. Current Topics in Developmental Biology. 121, 83-109 (2017).
  28. Souidi, A., Zmojdzian, M., Jagla, K. Dissecting Pathogenetic Mechanisms and Therapeutic Strategies in Drosophila Models of Myotonic Dystrophy Type 1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4104 (2018).
  29. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other Model Organisms for Sarcomeric Muscle Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 642, 192-206 (2008).
  30. Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1184, 1-20 (2010).
  31. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  32. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, 1361 (2018).
  33. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Current Biology. 24 (7), 705-716 (2014).
  34. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Seminars in Cell & Developmental Biology. 72, 56-66 (2017).
  35. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  36. Zappia, M. P., Rogers, A., Islam, A. B. M. M. K., Frolov, M. V. Rbf Activates the Myogenic Transcriptional Program to Promote Skeletal Muscle Differentiation. Cell Reports. 26 (3), 702-719 (2019).
  37. Zappia, M. P., Frolov, M. V. E2F function in muscle growth is necessary and sufficient for viability in Drosophila. Nature Communications. 7 (1), 10509 (2016).
  38. Bryantsev, A. L., et al. Myogenesis in Drosophila melanogaster: Dissection of Distinct Muscle Types for Molecular Analysis. Methods in Molecular Biology. 1889 (5), 267-281 (2019).
  39. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  40. Kaya-Çopur, A., Schnorrer, F. RNA Interference Screening for Genes Regulating Drosophila Muscle Morphogenesis. Myogenesis. 1889, Chapter 20 331-348 (2019).
  41. Chechenova, M. B., et al. Functional redundancy and non-redundancy between two Troponin C isoforms in Drosophila adult muscles. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 760-770 (2017).
  42. Alberts, B. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York, NY. (2017).
  43. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green fluorescent protein tagging Drosophila proteins at their native genomic loci with small P elements. Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  44. Orfanos, Z., Sparrow, J. C. Myosin isoform switching during assembly of the Drosophila flight muscle thick filament lattice. Journal of Cell Science. 126 (1), 139-148 (2013).
  45. Volohonsky, G., Edenfeld, G., Klambt, C., Volk, T. Muscle-dependent maturation of tendon cells is induced by post-transcriptional regulation of stripeA. Development. 134 (2), 347-356 (2007).
  46. Estes, P. S., Ho, G. L., Narayanan, R., Ramaswami, M. Synaptic localization and restricted diffusion of a Drosophila neuronal synaptobrevin--green fluorescent protein chimera in vivo. Journal of Neurogenetics. 13 (4), 233-255 (2000).
  47. Hida, N., et al. EC-tagging allows cell type-specific RNA analysis. Nucleic Acids Research. 45 (15), 138 (2017).
  48. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PLoS ONE. 7 (7), 40276 (2012).
  49. Yang, Z. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucleic Acids Research. 33 (17), 148 (2005).
  50. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  51. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 1775-1821 (2015).
  52. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9691-9704 (2012).
  53. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nature Protocols. 6 (1), 56-68 (2011).
  54. Grinstein, M., Dingwall, H. L., Shah, R. R., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A robust method for RNA extraction and purification from a single adult mouse tendon. PeerJ. 6 (8), 4664 (2018).
  55. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , (2012).
  56. Brown, R. A. M., et al. Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal. BMC Biotechnology. 18 (1), 16 (2018).
  57. Ford, K. L., et al. Optimisation of laboratory methods for whole transcriptomic RNA analyses in human left ventricular biopsies and blood samples of clinical relevance. PLoS ONE. 14 (3), 02136855 (2019).
  58. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harbor Protocols. (8), 5469 (2010).
  59. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Developmental Biology. 176 (1), 143-148 (1996).
  60. Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gómez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34 (1-2), 146-151 (2002).
  61. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. Journal of Visualized Experiments. (132), e57312 (2018).

Tags

Genetikk Drosophila utviklingsmessige biologi indirekte fly muskel Live disseksjon puppestadiet utvikling masse MASSESPEKTROMETRI RNA-SEQ RNA isolasjon Bruno1 alternative skjøting
Disseksjon av <em>Drosophila melanogaster</em> fly musklene for omics tilnærminger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kao, S. Y., Nikonova, E.,… More

Kao, S. Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (152), e60309, doi:10.3791/60309 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter