Myoblasts er voksende forløper celler som skiller å danne polynucleated myotubes og eventuelt skjelettlidelser muskel myofibers. Her presenterer vi en protokoll for effektiv isolering og kultur av primær myoblasts fra unge voksne mus skjelett muskler. Metoden muliggjør molekylær, genetisk, og metabolske studier av muskelceller i kulturen.
Primær myoblasts er udifferensierte voksende forløpere for skjelettlidelser muskel. De kan være kultivert og studert som muskel forløpere eller indusert å differensiere i senere stadier av muskelutvikling. Protokollen gitt her beskriver en robust metode for isolering og kultur av en svært proliferativ befolkning på myoblast celler fra unge voksen mus Skjelettmuskel explants. Disse cellene er nyttige for studiet av metabolske egenskaper av skjelettmuskulatur av forskjellige musemodeller, så vel som i andre nedstrøms applikasjoner som transfeksjoner med eksogene DNA eller Transduction med viral uttrykk vektorer. Nivået av differensiering og metabolsk profil av disse cellene avhenger av lengden på eksponering, og sammensetningen av mediene som brukes til å indusere myoblast differensiering. Disse metodene gir et robust system for studiet av mus muskel celle metabolisme ex vivo. I motsetning til in vivo-modeller, er metodene beskrevet her gir en celle befolkning som kan utvides og studert med høye nivåer av reproduserbarhet.
Mens ofte sitert som en indikasjon på total metabolsk helse, har flere studier vist at Body Mass Index (BMI) hos eldre voksne er ikke konsekvent forbundet med høyere risiko for dødelighet. Hittil, den eneste faktoren vist å være forenlig med redusert dødelighet i denne populasjonen er økt muskel masse1. Muskel vev representerer en av de største kildene til insulin-sensitive celler i kroppen, og er derfor kritisk i vedlikehold av samlede metabolske homeostase2. Aktivering av skjelettlidelser muskel vev via trening er forbundet med økninger i både lokale insulinfølsomhet og generell metabolsk helse3. Mens in vivo-modeller er avgjørende for å studere muskel fysiologi og virkningen av muskel funksjon på integrert metabolisme, primære kulturer av myotubes gi et medgjørlig system som reduserer kompleksiteten av dyrestudier.
Myoblasts avledet fra post-Natal muskler kan brukes til å studere virkningen av en rekke behandling og vekstforhold i en svært reproduserbar måte. Dette har lenge vært anerkjent og flere metoder for myoblast isolasjon og kultur har blitt beskrevet4,5,6,7,8,9. Noen av disse metodene bruker nyfødte muskler og gir relativt lavtantall myoblasts,som krever flere dyr for større skala studier. Også mest brukte metoder for dyrking myoblasts bruke “pre-plating” for å berike for myoblasts, som er mindre tilhenger enn andre celletyper. Vi har funnet den alternative berikelse metoden beskrevet her for å være mye mer effektiv og reproduserbar for berikende en svært proliferativ myoblast befolkning. Oppsummert muliggjør denne protokollen isolering av svært proliferativ myoblasts fra unge voksne muskel explants, via utvekst til kultur medier. Myoblasts kan høstes gjentatte ganger, over flere dager, raskt utvidet, og indusert å differensiere til myotubes. Denne protokollen reproduserbar genererer et stort antall sunne myoblast celler som robust differensiere til spontant rykninger myotubes. Det har gjort det mulig for oss å studere metabolisme og døgnrytme i primær myotubes av mus av en rekke genotyper. Til slutt inkluderer vi metoder for å utarbeide myotubes for studiet av oksidativt metabolisme, ved bruk av målinger av oksygen forbruks rater i 96 brønn plater.
Skjelettmuskel er avgjørende for etablering og vedlikehold av metabolske homeostase11. Studiet av muskel fysiologi er komplisert ved interindividuelle variasjon, så vel som vanskeligheter med å skaffe prøver, spesielt i tilfelle av menneskelige studier. Kultivert primære myotubes har vist å recapitulate mange funksjoner i muskel fysiologi, inkludert kalsium homeostase12, regenerering av skadede muskel vev5, metabolske forandringer som svar på …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for Dr. Matthew watt ved University of Melbourne og Dr. Anastasia Kralli ved Johns Hopkins University for hjelp til å vedta denne protokollen basert på arbeidet til Mokbel et al.6. Vi takker også Dr. Sabine Jordan for assistanse utvikle og vedta denne protokollen i laboratoriet vårt. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health R01s DK097164 og DK112927 til K.A.L.
Coating Solution: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
Plating Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
Myoblast Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
Differentiation Media: | |||
DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
Other Materials: | |||
PBS | Gibco | 14040133 | |
Gentamicin | Sigma | G1397 | |
TrypLE | Gibco | 12604013 | |
DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
Forceps | Any | ||
Razor Blades | Any | ||
Scissors | Any | ||
Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
Oxygen Consumption Rates: | |||
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |