Summary

Isolering og differensiering av primær Myoblasts fra mus skjelettlidelser Muscle Explants

Published: October 15, 2019
doi:

Summary

Myoblasts er voksende forløper celler som skiller å danne polynucleated myotubes og eventuelt skjelettlidelser muskel myofibers. Her presenterer vi en protokoll for effektiv isolering og kultur av primær myoblasts fra unge voksne mus skjelett muskler. Metoden muliggjør molekylær, genetisk, og metabolske studier av muskelceller i kulturen.

Abstract

Primær myoblasts er udifferensierte voksende forløpere for skjelettlidelser muskel. De kan være kultivert og studert som muskel forløpere eller indusert å differensiere i senere stadier av muskelutvikling. Protokollen gitt her beskriver en robust metode for isolering og kultur av en svært proliferativ befolkning på myoblast celler fra unge voksen mus Skjelettmuskel explants. Disse cellene er nyttige for studiet av metabolske egenskaper av skjelettmuskulatur av forskjellige musemodeller, så vel som i andre nedstrøms applikasjoner som transfeksjoner med eksogene DNA eller Transduction med viral uttrykk vektorer. Nivået av differensiering og metabolsk profil av disse cellene avhenger av lengden på eksponering, og sammensetningen av mediene som brukes til å indusere myoblast differensiering. Disse metodene gir et robust system for studiet av mus muskel celle metabolisme ex vivo. I motsetning til in vivo-modeller, er metodene beskrevet her gir en celle befolkning som kan utvides og studert med høye nivåer av reproduserbarhet.

Introduction

Mens ofte sitert som en indikasjon på total metabolsk helse, har flere studier vist at Body Mass Index (BMI) hos eldre voksne er ikke konsekvent forbundet med høyere risiko for dødelighet. Hittil, den eneste faktoren vist å være forenlig med redusert dødelighet i denne populasjonen er økt muskel masse1. Muskel vev representerer en av de største kildene til insulin-sensitive celler i kroppen, og er derfor kritisk i vedlikehold av samlede metabolske homeostase2. Aktivering av skjelettlidelser muskel vev via trening er forbundet med økninger i både lokale insulinfølsomhet og generell metabolsk helse3. Mens in vivo-modeller er avgjørende for å studere muskel fysiologi og virkningen av muskel funksjon på integrert metabolisme, primære kulturer av myotubes gi et medgjørlig system som reduserer kompleksiteten av dyrestudier.

Myoblasts avledet fra post-Natal muskler kan brukes til å studere virkningen av en rekke behandling og vekstforhold i en svært reproduserbar måte. Dette har lenge vært anerkjent og flere metoder for myoblast isolasjon og kultur har blitt beskrevet4,5,6,7,8,9. Noen av disse metodene bruker nyfødte muskler og gir relativt lavtantall myoblasts,som krever flere dyr for større skala studier. Også mest brukte metoder for dyrking myoblasts bruke “pre-plating” for å berike for myoblasts, som er mindre tilhenger enn andre celletyper. Vi har funnet den alternative berikelse metoden beskrevet her for å være mye mer effektiv og reproduserbar for berikende en svært proliferativ myoblast befolkning. Oppsummert muliggjør denne protokollen isolering av svært proliferativ myoblasts fra unge voksne muskel explants, via utvekst til kultur medier. Myoblasts kan høstes gjentatte ganger, over flere dager, raskt utvidet, og indusert å differensiere til myotubes. Denne protokollen reproduserbar genererer et stort antall sunne myoblast celler som robust differensiere til spontant rykninger myotubes. Det har gjort det mulig for oss å studere metabolisme og døgnrytme i primær myotubes av mus av en rekke genotyper. Til slutt inkluderer vi metoder for å utarbeide myotubes for studiet av oksidativt metabolisme, ved bruk av målinger av oksygen forbruks rater i 96 brønn plater.

Protocol

Denne protokollen følger dyre omsorgen retningslinjer for Scripps Research. 1. innsamling og bearbeiding av muskel vev Explants Dagen før disseksjon, sterilisere alt disseksjon utstyr (pinsett, barberblad og saks) og forberede alle nødvendige medier: fosfat bufret saltvann (PBS), MB plating Media (12,5 mL DMEM, 12,5 mL av SKINKE F12, 20 mL av varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 5 mL fostervann væske medium supplement), og coating løsning (24 mL DMEM, 24 mL SKINKE F12,…

Representative Results

Etter § 1 i den oppgitte protokollen skal gi primære celler dukker opp fra explants som vil være synlig under et standard lys mikroskop (figur 2). En heterogen celle befolkning vil bli sett vokser ut av og rundt hver muskel vev explant. Myoblasts vises som små, runde, lyse kuler. Etter § 2 i protokollen vil gi tidlige avlinger av myoblasts fra vev explants, som vil inneholde noen celler og vil være heterogen (Figur 3). § 3…

Discussion

Skjelettmuskel er avgjørende for etablering og vedlikehold av metabolske homeostase11. Studiet av muskel fysiologi er komplisert ved interindividuelle variasjon, så vel som vanskeligheter med å skaffe prøver, spesielt i tilfelle av menneskelige studier. Kultivert primære myotubes har vist å recapitulate mange funksjoner i muskel fysiologi, inkludert kalsium homeostase12, regenerering av skadede muskel vev5, metabolske forandringer som svar på …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er takknemlige for Dr. Matthew watt ved University of Melbourne og Dr. Anastasia Kralli ved Johns Hopkins University for hjelp til å vedta denne protokollen basert på arbeidet til Mokbel et al.6. Vi takker også Dr. Sabine Jordan for assistanse utvikle og vedta denne protokollen i laboratoriet vårt. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health R01s DK097164 og DK112927 til K.A.L.

Materials

Coating Solution:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Collagen Life Technologies A1064401 1.7 mL
Matrigel Fisher CB40234A 1 mL
Plating Media:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBS Life Technologies 16000044 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax Life Technologies 12556023 5 mL
Myoblast Media:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBS Life Technologies 16000044 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax Life Technologies 12556023 5 mL
Differentiation Media:
DMEM Gibco 10569010 Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12 Lonza 12-615F Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum Sigma H1138 1.5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin Life Technologies 41400045 0.5 mL
Other Materials:
PBS Gibco 14040133
Gentamicin Sigma G1397
TrypLE Gibco 12604013
DMSO Sigma 472301 Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
Forceps Any
Razor Blades Any
Scissors Any
Whatman paper VWR 21427-648
60 mm plate VWR 734-2318
10 cm plate VWR 25382-428 (CS)
T25 Flasks ThermoFisher 156367
T75 Flasks ThermoFisher 156499
Centrifuge Tubes (15mL) BioPioneer CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Seahorse XFe96 Analyzer Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 96-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate Agilent 102720-100 components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acid Sigma P5585-10G for measurement of fatty acid oxidation
carnitine Sigma C0283-5G for measurement of fatty acid oxidation
Etomoxir Sigma E1905 for measurement of fatty acid oxidation
BSA Sigma A7030 used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation

References

  1. Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
  2. Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
  3. Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
  4. Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
  5. Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
  6. Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
  7. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  8. Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
  9. Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
  10. Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
  11. Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
  12. Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
  13. Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
  14. Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
  15. Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
  16. Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
  17. Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
  18. Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).

Play Video

Cite This Article
Vaughan, M., Lamia, K. A. Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants. J. Vis. Exp. (152), e60310, doi:10.3791/60310 (2019).

View Video