Summary
このプロトコルは、免疫学的シナプス形成とその後の分極分泌トラフィックの両方を免疫学的シナプスに向かって画像化する。細胞コンジュゲートは、超抗原パルスラジ細胞(抗原提示細胞として作用する)とユルカトクローン(エフェクターヘルパーTリンパ球として作用する)との間に形成された。
Abstract
この方法の目的は、免疫学的シナプス(IS)を生成し、抗原提示細胞(APC)とエフェクターヘルパーTリンパ球(Th)細胞によって形成される細胞間結合の一例であり、および第1段階に対応する画像を記録することである。IS の形成とその後の入稿イベント (APC と Th セルの両方で発生)これらのイベントは、最終的にISで偏光分泌につながります。このプロトコルでは、細胞シナプスモデルとして黄色ブドウ球菌E(SEE)パルスラジ細胞に挑戦したユルカト細胞が使用されたのは、この実験システムが生物学的現実に近いため(Th細胞-APCシナプスコンジュゲート)。ここで提示されるアプローチには、細胞間結合、タイムラプス取得、広視野蛍光顕微鏡(WFFM)、画像処理(取得後のデコンボリューション)が含まれます。これにより、画像の信号対雑音比(SNR)が向上し、時間分解能が向上し、新興シナプスコンジュゲートにおける複数のフルオロクロムの同期取得が可能となり、蛍光漂白が減少する。さらに、プロトコルは、エンドポイント細胞固定プロトコル(パラホルムアルデヒド、アセトンまたはメタノール)とよく一致しており、さらなる免疫蛍光染色および分析を可能にするであろう。このプロトコルは、レーザー走査共焦点顕微鏡(LSCM)やその他の最先端の顕微鏡技術とも互換性があります。主な注意事項として、Z 軸に沿ってフォーカス平面に対して正しい 90° の角度にあった T セル APC 境界(IS インタフェースと呼ばれる)のみを適切にイメージし、解析できます。Z次元および以下の画像解析におけるイメージングを簡素化する他の実験モデルが存在するが、これらのアプローチはAPCの複雑で不規則な表面をエミュレートせず、ISにおける非生理学的相互作用を促進する可能性がある。したがって、ここで使用される実験的アプローチは、ISで発生するいくつかの生物学的複雑さを再現し、直面するのに適しています。
Introduction
この方法の主な目的は、SEE超抗原とエフェクターTh細胞をパルスした抗原提示細胞(APC)によって形成された免疫学的シナプス(IS)細胞間コンジュゲートを生成し、免疫学的シナプス形成の第1段階に対応する画像を登録すること(APCとTh細胞の両方で起こる)を、最終的に偏光に導く。APC上のMHC-IIに結合した抗原に結合した抗原に結合した際のTリンパ球によるISの確立は、抗原特異的、体液性および細胞性免疫応答1、2に関与する極めて動的で可鍛性および重要なインスタンスを組織する。ISは、アクチン再編成プロセス3によって特徴付けられた特別な超分子活性化複合体(SMAC)パターンの形成によって定義される。APCを用いたTリンパ球によるIS構築では、ISに向かう分泌小胞の偏光がシナプスギャップにおける偏光分泌に関与しているように見える。この焦点を当てた機械は、Tリンパ球の重要な分泌エフェクターの役割の有効性を高めるために、Tリンパ球の重要な分泌エフェクタムの有効性を高めるために、免疫システムに明確に供給するように見えるが、非特異的なサイトカイン凝集刺激を減らしながら、無関係な標的細胞の死および活性化誘発細胞死(AICD)4を介してアポトーシス自殺。
ISの結果は、Tリンパ球とAPCの両方の性質上異なる。MHC-IIに関連する抗原を示すAPCとのTh細胞(典型的にはCD4+細胞)のシナプス接触は、T細胞の活性化(サイトカイン分泌、増殖など)を産生し、そして場合によっては、AICD4を介したアポトーシスを生じる。細胞傷害性Tリンパ球(CTL)(主にCD8+細胞)がMHC-Iに関連する抗原を提示するAPCと相互作用する場合、結果は抗原を有するCtLの前刺激またはそうでないかで異なる。したがって、APC上の抗原MHC-I複合体を同定するナイーブCtLは、標的細胞を破壊し、分裂させるために「プライミング」される。Primed CTLはまた、抗原特異的細胞駆除5、6を産生する標的細胞(すなわち、ウイルスまたは腫瘍細胞に感染した細胞)とのシナプスを確立する。
免疫シナプスにおけるエキソソームの偏光分泌は、関連する免疫応答7に関与する研究の発展的かつ挑戦的な領域である。抗原によるTCR刺激時に、ルミナル小胞(IRV)を運ぶ多小胞(MVB)がIS8、9(ビデオ1)に向かって偏光輸送を経験することが実証されています。シナプス膜におけるこれらのMVBの融合は、シナプス裂口8、10にエキソソームとしてIlVの脱顆粒および放出を誘導する。これは、APC11、TCR刺激CD4+リンパ芽球、およびプライムCtLとして作用するSEE超抗原被覆ラジ細胞に挑戦したTh型ユルカト細胞によって形成されたISで発生します。このように、ユルカト細胞によって作られたシナプスは、エキソソームの偏光分泌トラフィックを研究する貴重なモデルを構成する。さらに、数十年にわたる調査は、TCRシグナル伝達に関する多くの基本的な洞察が、形質転換されたT細胞株を用いた研究から来ており、実際にこれらのモデルシステムの最もよく知られているのは、ユルカト白血病T細胞株12であることが示されている。
完全に発達したISの形成は、Th細胞の活性化、素朴なCtLの活性化、または素数CtLによる標的細胞殺害を含むいくつかの重要な生物学的結果を生み出す。したがって、Tリンパ球によって確立された分泌ISには2つの主要なタイプがあり、これは非常に多様をもたらすが、同様に重要な、免疫エフェクター機能1、6、13である。一方、プライミング細胞傷害性Tリンパ球(CtL)からのISは、ISに向かって溶解顆粒(「分泌リソソーム」と呼ばれる)の急速な偏光(数秒から数分の範囲)を誘発する。溶解顆粒の脱顆粒は、プロアポトーシス分子であるシナプス裂け目14に分泌パーポリンおよびグランザイムを誘導する。分泌されたペルフォアリンおよびグランザイムは、その後、標的細胞15、16の殺害を誘導する。CTLは、標的細胞が殺されるにつれて、ほんの数分しか持続しない一時的なシナプスを発症する。これは、最適なCTLタスクが、多数の標的細胞3、17にできるだけ多くの致死的なストライキを配布するために迅速かつ一時的な接触を必要とするという状況によるものと考えられる。対照的に、Jurkat細胞などのThリンパ球は、安定した長期のIS(10〜30分から数時間まで)を生成し、これは刺激サイトカイン3、17の指向性および絶え間ない分泌の両方に必要であると思われるからである。サイトカインはまた分泌小胞で囲まれており、その一部(すなわち、IL-2、IFN-γ)はIS17および分泌への偏光輸送を経験する。ISの本質的な特徴の1つは、T細胞とAPCとの間の探索的、弱い、一過性の接触の形成であり、より強い相互作用および成熟したISの確立を生み出し得る可能性があり、TCRがコグネイト抗原-MHC複合体を識別し、適切な共刺激接続が確立されることを提供する5。最初の接触の始まりと成熟した、完全に生産的なISの創設の両方は、本質的に確率的、高速かつ非同期プロセス5、18です。さらに、細胞間コンジュゲート19の作成には頻度が乏しく、画像化技術の課題となる可能性があります(結果と議論のセクションを参照してください)。
Tリンパ球における微小管組織化センター(MTOC)と分泌顆粒の偏光を調べる上でのもう一つの主な課題は、特にCTにおいて、プロセス全体が速い(数秒から数分)ということです。 これらの事実を考慮すると、ほとんどの初期のアプローチは、APC/標的細胞とTリンパ球を共同で混合し、低速遠心分離によって収束する終点戦略に直面し、細胞間コンジュゲート作成を支持し、数分間インキュベートし、固定し、その後評価した。MTOCおよび/または分泌小胞のIS20に向けた移転.このアプローチには2つの重要な制限がある:活発な人身売買データが達成されておらず、高レベルのバックグラウンドMTOC/分泌顆粒偏光が得られた、おそらくIS設立18の確率的な性格によるものである。さらに、TCR刺激との間の任意の相関関係は、初期シグナル伝達イベント(すなわち、細胞内カルシウムが上昇し、アクチン再編成)と分泌小胞偏光との間に問題がある。従って、生細胞におけるISの適切なイメージングのための命令的な規定は、細胞間共役物質化を増強し、ISの生成を同期させ、可能であれば、定義された顕微鏡XYフィールドおよびZ位置における細胞コンジュゲートの確立を保証するために組み合わせる。これらすべての問題を回避するために、いくつかの戦略が開発されました。これらの方法、その利点と弱点を説明することは、この論文の範囲外です。これらの重要なポイント1、4、5、21に取り組む以前に公開されたレビューを参照してください。
Thリンパ球によって作られたISが長命であるという事実、そしてThリンパ球MTOCでは、リンパ管含有分泌顆粒およびMVBがIS22に移動し、ドッキングするのに数分から数時間かかるという状況は、Th-APC ISがここで説明するプロトコルを使用してイメージングするための理想的な候補となる。
Protocol
1. ラジ細胞を付着させるスライドの調製
- ウェルあたり150μLのフィブロネクチン(100μg/mL)を8マイクロウェルチャンバースライド(プラスチック底面スライド)に加え、37°Cで30分間1時間インキュベートします。この接着基板は、ラジ細胞をウェルボトム(ステップ2)に結合させ、ユルカート細胞(ステップ4)細胞との生きたコンジュゲートの形成、およびタイムラプス顕微鏡捕捉(ステップ6)を可能にし、その後、オプションのパラホルムアルデヒド(PFA)固定との互換性も有する(ステップ7)。
注:アセトン固定には、アセトンがプラスチックを溶解するので、フィブロネクチンの代わりにガラス底室スライドとポリL-リジン(20μg/mL)を使用してください。8マイクロウェルチャンバースライド(1 cm2ウェル、最大容積300°L)または同等のものは、柔軟で適切なフォーマットです。 - 200°L自動ピペットを使用してフィブロネクチンを吸引し、穏やかな振とうで2分間200μLのPBSでそれぞれをよく洗浄します。この洗濯をもう一度繰り返します。チャンバースライドは、4°Cで1〜2週間PBSでこの段階で保存することができます。
2. チャンバースライドへのラジ細胞の接着と7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)標識
- ラジ細胞の10 mL(1-2 x 106細胞/mL)を15mL、V底管にプレカルチャーで転写する。よく混ぜ、10°Lを使用して、ノイバウアーチャンバーまたは同等の細胞をカウントします。
- 残りの細胞を300 x gで遠心分離し、室温で5分間行います。吸気して上清を捨てる。
- 10%FCS、2 mM グルタミン、10 mM HEPES、100 U/mL ペニシリン、および 100 g/mL ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640を106細胞/mLの濃度で穏やかに再サスペンドします。次の式を使用します。
([ ]初期 x V初期= [ ]最終x V最終), ここで [ ]初期は初期細胞濃度を表し, V初期= 細胞懸濁液の初期体積, [ ] 最終 =最終細胞濃度, V最終= 細胞懸濁液の最終体積.
注:開始培養の細胞濃度に応じて、必要以上に多くの細胞を採取することが可能であるが、潜在的な問題を防ぐために、実験の終わりまで培養中の残りの細胞(37°)を維持することが重要である(ステップ2.6参照)。 - ラジ細胞に標識して、シナプス共役体形成中の同定を可能にする。本実験では、7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)標識がステップ2.4.2で行われる。
- 培養培地中のラジ細胞の必要数を2mLチューブに移す。8マイクロウェルチャンバースライドでは、合計1.6 mLのセルサスペンションが必要です(ウェルあたり200°L)。
- CMACは光に敏感なので、アルミ箔でチューブを覆って、CMACを10μMの最終濃度に加えます。2 x 105ラジ細胞を含む 200 μL は、1 cm2ウェルごとに必要です。したがって、8つのウェルを調製する必要がある場合は、1.6 x 106 Raji細胞が必要です。
注:ラジ細胞にセルトラッカーブルー(CMAC、UV励起、青色発光)でラジ細胞を標識すると、シナプスコンジュゲートが形成されるとTh細胞と区別されます。この色素はPFAおよびアセトン固定剤と互換性があり、さらなる免疫蛍光のプロシージャを可能にする。光の博覧会を避けるようにしてください。CMACを用いたプール内のラジ細胞の標識に続いて、フィブロネクチンコーティングチャンバースライドへのラジ細胞の接着前に再懸濁が行われ、異なるウェル間でCMACを有するラジ細胞の均質な標識が保証されます。
- CMAC染色細胞を再懸濁し、ステップ1.2.からチャンバースライド中のPBSの吸引後、ステップ1.1〜1.2で調製したフィブロネクチン被覆チャンバースライドの各ウェルに200μLの細胞懸濁液を転写する。チャンバースライドを37°Cでインキュベートし、5%CO2を30分-1時間でインキュベートします。
注:接着とCMACラベリングは、このステップで同時に発生し、時間を節約します。ラジ細胞はすぐに堆積し、播種する前に細胞懸濁液中の均質な濃度を維持するために注意が必要に注意する必要があることに注意してください。CMAC洗浄はステップ2.7でより簡単に行われるので、遠心分離によってこの段階でCMACを洗浄する必要はありません(標識されたRaji細胞がすでにチャンバースライドに付着している場合)。CMACは大過剰に細胞懸濁液中に存在するので、青色蛍光背景が高すぎて青染色細胞を区別できない。CMAC洗浄後のステップ2.7で細胞CMAC蛍光を確認してください。 - ラジ細胞が顕微鏡上のチャンバースライドの穏やかな揺れによって井戸の底に付着していることを確認してください。セルが互いにギャップを表示し、コンフルでないことを確認します(図1、中央パネル)。細胞合流の50〜60%が適切である。
- ほとんどの細胞がチャンバースライドに効率的に付着し、細胞の隙間が見られない場合は、温かい完全な媒体でそれぞれをよく洗い、200μLの自動ピペットで媒体を再中断して細胞過剰を剥離します。各リサスペンションステップの後に合流を確認します。
- 細胞が付着しない場合は、接着工程をもう一度繰り返し、接着時間や細胞数を増やします。
注:ここで停止し、チャンバスライドを37°Cでインキュベートし、5%CO2を一晩(O/N)、翌日にプロトコルを継続することができる。次の日、ラジ細胞が付着したままで、蛍光顕微鏡を用いてCMAC標識を付けていることを確認してください。
- 温かい補完RPMIで再びよくよくよく洗い、余分なCMACを排除し、蛍光顕微鏡で青色発光をチェックします(図1)。
注:浸漬油(粘着性および粘性)および高い開口油目標の使用を避けるために、超長距離(すなわち、20xまたは40x)の目的は、蛍光顕微鏡を使用してCMAC標識を迅速にチェックするために使用することができます。
3. CMACのパルス — ブドウ球菌エンテロトキシンEを有する標識ラジ細胞
- ブドウ球菌エンテロトキシンE(SEE, 1μg/mL)を各ウェルに加えます。SEEは、SEE凍結ストック(PBSで1mg/mL)から細胞培養培地(100μg/mLで作動溶液)で簡便に希釈することができます。200 μL マイクロウェルあたり 100x 作動溶液の 2 μL を使用します。
注意:このステップには手袋を使用し、使用した先端をバイオハザードボックスに処分します。 - チャンバースライドを37°Cでインキュベートし、5%CO2を少なくとも30分間インキュベートします。SEE 効果は、少なくとも 3 ~ 4 時間続く効果があります。
注:SEEは、個別のタイムラプス設定が計画されている場合(ステップ5)、および/または終点実験の開始時間点に応じて、必要に応じて異なる時点で井戸に追加することができます(ステップ6)。
4. ユルカート細胞の調製
- この実験では、以前に増殖したユルカット細胞(1-2 x 106細胞/mL)を用いる。前述の23のように、標準培養フラスコまたは標準エレクトロポレーションプロトコルに続く以前のトランスフェクションからの細胞を使用する。Jurkat細胞のトランスフェクションは、生きている細胞内の分泌顆粒のトラフィックのタイムラプス可視化を可能にします。例えば、GFP-CD63(MVBのマーカー)を表現すると、GFP-CD63装飾小胞の動きを記録することができます(ビデオ1)。
- 位相差顕微鏡で細胞を観察する。過剰な死細胞の場合 (>20-30%)観察される、標準プロトコル24を用いてフィコール密度勾配遠心分離を行い、使用前に死細胞の過剰を排除する(死細胞は生細胞よりも高密度を示す)(ディスカッション参照)。
- 細胞を15mLチューブ、V底管に移し、ヘモサイトメーターを使用して計数するために10°Lを使用します。
- ステップ2.2で説明したように残りの細胞を遠心分離する。上清を廃棄し、新鮮で温かい培養培地を用いてラジ細胞(1x 106/mL)と同じ濃度で細胞を再サスペンドする。手順 2.2~ 2.3 に従います。
- ステップ4を待つ間、培養中のJurkat細胞(37°、5%CO2)を維持します。
注:2番目のオプション(トランスフェクション)では、生きている細胞の数は最初の細胞よりもはるかに少なくなります。したがって、実験に十分な細胞を持つために、より高い開始細胞培養量を使用することを検討してください。エレクトロポレーションキュベットおよびトランスフェクションあたり10 x 106 Jurkat細胞から、トランスフェクションの48時間後に生き残る2-4 x 106 Jurkat細胞のみが生き残り、これらの細胞の一部はフィコールステップ中に失われます。したがって、1つのエレクトロポレーションキュベットは、一般に、8マイクロウェル(1.6 x 106トランスフェクトされたJurkat細胞)から付着したSEEパルスラジ細胞に挑戦するのに十分である。
5. ラジ細胞とユルカト細胞の共同播種
- CMAC標識、SEEパルス、付着Raji細胞を含むチャンバースライドをステップ3.2からインキュベーターから取り出します。これはステップ 2.7 で以前に行われたため、この段階で CMAC を洗浄する必要はありません。
- 自動200°Lピペットを使用して井戸の一角から、各井戸の培養培地を1つずつ慎重に吸引する。よく媒体を完全に乾燥させないでください。
- 直ちに、ステップ4.5で調製した細胞培養培地(1 x 106/mL)の再懸濁ユルカット細胞の200μLに培地を交換します。タイムラプスイメージングが行われる場合、Jurkat細胞は堆積物を形成し、シナプスコンジュゲートを形成する傾向があるため、このステップの直後にステップ6に進みます。便宜上、SEEパルスを含むマイクロウェルは、この段階でJurkat細胞との播種を受け取らない付着Raji細胞を、Jurkat細胞とのその後の挑戦まで細胞培養培地で維持する必要があります。これにより、Jurkat細胞に対する後続のチャレンジが、追加のタイムラプスまたは逆運動、終点実験アプローチに対する回避的なアプローチが可能になります。
- タイムラプスが実行される場合は、すぐにステップ6に進みます。これは、37°Cで顕微鏡ステージインキュベーターまたは同等の1〜2時間の共培養を伴い、5%CO2はシナプス共役体形成および同時画像取得を可能にする。終点分析の場合、時間経過はないが、細胞を固定する前に顕微鏡を用いて共培養期間後のチェックコンジュゲート形成を予見する(図1参照)。
6. 新興シナプスコンジュゲートのタイムラプスイメージング
- イメージングの前に顕微鏡とインキュベーションチャンバーを準備します。ビデオ 1 に示す例では、詳細な顕微鏡の設定を図 2に示します。
注:タイムラプス実験が計画されている場合は、すべての顕微鏡設定と補体(周囲細胞培養室など)を、付着したRaji細胞を用いてチャンバースライドにユルカット懸濁液を追加する前に準備する必要があります。市販の顕微鏡 (材料の表) については、次の手順について説明します。しかしながら、細胞培養インキュベーターを備えた任意の反転蛍光顕微鏡を使用することができる。- 偏光トラフィックをイメージングする際は、60倍のオイル浸漬、高い開口を備えた顕微鏡を使用してください。
- 自動フォーカスシステムの電源が入っていることを確認し、オフセットを調整して、底面にバインドされたRajiセルに焦点を合わせます。図 1、ビデオ1、およびビデオ 2を参照してください。
- ステップ5.3で付着したRaji細胞を含む各ウェルにJurkatを加えた後、予熱(1-2時間)顕微鏡ステージインキュベーター(すなわちOKOlab)上のマイクロウェルチャンバースライドを素早く見つけ、顕微鏡でいくつかのXY位置を選択し、そのフィールド例えば、ユルカットトランスフェクト細胞が顕微鏡の焦点に落ちて作られた新しいIS形成を記録する可能性が高い。
- 温度安定化ステージが安定したX,Y,Z位置を維持することが観察されたので、予熱顕微鏡ステージインキュベーターを使用してください。便利なXYフィールドの基準は、よく焦点を当てた非コンフルエントラジ細胞(すなわち、細胞間のギャップを表示する)とトランスフェクトされたJurkat細胞の存在(これは透過率とUVまたはGFPチャネルを組み合わせることによって確認することができます)です。Jurkat細胞はチャンバースライド上で非常に迅速に(数分)堆積し、新しいシナプスを画像化する機会は時間とともに減少します(図1)。定義された時間経過後に実験を終了するか、ステップ7に進み、その後の免疫蛍光および分析のためにコンジュゲートを固定することができます。
注:適切な時間分解能(フレームあたり1〜2分)で同時にマルチウェルタイムラプス取得のために最大4つの異なるマイクロウェルから最大16の異なる顕微鏡フィールドを選択することが可能です。この制限は、画像化される多様なフルオロクロムの数と強度(カメラの博覧会に影響を与える)の両方に依存します(CMACを除いて発現した蛍光タンパク質の数に依存します)。フレームレートを上げる 1 つの方法は、GFP の各 "n" 時間枠 (図2に示すように n = 8) のうち 1 つだけで CMAC チャネルを記録することです。さらに、これは頻繁な紫外線暴露が細胞を損傷する可能性があるため、細胞の生存率に利益をもたらす。MVB の偏光が完了するまでに数分から数時間かかるため、時間枠レートを 1 分ごと 1 分ごと (ビデオ1のフレームあたり 20 秒) に調整してください。この多チャンネルキャプチャを実行するには、電動エピ蛍光タレットと適切なバンドパス蛍光フィルタまたは同等物を搭載した顕微鏡が必要です。
7. シナプスコンジュゲートと固定の終点形成
- エンドポイント実験のみが計画されている場合(シナプスコンジュゲート形成を可能にする1〜2時間のインキュベーションが適切である)、37°Cでチャンバースライドをインキュベートし、1〜2時間の5%CO2を培養期間後にコンジュゲート形成をチェックし(図1参照)、続いて、アセトンまたはPFAでコンジュゲートを固定する(固定は抗原に依存する)。この場合、インキュベーションは顕微鏡段階インキュベーターを必要としない。例については、ビデオ3を参照してください。
- 細胞を固定するには、FCSなしで温かいRPMI(37°)培地で穏やかに振とうして井戸を洗浄する(血清からのアルブミンはアセトン固定で沈殿することがある)。吸引し、各井戸にPFAまたは予冷アセトンの200°Lを追加します。室温(RT)または氷上でチャンバースライドをそれぞれ20分間インキュベートします。
注:アセトン固定の場合は、-20°Cでアセトンを事前に冷やし、チャンバースライドを4°Cで事前に冷やします。アセトンを使用して8ウェルガラス底のチャンバースライドで培養した細胞を固定する場合は、プラスチック製の蓋を取り外します。 - PBSで各ウェルを2回洗い、200°Lの焼入れ溶液(PBS、50 mM NH4Cl)を加えます。チャンバースライドを4°Cでインキュベートします。
注:この段階では、チャンバースライドは、説明に従って、免疫蛍光プロトコルを実行する前に、4°Cで少なくとも1ヶ月間滞在することができる。ふたは蒸発を防ぐ。
8. 画像処理
- タイムラプスシリーズおよび/または固定細胞の静止画の取得後画像デコンボリューション(すなわちホイヘンスデコンボリューションまたは同等の、材料の表)を実行します。適切なソフトウェア(すなわち、ホイヘンスの「広視野」光学オプションを使用して)と正しい光学パラメータを採用することにより、デコンボリュート。デコンボリューションは、顕微鏡4の測定点広がり関数(PSF)の画像処理に必要である。
- あるいは、顕微鏡ファイルからメタデータの中に含まれる光学パラメータの自動ロードによって理想化されたPSFを計算するためにソフトウェアを使用してください。これらの光学パラメータは、フルオロクロム波長、屈折率、目的の開口数、およびイメージング技術(共焦点、広視野など)を含む4.
- その後、イメージングソフトウェアは、PSFと多様なデコンボリューションアルゴリズム(すなわち、HuygensソフトウェアのQMLEおよびCMLE)を段階的に累積的に計算するプロセスを使用し、その結果はユーザーが必要とする場合に継続的に視覚化および停止(または再開)することができます。この段階で、ユーザーは畳み込みの数や信号対雑音比を変更し、デコンボリューションを再開することができます。デコンボリューションソフトウェアは、タイムラプスシリーズ(X、Y、T)(ビデオ2)とZスタック(X、Y、Z)(ビデオ3)でうまく動作します。その後、デコンボリュートされたチャネルはCMACにマージされ、生チャネルは、細胞質、拡散フルオロクロムはデコンボリューション4、9によって改善されないのでである。
Representative Results
我々は、ユルカト・ラジ免疫シナプス共役体を生成し、IS形成の初期段階を適切に画像化するために、記載されたプロトコルに従った。我々の目的は、MTOCの偏光とISに向けた分泌機械の研究に先立って続いた初期のアプローチ20を改善するかった。これらのアプローチは、これらの戦略では、混合された遠心分離細胞のペレットではIS形成義務が生じたが、顕微鏡では起こらなかったため、IS形成または初期シナプス事象のイメージングを可能にしなかった終点戦略に基づいていた。我々のプロトコルは、この主な注意点を避けるように設計された、アプローチは、適切な細胞濃度(ステップ2および3)の使用に基づいてあったので、独自の顕微鏡室スライド(8マイクロウェルチャンバースライド)上の細胞間ISコンジュゲートの形成を支持し、予熱顕微鏡ステージインキュベーター(ステップ4)に取り付けた。この戦略は、IS形成を誘導し、同時にタイムラプスイメージングキャプチャ(ビデオ1)に。
図1は、プロトコルに続いて得られたシナプスユルカート・ラジコンジュゲートを表す(ステップ5.2)。画像は、代表的なタイムラプス実験からの最初のフレームを表す。2 x 105ラジ細胞および 2 x 105 Jurkat細胞を1cm2ウェルに添加した。上部パネルは透過率チャネルを示し、中央パネルはCMAC(青)チャネル(Rajiセル)で構成され、下側のパネルは透過率とCMAC結合チャネルの両方を示しています。黄色の矢印は、いくつかのシナプスコンジュゲートを参照としてラベル付けし、緑色の矢印は、1つのJurkat細胞といくつかのRaji細胞(複合コンジュゲート)によって作られたシナプスコンジュゲートを示します。細胞濃度(1cm2ウェル内の105以下の細胞)を減少させることは、複雑な細胞コンジュゲートの形成を回避しますが、その後の偏光トラフィックの分析に十分な細胞コンジュゲートがない可能性があり(下記参照)、シナプスコンジュゲートを見つけて画像化する機会も減少します。
図2は、ビデオ1に対応する代表的なタイムラプス実験において適切なソフトウェア(すなわち、NIKONNIS_AR)を用いて2つの異なるフルオロクロム(CMACおよびGFP-CD63)の同時捕捉に用いられる撮像パラメータに対応するスクリーンショットを表す。
ビデオ1(免疫学的シナプス、生)は、GFP-CD63(多発性体-MVB、緑色小胞のマーカー)およびCMACで標識された1ジュルカット細胞と2ラジ細胞との間の二重シナプスの形成を表すユルカットTリンパ球を青色で表す(そのうちの1つは巻き込み中)。ユルカットセル内のシナプス領域に向かうMVBの同時移動が記録されました(GFP-CD63の場合は20秒ごとに1フレーム、ビデオ再生速度= 秒あたり2フレーム)。シナプスコンジュゲートを得て、上記のプロトコルに従って画像化した(ステップ6.2)。GFP-CD63およびCMAC蛍光チャネルの両方の同時捕捉は、適切なソフトウェア(すなわち、NIS-AR、材料のテーブル)を使用して行った。ビデオは、代表的なタイムラプス実験からの生データを表します。自動焦点系は、ガラス底部に結合したRaji細胞に対して適切なオフセットで定義し、実験に沿って安定した焦点を確保した。
ビデオ2(免疫学的シナプス、デコンボリューション後)はビデオ1に対応するが、GFP-CD63蛍光チャネル画像のデコンボリューションは、適切なデコンボリューションソフトウェア(すなわち、ホイヘンス)を用いて、「広視野」光学オプションと適切な光学パラメータを用いて行った(ステップ8)。このデコンボリュート・チャネルは、その後、CMAC の未加工チャネルにマージされました。信号対雑音比と画像の鮮明度の両方の改善は明らかです。デコンボリューションは、上述したように取得後に行った。デコンボリューションソフトウェアに関する具体的な詳細については、4を参照してください。
ビデオ3(免疫学的シナプス、固定および免疫蛍光染色後)は、プロトコルのステップ6後の固定ISコンジュゲートのZスタック(Zステップサイズ=0.8μm、5フレーム)を表す(アセトン固定)。固定後、F-アクチン(緑色)を可視化するためにファロイジンを用いて以下の標準プロトコル25に従って免疫蛍光を行い、抗CD63はMVB(マゼンタ)を可視化し、抗γチューブリンはMTOC(赤色)を可視化した。CMAC(青)はラジセルにラベルを付けます。続いてコンジュゲートをエピ蛍光によって画像化し、「広視野」光学オプションと適切な光学パラメータを用いて数チャンネルを減衰させた(ステップ7)。その後、デコンボルトされたチャネルは、異なるパネル(CMACプラス透過率-TRANS、CMACプラスファロジン、CMACプラスアンチCD63およびCMACプラスアンチγチューブリン)に示すように、CMAC、生チャネルにマージされた。白い矢印はシナプスにラベルを付け、緑色の矢印は MVB にラベルを付け、黄色の矢印は MTOC にラベルを付けます。MVBおよびMTOC偏光の詳細な定量は、他の25で説明されている。
ここで提示するアプローチは、細胞間コンジュゲートの形成と、同時に、広視野蛍光顕微鏡(WFFM)によるタイムラプス取得と画像処理(取得後のデコンボリューション)を伴う。この戦術は、画像の信号対雑音比(SNR)を改善し、その時間分解能を高め、新興シナプスコンジュゲート4におけるいくつかのフルオロクロムの同期取得を可能にした。さらに、プロトコルは、その後の終点細胞固定方法(パラホルムアルデヒド、アセトンまたはメタノール)とよく一致し、これはさらなる免疫蛍光染色および分析25を可能にするであろう(ビデオ3)。このプロトコルはまたレーザースキャン共焦点顕微鏡および他の最先端の顕微鏡技術と互換性がある。
図1:シナプスコンジュゲートの代表的な二重サイズ顕微鏡分野画像は、プロトコルに続く代表的なタイムラプス実験からの最初のフレームを表す。上部パネルには、透過率チャネル、中央パネル CMAC チャネル(Raji セル)、下部パネルの両方の結合チャネルが表示されます。黄色の矢印は、いくつかのシナプスコンジュゲートを参照としてラベル付けします。緑色の矢印は、複雑なシナプスコンジュゲート(すなわち、複数のRaji細胞を有するシナプスを確立する1つのJurkat細胞)を示す。40x EWD (0.6 NA) の目標でキャプチャされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:タイムラプス顕微鏡の設定この画像は、ビデオ1に対応する代表的なタイムラプス実験において適切なソフトウェア(すなわち、NIKONNIS_AR)を用いた2つの異なるフルオロクロム(CMACおよびGFP-CD63)の同時捕捉に用いられる撮像パラメータに対応するいくつかのスクリーンショットに対応する。GFP-CD63チャンネルの各フレームは20sごとにキャプチャされた。GFP チャネルの 8 フレームのうち UV チャネルの 1 つのフレームのみがキャプチャされ、実験に沿ってセルの生存率を維持しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:GFP-CD63を発現するユルカット細胞によって作られた免疫学的シナプス、生データ。細胞トラッカーブルー(CMAC、ブルー)で標識されたラジB細胞を30分間SEEでパルスし、GFP-CD638を発現するJurkat細胞とシナプスを形成した。GFP-CD63 および CMAC チャンネルに対応するタイムラプスがキャプチャされ(フレームあたり 20 秒、ビデオ再生速度 = 2 フレームあたり 2 フレーム)、代表的な例が示されています。60x PLAN APO (1.4 NA) の目的でキャプチャされます。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
ビデオ2:GFP-CD63を発現するユルカット細胞によって作られた免疫学的シナプスは、デコンボリューション後。ビデオ1と同じですが、画像はデコンボリューションソフトウェアを使用してデコンボレーションされました。シグナル対雑音比の向上とシャープネスの向上は、蛍光の焦点を外した汚染物質の除去に起因して明らかである。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
ビデオ3:固定および免疫染色免疫シナプス。画像は、プロトコルのステップ7以降の免疫蛍光の後の代表的な固定シナプスコンジュゲートを示す。CMAC(青)標識ラジ細胞、シナプスコンジュゲート(白矢印)を示す透過率(TRANS)、ファロイジン標識F-アクチン(緑)、抗CD63ラベルMVB(マゼンタ、緑色矢印)および抗γチューブリン標識MTOC(赤、黄色矢印)をそれぞれ示す。これらのチャネルは、エピ蛍光によって画像化され、示されているように減衰し、合併した。ビデオにはZスタック(Zステップサイズ= 0.8μm、5フレーム)が含まれています。白い矢印はシナプス接触領域にラベルを付け、緑色の矢印は MVB にラベルを付け、黄色の矢印は MTOC にラベルを付けます。このビデオを表示するには、ここをクリックしてください(右クリックしてダウンロードしてください)。
Discussion
このプロトコルの制限は、すべてのシナプスが理想的に光軸に垂直に向けるわけではないということです。この技術を使用して、免疫シナプスイメージングのための理想的な向きを予測および/または影響を与える方法はありません。この問題を解決するために、最終的に理想的な基準を満たさないランダムにキャプチャされたすべてのシナプスを後続の分析から除外します。これらのシナプスは、十分に、あまり頻繁ではありません。しかし、いくつかの実験的アプローチ4を使用してこの制限を回避することが可能です。
偏光CD63放出(脱顆粒)は、生細胞におけるCD63の細胞表面染色(CD63の細胞表面への再局在化)(透過していない固定されていない)、ステップ6の後、およびその後の洗浄および固定などの他の相補的な技術によって定量することができる。また、エキソソーム8、9及びナノ粒子トラッキング解析9、25によるエキソソーム定量に関するCD63放出を行うことができる。これらのアプローチは確かに我々のプロトコルと互換性があり、生細胞の細胞表面免疫蛍光の後に固定が行われている。
理想的な数の細胞(8ウェルチャンバースライドで1cm2ウェル)は、井戸の底部に効率的に付着するため、4 x 105細胞(2 x 105 Raji細胞と2 x 105 Jurkat細胞)であることがわかりました。プラスチック(フィブロネクチンを使用)、またはガラス底部(ポリL-リジンを使用)マイクロスライドへの結合効率は、通常問題ではない。細胞数が高いほど、付着した細胞間に隙間がなく、その後、複雑なシナプスコンジュゲート(図1)。どちらの状況も、単一の細胞間コンジュゲートを画像化する必要がある場合、例えば、MTOCまたは分泌顆粒偏光実験では望ましくありません。細胞の数が少ない場合、特にトランスフェクトされたJurkat細胞がシナプスを生成するためにAPCに挑戦する場合、コンジュゲートを見つける可能性が低くなる可能性があります。我々は、プロトコルの発症前に顕微鏡X/Yステージ上の所定の場所に温度安定化ステージインキュベーター(すなわち、ステージ/顕微鏡セットアップを安定させるために1-2時間前に)が適切なイメージングのために重要である安定したX、Y、Zパラメータを維持することを観察したことに注意してください。自動焦点システムは最終的に小さなZの変化を補償する。
エレクトロポレーションなどの特定の遺伝子伝達技術を使用して、Jurkatクローン(ビデオ1)において蛍光キメラタンパク質(すなわちGFP-CD63)を発現すると、エレクトロポレーション後にかなりの部分の細胞が死ぬ可能性があります。死細胞はシナプスを形成しないが、生きている細胞を超えるとトランスフェクトされた細胞が、生きているTh細胞によって作られたコンジュゲートの形成を妨げる可能性があるため、これは問題となる可能性がある。我々は、コンジュゲート形成ステップの前に標準プロトコルに従う密度勾配培地を用いてトランスフェクト培養物から死細胞を慎重に排除することで、適切に画像化する機会を増やすことができることを発見した。また、トランスフェクション効率が低い(<20%)これは、適度なコンジュゲート形成効率(約60%)25と組み合わせることで、トランスフェクトされた細胞によって作られたコンジュゲートを見つける確率を低下させるので、重要な注意点であり得る。これは、非トランスフェクトされた細胞を使用して終点実験とその後の固定でコンジュゲートを得る場合には問題ありません。8マイクロウェルチャンバースライドは、従来の免疫蛍光プロトコルと互換性があります。これにより、異なる目的を持つ上記のプロトコルの柔軟性が向上します。アセトンを使用した固定は、プラスチック底の井戸でチャンバースライドを使用する際に考慮すべき問題になる可能性があります。しかし、アセトン固定と互換性のあるガラス底を含む8マイクロウェル顕微鏡室スライドが市販されている。アセトンを使用して8マイクロウェルガラス底室スライドで培養した細胞を固定する場合は、プラスチック製の蓋を取り外します。
顕微鏡は、電動XYステージ、電動エピ蛍光タレットおよび自動焦点システム(例えば、パーフェクトフォーカスシステム)または同等のサプリメントを装備することをお勧めします。マルチウェル取得が必要な場合25、自動焦点システムは、実験に沿ってすべての安定した焦点を確保します。これまでの経験は、Raji細胞に適切なフォーカスオフセットを確立することにより、XY多点実験におけるT細胞(ビデオ1)と顕微鏡ステージ/チャンバースライドの動きの両方を補正し得ることを示している。これは、マルチウェルタイムラプスキャプチャに実際に便利です。
黒と白、パンクロマティックおよび冷却された帯電した結合デバイス(CDD)カメラが使用されましたが、より高感度で、蛍光科学的相補金属酸化物半導体(sCMOS)カメラが望ましいです。自動蛍光シャッターと組み合わせた短いカメラの露出時間(ランキング形式100 ms~500 ms)により、細胞の生存性に大きな蛍光漂白や損失を伴わずに、十分な時間分解能(1分あたり1フレーム以下、最大16 XYポジション)で長時間のタイムラプスキャプチャ(最大24時間)を実現できます。電動ステージは、マルチポイント(XY)キャプチャを可能にし、理想的な向きで新興および発展シナプスを見つけて画像化する機会を増やすが、異なるJurkatクローンを同時に共役する必要がある場合にマルチウェルチャンバースライドで画像取得を可能にする25。分泌顆粒のトラフィックを分析する際に最良の結果を得るためには、目的の高い開口(すなわち60x、1.4)が必要です。
RAJI-SEE-Jurkatは、もともと11について説明されて以来、無数の研究者によって使用されてきた確立された免疫学的シナプスモデルを構成する。我々は、IS形成の初期段階を適切に画像化するために、このモデルに我々のプロトコルを適応させた。我々の目的は、MTOCの偏光とISに向けた分泌機械の研究に先立って続いた初期のアプローチ20を改善するかった。このプロトコルで作られたコンジュゲートがシナプスでF-アクチン再編成を生み出し、正規SMACを構成し、MVB偏光トラフィック25に付随することは注目に値する。これらの重要な事象はまた、共焦点顕微鏡25によって分析され、検証されている。
IS の種類によって、偏光トラフィックのキネティックな違いが存在します。例えば、CtLsからの溶解顆粒の偏光輸送は数秒または非常に数分で行われますが、Thリンパ球からのいくつかのサイトカイン含有小胞は数分から数時間で終了します。これらの時間的な異性は、最良の戦略を設計し、最も適切な実験およびイメージングアプローチを選択するために、いくつかのイメージング階層(すなわち、レーザー走査共焦点顕微鏡(LSCM))のために、捕捉時間が適切な時間分解能(1分以下)よりはるかに高いので、時間が制限要因となり得る4を考慮する必要があります。これは、上記のプロトコルで説明したように広視野蛍光顕微鏡(WFFM)が使用される場合の制限ではない。CTでは、シナプスに向かうMTOCの偏光は数分3、6、17しか持続しないため、ここで説明したものとは異なる多様な特定の状態の顕微鏡法が必要である(ただし、より高い空間的および時間的解像度を有する)これらのシナプス26、27を適切に画像化するためには、主にいくつかの顕微鏡分野(多点捕捉)が画像化されている場合に必要である。これらの高解像度、新しいアプローチは、Thリンパ球によって作られたシナプスのイメージングにも利用できるが、経済的および/またはロジスティック上の理由(すなわち、これらのイメージング技術の一部に必要なコア機器は、ここで説明したものより6〜7倍の費用がかかる)は、これらの最先端のイメージング方法4の制限を確実に構成し得る。Thリンパ球によって作られたISが長命であるという事実、そしてThリンパ球MTOCにおいて、リンパカイン含有分泌小胞およびMVBがIS22に輸送し、ドッキングするのに数分から数時間かかるという状況は、このプロトコルをTh-APC ISをイメージングするための理想的で手頃な価格のアプローチにする。
WFFMは、取得後の画像のデコンボリューションと組み合わせることで興味深いアプローチを構成し、経済的な理由だけでなく、この戦略をサポートしています。Z軸の本質的な貧弱な解像度(技術の最も重要な注意点)は、取得後の画像のデコンボリューション4(ビデオ1とビデオ2を比較する)を使用して改善することができます。デコンボリューションは、信号対雑音比と画像解像度とコントラスト27を2回まで改善できる計算ベースの画像処理アプローチを使用し、XY軸では150〜100nm、Z軸4では500nmまでです。
高感度、高い読み出し速度と広いダイナミックレンジを使用すると、新しい蛍光sCMOSカメラは、画像の品質を向上させ、蛍光漂白を低減します。ここで説明する細胞間コンジュゲーションプロトコルによって提供される柔軟性により、記載された細胞アプローチと、生細胞の両方で、固定細胞の両方で、いくつかの最先端の顕微鏡技術との組み合わせを可能にし、期待される結果確かに免疫学的シナプスの知識を向上させます。
我々は、扱いやすい、十分に確立された細胞株を使用してプロトコルを実装し、検証したが、このアプローチは、一次T細胞および異なるタイプの抗原提示細胞(マクロファージの樹状細胞など)が使用される場合に、より多くの生理学的相互作用の可視化を可能にする可能性がある5。この文脈において、このプロトコルはまた、APCとして使用されるスーパーアンチゲン(SEB)パルスマウスEL-4細胞株を用いて拡張および検証され、一次マウスTリンパ芽細胞9に挑戦する。実際に原発性Tリンパ球、特にCTは、SEE-RajiおよびJurkatモデルで見られるものに対して、より短命で動的なシナプス接触(参考9の補足ビデオ8を参照)をレンダリングした。シナプス接触モードの変動は、このプロトコルを使用して記録および分析することができる2次元in vitro組織等価物の樹状細胞またはB細胞との一次T細胞相互作用に最もよく見ることができます。さらに、スーパーアンチゲンとは別に、この技術は他のタイプのシナプスを画像化するために使用することができる。例えば、TCRトランスジェニック、抗原特異的T細胞モデル、例えばオボアルブミン特異的マウスOT1/OT2系を用いたり、抗原特異的T細胞受容体を有するT細胞のトランスフェクションによって使用することができる。これは、当面の将来のための実験的な可能性の無数を開きます。
Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
私たちは、彼らの寛大な貢献のために研究室のすべての過去と現在のメンバーを認めます。この作品は、スペインのエコノミー・イ・コンペティビダード(MINECO)、プラン・ナシオナル・デ・インベスティガシオン・シエンティフィカ(SAF2016-77561-RからM.I.への助成金によって支えられました)。我々は、彼らのサポートとビデオを制作するために提供された施設のために、ファカルト・デ・メディチナ(UAM)とプロデアメント・デ・オーディオビジュアルを認めます。我々は、継続的かつ優れた技術および理論的なサポートのためにNIKON-Europeを認めます。この記事への無料アクセスは、ニコンが後援しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
| CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
| JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
| μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
| Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
| Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
| Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
| RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
| Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
| Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
| Software ImageJ | NIH | Image J | Image software |
| Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |
References
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