Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Billeddannelse den humane immunologiske synapse

Published: December 26, 2019 doi: 10.3791/60312
Automatic Translation
*1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, *1,2
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid, 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC-UAM, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, 3Unidad de Audiovisuales, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol billeder både den immunologiske synapse dannelse og den efterfølgende polariserede sekretoriske trafik mod den immunologiske synapse. Cellulære konjugater blev dannet mellem en super antigen-pulserende Raji-celle (fungerer som en antigen-præsenterer celle) og en Jurkat klon (fungerer som en Effector hjælper T lymfocyt).

Abstract

Formålet med metoden er at generere en immunologisk synapse (IS), et eksempel på celle-til-celle konjugation dannet af en antigen-præsenterer celle (APC) og en Effector hjælper T lymfocyt (th) celle, og til at registrere de billeder, der svarer til de første stadier af ER dannelse og de efterfølgende menneskehandel begivenheder (forekommer både i APC og i th-cellen). Disse begivenheder vil i sidste ende føre til polariseret sekretion på IS. I denne protokol, jurkat celler udfordret med Staphylococcus enterotoksiner E (Se)-pulserende Raji celler som en celle synapse model blev brugt, på grund af den nærhed af dette eksperimentelle system til den biologiske virkelighed (th Cell-APC synaptisk konjugater). Den fremgangsmåde, der præsenteres her involverer celle-til-celle konjugering, time-lapse erhvervelse, Wide-felt Fluorescens mikroskopi (WFFM) efterfulgt af billedbehandling (efter erhvervelse devolution). Dette forbedrer signal-til-støj-forholdet (SNR) af billederne, forbedrer den tidsmæssige opløsning, giver mulighed for synkroniseret erhvervelse af flere fluorokromer i spirende synaptiske konjugater og nedsætter fluorescens blegning. Desuden er protokollen godt afstemt med slutpunkts-celle fikserings protokollerne (PARAFORMALDEHYD, acetone eller methanol), hvilket vil give mulighed for yderligere immunofluorescens farvning og analyser. Denne protokol er også kompatibel med Laserscanning confokal mikroskopi (lscm) og andre State-of-the-art mikroskopi teknikker. Som en vigtigste advarsel, kun de T Cell-APC grænser (kaldet er grænseflader), der var på den rigtige 90 ° vinkel til fokus flyet langs Z-aksen kunne være korrekt afbildet og analyseret. Der findes andre eksperimentelle modeller, som forenkler billeddannelse i Z-dimensionen og følgende billedanalyser, men disse tilgange emulerer ikke den komplekse, uregelmæssige overflade af et APC og kan fremme ikke-fysiologiske interaktioner i IS. Således er den eksperimentelle tilgang, der anvendes her, egnet til at reproducere og til at konfrontere nogle biologiske kompleksiteter, der forekommer på IS.

Introduction

Hovedformålet med metoden er at generere immunologiske synapse (IS) celle-til-celle konjugater dannet af en antigen-præsenterer celle (APC) pulserende med Se super antigener og en Effector th celle, og for at registrere de billeder, der svarer til de første stadier af immunologisk synapse dannelse og den efterfølgende handel begivenheder (forekommer både i APC og th-cellen), som i sidste ende vil føre til polariseret sekretion på IS. Etableringen af is ved T-lymfocytter ved binding af deres celle receptor (TCR) til antigener bundet til MHC-II på APC organiserer en ekstremt dynamisk, formbart og kritisk tilfælde involveret i antigen-specifikke, humorale og cellulære immunrespons1,2. Den er defineret ved dannelsen af et særligt Supramolekylær aktiverings kompleks (SMAC) mønster karakteriseret ved en actin reorganisation proces3. Ved er konstruktion af T-lymfocytter med en APC, polariseringen af de sekretoriske vesikler mod er synes at være impliceret i polariseret sekretion på den synaptiske kløft. Dette fokuserede maskineri synes utvetydigt at forsyne immunsystemet med en fremragende reguleret List for at øge effektiviteten af kritiske sekretoriske Effector roller af T-lymfocytter, samtidig med at ikke-specifik, cytokin-arbitrated stimulation af tilskuer celler, drab af irrelevante målceller og apoptotisk selvmord via aktiverings induceret celledød (aicd)4.

Konsekvensen af er varierer afhængigt af arten af både T-lymfocyt og APC. Den synaptiske kontakt af th celler (typisk CD4 + celler) med APC viser antigen-associeret til MHC-II producerer aktivering af T-cellen (cytokin sekretion, proliferation, etc.) og, i nogle tilfælde, apoptose via AICD4. For cytotoksiske T-lymfocytter (CTLs) (hovedsageligt CD8 + celler), der interagerer med APC, som præsenterer antigen associeret med MHC-I, er resultatet forskelligt på præ-stimulation eller ikke af CTL'erne med antigen. Således, naive CTLs identificere antigen-MHC-I komplekser på APC er "primet" at ødelægge Target celler og kløft. Primet CTLS også etablere synapser med målceller (dvs. celler inficeret med vira eller tumorceller) producerer antigen-specifikke celle udryddelsen5,6.

Den polariserede sekretion af exosomer ved den immunologiske synapse er et udviklings-og udfordrende område for forskning, der er involveret i relevante immunrespons7. Det er blevet påvist, at multivesikulære organer (mvb), der transporterer intraluminal vesikler (ilvs), har polariseret transport mod is8,9 (video 1) ved TCR stimulation med antigen. Fusionen af disse mvb på den synaptiske membran inducerer deres degranulering og frigivelsen af ilvs som exosomer til den synaptiske kløft8,10. Dette sker i er dannet af th-type Jurkat celler, der blev udfordret med Se super antigen-coated Raji celler fungerer som APC11, TCR-stimuleret CD4+ Lymfoblaster, og primet CTLS. Således synapser lavet af Jurkat celler udgør en værdifuld model til at studere polariseret sekretoriske trafik af exosomer. Desuden har flere årtier af undersøgelsen vist, at mange grundlæggende indsigt i TCR signalering kom fra undersøgelser med transformerede T-cellelinjer, og faktisk den bedst kendte af disse modelsystemer er Jurkat leukæmi T-Cell linje12.

Dannelsen af en fuldt udviklet er producerer flere afgørende biologiske resultater, herunder aktivering af th celler, aktivering af naive CTLS eller Target Cell drab ved primet CTLS, bortset fra Anergi eller aicd5. Derfor er der to store typer af sekretoriske er etableret af T-lymfocytter, der resulterer i meget forskellige, men ligeledes kritisk, immun Effector funktioner1,6,13. På den ene side, er fra primet cytotoksiske T lymfocytter (CTLS) inducerer hurtig polarisering (spænder fra sekunder til få minutter) af lytisk granulat (kaldet "sekretoriske lysosomer") mod is. Degranulering af det lytiske granulat inducerer sekretionen perforin og granzymes til den synaptiske kløft14, som er Pro-apoptotiske molekyler. De udskillede perforin-og granzymes fremkalder efterfølgende aflivning af målcellerne15,16. CTLS udvikler midlertidige synapser, der kun varer få minutter, da målcellerne myrdes3,17. Dette er sandsynligvis på grund af den omstændighed, at den optimale CTL opgave kræver en hurtig og midlertidig kontakt for at distribuere så mange dødbringende strejker som muligt til talrige mål celler3,17. I modsætning hertil, th lymfocytter såsom jurkat celler generere stabile, langvarige er (fra 10-30 min op til timer), da dette synes at være nødvendigt for både retningsbestemt og uophørligt sekretion af stimulerende cytokiner3,17. Cytokinerne er også omsluttet af sekretoriske vesikler, og nogle af dem (dvs. IL-2, IFN-γ) oplever polariseret transport til er17 og sekretion. Et væsentligt kendetegn ved IS er dannelsen af sonderende, svage og forbigående kontakter mellem T-cellen og APC (video 1), der kan skabe en stærkere interaktion og etablering af en moden er, forudsat at TCR identificerer de cognate antigen-MHC komplekser, og at passende Co-stimulerende forbindelser er etableret5. Både begyndelsen af de indledende kontakter og grundlæggelsen af en moden, helt produktiv er, er i sagens natur stokastiske, hurtige og asynkrone processer5,18. Desuden er der en begrænset hyppighed i skabelsen af celle-til-celle konjugater19, som kan udgøre en udfordring for billeddannelsesteknikker (se resultater og diskussions sektioner).

En anden Hovedudfordring i at undersøge polarisering af microtubule-organisere Center (MTOC) og sekretoriske granulat i T-lymfocytter er, at hele processen er hurtig (sekunder til få minutter), især i CTLs. i betragtning af disse kendsgerninger, de fleste tidlige tilgange konfronteret en slutpunkt strategi, hvor APC/Target-celler og T-lymfocytter blandes i fællesskab og konvergeret ved lav hastighed centrifugering, at favorisere celle-til-celle konjugation skabelse, inkuberet i flere minutter, fast og efterfølgende evalueret for flytning af MTOC og/eller sekretoriske vesikler mod20. Denne fremgangsmåde har to væsentlige begrænsninger: ingen livlige menneskehandel data blev opnået, og høje niveauer af baggrund MTOC/secretory granulat polarisering blev opnået, sandsynligvis på grund af den stokastiske karakter af er etablering18. Desuden er enhver sammenhæng mellem TCR-stimuleret, indledende signalering hændelser (dvs. intracellulære calcium stigninger, actin reorganisering) og sekretoriske vesikelprotein polarisering problematisk at undersøge. Derfor er det bydende nødvendigt at fastsætte bestemmelser om passende billeddannelse er i levende celler kombineres for at forbedre celle-til-celle konjugat materialisering, at synkronisere genereringen af IS og, når det er muligt, at sikre etableringen af cellulære konjugater på definerede mikroskopet XY felter og Z positioner. Flere strategier er blevet udviklet for at undgå alle disse problemer. Det er ikke omfattet af dette dokument til at forklare disse metoder, deres fordele og svagheder. Se de tidligere offentliggjorte anmeldelser, som tackler disse vigtige punkter1,4,5,21.

Det faktum, at er lavet af th lymfocytter er langlivet, og den omstændighed, at i th lymfocytter MTOC, lymfoktin-holdige sekretoriske granulat og MVB tage fra flere minutter op til timer til at flytte og dock til er22 gør th-APC er en ideel kandidat til billeddannelse ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her.

Protocol

1. forberedelse af dias til at overholde Raji celler

  1. Tilsæt 150 μl fibronektin (100 μg/ml) pr. brønd til en 8 strips med mikrobrønde Chamber slide (plastik-bund kammer slide) og Inkuber det i 30 min til 1 time ved 37 °c. Denne adhæsion substrat vil tillade binding af Raji celler til brønd bunden (trin 2), dannelsen af levende konjugater med jurkat celler (trin 4) celler, og time-lapse mikroskopi Capture (trin 6), og er også kompatibel bagefter med valgfri PARAFORMALDEHYD (PFA) fiksering (trin 7).
    Bemærk: Til acetone fiksering, brug glasbund kammer slides og poly-L-lysin (20 μg/mL) i stedet for fibronectin, da acetone opløse plastik. 8 strips med mikrobrønde Chamber slide (1 cm2 brønd, 300 μl maksimal volumen) eller tilsvarende er et fleksibelt og passende format.
  2. Aspirér fibronektin ved hjælp af en 200 μl automatisk pipette og vask hver brønd med 200 μl PBS i 2 min med blid rystning. Gentag denne vask en gang til. Kammer sliden kan opbevares på dette stadie med PBS i 1-2 uger ved 4 °C.

2. vedhæftning af Raji celler til kammeret glider og 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) mærkning

  1. Overfør 10 ml af en flydende (1-2 x 106 celler/ml) præ-kultur af Raji celler til en 15 ml, V-bottom tube. Bland godt og brug 10 μL til at tælle cellerne på Neubauer-kammeret eller tilsvarende.
  2. De resterende celler centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirér og kassér supernatanten.
  3. Resuspender forsigtigt celle pellet i varmt komplet kulturmedium (RPMI 1640 suppleret med 10% FCS, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin) i en koncentration på 106 celler/ml. Brug ligningen nedenfor:
    ([]Initial x vInitial = []endelig x vFinal), hvor []Initial repræsenterer Initial celle koncentration, vInitial = Initial volumen af cellesuspensionen, []Final = endelig celle koncentration, vFinal = slutvolumen af cellesuspensionen.
    Bemærk: Afhængig af celle koncentrationen af start kulturen, er det muligt at indsamle flere celler end nødvendigt, men det er vigtigt at opretholde de resterende celler i kulturen (37 °C) indtil afslutningen af forsøget for at forhindre potentielle problemer (Se trin 2,6).
  4. Mærk Raji-cellerne, så de kan identificeres under den synaptiske konjugat dannelse. I dette eksperiment, 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) mærkning udføres i trin 2.4.2.
    1. Det nødvendige antal Raji-celler overføres til et 2 mL rør i dyrkningsmediet. For 8 strips med mikrobrønde Chamber slide er der behov for i alt 1,6 ml af cellesuspensionen (200 μl pr. brønd).
    2. Tilsæt CMAC til en endelig koncentration på 10 μM. hold cellerne i mørket ved at dække røret med aluminiumsfolie, da CMAC er lysfølsom. 200 μL indeholdende 2 x 105 Raji-celler er nødvendige pr. 1 cm2 brønd. Således, hvis 8 brønde skal forberedes, 1,6 x 106 Raji celler er påkrævet.
      Bemærk: Mærkning Raji celler med Cell tracker Blue (CMAC, UV excitation og blå emission) adskiller dem fra th celler, når de synaptiske konjugater dannes. Dette farvestof er kompatibelt med PFA og acetone fikater og tillader yderligere immunofluorescens procedurer. Prøv at undgå lys udstilling. Mærkningen af Raji celler i en pulje med CMAC efterfulgt af opblanding før adhæsion af Raji-cellerne til fibronectin-coatede kammer slides sikrer den homogene mærkning af Raji-celler med CMAC blandt forskellige brønde.
  5. Resuspendere CMAC-farvede celler og, efter aspiration af PBS i kammeret glide fra trin 1,2., overføre 200 μL af cellesuspensionen til hver brønd af fibronectin-belagt kammer glider forberedt i trin 1.1-1.2. Inkuber kammer sliden ved 37 °C, 5% CO2 i 30 min-1 h.
    Bemærk: Adhæsion og CMAC mærkning vil samtidig forekomme på dette trin, og det sparer tid. Vær opmærksom på, at Raji-celler hurtigt vil sediment, og der skal udvises forsigtighed for at opretholde en homogen koncentration i cellesuspensionen før såning. Det er ikke nødvendigt at vaske CMAC på dette tidspunkt ved centrifugering, da CMAC vask vil være lettere at gøre på trin 2,7 (når de mærkede Raji celler er allerede overholdt til kammeret slides). Da CMAC er til stede i cellen suspension i stort overskud, den blå fluorescens baggrund er for høj til at skelne de blåfarvede celler. Check Cell CMAC fluorescens i trin 2,7 efter CMAC vask.
  6. Sørg for, at Raji-cellerne overholdes i bunden af brøndene ved forsigtigt at ryste kammer gliderne på mikroskopet. Sørg for, at cellerne viser huller mellem hinanden og ikke er flydende (figur 1, midterste panel). 50-60% af cellens sammenløbet er hensigtsmæssig.
    1. Hvis de fleste af cellerne effektivt holder sig til kammer sliden, og der ikke observeres celle huller, skal du vaske hver brønd med varmt komplet medium og resuspendere mediet med et 200 μL automatisk pipet for at frigøre celle overskud. Kontrollér sammenløbet efter hvert ophængs trin.
    2. Hvis cellerne ikke overholder, skal du gentage vedhæftnings trinnet igen og øge vedhæftnings tiden og/eller celle nummeret.
      Bemærk: Det er muligt at stoppe her, inkubere kammer sliden ved 37 °C, 5% CO2 overnight (O/N), og Fortsæt med protokollen den næste dag. Bekræft den næste dag, at Raji-celler forbliver overholdt og CMAC-mærket ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.
  7. Vask hver brønd omhyggeligt med varm suppleret RPMI for at eliminere overskydende CMAC og kontrollere for blå emission med fluorescens mikroskop (figur 1).
    Bemærk: For at undgå brug af nedsænkning olie (klæbrig og viskøs) og høje numeriske blænde olie mål, ekstra langdistance (dvs., 20x eller 40x) mål kan bruges til hurtigt at kontrollere CMAC mærkning ved hjælp af fluorescens mikroskop.

3. puls af CMAC — mærket Raji celler med Staphylococcal Enterotoxin E

  1. Tilsæt Staphylococcal Enterotoxin E (se, 1 μg/mL) til hver brønd. Se kan bekvemt fortyndes i cellekulturmedium (arbejdsopløsning ved 100 μg/mL) fra de Se frosne bestande (1 mg/mL i PBS). Brug 2 μL af 100x arbejdsopløsningen pr. 200 μL mikrobrønd.
    Forsigtig: Brug handsker til dette trin og bortskaf den brugte spids i Biohazard boksen.
  2. Indinkuber kammer sliden ved 37 °C, 5% CO2 i mindst 30 minutter. Se-effekten varer i mindst 3-4 h.
    Bemærk: Se kan tilføjes til brøndene på forskellige tidspunkter, når det er nødvendigt, hvis særskilte tidsforskudt opsætninger er planlagt (trin 5) og/eller afhængigt af starttidspunktet for slutpunkt eksperimenter (trin 6).

4. forberedelse af Jurkat celler

  1. Brug en tidligere voksende kultur af Jurkat celler (1-2 x 106 celler/ml) til dette eksperiment. Brug celler fra en standard dyrknings kolbe eller fra en tidligere transfektering efter standard elektroporations protokoller, som tidligere beskrevet23. Transfektering af jurkat celler vil tillade tidsforskydning visualisering af trafikken af sekretoriske granulat i levende celler. For eksempel, når GFP-CD63 (en markør for MVB) udtrykkes bevægelsen af GFP-CD63-dekorerede vesikler kan optages (video 1).
  2. Overhold cellerne under en fasekontrast mikroskop. Hvis et overskud af døde celler (> 20-30%) observeres, udføre Ficoll tæthed gradient centrifugering ved hjælp af standardprotokoller24, at eliminere overskydende af døde celler (døde celler udviser højere tæthed end levende celler) før brug (Se diskussion).
  3. Cellerne overføres til et 15 mL rør, et V-bund rør, og der anvendes 10 μL til tælling ved hjælp af hemocytometer.
  4. Centrifuger de resterende celler som beskrevet i trin 2,2. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i samme koncentration som Raji-celler (1 x 106/ml) ved hjælp af et frisk, varmt dyrkningsmedium. Følg trin 2.2-2.3.
  5. Vedligehold Jurkat-cellerne i kulturen (37 °C, 5% CO2), mens du venter på trin 4.
    Bemærk: I den anden mulighed (transfection), antallet af levende celler vil være meget lavere end i den første. Overvej således at bruge en højere startcelle kultur volumen for at have nok celler til eksperimentet. Fra 10 x 106 jurkat celler pr. Elektro poration kuvette og transfektering, kun 2-4 x 106 jurkat celler vil overleve efter 48 h af transfektering og nogle af disse celler vil gå tabt under ficoll trin. Således en elektro poration kuvette er generelt nok til at udfordre de klæbet Se-pulserende Raji celler fra 8 mikro brønde (1,6 x 106 transficeret jurkat celler behov).

5. co-seeding af Raji og Jurkat celler

  1. Tag kammer gliderne med CMAC-mærkede, se-pulserende, klæbet Raji-celler ud af inkubator fra trin 3,2. Det er ikke nødvendigt at vaske CMAC på dette tidspunkt, da dette tidligere blev gjort i trin 2,7.
  2. Aspirér forsigtigt kulturmediet for hver brønd, en efter en, fra det ene hjørne af brønden ved hjælp af en automatisk 200 μL pipette. Lad ikke mediet i brønden tørre ud helt.
  3. Udskift straks mediet med 200 μL resuspenderet Jurkat celler i cellekulturmedium (1 x 106/ml) tilberedt i trin 4,5. Hvis timelapse Imaging udføres, skal du gå til trin 6 umiddelbart efter dette trin, da Jurkat celler har tendens til sediment og danner synaptiske konjugater meget hurtigt. For nemheds skyld, mikrobrønde indeholder Se-pulserende, klæbet Raji celler, der ikke modtager såning med Jurkat celler på dette stadium bør opretholdes med cellekulturmedium indtil efterfølgende udfordring med Jurkat celler. Dette vil fleksibelt tillade efterfølgende udfordring med Jurkat celler for yderligere tid bortfalder eller reverse Kinetic, slutpunkt eksperimentelle tilgange.
  4. Hvis der skal udføres en tidsforskydning, skal du hurtigt fortsætte til trin 6. Dette indebærer Co-kultur for 1-2 h på mikroskopet fase inkubator eller tilsvarende ved 37 °C, 5% CO2 at tillade den synaptiske konjugat dannelse og samtidig billed erhvervelse. Hvis slutpunkt analyse, men ingen tid bortfalder, er forudset kontrollere konjugat dannelse efter Co-kultur periode ved hjælp af mikroskopet (som i figur 1) før fastgørelse af cellerne (trin 7).

6. time lapse billeddannelse af nye synaptiske konjugater

  1. Forbered mikroskopet og inkubations kammeret før billeddannelse. For eksemplet vist i video 1 vises de detaljerede indstillinger for mikroskopi i figur 2.
    Bemærk: Hvis et tidsforskudt eksperiment er planlagt, skal alle mikroskopets indstillinger og komplementer (omgivende cellekultur kammer, etc.) forberedes, før du tilføjer Jurkat suspensionen til kammer diaset med klæbet Raji-celler. Følgende trin er beskrevet for et kommercielt mikroskop (tabel over materialer). Dog kan ethvert inverteret fluorescens mikroskop, der er udstyret med en cellekultur inkubator, anvendes.
    1. Brug et mikroskop med en 60x olie nedsænkning, høj numerisk blænde, når Imaging polariseret trafik.
    2. Sørg for, at det automatiske fokus system er tændt, og Juster forskydningen for at fokusere de Raji-celler, der er bundet til den nederste overflade. Se venligst figur 1, video 1 og video 2.
  2. Efter jurkat tillæg til hver brønd indeholdende de klæbet Raji celler i trin 5,3, hurtigt finde strips med mikrobrønde kammer slide på forvarmet (1-2 h) mikroskop fase inkubator (dvs. okolab) og vælge nogle XY positioner med mikroskopet, områder, hvor det er sandsynlighed for at registrere en spirende er dannelse lavet af, for eksempel, en Jurkat-transfected celle falder i mikroskopet fokus.
  3. Brug en præ-opvarmet mikroskop fase inkubator, da det blev observeret, at et temperatur stabiliseret stadie opretholder stabile X, Y, Z positioner. Kriterier for en bekvem XY felt er: velfokuserede og ikke-confluent Raji celler (dvs., viser huller blandt celler) og tilstedeværelsen af transficeret jurkat celler (dette kan kontrolleres ved at kombinere transmittans og UV eller gfp kanaler). Jurkat celler vil sediment meget hurtigt (få minutter) på kammeret slide, og chancerne for at billedet spirende synapser vil falde med tiden (figur 1). Det er muligt enten at afslutte forsøget efter den definerede tid bortfalder eller gå videre til trin 7 og fastsætte konjugater for efterfølgende immunofluorescens og analyser.
    Bemærk: Det er muligt at vælge op til 16 forskellige mikroskop felter fra op til 4 forskellige mikrobrønde til samtidig, multi-Well time-lapse erhvervelse med den korrekte tidsmæssige opløsning (1-2 min pr frame). Begrænsningen er afhængig af både antallet og intensiteten (påvirker kameraets udstilling) af de forskellige fluorchromes, der skal afbildet (afhængig af antallet af udtrykte fluorescerende proteiner, bortset fra CMAC). En måde at øge frame rate er optagelse til CMAC-kanalen i kun én ud af hver "n" tidsrammer for GFP (dvs. n = 8, som vist i figur 2), da Raji celler er overholdt til brønd bunden og ikke nemt flytte som jurkat celler. Desuden, dette gavner cellens levedygtighed, da hyppig UV-lys eksponering kan beskadige cellerne. Prøv at justere tidsrammen sats til 1 ramme hver 1 minut eller mindre (dvs., 20 s pr frame i video 1, figur 2) da polariseringen af mvb tager et par minutter til timer at fuldføre. Et mikroskop udstyret med et motoriseret EPI-fluorescens tårn og passende bånd-pass fluorescens filtre eller ækvivalenter er nødvendige for at udføre denne multikanal opsamling.

7. slutpunkt dannelse af synaptiske konjugater og fiksering

  1. Hvis der kun er planlagt et endepunkt eksperiment (1-2 timer inkubation for at tillade synaptisk konjugat dannelse er passende), Inkubér kammer sliden ved 37 °C, 5% CO2 for 1-2 h. Kontrollér konjugat dannelse efter dyrkningsperioden (som i figur 1), og fastgør derefter konjugater med acetone eller PFA (fiksering vil afhænge af de antigener og antistoffer, der skal anvendes i den efterfølgende immunofluorescens). I dette tilfælde inkubationen kræver ikke en mikroskop fase inkube. Se venligst video 3 for et eksempel.
  2. For at fastsætte cellerne, vaskes brønden ved blid omrystning med varmt RPMI (37 °C) medium uden FCS (albumin fra serum kan udløse med acetone fiksering). Aspirer og tilsæt 200 μL PFA eller præ-kølet acetone til hver brønd. Inkuber kammer sliden ved stuetemperatur (RT) eller på is i henholdsvis 20 min.
    Bemærk: Til acetone fiksering, før du slapper af acetone ved-20 °C og forafkøer kammer sliden ved 4 °C. Fjern plastik låg, når acetone bruges til at fastsætte de celler, der dyrkes i de 8 brønd glas-bund kammer slides.
  3. Vask hver brønd to gange med PBS og tilsæt 200 μL dæmpnings opløsning (PBS, 50 mM NH4CL). Inkuber kammer sliden ved 4 °C.
    Bemærk: På dette tidspunkt kan kammer sliden blive i mindst en måned ved 4 °C, før immunofluorescens protokollen udføres, som beskrevet8. Låget forhindrer fordampning.

8. billedbehandling

  1. Udføre billed dekoncentrering efter erhvervelse (dvs. Huygens dekoncentrering eller tilsvarende, tabel over materialer) af time-lapse-serien og/eller stillbilleder af faste celler. Devolute ved at anvende en passende software (dvs. ved hjælp af den "brede felt" optisk option i Huygens) og de korrekte optiske parametre. Dekoncentrering nødvendiggør en billedbehandling af den målte punkt sprednings funktion (PSF) i mikroskop4.
  2. Alternativt kan du bruge softwaren til at beregne de idealiserede PSF ved automatisk indlæsning af de optiske parametre, der er inkluderet blandt metadataene fra mikroskop filerne. Disse optiske parametre omfatter fluorchrom bølgelængde, brydningsindeks, numerisk blænde af målet, og Imaging teknik (Konfokal, Wide-felt, etc.) 4.
  3. Efterfølgende bruger billedbehandlings softwaren PSF og forskellige dekoncentrerings algoritmer (dvs. QMLE og CMLE i Huygens software) i en trinvis akkumulerende beregnings proces, hvis resultater kan visualiseres kontinuerligt og stoppes (eller genoptages), når brugeren kræver det. På nuværende tidspunkt kan brugeren ændre antallet af indviklede forhold og/eller signalet til støj forholdet og genoptage dekoncentreringen. Devolution-softwaren fungerer godt sammen med timelapse-serien (X, Y, T) (video 2) og z-stakke (x, y, z) (video 3). De devoluterede kanaler blev efterfølgende fusioneret til CMAC, RAW Channel, da cytosolic, diffuse fluorchromes ikke forbedres ved devolution4,9.

Representative Results

Vi har fulgt den beskrevne protokol for at generere Jurkat-Raji immun synapse konjugater og korrekt billede de tidlige stadier af IS formation. Vores mål var at forbedre de tidlige tilgange20 tidligere fulgt for at studere polariseringen af MTOC og sekretoriske maskineri mod is. Disse tilgange var baseret på en slutpunkt strategi, der ikke tillod billeddannelse af IS dannelse eller de tidlige synaptiske begivenheder, da der i disse strategier er dannelse obligatorisk fandt sted i pellet af blandede, centrifugeret celler, men ikke på et mikroskop. Vores protokol var designet til at undgå denne vigtigste advarsel, da tilgangen var baseret på brugen af en passende celle koncentration (trin 2 og 3), til fordel for dannelsen af cellen til celle er konjugater på egen mikroskop kammer slides (8 mikro brøndkammer slide), monteret på den præ-opvarmede mikroskop fase inkubator (i trin 4). Denne strategi inducerer IS dannelse, samtidig til time-lapse Imaging Capture (video 1).

Figur 1 repræsenterer synaptisk jurkat-Raji konjugater, der blev opnået efter protokollen (trin 5,2). Billedet repræsenterer den første ramme fra et repræsentativt, tidsforskudt eksperiment. 2 x 105 Raji celler og 2 x 105 jurkat celler blev føjet til en 1 cm2 godt. Det øverste panel viser transmittans Channel, det midterste panel består af CMAC (blå) kanal (Raji celler), og det nederste panel viser både transmittans plus CMAC fusionerede kanaler. Gule pile mærke nogle synaptiske konjugater, som en reference, mens grønne pile indikerer synaptiske konjugater lavet af en Jurkat celle og flere Raji celler (komplekse konjugater). Faldende celle koncentrationer (105 eller færre celler i 1 cm2 brønden) vil omgå dannelsen af komplekse cellulære konjugater, men der kan ikke være nok celle konjugater til efterfølgende analyse af polariseret trafik (se nedenfor), der igen vil falde også chancerne for at finde og billedet spirende synaptiske konjugater.

Figur 2 repræsenterer screenshots svarende til de Imaging parametre, der anvendes til samtidig opsamling af de to forskellige fluorokromer (CMAC og gfp-CD63) ved hjælp af passende software (dvs., Nikon NIS_AR) i et repræsentativt tidsinterval eksperiment svarende til video 1.

Video 1 (immunologiske synapser, rå) repræsenterer en Jurkat T lymfocyt udtrykker gfp-CD63 (en markør af multivesikulære organer-mvb, grønne vesikler) og dannelsen af en dobbelt synapse mellem 1 jurkat celle og 2 Raji celler mærket med CMAC, i blåt (en af dem gennemgår opsigt). Den samtidige bevægelse af MVB inde i Jurkat cellen mod synapse områder blev indspillet (Capture frame rate = 1 ramme hver 20 sekunder for GFP-CD63; video reproduktion hastighed = 2 frames per s). De synaptiske konjugater blev opnået og afbildet efter den protokol, der er beskrevet ovenfor (trin 6,2), som tillod billeddannelse af nye synapser (video 1). Den samtidige opsamling af både GFP-CD63 og CMAC fluorescens kanaler blev udført ved hjælp af en passende software (dvs. NIS-AR, tabel over materialer). Videoen repræsenterer de rå data fra en repræsentativ, time-lapse eksperiment. Det automatiske fokus system blev defineret med en passende forskydning i forhold til de Raji-celler, der var bundet til glasbunden, for at sikre et stabilt fokus langs eksperimentet.

Video 2 (immunologiske synapser, efter dekoncentrering) svarer til video 1, men DEKONCENTRERINGEN af gfp-CD63 fluorescens kanal billeder blev udført ved at ansætte en passende devolution software (dvs., Huygens), ved hjælp af "Wide Field" optisk option og de korrekte optiske parametre (trin 8). Denne devoluted kanal blev efterfølgende fusioneret til CMAC, RAW Channel. Forbedringen af både signal-støj-forhold og skarphed af billedet er indlysende. Dekoncentreringen blev udført efter erhvervelsen, som beskrevet ovenfor. For specifikke detaljer vedrørende dekoncentrerings softwaren, se venligst4.

Video 3 (immunologisk synapse, efter fastgørelse og immunofluorescens farvning) repræsenterer en z-stak (z-trins størrelse = 0,8 μm, 5 frames) af en fast er konjugat efter trin 6 i protokollen (acetone fiksering). Efter fiksering blev immunofluorescens udført efter standardprotokoller25 ved at bruge Phalloidin til at visualisere F-actin (grøn), anti-CD63 at VISUALISERE mvb (magenta), anti-γ-Tubulin at VISUALISERE MTOC (rød). CMAC (blå) mærker Raji-cellen. Efterfølgende blev konjugaten afbildet af epifluorescens og flere kanaler devoluted ved hjælp af den "brede felt" optisk option og de korrekte optiske parametre (trin 7). De devoluterede kanaler blev efterfølgende fusioneret til CMAC, RAW Channel, som angivet i de forskellige paneler (CMAC plus Transmittance-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus anti-CD63 og CMAC plus anti-γ-Tubulin, hhv.). Hvid pil etiketter synapse, mens grøn pil etiketter MVB og den gule pil etiketter MTOC. Den detaljerede kvantificering af MVB og MTOC polarisering er blevet forklaret andetsteds25.

Den fremgangsmåde, der præsenteres her, involverer dannelsen af celle-til-celle konjugater og samtidig tidsforskudt erhvervelse ved Wide-felt Fluorescens mikroskopi (WFFM) efterfulgt af billedbehandling (efter erhvervelse devolution). Denne taktik forbedrede signal-til-støj-forholdet (SNR) af billederne, forbedrede deres tidsmæssige opløsning og tillod den synkroniserede erhvervelse af flere fluorochromer i nye synaptiske konjugater4. Desuden er protokollen godt matchet med efterfølgende slutpunkts-celle fikserings metoder (PARAFORMALDEHYD, acetone eller methanol), hvilket ville give mulighed for yderligere immunofluorescens farvning og analyse25 (video 3). Denne protokol er også kompatibel med Laserscanning confokal mikroskopi og andre State-of-the-art mikroskopi teknikker.

Figure 1
Figur 1: repræsentativ dobbelt størrelse mikroskopi felt af synaptiske konjugater. Billedet repræsenterer den første ramme fra et repræsentativt, tidsforskudt eksperiment, der følger protokollen. Den øvre panel viser transmittans kanal, den midterste panel CMAC-kanal (Raji celler) og den nederste panel begge fusionerede kanaler. Gule pile mærke nogle synaptiske konjugater, som en reference. Grønne pile indikerer komplekse synaptiske konjugater (dvs. en Jurkat celle etablerer synapser med mere end en Raji celle). Taget med et 40x EWD (0,6 NA)-mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: indstillinger for tidsforskudt mikroskop. Billedet svarer til flere screenshots svarende til de Imaging parametre, der anvendes til samtidig opsamling af de to forskellige fluorokromer (CMAC og gfp-CD63) ved hjælp af passende software (dvs., Nikon NIS_AR) i et repræsentativt tidsinterval eksperiment svarende til video 1. Hver frame til GFP-CD63 kanal blev erobret hver 20 s. Der blev kun taget én ramme til en UV-kanal ud af otte rammer til GFP-kanalen for at bevare cellens levedygtighed langs eksperimentet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: immunologiske synapser lavet af en Jurkat celle udtrykker GFP-CD63, rå data. Raji B-celler mærket med Cell tracker Blue (CMAC, blå) blev pulseret med Se for 30 min og synapser med Jurkat celler, der udtrykker GFP-CD638 blev dannet. Time-lapses svarende til GFP-CD63 og CMAC kanaler blev erobret (20 s pr frame; video reproduktion hastighed = 2 frames per s) og et repræsentativt eksempel vises. Taget med et mål på 60x PLAN APO (1,4 NA). Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Video 2
Video 2: immunologiske synapser lavet af en Jurkat celle udtrykker GFP-CD63, efter dekoncentrering. Samme som video 1, men billeder blev devoluted ved hjælp af en devolution software. Det forbedrede signal-støj-forhold og den forbedrede skarphed, som følge af elimineringen af forurenende stof ud af fokus fluorescens, er tydelig. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Video 3
Video 3: fast og immunoplettet immunologisk synapse. Billedet viser en repræsentativ fast synaptisk konjugat efter trin 7 i protokollen og efterfølgende immunofluorescens. CMAC (blå) etiketter Raji celler, transmittans (Trans) for at vise den synaptiske konjugat (hvid pil), phalloidin etiketter F-actin (grøn), anti-CD63 etiketter mvb (magenta, grøn pil) og anti-γ-Tubulin etiketter MTOC (rød, gul pil), hhv. Disse kanaler blev afbildet af epifluorescens, devoluterede og fusioneret som angivet. Videoen indeholder en Z-stak (z-trins størrelse = 0,8 μm, 5 frames). Hvid pil etiketter den synaptiske kontaktområde, mens den grønne pil etiketter MVB og den gule pil etiketter MTOC. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).

Discussion

En begrænsning af denne protokol er, at ikke alle synapser vil være ideelt orienteret vinkelret på den optiske akse. Ved hjælp af denne teknik, er der ingen måde at forudsige og/eller til at påvirke den ideelle orientering for immun synapse Imaging. For at løse dette problem, udelukker vi fra de efterfølgende analyser alle de tilfældigt erobrede synapser, der endelig ikke opfylder de ideelle kriterier. Disse synapser, belejligt nok, er ikke meget hyppige. Det er dog muligt at omgå denne begrænsning ved hjælp af flere eksperimentelle tilgange4.

Den polariserede CD63 frigivelse (degranulering) kan kvantificeres ved andre komplementære teknikker såsom celleoverfladen farvning af CD63 (CD63 flytning til cellens overflade) i levende celler (ikke fast og ikke permeabilized), efter trin 6, og efterfølgende vask og fiksering, som tidligere vist8. Desuden, CD63 frigivelse på exosomerne8,9 og exosomvesikler kvantificering af nanopartikel tracking analyser9,25 kan udføres. Disse tilgange er helt sikkert forenelige med vores protokol, forudsat fiksering udføres efter celleoverfladen immunofluorescenstest af levende celler.

Vi har fundet det ideelle antal celler (for en 1 cm2 brønd i 8-brønden kammer slide) er 4 x 105 celler (2 x 105 Raji celler og 2 x 105 jurkat celler), da de holder sig effektivt til bunden af brønden. Bindende effektivitet til plast (ved hjælp af fibronectin), eller glasbund (ved hjælp af poly-L-lysin) mikroslides er normalt ikke et problem. Højere celle tal kan ikke give nogen huller blandt klæbet celler og derefter komplekse synaptiske konjugater (figur 1); begge situationer er ikke ønskeligt, når enkelt celle-til-celle konjugater skal afbildet i, for eksempel, MTOC eller sekretoriske granulet polarisering eksperimenter. Lavere antal celler kan mindske chancerne for at finde konjugater, især når transficeret jurkat celler udfordres med APC til at generere synapser. Bemærk venligst, at vi har observeret, at en temperatur stabiliseret fase inkubator på plads på mikroskopet X/Y fase før starten af protokollen (dvs., 1-2 h på forhånd for at stabilisere scenen/mikroskopet setup) opretholder stabile X, y, Z parametre, som er afgørende for korrekt billeddannelse. Automatisk fokus system vil i sidste ende kompensere små Z variationer.

Når visse gentransduktion teknikker såsom elektroporation bruges til at udtrykke fluorescerende chimeriske proteiner (dvs. GFP-CD63) i Jurkat kloner (video 1), en betydelig brøkdel af celler kan dø efter elektro poration. Dette kan være et problem, da selvdøde celler ikke danner synapser, når de er overskydende over de levende, transficeret celler, de kan forstyrre dannelsen af konjugater lavet af levende th celler. Vi har fundet, at omhyggelig eliminering af døde celler fra transficeret kulturer ved hjælp af en tæthed gradient medium efter standardprotokoller, før konjugat dannelse skridt kan faktisk øge chancerne for korrekt billede konjugater. Desuden har lave transfektering effektivitetsgevinster (< 20%) kan være en vigtig advarsel, da dette, kombineret med en moderat konjugat dannelse effektivitet (omkring 60%)25, vil mindske sandsynligheden for at finde konjugater lavet af transficeret celler. Dette er ikke et problem, når ikke-transfected celler bruges til at opnå konjugater i slutpunkt eksperimenter og efterfølgende fiksering. De 8 strips med mikrobrønde kammer slides er kompatible med konventionelle immunofluorescens protokoller. Dette øger fleksibiliteten i ovenstående protokol med forskellige formål. Fiksering med acetone kan være et problem at overveje, når du bruger kammer glider med plastik bund brønde. Men der er kommercielt tilgængelige 8 strips med mikrobrønde mikroskop kammer glider indeholdende glas bunde, som er kompatible med acetone fiksering. Fjern plastik låg, når acetone bruges til at fastsætte cellerne, der dyrkes i 8 strips med mikrobrønde Glass-bottom kammer slides.

Det anbefales, at mikroskop er udstyret med en motoriseret XY Stage, motoriseret EPI-fluorescens tårn og automatisk fokus system (f. eks. perfekt fokus system) eller tilsvarende kosttilskud. Når multi-Well erhvervelse er påkrævet25, vil det automatiske fokus system sikre et stabilt fokus hele vejen gennem eksperimentet. Tidligere erfaring indikerer, at ved at etablere en passende fokus offset på de Raji celler, kan både bevægelsen af T-celler (video 1) og mikroskopet fase/kammer slide bevægelser i XY multi-punkt eksperimenter, kompenseres. Dette er faktisk bekvemt for multiwell time-lapse Capture.

En sort og hvid, panchromatisk og afkølet opladet koblet enhed (CDD) kamera blev brugt, men højere følsomhed, fluorescens videnskabelige komplementære metal-oxid halvleder (sCMOS) kamera er ønskelig, da dette vil mindske kameraets eksponeringstider og vil forbedre tidsmæssig opløsning. Den korte kamera eksponering gange vi har brugt (ranking form 100 MS til 500 MS) kombineret med den automatiske fluorescens lukker tillader langvarig tid lapse Capture (op til 24 h) med en passende tidsopløsning (1 frame per minut eller mindre, for op til 16 XY positioner) uden signifikant fluorescens blegning og/eller tab i cellernes levedygtighed. Den motoriserede fase tillader multi-point (XY) Capture og øger chancen for at finde og billede de spirende og udvikle synapser i den ideelle orientering, men også tillader billed erhvervelse i multiwell kammer slides, når forskellige Jurkat kloner skal samtidig konjugeret25. Høj numerisk blænde af målet (dvs. 60x, 1,4) er nødvendig for at opnå de bedste resultater ved analyse af trafikken af sekretoriske granulat.

RAJI-SEE-Jurkat udgør en veletableret immunologisk synapse model, der er blevet brugt af et utal af forskere, da det oprindeligt blev beskrevet11. Vi har tilpasset vores protokol til denne model for at korrekt billede de tidlige stadier af IS formation. Vores mål var at forbedre de tidlige tilgange20 tidligere fulgt for at studere polariseringen af MTOC og sekretoriske maskineri mod is. Det er bemærkelsesværdigt, at konjugater lavet med denne protokol producere F-actin reorganisering på synapse, konfiguration af en kanonisk SMAC, samtidig med MVB polariseret trafik25. Disse afgørende begivenheder er også blevet analyseret og valideret af confokal mikroskopi25.

Kinetiske forskelle i polariseret trafik findes blandt forskellige typer af IS. For eksempel foregår den polariserede transport af lytisk granulat fra CTLs på få sekunder eller meget få minutter, mens flere cytokinholdige vesikler fra th-lymfocytter tager fra minutter op til flere timer for at afslutte. Disse tidsmæssige forskelle skal tages i betragtning på forhånd, for at designe den bedste strategi og vælge den mest hensigtsmæssige eksperimentel og billedbehandlings metode, da for nogle billedbehandlings kneb (dvs. Laserscanning confokal mikroskopi (lscm)), kan tiden være en begrænsende faktor, da Capture tid er meget højere end den passende tidsopløsning (1 min eller mindre)4. Dette er ikke en begrænsning, når Wide-felt Fluorescens mikroskopi (WFFM) anvendes som beskrevet i protokollen ovenfor. Da i CTLS, polariseringen af MTOC mod synapse varer kun et par minutter3,6,17, forskellige specifikke State-of the art mikroskopi tilgange forskellige til, der er beskrevet her (men harkedeligt højere rumlig og tidsmæssig opløsning) er nødvendige for at korrekt billede disse synapser26,27, især når flere mikroskop felter (multi-point Capture) er afbildet. Disse høj opløsning, nye tilgange kan også udnyttes til billeddannelse synapser fremstillet af th lymfocytter, selv om økonomiske og/eller logistiske årsager (dvs. det centrale udstyr, der kræves for nogle af disse Imaging teknikker omkostninger 6-7 gange mere end den beskrevne her) kunne helt sikkert udgøre en begrænsning for disse State of the art Imaging metoder4. Det faktum, at er lavet af th lymfocytter er langlivet, og den omstændighed, at i th lymfocytter MTOC, de lymfoktin-holdige sekretoriske vesikler og MVB tage fra flere minutter op til timer til transport og dock til er22, gør denne protokol en ideel, overkommelig tilgang til billeddannelse th-APC er.

WFFM i kombination med efter købet billede dekoncentrering udgør en interessant tilgang, og ikke kun økonomiske årsager støtte denne strategi. Den iboende dårlige opløsning i Z-aksen (den vigtigste advarsel af teknikken) kan forbedres ved at bruge post-erhvervelse billede devolution4 (Sammenlign video 1 med video 2). Dekoncentrering bruger en beregningsbaseret, billedbehandlings metode, der kan forbedre signal-og støjforhold og billedopløsning og kontrast27 op til 2 gange, ned til 150-100 nm i XY-akse og 500 nm i Z-aksen4.

Brugen af højere følsomhed, høj udlæsninghastighed og bredt dynamisk område, nye fluorescens sCMOS-kameraer vil forbedre kvaliteten af billederne og vil reducere fluorescens blegning. Den fleksibilitet, der tilbydes af celle-til-celle konjugering protokol beskrevet her gør det muligt at kombinationen af den beskrevne cellulære tilgang med flere state of the art mikroskopi teknikker, både i levende celler, men også i faste celler, og det forventede resultat vil faktisk forbedre vores viden om den immunologiske synapse.

Selv om vi har implementeret og valideret protokollen ved hjælp af let at håndtere, veletablerede cellelinjer, potentialet tilgangen kan tillade visualisering af mere fysiologiske interaktioner, når primære T-celler og forskellige typer af antigen-præsenterer celler (såsom dendritiske celler af makrofager) anvendes5. I denne forbindelse er denne protokol også blevet udvidet og valideret ved anvendelse af super antigen (SEB)-pulserende mus EL-4-cellelinje, der anvendes som et APC, til at udfordre primær mus T-Lymfoblaster9. Faktisk primære T-lymfocytter, CTLs i særdeleshed, gjort mere kortvarige og dynamiske synaptiske kontakter (Se supplerende video 8 i reference9) til dem, der ses med See-Raji og jurkat model. Variabiliteten af synaptiske kontakt tilstande kan bedst ses for primære T-celle interaktioner med dendritiske celler eller B-celler i to-dimensionelle in vitro-vævs ækvivalenter, der også kan optages og analyseres ved hjælp af denne protokol. Hertil kommer, bortset fra Super antigener, teknikken kan bruges til at afbilde andre typer af synapser. For eksempel, det kunne anvendes i en TCR transgene, antigen-specifik T celle model, for eksempel ved hjælp af ægalbumin specifikke murine OT1/OT2 system eller ved transfektering af t-celler med antigen-specifikke t celle receptorer. Dette åbner et utal af eksperimentelle muligheder for den umiddelbare fremtid.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi anerkender alle de tidligere og nuværende medlemmer af laboratoriet for deres generøse bidrag. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), plan Nacional de Investigación Científica (SAF2016-77561-R til M.I., som delvis blev ydet med FEDER-EF-finansiering). Vi anerkender Facultad de Medicina (UAM) og Departamento de Audiovisuales fra Facultad de Medicina for deres støtte og de faciliteter, der leveres til at producere videoen. Vi anerkender NIKON-Europe for den kontinuerlige og fremragende tekniske og teoretiske støtte. Fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Nikon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon DS-QI1MC Nikon MQA11550 Cooled Camera Head
CMAC ThermoFisher Scientific C2110 Cell tracker blue
JURKAT cells ATCC ATCC TIB-152 Effector T lymphocytes
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom IBIDI Cat.No: 80826, 80827 Cell culture and cell imaging supports
Microscope NIKON Eclipse Ti-E Nikon NIKON Eclipse Ti-E Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module OKOLAB H201-NIKON-TI-S-ER Cell culture atmosphere
Raji Cells ATCC ATCC CCL-86 APC
RPMI medium GIBCO ThermoFisher Scientific 21875034 Culture medium
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) Toxin Technology, Inc EP404 Bacterial Toxin
Software Huygens Essential SVI Huygens Essential Image Deconvolution software
Software ImageJ NIH Image J Image software
Software Nikon NIS-AR Nikon NIS-Elements AR Image capture and analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fooksman, D. R., et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation. Annual Review of Immunology. 28, 79-105 (2010).
  2. de la Roche, M., Asano, Y., Griffiths, G. M. Origins of the cytolytic synapse. Nature Reviews. Immunology. 16, 421-432 (2016).
  3. Griffiths, G. M., Tsun, A., Stinchcombe, J. C. The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis. The Journal of Cell Biology. 189, 399-406 (2010).
  4. Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes. Frontiers in Immunology. 9, 684 (2018).
  5. Friedl, P., den Boer, A. T., Gunzer, M. Tuning immune responses: diversity and adaptation of the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 5, 532-545 (2005).
  6. Xie, J., Tato, C. M., Davis, M. M. How the immune system talks to itself: the varied role of synapses. Immunological Reviews. 251, 65-79 (2013).
  7. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  8. Alonso, R., et al. Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 18, 1161-1173 (2011).
  9. Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., Izquierdo, M. Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 23, 99-109 (2016).
  10. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  11. Montoya, M. C., et al. Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs. Nature Immunology. 3, 159-168 (2002).
  12. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews. Immunology. 4, 301-308 (2004).
  13. Huse, M., Quann, E. J., Davis, M. M. Shouts, whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nature Immunology. 9, 1105-1111 (2008).
  14. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. The Journal of Experimental Medicine. 173, 1099-1109 (1991).
  15. Vignaux, F., et al. TCR/CD3 coupling to Fas-based cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 181, 781-786 (1995).
  16. de Saint Basile, G., Menasche, G., Fischer, A. Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules. Nature Reviews. Immunology. 10, 568-579 (2010).
  17. Huse, M. Microtubule-organizing center polarity and the immunological synapse: protein kinase C and beyond. Frontiers in Immunology. 3, 235 (2012).
  18. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. The Journal of Cell Biology. 202, 779-792 (2013).
  19. Jang, J. H., et al. Imaging of Cell-Cell Communication in a Vertical Orientation Reveals High-Resolution Structure of Immunological Synapse and Novel PD-1 Dynamics. Journal of Immunology. 195, 1320-1330 (2015).
  20. Kupfer, A., Singer, S. J. Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples. Annual Review of Immunology. 7, 309-337 (1989).
  21. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature Reviews. Immunology. 11, 672-684 (2011).
  22. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. Journal of Structural Biology. 168, 152-160 (2009).
  23. Jambrina, E., et al. Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death. The Journal of Biological Chemistry. 278, 14134-14145 (2003).
  24. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7 1 (2009).
  25. Herranz, G., et al. Protein Kinase C delta Regulates the Depletion of Actin at the Immunological Synapse Required for Polarized Exosome Secretion by T Cells. Frontiers in Immunology. 10, 851 (2019).
  26. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42, 864-876 (2015).
  27. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence Microscopy: A Concise Guide to Current Imaging Methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, (2017).

Tags

Immunologi og infektion T-lymfocytter antigen-præsenterer celler immunologisk synapse microtubule-organisere-Center polariseret trafik multivesikulære organer
Billeddannelse den humane immunologiske synapse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M.,… More

Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M., Velasco, M., Moreno, S., Garrido, A., Meyers, L., Palomino, J. C., Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging the Human Immunological Synapse. J. Vis. Exp. (154), e60312, doi:10.3791/60312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter