Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imaging Human immunologiske synapse

Published: December 26, 2019 doi: 10.3791/60312
Automatic Translation
*1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, *1,2
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid, 2Departamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols CSIC-UAM, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, 3Unidad de Audiovisuales, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen bilder både immunologiske synapse formasjon og den påfølgende polarisert sekretoriske trafikk mot immunologiske synapse. Cellular konjugater ble dannet mellom en superantigen-pulserende Raji celle (fungerer som en antigen-presentere celle) og en Jurkat klone (fungerer som en effektor hjelper T-lymfocytter).

Abstract

Formålet med metoden er å generere en immunologiske synapse (IS), et eksempel på celle-til-celle Bøyning dannet av en antigen-presentere celle (APC) og en effektor hjelper T lymfocytter (th) celle, og for å spille inn bilder som tilsvarer de første stadiene av IS formasjon og påfølgende smugling hendelser (forekommer både i APC og i th cellen). Disse hendelsene vil til slutt føre til polarisert sekresjon på IS. I denne protokollen, Jurkat celler utfordret med Staphylococcus enterotoksin E (se)-pulserende Raji celler som en celle synapse modellen ble brukt, på grunn av nærheten til dette eksperimentelle systemet til den biologiske virkeligheten (th Cell-APC Synaptic konjugater). Tilnærmingen som presenteres her innebærer celle-til-celle Bøyning, time-lapse oppkjøp, Wide-Field fluorescens mikroskopi (WFFM) etterfulgt av bildebehandling (post-oppkjøpet deconvolution). Dette forbedrer signal-til-støy-forhold (SNR) av bildene, forbedrer Temporal oppløsning, gjør synkronisert oppkjøpet av flere fluorokromer i nye Synaptic konjugater og reduserer fluorescens bleking. I tillegg er protokollen godt matchet med endepunktet celle fiksering protokoller (paraformaldehyde, aceton eller metanol), som ville tillate ytterligere immunofluorescence farging og analyser. Denne protokollen er også kompatibel med laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi (LSCM) og andre State-of-the-art mikroskopi teknikker. Som en hoved advarsel, bare de T Cell-APC grenser (kalt IS grensesnitt) som var på rett 90 ° vinkel til fokus flyet langs Z-aksen kan være riktig avbildet og analysert. Andre eksperimentelle modeller eksisterer som forenkler Imaging i Z dimensjon og følgende bildeanalyser, men disse tilnærmingene ikke etterligne den komplekse, uregelmessige overflaten av en APC, og kan fremme ikke-fysiologiske interaksjoner i IS. Dermed er den eksperimentelle tilnærmingen som brukes her er egnet til å reprodusere og å konfrontere noen biologiske kompleksiteten oppstår på IS.

Introduction

Hovedmålet med metoden er å generere immunologiske synapse (IS) celle-til-celle konjugater dannet av en antigen-presentere celle (APC) pulserende med se superantigens og en effektor th celle, og å registrere bilder som tilsvarer de første stadiene av immunologiske synapse formasjon og påfølgende smugling hendelser (forekommer både i APC og th cellen), som til slutt vil føre til polarisert sekresjon på IS. Opprettelsen av det er av T-lymfocytter ved binding av deres celle reseptor (TCR) til antigener bundet til MHC-II på APC organiserer en ekstremt dynamisk, formbare og kritisk forekomst involvert i antigen-spesifikke, humoral og cellulære immunresponser1,2. IS er definert ved dannelsen av en spesiell supramolekylært aktiverings kompleks (SMAC) mønster preget av en utgangen omorganisering prosess3. Upon IS konstruksjon av T-lymfocytter med en APC, polarisering av sekretoriske blemmer mot IS synes å være innblandet i polarisert sekresjon på Synaptic gapet. Dette fokuserte maskiner synes å entydig forsyne immunforsvaret med en ypperlig regulert krigslist å forsterke effekten av kritiske sekretoriske effektor roller av T-lymfocytter, samtidig redusere uspesifisert, cytokin-meglet stimulering av tilskuer celler, drap av irrelevante målceller og apoptotisk selvmord via aktivisering-indusert celle død (AICD)4.

Konsekvensen av IS varierer på innholdet i både T-lymfocytter og APC. Den Synaptic kontakt av th celler (vanligvis CD4 + celler) med APC viser antigen-knyttet til MHC-II produserer aktiveringen av T-cellen (cytokin sekresjon, spredning, etc.) og, i noen tilfeller, apoptose via AICD4. For cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) (hovedsakelig CD8 + celler) i samspill med APC presentere antigen knyttet til MHC-I, utfallet avviker på pre-stimulering eller ikke av CTLer med antigen. Dermed naiv CTLer identifisere antigen-MHC-I komplekser på APC er "primet" for å ødelegge målet celler og dividere. Primet CTLer også etablere synapser med målcellene (dvs. celler infisert av virus eller tumorceller) produserer antigen-spesifikk celle utryddelse5,6.

Den polariserte utskillelsen av exosomes på immunologiske synapse er et utviklende og utfordrende område av forskning involvert i relevante immunresponser7. Det har blitt demonstrert at multivesicular organer (MVB) bærer intraluminal blemmer (ILVs) erfaring polarisert transport mot er8,9 (Video 1) ved TCR stimulering med antigen. Fusjonen av disse MVB på Synaptic membranen induserer deres degranulering og utgivelsen av ILVs som exosomes til Synaptic kløft8,10. Dette skjer i er dannet av th-type Jurkat celler som ble utfordret med se superantigen-belagt Raji celler opptrer som APC11, TCR-stimulert CD4+ Lymphoblasts, og primet CTLer. Således, synapser fremstilt av Jurkat celler utgjøre en kostbar modell å studere polarisert sekretoriske trafikk av exosomes. I tillegg har flere ti år med etterforskning vist at mange grunnleggende innsikt i TCR signalering kom fra studier med transformert T-cellelinjer, og faktisk den mest kjente av disse modellsystemer er Jurkat Leukemic T-Cell linje12.

Dannelsen av en fullt utviklet IS produserer flere viktige biologiske utfall, inkludert aktivering av th celler, aktivering av naive CTLer eller målet celle drap av primet CTLer, bortsett fra anergy eller AICD5. Derfor er det to hovedtyper av sekretoriske er etablert av T-lymfocytter som resulterer i svært mangfoldig, men tilsvarende kritisk, uimottakelig effektor funksjoner1,6,13. På den ene siden, er fra primet cytotoksisk T-lymfocytter (CTLer) induserer rask polarisering (alt fra sekunder til noen minutter) av lytisk granulater (kalt "sekretoriske lysosomer") mot IS. Degranulering av lytisk granulater induserer utskillelsen perforin og granzymes til Synaptic kløft14, som er Pro-apoptotisk molekyler. De skilles ut perforin og granzymes senere indusere drap av målet cellene15,16. CTLer utvikle midlertidige synapser, som varer bare noen få minutter, som målcellene blir myrdet3,17. Dette er trolig på grunn av omstendighetene som den optimale CTL oppgaven krever en rask og midlertidig kontakt for å distribuere så mange dødelige streiker som mulig til en rekke målcellene3,17. I kontrast, th lymfocytter som Jurkat celler genererer stabil, langvarig er (fra 10-30 min opp til timer), siden dette synes å være nødvendig for både retningsbestemt og uopphørlig sekresjon av stimulerende cytokiner3,17. Cytokiner er også omsluttet av sekretoriske blemmer og noen av dem (dvs. IL-2, IFN-γ) erfaring polarisert transport til IS17 og sekresjon. En viktig karakteristikk av IS er dannelsen av utforskningen, svake og forbigående kontakter mellom T-cellen og APC (Video 1) som kan gi en sterkere interaksjon og etablering av en moden is, forutsatt at TCR identifiserer beslektet ANTIGEN-MHC komplekser og at passende co-stimulerende tilkoblinger er etablert5. Både begynnelsen av den innledende kontakter og grunnleggelsen av en moden, helt produktive er, er iboende Stokastisk, rask og asynkron prosesser5,18. Videre er det en knappe frekvens i etableringen av celle-til-celle konjugater19, som kan utgjøre en utfordring for Imaging teknikker (Vennligst se resultater og diskusjon seksjoner).

En annen stor utfordring i å undersøke polarisering av mikrotubulinettverket-organisering Center (MTOC) og sekretoriske granulater i T-lymfocytter er at hele prosessen er rask (sekunder til noen minutter), spesielt i CTLer. vurderer disse fakta, de fleste tidlige tilnærminger konfrontert en endepunkt strategi der APC/Target celler og T-lymfocytter er blandet sammen og løpe sammen med lav hastighet sentrifugering, for å favorisere celle-til-celle bøye skapelsen, inkubert i flere minutter, fast og senere evaluert for flytting av MTOC og/eller sekretoriske blemmer mot IS20. Denne tilnærmingen har to vesentlige begrensninger: ingen levende menneskehandel data ble oppnådd og høye nivåer av bakgrunn MTOC/sekretoriske granulater polarisering ble innhentet, sannsynligvis på grunn av Stokastisk karakter er etablering18. Videre enhver sammenheng mellom TCR-stimulert, innledende signalering hendelser (dvs. intracellulære kalsium stiger, utgangen omorganisering) og sekretoriske vesicle polarisering er problematisk å undersøke. Dermed er avgjørende bestemmelser for hensiktsmessig avbildning av IS i levende celler kombineres for å forbedre celle-til-celle bøy materialisering, for å synkronisere generering av IS og, når det er mulig, for å garantere etablering av mobilnettet konjugater på definerte mikroskop XY felt og Z posisjoner. Flere strategier har blitt utviklet for å unngå alle disse problemene. Det er ute av omfanget av dette papiret for å forklare disse metodene, deres fordeler og svakheter. Vennligst henvis til tidligere publiserte vurderinger håndtere disse viktige punktene1,4,5,21.

Det faktum at er laget av th lymfocytter er lang levetid, og forholdet som i th lymfocytter den MTOC, lymfokingener inneholder sekretoriske granulater og MVB ta fra flere minutter til timer for å flytte og Dock til er22 gjør th-APC er en ideell kandidat for Imaging bruker protokollen beskrevet her.

Protocol

1. utarbeidelse av slides å overholde Raji Cells

  1. Tilsett 150 μL av fibronektin (100 μg/mL) per brønn til en 8 mikrotiterplateleser kammer sklie (plast bunn kammer Slide) og ruge det i 30 min til 1 t ved 37 ° c. Dette vedheft underlaget vil tillate binding av Raji celler til brønnen bunnen (trinn 2), dannelsen av levende konjugater med Jurkat celler (trinn 4) celler, og time-lapse mikroskopi fangst (trinn 6), og er også kompatibel etterpå med valgfri paraformaldehyde (PFA) fiksering (trinn 7).
    Merk: For aceton fiksering, bruk glassbunn kammer lysbilder og Poly-L-lysin (20 μg/mL) i stedet for fibronektin, siden aceton oppløse plast. 8 mikrotiterplateleser kammer Slide (1 cm2 brønn, 300 μL maksimalt volum) eller tilsvarende er et fleksibelt og passende format.
  2. Aspirer fibronektin med en 200 μL automatisk pipette og vask hver brønn med 200 μL av PBS i 2 minutter med skånsom risting. Gjenta denne vasken en gang til. Kammeret lysbildet kan lagres på dette stadiet med PBS for 1-2 uker ved 4 ° c.

2. vedheft av Raji celler til kammeret slides og 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) merking

  1. Overføring 10 mL av en confluent (1-2 x 106 celler/ml) pre-kulturen i Raji celler til en 15 ml, V-Bottom tube. Bland godt og bruk 10 μL for å telle cellene i Neubauer kammer eller tilsvarende.
  2. Sentrifuger de resterende cellene ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur. Aspirer og kast supernatanten.
  3. Forsiktig resuspend celle pellet i varmt komplett kultur medium (RPMI 1640 supplert med 10% FCS, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL Streptomycin) ved en konsentrasjon på 106 celler/ml. Bruk ligningen som er angitt nedenfor:
    ([]Initial x vInitial = []Final x vFinal), der []første representerer første celle konsentrasjon, VInitial = første bind av cellen suspensjon, []Final = endelig celle konsentrasjon, VFinal = endelige volumet av cellen suspensjon.
    Merk: Avhengig av celle konsentrasjonen av Start kulturen, er det mulig å samle flere celler enn nødvendig, men det er viktig å opprettholde de resterende cellene i kulturen (37 ° c) til slutten av eksperimentet for å hindre potensielle problemer (se trinn 2,6).
  4. Label Raji celler for å tillate deres identifikasjon under Synaptic bøye formasjonen. I dette eksperimentet utføres merkingen av 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) i trinn 2.4.2.
    1. Overfør det nødvendige antall Raji-celler i kultur mediet til et 2 mL rør. For 8 mikrotiterplateleser kammer slide, er totalt 1,6 mL av celle suspensjonen nødvendig (200 μL per brønn).
    2. Legg CMAC til en endelig konsentrasjon på 10 μM. Hold cellene i mørket ved å dekke røret med aluminiumsfolie siden CMAC er lysfølsom. 200 μL som inneholder 2 x 105 Raji celler er nødvendig per 1 cm2 brønn. Således, hvis 8 brønner må være forberedt, 1,6 x 106 Raji celler er nødvendig.
      Merk: Merking Raji celler med celle tracker blå (CMAC, UV eksitasjon og blå utslipp) skiller dem fra th celler når Synaptic konjugater dannes. Dette fargestoffet er kompatibelt med PFA og aceton fiksativene og tillater videre immunofluorescence prosedyrer. Prøv å unngå lys utstilling. Merkingen av Raji celler i et basseng med CMAC etterfulgt av blanding før vedheft av Raji cellene til fibronektin kammer lysbilder sikrer homogen merking av Raji celler med CMAC blant forskjellige brønner.
  5. Resuspend CMAC-fargede celler, og etter aspirasjon av PBS i kammeret lysbildet fra trinn 1,2., overføre 200 μL av celle suspensjonen til hver brønn av fibronektin-belagt kammer lysbilder utarbeidet i trinn 1.1-1.2. Ruge kammer raset ved 37 ° c, 5% CO2 for 30 min-1 h.
    Merk: Vedheft og CMAC merking vil samtidig skje på dette trinnet, og dette sparer tid. Vær oppmerksom på at Raji celler vil sediment raskt og forsiktighet må tas for å opprettholde en homogen konsentrasjon i celle suspensjonen før seeding. Det er ikke nødvendig å vaske CMAC på dette stadiet av sentrifugering, siden CMAC vasking vil bli lettere gjort på trinn 2,7 (når merket Raji cellene er allerede levd opp til kammeret lysbilder). Siden CMAC er til stede i celle suspensjonen i stort overskudd, den blå fluorescens bakgrunnen er for høy til å skille de blå-farget celler. Sjekk celle CMAC fluorescens i trinn 2,7 etter CMAC vasking.
  6. Sørg for at Raji celler er festet til bunnen av brønnene ved forsiktig risting av kammeret lysbilder på mikroskopet. Kontroller at cellene viser mellomrom mellom hverandre og ikke er confluent (figur 1, midtre panel). 50-60% av celle samløpet er hensiktsmessig.
    1. Hvis de fleste cellene effektivt holder seg til kammer raset og det ikke blir observert noen celle åpninger, vask hver brønn med varmt komplett medium og resuspend mediet med en 200 μL automatisk Pipet for å løsne celle overflødig. Sjekk samløpet etter hvert blanding trinn.
    2. Hvis cellene ikke overholder, gjentar vedheft trinn igjen og øke vedheft tid og/eller celle nummer.
      Merk: Det er mulig å stoppe her, ruge kammer raset ved 37 ° c, 5% CO2 overnight (O/N), og fortsette med protokollen neste dag. Vennligst Bekreft neste dag at Raji celler forblir overholdt og CMAC-merket ved hjelp fluorescens mikroskopi.
  7. Vask hver brønn igjen nøye med varmt supplert RPMI å eliminere overflødig CMAC og se etter blå utslipp med fluorescens mikroskop (figur 1).
    Merk: For å unngå bruk av nedsenking olje (klissete og tyktflytende) og høy numerisk blenderåpning olje mål, ekstra lang avstand (dvs, 20x eller 40x) mål kan brukes til å raskt sjekke CMAC merking ved hjelp av fluorescens mikroskop.

3. puls av CMAC-merket Raji celler med stafylokokk enterotoksin E

  1. Legg til stafylokokk enterotoksin E (se, 1 μg/mL) i hver brønn. SEE kan enkelt fortynnes i cellekultur medium (arbeids løsning ved 100 μg/mL) fra se frosne aksjer (1 mg/mL i PBS). Bruk 2 μL av den 100. arbeids løsningen per 200 μL mikrotiterplateleser.
    Forsiktig: Bruk hansker for dette trinnet og kast den brukte spissen inn i Biohazard boksen.
  2. Ruge kammer raset ved 37 ° c, 5% CO2 i minst 30 min. SE-effekten varer i minst 3-4 t.
    Merk: SEE kan legges til brønnene på ulike tidspunkter når det er nødvendig, hvis forskjellige tidsforløp oppsett er planlagt (trinn 5) og/eller avhengig av starttidspunktet for sluttpunktet eksperimenter (trinn 6).

4. utarbeidelse av Jurkat Cells

  1. Bruk en tidligere voksende kultur av Jurkat celler (1-2 x 106 celler/ml) for dette eksperimentet. Bruk celler fra en standard kultur kolbe eller fra en tidligere transfeksjoner følgende standard electroporation protokoller, som tidligere beskrevet23. Transfeksjoner av Jurkat celler vil tillate tid forfalle visualisering av trafikken av sekretoriske granulater i levende celler. For eksempel, når GFP-CD63 (en markør av MVB) uttrykkes bevegelsen av GFP-CD63-dekorerte blemmer kan tas opp (Video 1).
  2. Observer cellene under et fase kontrast mikroskop. Hvis et overskudd av døde celler (> 20-30%) er observert, utføre Ficoll tetthet gradient sentrifugering bruker standardprotokoller24, for å eliminere overflødig av døde celler (døde celler viser høyere tetthet enn levende celler) før bruk (se diskusjon).
  3. Overfør cellene til et 15 mL rør, V-bunn rør, og bruk 10 μL for telling ved hjelp av hemocytometer.
  4. Sentrifuger de resterende cellene som beskrevet i trinn 2,2. Kast supernatanten og resuspend cellene i samme konsentrasjon som Raji celler (1 x 106/ml) ved hjelp av friskt, varmt kultur medium. Følg trinn 2.2-2.3.
  5. Opprettholde Jurkat cellene i kultur (37 ° c, 5% CO2) mens du venter på trinn 4.
    Merk: I det andre alternativet (transfeksjoner), er antall levende celler kommer til å være mye lavere enn i den første. Derfor bør du vurdere å bruke et høyere Start cellekultur volum for å få nok celler til eksperimentet. Fra 10 x 106 Jurkat celler per electroporation Cuvette og transfeksjoner, bare 2-4 x 106 Jurkat celler vil overleve etter 48 h av transfeksjoner og noen av disse cellene vil gå tapt under Ficoll trinnet. Således, ettall electroporation Cuvette er vanligvis nok å angripe det holdt se-pulserende Raji celler fra 8 mikro-brønner (1,6 x 106 transfekterte Jurkat celler behøvde).

5. co-seeding av Raji og Jurkat Cells

  1. Ta kammeret lysbilder som inneholder CMAC-merket, se-pulserende, levd Raji celler ut av inkubator fra trinn 3,2. Det er ikke nødvendig å vaske CMAC på dette stadiet siden dette ble gjort tidligere i trinn 2,7.
  2. Aspirer nøye kulturen medium for hver brønn, en etter en, fra et hjørne av brønnen ved hjelp av en automatisk 200 μL pipette. Ikke la mediet i brønnen tørke ut helt.
  3. Erstatt umiddelbart mediet med 200 μL av resuspendert Jurkat celler i cellekultur medium (1 x 106/ml) fremstilt i trinn 4,5. Hvis tid forfalle tenkelig er utført, gå til trinn 6 umiddelbart etter dette trinnet, siden Jurkat celler har en tendens til sediment og form Synaptic konjugater svært raskt. For enkelhets skyld, microwells inneholder SEE-pulserende, overholdt Raji celler som ikke mottar seeding med Jurkat celler på dette stadiet bør opprettholdes med cellekultur medium inntil etterfølgende utfordring med Jurkat celler. Dette vil fleksibelt tillate påfølgende utfordring med Jurkat celler for ekstra tid forfalle eller omvendt kinetisk, endepunkt eksperimentelle tilnærminger.
  4. Hvis en tidsforløp skal utføres, går du raskt videre til trinn 6. Dette innebærer co-kulturen for 1-2 h på mikroskopet scenen inkubator eller tilsvarende ved 37 ° c, 5% CO2 for å tillate Synaptic bøye formasjonen og samtidig bilde oppkjøpet. Hvis sluttpunkt analyse, men ingen tidsforløp, er forutsett sjekke bøye formasjon etter co-kulturen perioden ved hjelp av mikroskopet (som i figur 1) før fikse cellene (trinn 7).

6. tid lapse tenkelig av Emerging Synaptic Konjugater

  1. Klargjør mikroskopet og inkubasjons kammeret før bildebehandling. For eksempelet som vises i video 1, vises de detaljerte mikroskopi innstillingene i figur 2.
    Merk: Hvis en tid forfalle eksperimentet er planlagt, alle mikroskop innstillinger og utfyller (ambient cellekultur kammer, etc.) bør være forberedt før du legger til Jurkat suspensjon til kammeret lysbildet med levd Raji celler. Følgende trinn er beskrevet for et kommersielt mikroskop (materialfortegnelsen). Men noen invertert fluorescens mikroskop utstyrt med en cellekultur inkubator kan brukes.
    1. Bruk et mikroskop med en 60x, høy numerisk blenderåpning ved bildebehandling med polarisert trafikk.
    2. Kontroller at det automatiske fokus systemet er slått på og Juster forskyvningen for å fokusere Raji-cellene som er bundet til den nederste overflaten. Se figur 1, Video 1 og video 2.
  2. Etter Jurkat tillegg til hver brønn inneholder overholdt Raji cellene i trinn 5,3, raskt finne mikrotiterplateleser kammer lysbilde på pre-oppvarmet (1-2 h) mikroskop scenen inkubator (dvs. OKOlab) og velg noen XY posisjoner med mikroskopet, felt der det er sannsynlig å spille inn en voksende IS formasjon laget av for eksempel en Jurkat-transfekterte celle faller i mikroskopet fokus.
  3. Bruk en pre-oppvarmet mikroskop scene inkubator siden det ble observert at en temperatur-stabilisert scenen opprettholder stabile X, Y, Z posisjoner. Kriterier for en praktisk XY feltet er: godt fokusert og ikke-confluent Raji celler (dvs. viser hullene mellom celler) og tilstedeværelsen av transfekterte Jurkat celler (dette kan kontrolleres ved å kombinere transmisjon og UV eller GFP kanaler). Jurkat celler vil sediment svært raskt (noen minutter) på kammeret lysbildet, og sjansene til bildet nye synapser vil avta med tiden (figur 1). Det er mulig enten å fullføre eksperimentet etter den definerte tidsforløp eller gå videre til trinn 7 og fikse konjugater for senere immunofluorescence og analyser.
    Merk: Det er mulig å velge opptil 16 ulike mikroskop felt fra opptil 4 forskjellige microwells for samtidig, multi-Well time-lapse oppkjøpet med riktig Temporal oppløsning (1-2 min per bilde). Begrensningen er avhengig av både antall og intensitet (påvirker kameraet utstillingen) av de ulike fluorokromer å bli avbildet (avhengig av antall uttrykte fluorescerende proteiner, bortsett fra CMAC). En måte å øke bildefrekvensen er innspillingen for CMAC kanal i bare én av hver "n" tidsrammer for GFP (dvs. n = 8, som vist i figur 2), siden Raji celler er levd opp til brønnen bunn og ikke lett bevege seg som Jurkat celler. I tillegg er dette fordeler cellen levedyktighet, siden hyppige UV-lys eksponering kan skade cellene. Prøv å justere tidsramme hastigheten til 1 ramme hvert 1 minutt eller mindre (dvs. 20 s per ramme i Video 1, figur 2) siden polarisering av MVB tar noen minutter til timer å fullføre. Et mikroskop utstyrt med en motorisert Epi-fluorescens turret og passende band-pass fluorescens filtre eller ekvivalenter er nødvendig for å utføre denne flerkanals fangst.

7. sluttpunkt dannelse av Synaptic Konjugater og fiksering

  1. Hvis bare et sluttpunkt eksperiment er planlagt (1-2 timer inkubasjons å tillate Synaptic bøye formasjonen er hensiktsmessig), ruge kammeret lysbildet ved 37 ° c, 5% CO2 for 1-2 h. Sjekk bøye formasjon etter kultur perioden (som i figur 1) og, senere, fikse KONJUGATER med aceton eller PFA (fiksering vil avhenge av antigener og antistoffer som skal brukes i den påfølgende immunofluorescence). I dette tilfellet inkubasjons ikke krever et mikroskop scenen inkubator. Vennligst referer til video 3 for et eksempel.
  2. For å fikse cellene, vask godt ved mild risting med varm RPMI (37 ° c) medium uten FCS (albumin fra serum kan utløse med aceton fiksering). Aspirer og tilsett 200 μL av PFA eller pre-kjølt aceton til hver brønn. Ruge kammer lysbildet ved romtemperatur (RT) eller på is, henholdsvis i 20 min.
    Merk: For aceton fiksering, pre-chill den aceton ved-20 ° c og pre-chill kammeret raset ved 4 ° c. Fjern plastlokk når aceton brukes til å fikse cellene kultivert i 8 brønn glass-Bottom kammer lysbilder.
  3. Vask hver brønn to ganger med PBS og tilsett 200 μL av slukke oppløsning (PBS, 50 mM NH4CL). Ruge kammer raset ved 4 ° c.
    Merk: På dette stadiet av kammeret Slide kan bo i minst en måned ved 4 ° c før du utfører immunofluorescence protokollen, som beskrevet8. Lokket hindrer fordampning.

8. bildebehandling

  1. Utfør bilde deconvolution (dvs. Huygens deconvolution eller tilsvarende, tabell over materialer) av tidsforløp serien og/eller stillbilder av faste celler. Deconvolute ved å bruke en passende programvare (dvs. ved hjelp av "Wide feltet" optisk alternativ i Huygens) og de riktige optiske parametre. Deconvolution nødvendiggjør for bildebehandling av den målte punkt sprednings funksjonen (PSF) til mikroskopet4.
  2. Alternativt kan du bruke programvaren til å beregne idealisert PSF ved automatisk lasting av de optiske parametrene inkludert blant metadataene fra mikroskopet filer. Disse optiske parametrene omfatter fluorokromkonjugert bølgelengde, brytningsindeks, numerisk blenderåpning og bildeteknikk (konfokalmikroskopi, vid felt, etc.) firetil.
  3. Deretter bruker Imaging programvaren PSF og diverse deconvolution algoritmer (dvs. QMLE og CMLE i Huygens programvare) i en steg-for-trinn samles opp, beregningsprosessen, hvis resultater enn kan være kontinuerlig visualisere og stoppet (eller gjenopptatt) når det kreves av brukeren. På dette stadiet kan brukeren endre antall convolutions og/eller signal til støyforhold og gjenoppta deconvolution. Den deconvolution programvaren fungerer godt med time lapse serien (X, Y, T) (video 2) og Z-stabler (X, Y, Z) (video 3). De deconvoluted kanalene ble senere slått sammen til CMAC, rå kanalen, siden cytosolic, diffus fluorokromer ikke forbedres av deconvolution4,9.

Representative Results

Vi har fulgt den beskrevne protokollen for å generere Jurkat-Raji immune synapse konjugater og til riktig bilde de tidlige stadier av IS formasjon. Vårt mål var å forbedre tidlig tilnærminger20 tidligere fulgt for å studere POLARISERING av MTOC og sekretoriske maskiner mot is. Disse tilnærmingene var basert på en endepunkt strategi som ikke tillater Imaging av IS formasjon eller tidlig Synaptic hendelser, siden i disse strategiene i IS formasjon obligatoriske skjedde i pellet av blandede, sentrifugert celler, men ikke på et mikroskop. Vår protokoll ble utviklet for å unngå dette viktigste påminnelse, siden tilnærmingen var basert på bruk av en passende celle konsentrasjon (trinn 2 og 3), for å favorisere dannelsen av celle-til-celle er konjugater på egen mikroskop kammer lysbilder (8 mikro brønn kammer Slide), montert på pre-oppvarmet mikroskop scenen inkubator (i trinn 4). Denne strategien induserer IS formasjon, samtidig til tid-lapse Imaging Capture (Video 1).

Figur 1 representerer Synaptic Jurkat-Raji-konjugater som ble innhentet etter protokollen (trinn 5,2). Bildet representerer det første bildet fra et representativt eksperiment med tidsforløp. 2 x 105 Raji celler og 2 x 105 Jurkat celler ble lagt til en 1 cm2 brønn. Den øvre panelet viser transmisjon kanal, den midterste panelet består av CMAC (blå) kanal (Raji celler), og den nedre panelet viser både transmisjon pluss CMAC fusjonerte kanaler. Gule piler merke noen Synaptic konjugater, som referanse, mens grønne piler indikerer Synaptic konjugater laget av en Jurkat celle og flere Raji celler (komplekse konjugater). Synkende celle konsentrasjoner (105 eller mindre celler i 1 cm2 brønn) vil omgå dannelsen av komplekse cellulære konjugater, men det kan ikke være nok celle konjugater for påfølgende analyse av polarisert trafikk (se nedenfor), som igjen vil redusere også sjansene for å finne og til bildet nye Synaptic konjugater.

Figur 2 representerer skjermbilder som tilsvarer bilde parametrene som brukes for samtidig fangst av de to forskjellige FLUOROKROMER (CMAC og GFP-CD63) ved hjelp av riktig programvare (dvs. Nikon NIS_AR) i et representativt tidsforløp eksperiment som tilsvarer Video 1.

Video 1 (immunologiske synapser, rå) representerer en Jurkat T-LYMFOCYTTER uttrykker GFP-CD63 (en markør av multivesicular organer-MVB, grønne blemmer) og dannelsen av en dobbel synapse mellom 1 Jurkat celle og 2 Raji celler merket med CMAC, i blått (en av dem gjennomgår oppslukningsprosess). Den samtidige bevegelse av MVB inne i Jurkat cellen mot synapse områder ble registrert (Capture Frame Rate = 1 ramme hvert 20. sekund for GFP-CD63; video reproduksjon hastighet = 2 bilder per s). Den Synaptic konjugater ble innhentet og avbildet etter protokollen beskrevet ovenfor (trinn 6,2), som tillot Imaging av nye synapser (Video 1). Samtidig fangst av både GFP-CD63 og CMAC fluorescens kanaler ble utført ved hjelp av en passende programvare (dvs. NIS-AR, tabell av materialer). Videoen representerer rådata fra et representativt eksperiment med tidsforløp. Det automatiske fokus systemet ble definert med en hensiktsmessig forskyvning med hensyn til Raji-cellene som var bundet til glass bunnen, for å sikre et stabilt fokus langs eksperimentet.

Video 2 (immunologiske synapser, etter deconvolution) tilsvarer Video 1, men DECONVOLUTION av GFP-CD63 fluorescens kanal bildene ble utført ved å ansette en passende deconvolution programvare (dvs. Huygens), ved hjelp av "Wide feltet" optisk alternativ og riktig optiske parametre (trinn 8). Denne deconvoluted kanalen ble senere slått sammen til CMAC, rå kanalen. Forbedringen av både signal-til-støy-forhold og skarpheten i bildet er tydelig. Deconvolution ble utført etter oppkjøpet, som beskrevet ovenfor. For spesifikke detaljer om deconvolution programvare henvises til4.

Video 3 (immunologiske synapse, etter innfesting og immunofluorescence farging) representerer en z-stabel (z-trinn størrelse = 0,8 μm, 5 bilder) av en fast er bøye etter trinn 6 av protokollen (aceton fiksering). Etter fiksering ble immunofluorescence utført etter standardprotokollene25 ved hjelp av Phalloidin for å visualisere F-utgangen (grønn), anti-CD63 for å visualisere MVB (magenta), anti-γ-tubulin for å visualisere MTOC (rød). CMAC (blå) merker Raji-cellen. Deretter ble bøy avbildet av epifluorescence og flere kanaler deconvoluted ved hjelp av "Wide feltet" optisk alternativ og de riktige optiske parametre (trinn 7). De deconvoluted kanalene ble senere fusjonert til CMAC, rå kanal, som indikert i de forskjellige panelene (CMAC pluss transmisjon-TRANS, CMAC pluss Phallodin, CMAC pluss anti-CD63 og CMAC pluss anti-γ-tubulin, henholdsvis). Hvit pil merker synapse, mens den grønne pilen merker MVB og den gule pilen merker MTOC. Den detaljerte kvantifisering av MVB og MTOC polarisering har blitt forklart andre steder25.

Tilnærmingen som presenteres her innebærer dannelsen av celle-til-celle konjugater og samtidig, det time-lapse oppkjøpet av Wide-feltet fluorescens mikroskopi (WFFM) etterfulgt av bildebehandling (post-oppkjøpet deconvolution). Denne taktikken forbedret signal-til-støy-forhold (SNR) av bildene, forbedret deres Temporal oppløsning, og tillot synkronisert oppkjøpet av flere fluorokromer i fremvoksende Synaptic konjugater4. I tillegg er protokollen godt matchet med påfølgende endepunkt celle fiksering metoder (paraformaldehyde, aceton eller metanol), som ville tillate ytterligere immunofluorescence farging og analyser25 (video 3). Denne protokollen er også kompatibel med laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi og andre State-of-the-art mikroskopi teknikker.

Figure 1
Figur 1: representativ dobbel størrelse mikroskopi felt av Synaptic konjugater. Bildet representerer det første bildet fra et representativt eksperiment med tidsforløp etter protokollen. Den øvre panelet viser transmisjon kanal, midtpanelet CMAC kanal (Raji celler) og den nedre panel begge fusjonerte kanaler. Gule piler merke noen Synaptic konjugater, som referanse. Grønne piler indikerer kompleks Synaptic konjugater (dvs. en Jurkat celle etablere synapser med mer enn én Raji celle). Tatt med en 40x EWD (0,6 NA) mål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: innstillinger for tidsforløp mikroskop. Bildet tilsvarer flere skjermbilder som tilsvarer Imaging parametrene som brukes for samtidig fangst av de to forskjellige fluorokromer (CMAC og GFP-CD63) ved hjelp av riktig programvare (dvs. NIKON NIS_AR) i et representativt tidsforløp eksperiment tilsvarende Video 1. Hvert bilde for GFP-CD63 kanal ble tatt hver 20 s. Bare én ramme for en UV-kanal av åtte rammer for GFP-kanalen ble fanget opp for å opprettholde celle levedyktigheten langs eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: immunologiske synapser laget av en Jurkat celle uttrykker GFP-CD63, rå data. Raji B-celler merket med celle tracker blå (CMAC, blå) var pulserende med se i 30 min og synapser med Jurkat celler uttrykker GFP-CD638 ble dannet. Time-bortfaller tilsvarende GFP-CD63 og CMAC kanaler ble tatt (20 s per bilde; video reproduksjon hastighet = 2 bilder per s) og et representativt eksempel vises. Tatt med en 60x PLAN APO (1,4 NA) mål. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).

Video 2
Video 2: immunologiske synapser laget av en Jurkat celle uttrykker GFP-CD63, etter deconvolution. Likt idet Video 1, bortsett fra profilen var deconvoluted benytter en deconvolution programvare. Den forbedrede signal-til støy-forhold og forbedret skarphet, på grunn av eliminering av forurensende stoff ute av fokus fluorescens, er tydelig. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).

Video 3
Video 3: faste og immunostained immunologiske synapse. Bildet viser en representativ fast Synaptic bøye etter trinn 7 av protokollen og påfølgende immunofluorescence. CMAC (blå) etiketter Raji celler, transmisjon (TRANS) å vise Synaptic bøy (hvit pil), Phalloidin etiketter F-utgangen (grønn), anti-CD63 etiketter MVB (magenta, grønn pil) og anti-γ-tubulin etiketter MTOC (rød, gul pil), henholdsvis. Disse kanalene ble avbildet av epifluorescence, deconvoluted og slått sammen som indikert. Videoen inneholder en Z-stabel (z-trinns størrelse = 0,8 μm, 5 bilder). White Arrow etiketter i Synaptic kontaktområdet, mens den grønne pilen etikettene MVB og den gule pilen etikettene MTOC. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).

Discussion

En begrensning av denne protokollen er at ikke alle synapser vil være ideelt orientert vinkelrett på den optiske aksen. Ved hjelp av denne teknikken, er det ingen måte å forutsi og/eller å påvirke den ideelle orientering for uimottakelig synapse Imaging. For å løse dette problemet, ekskluderer vi fra den påfølgende analyser alle tilfeldig fanget synapser som til slutt ikke oppfyller de ideelle kriteriene. Disse synapser, opportunely nok, er ikke veldig hyppige. Det er imidlertid mulig å omgå denne begrensningen ved hjelp av flere eksperimentelle tilnærminger4.

Den polariserte CD63 release (degranulering) kan kvantifisert av andre komplementære teknikker som celleoverflaten farging av CD63 (CD63 relocalization til celleoverflaten) i levende celler (ikke fast og ikke permeabilized), etter trinn 6, og påfølgende vask og fiksering, som tidligere vist8. I tillegg kan CD63 utgivelse på exosomes8,9 og exosome kvantifisering av nanopartikkel Tracking analyser9,25 utføres. Disse tilnærmingene er sikkert kompatible med vår protokoll, forutsatt fiksering blir utført etter celleoverflaten immunofluorescence av levende celler.

Vi har funnet det ideelle antall celler (for en 1 cm2 godt i 8-brønn kammer Slide) er 4 x 105 celler (2 x 105 Raji celler og 2 x 105 Jurkat celler) siden de holder seg effektivt til bunnen av brønnen. Bindende effektivitet til plast (ved hjelp av fibronektin), eller glassbunn (ved hjelp av Poly-L-lysin) microslides er vanligvis ikke et problem. Høyere celle tall kan produsere noen hull blant overholdt celler og, senere, komplekse Synaptic konjugater (figur 1); begge situasjoner er ikke ønskelig når én celle-til-celle konjugater trenger å bli avbildet i, for eksempel, MTOC eller sekretoriske granule polarisering eksperimenter. Lavere antall celler kan redusere sjansene for å finne konjugater, spesielt når transfekterte Jurkat celler blir utfordret med APC til å generere synapser. Vær oppmerksom på at vi har observert at en temperatur stabilisere scenen inkubator på plass på mikroskopet X/Y scenen før utbruddet av protokollen (dvs. 1-2 h på forhånd for å stabilisere scenen/mikroskop oppsett) opprettholder stabile X, Y, Z parametere, som er avgjørende for riktig bildebehandling. Automatisk fokus systemet vil til slutt kompensere små Z variasjoner.

Når visse gen Transduction teknikker som electroporation brukes til å uttrykke fluorescerende chimeric proteiner (dvs. GFP-CD63) i Jurkat kloner (Video 1), kan en betydelig brøkdel av cellene dø etter electroporation. Dette kan være et problem siden selv om døde celler ikke danner synapser, når de er i overkant over de levende, transfekterte celler, kan de forstyrre dannelsen av konjugater laget av levende th celler. Vi har funnet at forsiktig eliminering av døde celler fra transfekterte kulturer ved hjelp av en tetthet gradient medium følgende standardprotokoller før bøye formasjonen trinnet kan faktisk øke sjansene til riktig bilde konjugater. I tillegg har lav transfeksjoner effektivitet (< 20%) kan være en viktig påminnelse siden dette, kombinert med en moderat bøye formasjon effektivitet (rundt 60%)25, vil redusere sannsynligheten for å finne konjugater laget av transfekterte celler. Dette er ikke et problem når ikke-transfekterte celler brukes til å få konjugater i endepunktet eksperimenter og påfølgende fiksering. De 8 mikrotiterplateleser kammer lysbildene er kompatible med konvensjonelle immunofluorescence protokoller. Dette øker fleksibiliteten i protokollen ovenfor med ulike formål. Fiksering med aceton kan være et problem å vurdere når du bruker kammer lysbilder med plast-bunn brønner. Men det er kommersielt tilgjengelig 8 mikrotiterplateleser mikroskop kammer lysbilder som inneholder glass bunner, som er kompatible med aceton fiksering. Fjern plastlokk når aceton brukes til å fikse cellene kultivert i 8 mikrotiterplateleser glass-bunn kammer lysbilder.

Det anbefales at mikroskopet er utstyrt med en motorisert XY-scene, motorisert Epi-fluorescens turret og automatisk fokus system (for eksempel Perfect Focus system) eller tilsvarende kosttilskudd. Når multi-brønn oppkjøpet er nødvendig25, vil automatisk fokus systemet sikre et stabilt fokus langs hele eksperimentet. Tidligere erfaring indikerer at ved å etablere en hensiktsmessig fokusforskyvning på Raji cellene, både bevegelse av T-celler (Video 1) og mikroskopet scenen/kammer lysbilde bevegelser i xy Multi-punkt eksperimenter, kan kompenseres. Denne er virkelig bekvem for multiwell tid-lapse fange.

En sort og hvit, panchromatic og avkjøle beregnet koplet apparat (CDD) kameraet var anvendt bortsett fra høyere-følsomheten, fluorescens naturvitenskapelig komplementær metallisk-oksid halvleder (sCMOS) kameraet er ønskelig, siden denne ville nedgang kameraet avsøring timene og ville forsterke Temporal resolution. Den korte kameraet eksponeringstider vi har brukt (ranking form 100 MS til 500 MS) kombinert med automatisk fluorescens lukkeren kan langvarig tid forfalle fangst (opp til 24 h) med en tilstrekkelig tid oppløsning (1 ramme per minutt eller mindre, for opptil 16 XY stillinger) uten betydelige fluorescens bleking og/eller tap i celle levedyktighet. Den motoriserte scenen tillater multi-Point (XY) fangst og øker sjansen til å finne og bilde den nye og utvikle synapser i den ideelle orientering, men også tillater bildeoppkjøp i multiwell kammer lysbilder når ulike Jurkat kloner må samtidig bøyes25. Høy numerisk blenderåpning av målet (dvs. 60x, 1,4) er nødvendig for å oppnå de beste resultatene når analysere trafikken av sekretoriske granulater.

Den RAJI-SEE-Jurkat utgjør en veletablert immunologiske synapse modell som har blitt brukt av en myriade av forskere siden det opprinnelig ble beskrevet11. Vi har tilpasset vår protokoll til denne modellen for å riktig bilde de tidlige stadier av IS formasjon. Vårt mål var å forbedre tidlig tilnærminger20 tidligere fulgt for å studere POLARISERING av MTOC og sekretoriske maskiner mot is. Det er bemerkelsesverdig at konjugater gjort med denne protokollen produsere F-utgangen omorganisering på synapse, konfigurere en Kanonisk SMAC, samtidig til MVB polarisert trafikk25. Disse viktige hendelsene er også analysert og validert av konfokalmikroskopi mikroskopi25.

Kinetic forskjeller i polarisert trafikk finnes blant ulike typer IS. For eksempel, polarisert transport av lytisk granulater fra CTLer finner sted i sekunder eller svært få minutter, mens flere cytokin blemmer fra th lymfocytter ta fra minutter til flere timer å fullføre. Disse timelige dissimilarities må tas hensyn til på forhånd, for å designe den beste strategien og å velge den mest hensiktsmessige eksperimentelle og Imaging tilnærming, siden for noen tenkelig krigslist (dvs. laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi (LSCM)), tid kan være en begrensende faktor siden fangst tid er mye høyere enn den riktige tidsoppløsning (1 min eller mindre)4. Dette er ikke en begrensning når bredt felt fluorescens mikroskopi (WFFM) brukes som beskrevet i protokollen ovenfor. Siden i CTLer, den polarisering av MTOC mot synapse varer bare noen få minutter3,6,17, diverse spesifikke State-of the art mikroskopi tilnærminger annerledes enn det som er beskrevet her (men harboring høyere romlig og Temporal oppløsning) er nødvendig for å riktig bilde disse synapser26,27, hovedsakelig når flere mikroskop felt (multi-Point Capture) er avbildet. Disse høyoppløselige, nye tilnærminger kan også benyttes for Imaging synapser laget av th lymfocytter, men økonomisk og/eller logistikk grunner (dvs. kjerne utstyr som kreves for noen av disse Imaging teknikker koster 6-7 ganger mer enn det som er beskrevet her) kan sikkert utgjøre en begrensning for disse State of the art Imaging metoder4. Det faktum at er laget av th lymfocytter er lang levetid, og forholdet som i th lymfocytter den MTOC, den lymfokingener inneholder sekretoriske blemmer og MVB ta fra flere minutter til timer for å transportere og Dock til IS22, gjør denne protokollen en ideell, rimelig tilnærming for Imaging den th-APC is.

WFFM i kombinasjon med post-oppkjøpet bilde deconvolution utgjør en interessant tilnærming og ikke bare økonomiske grunner støtte denne strategien. Den iboende dårlig oppløsning i Z-aksen (den viktigste påminnelse av teknikken) kan forbedres ved hjelp av post-oppkjøpet bilde deconvolution4 (sammenlign Video 1 med video 2). Deconvolution bruker en beregning-basert, bildebehandling tilnærming som kan forbedre signal til støyforhold og bildeoppløsning og kontrast27 opp til 2 ganger, ned til 150-100 NM i XY-aksen og 500 NM i Z-aksen4.

Bruk av høyere følsomhet, høy avlesning hastighet og bredt dynamisk område, nye fluorescens sCMOS kameraer vil forbedre kvaliteten på bildene og vil redusere fluorescens bleking. Fleksibiliteten som tilbys av celle-til-celle Bøyning protokollen beskrevet her tillater kombinasjonen av de beskrevne cellulære tilnærming med flere State of the art mikroskopi teknikker, både i levende celler, men også i faste celler, og den forventede utfallet vil faktisk forbedre vår kunnskap om immunologiske synapse.

Selv om vi har implementert og validert protokollen ved hjelp av lett-å-håndtere, godt etablerte cellelinjer, potensialet tilnærmingen kan tillate visualisering av mer fysiologiske interaksjoner når primære T-celler og ulike typer antigen-presentere celler (for eksempel dendrittiske celler av makrofager) brukes5. I denne sammenhengen har denne protokollen er også utvidet og validert ved hjelp av superantigen (SEB)-pulserende mus EL-4 cellelinje brukes som en APC, til å utfordre primær mus T lymphoblasts9. Faktisk primære T-lymfocytter, CTLer spesielt, gjengitt mer kortvarig og dynamisk Synaptic kontakter (se supplerende video 8 i referanse9) til de sett med se-Raji og Jurkat modell. Variasjonen av Synaptic kontakt moduser kan best sees for primær T-celle interaksjoner med dendrittiske celler eller B-celler i to-dimensjonale in vitro vev ekvivalenter som kan også registreres og analyseres ved hjelp av denne protokollen. I tillegg, bortsett fra superantigens, kan teknikken brukes til bilde andre typer synapser. For eksempel kan det brukes i en TCR transgene, antigen-spesifikk T celle modell, for eksempel ved hjelp av ovalbumin spesifikke murine OT1/OT2 system eller ved transfeksjoner av T-celler med antigen-spesifikke T celle reseptorer. Dette åpner en myriade av eksperimentelle muligheter for umiddelbar fremtid.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi anerkjenner alle tidligere og nåværende medlemmer av laboratoriet for deres sjenerøse bidrag. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra den spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), plan Nacional de Investigación Científica (SAF2016-77561-R til M.I., som delvis ble gitt med FEDER-EC finansiering). Vi erkjenner Facultad de Medicina (UAM) og Departamento de Audiovisuales av Facultad de Medicina for deres støtte og de fasiliteter som tilbys for å produsere videoen. Vi anerkjenner NIKON-Europe for kontinuerlig og ypperlig teknisk og teoretisk støtte. Gratis tilgang til denne artikkelen er sponset av Nikon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon DS-QI1MC Nikon MQA11550 Cooled Camera Head
CMAC ThermoFisher Scientific C2110 Cell tracker blue
JURKAT cells ATCC ATCC TIB-152 Effector T lymphocytes
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom IBIDI Cat.No: 80826, 80827 Cell culture and cell imaging supports
Microscope NIKON Eclipse Ti-E Nikon NIKON Eclipse Ti-E Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module OKOLAB H201-NIKON-TI-S-ER Cell culture atmosphere
Raji Cells ATCC ATCC CCL-86 APC
RPMI medium GIBCO ThermoFisher Scientific 21875034 Culture medium
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) Toxin Technology, Inc EP404 Bacterial Toxin
Software Huygens Essential SVI Huygens Essential Image Deconvolution software
Software ImageJ NIH Image J Image software
Software Nikon NIS-AR Nikon NIS-Elements AR Image capture and analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fooksman, D. R., et al. Functional anatomy of T cell activation and synapse formation. Annual Review of Immunology. 28, 79-105 (2010).
  2. de la Roche, M., Asano, Y., Griffiths, G. M. Origins of the cytolytic synapse. Nature Reviews. Immunology. 16, 421-432 (2016).
  3. Griffiths, G. M., Tsun, A., Stinchcombe, J. C. The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis. The Journal of Cell Biology. 189, 399-406 (2010).
  4. Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes. Frontiers in Immunology. 9, 684 (2018).
  5. Friedl, P., den Boer, A. T., Gunzer, M. Tuning immune responses: diversity and adaptation of the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 5, 532-545 (2005).
  6. Xie, J., Tato, C. M., Davis, M. M. How the immune system talks to itself: the varied role of synapses. Immunological Reviews. 251, 65-79 (2013).
  7. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  8. Alonso, R., et al. Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 18, 1161-1173 (2011).
  9. Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., Izquierdo, M. Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes. Cell Death & Differentiation. 23, 99-109 (2016).
  10. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  11. Montoya, M. C., et al. Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs. Nature Immunology. 3, 159-168 (2002).
  12. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews. Immunology. 4, 301-308 (2004).
  13. Huse, M., Quann, E. J., Davis, M. M. Shouts, whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nature Immunology. 9, 1105-1111 (2008).
  14. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. The Journal of Experimental Medicine. 173, 1099-1109 (1991).
  15. Vignaux, F., et al. TCR/CD3 coupling to Fas-based cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 181, 781-786 (1995).
  16. de Saint Basile, G., Menasche, G., Fischer, A. Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules. Nature Reviews. Immunology. 10, 568-579 (2010).
  17. Huse, M. Microtubule-organizing center polarity and the immunological synapse: protein kinase C and beyond. Frontiers in Immunology. 3, 235 (2012).
  18. Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. The Journal of Cell Biology. 202, 779-792 (2013).
  19. Jang, J. H., et al. Imaging of Cell-Cell Communication in a Vertical Orientation Reveals High-Resolution Structure of Immunological Synapse and Novel PD-1 Dynamics. Journal of Immunology. 195, 1320-1330 (2015).
  20. Kupfer, A., Singer, S. J. Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples. Annual Review of Immunology. 7, 309-337 (1989).
  21. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature Reviews. Immunology. 11, 672-684 (2011).
  22. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. Journal of Structural Biology. 168, 152-160 (2009).
  23. Jambrina, E., et al. Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death. The Journal of Biological Chemistry. 278, 14134-14145 (2003).
  24. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7 1 (2009).
  25. Herranz, G., et al. Protein Kinase C delta Regulates the Depletion of Actin at the Immunological Synapse Required for Polarized Exosome Secretion by T Cells. Frontiers in Immunology. 10, 851 (2019).
  26. Ritter, A. T., et al. Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse. Immunity. 42, 864-876 (2015).
  27. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence Microscopy: A Concise Guide to Current Imaging Methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon T-lymfocytter antigen-presentere celler immunologiske synapse mikrotubulinettverket-organisering-senter polarisert trafikk multivesicular organer
Imaging Human immunologiske synapse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M.,… More

Bello-Gamboa, A., Izquierdo, J. M., Velasco, M., Moreno, S., Garrido, A., Meyers, L., Palomino, J. C., Calvo, V., Izquierdo, M. Imaging the Human Immunological Synapse. J. Vis. Exp. (154), e60312, doi:10.3791/60312 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter