Summary
Здесь мы описываем протокол для создания дискретных и точных неорганических наноструктур на субстратах, используя формы ДНК оригами в качестве руководящих шаблонов. Метод демонстрируется созданием плазмонных золотых антенн в форме луковицы на прозрачном субстрате (сапфире).
Abstract
Структурные нанотехнологии ДНК обеспечивает жизнеспособный путь для строительства снизу вверх с использованием ДНК в качестве строительного материала. Наиболее распространенный метод нанофабрикиния ДНК называется ДНК оригами, и он позволяет высокой пропускной результате синтеза точных и высоко универсальных структур с точностью нанометрового уровня. Здесь показано, как пространственная информация оригами ДНК может быть передана в металлические наноструктуры путем объединения снизу вверх ДНК оригами с условно используемыми сверху вниз литографии подходов. Это позволяет изготавливать миллиарды крошечных наноструктур в один шаг на выбранных субстратах. Метод продемонстрирован с помощью bowtie ДНК оригами для создания металлических bowtie-образных антенны хоти на нитрид кремния или сапфировых субстратов. Метод опирается на селективный рост слоя оксида кремния в верхней части субстрата осаждения оригами, что приводит к узорной маске для следующих литографических шагов. Эти наноструктурные поверхности могут в дальнейшем использоваться в качестве молекулярных датчиков (например, улучшенная поверхностью Раманской спектроскопии (SERS)) и в различных других оптических приложениях в видимом диапазоне длин волн из-за небольших размеров объектов (суб-10 нм). Техника может быть распространена на другие материалы с помощью методологических модификаций; таким образом, полученные оптически активные поверхности могут найти применение в разработке метаматериалов и метаповерхностей.
Introduction
Структурные нанотехнологии ДНК быстро развивались в течение последнего десятилетия1,2, и наиболее влиятельных развития в этой области, возможно, было изобретение ДНК оригами3,4. Техника ДНК оригами позволяет изготов практически любую наноформу с точными структурными особенностями3,4. Этот мощный метод может быть использован в (суб) нанометровточное пространственное расположение и якорь других нано-объектов, таких как углеродные нанотрубки5, металлические наночастицы6,7,8, 9, ферменты/белки10,11,12,13 и терапевтические материалы14,15,16,17 . Важно отметить, что эти структуры не просто статические, но они также могут быть запрограммированы действовать в динамической манере18,19. Бесчисленные применения ДНК оригами варьируются от доставки лекарств20,21,22 молекулярной электроники / плазмоники5,23,24, 25 и от материаловедения26,27 к новым методам визуализации и калибровки28.
Помимо упомянутых выше приложений, экстремальное пространственное разрешение форм оригами ДНК может быть использовано в нанопатильной и деликатной наномасштабной литографии29,30. Этот протокол описывает метод литографии для создания дискретных и точных неорганических наноструктур на субстратах с использованием шаблонов ДНК оригами. Эти шаблоны могут быть эффективно изготовлены в различных формах и в больших количествах31, и сдавленные без особых усилий на выбранные субстраты в больших масштабах32. Эти свойства позволяют очень параллельное изготовление миллиардов наноструктур в один шаг, в отличие от широко используемых, но довольно медленно электронного луча литографии или других методов нанофабрикии нанофабрикивания на основе сканирования.
При этом процесс изготовления демонстрируется путем создания золотых лукообразных структур на нитриде кремния и сапфировых субстратах; другими словами, пространственная информация оригами ДНК передается полностью металлическим наноструктурам. Как обсуждалось здесь, метод не ограничивается выбранной bowtie ДНК оригами структуры, поскольку метод позволяет использовать практически любую форму ДНК оригами. Кроме того, с помощью методических модификаций, техника может быть распространена на различные металлы и субстраты, прокладывающие путь к изготовлению метаповерхностей33.
Поверхности, узорчатые с ДНК оригами опосредованного изготовления может служить в качестве универсальных датчиков; например, они могут быть использованы в улучшенной на поверхности Рамане спектроскопии (SERS). В результате небольших размеров отдельных наноформ, созданные поверхности могут найти применение в оптических и плазмонных приложений на видимом диапазоне длин волн.
Protocol
1. Дизайн ДНК оригами
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе описывается процесс нанопаттернирования с помощью двухмерной (2D) структуры ДНК оригами(рисунок 1)34. Чтобы разработать новую форму ДНК оригами, следуйте руководящим принципам ниже:
- Дизайн желаемой формы и необходимых основных последовательностей нити ДНК оригами с помощью caDNAno35. Чтобы произвести плоский, однослойный оригами, использовать квадратный вариант решетки caDNAno и вручную настроить расстояние кроссовера, пропустив некоторые основания в дизайне (см. Рисунок 1 и дополнительный файл caDNAno), чтобы удалить структурный поворот в результате из квадратной решетки упаковки36,37.
- Расширить концы каждой стельности ДНК с нитей, содержащих поли-T (8 nt) свесы; это предотвратит мультимеризацию объектов с помощью тупых взаимодействий базового укладки(рисунок 1 и дополнительный файл caDNAno).
- Выполнить вычислительный анализ конструкции. CanDo38,39 может быть использован для прогнозирования трехмерной (3D) формы и структурной жесткости ДНК оригами. CanDo также является полезным инструментом для итерирования количества базовых пропусков, необходимых для коррекции поворота, и корректировки конструкции соответствующим образом.
- В caDNAno выберите предпочтительную длину эшафота и создайте основные нити, необходимые для складывания структуры. Для bowtie структуры, 7249 nt длина M13mp18 эшафот и 205 уникальных основных нитей используются (см. дополнительный файл caDNAno).
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть также другие вычислительные инструменты, доступные для проектирования ДНК оригами структур40,41,42,43. В зависимости от выбранного инструмента/программного обеспечения, другие инструменты моделирования также могут быть использованы43,44.
2. Сборка ДНК оригами
- Сделать запас основных нитей путем смешивания равное количество всех олигонуклеотидов, необходимых для bowtie структуры (в общей сложности 205 скобы)34. Олигонуклеотиды должны иметь одинаковую начальную концентрацию (например, 100 мкм в свободной воде RNase).
- Подготовка ДНК оригами складной реакции смеси в 100 мл количествах в 0,2 мл ПЦР трубки, смешивая 20 л из M13mp18 эшафот прядь (тип p7249, на 100 нм), 40 л основного баланса запасов, где каждая прядь находится на 500 нм (который дает 10x молотых избыток скотных смесей по сравнению к эшафоту) и 40 л 2,5x складного буфера (FOB). FOB содержит Tris - уксусную кислоту - этиленденедиаминететраацетическую кислоту (ЭДТА) буфер (TAE) дополненный MgCl2. См. Таблицу 1 для концентраций компонентов FOB.
- Аннеал реакционная смесь в термоцикле от 90 градусов по Цельсию до 27 градусов по Цельсию. Используйте тепловой складной пандус, представленный в таблице 2.
3. Очистка ДНК оригами
ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное количество основных нитей может быть удалено из раствора ДНК оригами с помощью неразрушающего метода очистки поли (этиленгликоль) (PEG). Протокол адаптирован из Stahl et al.45.
- Разбавить 200 л собранных структур ДНК оригами с 600 ЗЛ 1x FOB (см. Таблица 1),чтобы получить стартовый объем 800 зл.
- Смешайте разбавленный раствор ДНК оригами 1:1 с 800 зл и буфером осадков ПЭГ (15% PEG 8000 (w/v), 1x TAE, 505 мМ NaCl) и тщательно перемешайте, промокнув туда и обратно.
- Центрифуге смесь в течение 30 мин при 14000 х г и комнатной температуры.
- Тщательно удалите супернатант с помощью пипетки.
- Добавить 200 л 1x FOB и аккуратно перемешать путем пипетки. Другое количество 1x FOB также может быть добавлен для получения желаемой концентрации оригами ДНК.
- Чтобы рерастворить структуры ДНК оригами (небольшие прозрачные гранулы в нижней части трубки), инкубировать ПЕГ очищенной ДНК оригами структур на ночь при комнатной температуре.
- Оцените концентрацию ДНК оригами после очистки ПЭГ, измерив абсорбцию на длине волны 260 нм с помощью уф-спектрофотометра. Используйте закон Пиво-Ламберт и коэффициент вымирания 1,10 х 10м -1 см-1 для расчета6. Типичная концентрация ДНК оригами после очистки ПЭГ составляет 15-20 нм.
- Храните ПЕГ очищенных структур ДНК оригами при 4 градусах Цельсия. Структуры днк оригами, как правило, стабильны в течение нескольких месяцев, поэтому большие количества запасов могут быть подготовлены для последующего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избыточное количество основных нитей также могут быть удалены с помощью других методов очистки46, таких как спин-фильтрация47, скорость зональной центрифугации48 и агарозный гель экстракции49. Структуры ДНК оригами стабильны в различных буферных растворах50,и при необходимости среда хранения может быть изменена после очистки ПЭГ через фильтрацию спина51.
4. Электрофораз геля Агарозе
ПРИМЕЧАНИЕ: Качество складывания и удаления избыточных основных нитей могут быть проверены с помощью электрофороза геля агарозы.
- Подготовьте агарозный гель в размере 2% (w/v), добавив 1 г агарозы и 45 мл 1x TAE в колбу Эрленмейера. Нагрейте смесь в микроволновой печи до полного растворения агарозы и вырабатывания четкого раствора.
- Охладите раствор под проточной водой до тех пор, пока колба не будет удобно йоге (50-60 градусов по Цельсию).
- Добавьте в раствор 5 мл 110 мМ mgCl2 и 40 л раствора бромистого этида (0,58 мг мл-1) и осторожно встряхните смесь.
ВНИМАНИЕ: Бромид этидия является потенциальным канцерогеном и должен быть обработан с осторожностью. - Настроите лоток для литья геля и налейте жидкий агароз в поднос для литья. Пусть гель затвердеть при комнатной температуре, по крайней мере 30 мин.
- Снимите гель с подноса для литья и поместите его в гель электрофорусной камеры. Заполните камеру с запущенным буфером (1x TAE с 11 mM MgCl2).
- Добавьте 1 зл из 6x гель загрузки красителя на 5 л образца раствора и тщательно перемешать. Загрузите образцы, тщательно нанеся нужное количество образецрешений в отдельные гелевые карманы.
- Запустите гель агарозы при постоянном напряжении 95 V в течение 45 мин. Держите камеру электрофорез геля на ледяной ванне для бега, чтобы избежать теплового повреждения геля.
- Визуализируйте гель под ультрафиолетовым светом с помощью системы визуализации геля(рисунок 2A).
5. Подготовительный препарат(рисунок 3А)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются внутри чистой комнаты, за исключением роста SiO2 (Шаг 9). Шаги очистки также могут быть заменены стандартной очисткой на основе решения пираньи, если этого процесса недостаточно для удаления всех остатков из субстрата.
- Вырезать 7 мм х 7 мм чипы из пластины, которые будут использоваться в качестве субстрата. Для SiN используйте кремниевую пилу, ручку для резака для алмазов или аналогичный инструмент. Dicing сапфир (Al2O3) потребует специализированного инструмента или пилы лезвия. Размер чипа не должен быть точным.
- Очистка чипов.
- Погрузите нарезанные кубиками стружки в стакан с горячим ацетоном (ацетон с подогревом до 52 градусов по Цельсию) и держите их нагретыми не менее 15 мин. В зависимости от стартовой чистоты субстрата может потребоваться более длительное время.
- Пока они все еще находятся в горячей ванне ацетона, аккуратно руб чипсы с ватным тампоном механически удалить любые остатки пленки.
- Используя пинцет, поднимите чипсы из горячего ацетона и используйте бутылку для мытья, чтобы промыть их ацетоном комнатной температуры.
- Погрузите чипсы в стакан с изопропанолом и ультрасоникат в течение 2 мин.
- Поднимите фишки из изопропанола с помощью пинцета и высушите их немедленно и тщательно с помощью потока азота. Только коснуться и удерживать стороны и края чипов, так как области, покрытые пинцетом не высохнет должным образом, оставляя потенциально остатки и другие загрязнения на контактных участках. Для достижения наилучших результатов используйте как можно более высокий поток и удерживайте поверхности чипа параллельно направлению потока.
- Храните чипы в крытом контейнере внутри уборной для последующего использования.
6. Плазменный улучшенный химический пар осаждения (PECVD) аморфного кремния (a-Si) слой(рисунок 3B)
- Поместите чипы в оборудование PECVD.
- Настройка параметров осаждения, чтобы вырастипримерно 50 нм аморфного кремния (a-Si). Точные настройки варьируются в зависимости от модели оборудования и калибровки. Смотрите таблицу 3 для параметров, используемых здесь. Запустите программу осаждения a-Si для роста слоя.
- После обработки храните чипы в крытом контейнере в стандартных условиях чистой комнаты.
7. Обработка плазмы кислорода слоя a-Si(рисунок 3B)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг сделает поверхность субстрата слегка отрицательно заряженной и гидрофильной, так что структуры ДНК оригами могут быть позже эффективно адсорбироваться на поверхность с помощью дополнительных ионов магния.
- Поместите чипы в реактивное ионное травление (RIE) оборудования.
- Настройка параметров травления для генерации кислородной плазмы. Опять же, точные настройки варьируются в зависимости от модели оборудования и калибровки. Смотрите таблицу 3 для параметров, используемых здесь. Запустите программу лечения кислородной плазмы.
- Продолжайте делать следующий шаг немедленно, так как последствия лечения будут ухудшаться быстро. Как правило, субстраты следует использовать в течение следующих 30 минут после плазменной обработки.
8. Осаждение ДНК оригами(Рисунок 3C)
- Подготовьте смесь ДНК-оригами для осаждения путем смешивания 5 зл и сложить/очищенного раствора оригами ДНК (20 нм) с 4 л 1x FOB и 1 Л 1 М MgCl2. В результате раствор содержит 10 нм ДНК оригами и примерно 100 мм Mg2 "
- Депозит 10 зл смеси ДНК оригами на кислородной плазмы обработанных чипов и инкубировать покрыты в течение 5 минут при комнатной температуре. Покрытие предотвращает непреднамеренную сушку и помогает в удалении посторонних структур соли и ДНК оригами позже.
- После инкубации промойте поверхность, сначала промывив на чипе 100 л дистиллированной воды (например, Милли). Промыть воду взад и вперед несколько раз с пипеткой, избегая при этом касаясь центра чипа. Удалите большую часть воды с поверхности с помощью пипетки. Это приводит только правильно адсорбировать оригами, чтобы остаться на поверхности.
- Повторите этот цикл стирки (шаги 8.3) от 3 до 4 раз.
- После мытья высушите образец сразу же с потоком азота. Делайте это так же, как сушка в подготовке субстрата (шаг 5). Важно высушить образец как можно тщательнее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность отложенных структур и, таким образом, плотность металлических наноструктур могут быть изменены путем корректировки концентрации ДНК оригами и Mg2 "в растворе осаждения. Более высокая концентрация Mg2 'улучшает сливку ДНК оригами и, таким образом, увеличивает плотность, но это в конечном итоге также вызывает агломерацию структур ДНК оригами. Таким образом, в первую очередь концентрация ДНК оригами должна быть скорректирована в первую очередь.
9. Рост маски SiO2 (рисунок 3D)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен за пределами уборной. Следующая версия даст отрицательный тон шаблон, но можно изменить процесс, чтобы дать положительный тон шаблон вместо. Процесс роста SiO2 адаптирован из Surwade et al.52,разработан авторами53,и, наконец, оптимизирован для этого протокола.
- Возьмите герметичный desiccator (1,5 л), чашку Петри, которая помещается внутри desiccator (по желанию) и перфорированную пластину, которая может функционировать в качестве платформы внутри desiccator.
- Возьмите 100 г кремнезема гель и смешать его с 30 г дистиллированной воды в чашке Петри или непосредственно в desiccator. Сделайте этот шаг предпочтительно по крайней мере 24 ч заранее, чтобы кремнезем гель стабилизироваться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это используется для контроля влажности внутри desiccator и, следовательно, также темпы роста и морфологии SiO2 пленки. Более высокая влажность приводит к более высокой скорости и грубой структуре. Кроме того, кремнезем гель можно вылечить в климатической испытательной камере. - Поместите кремнеземный гель в ошикатор и разделите его перфорированной пластиной.
- Расположите фишки с адсорбированными ДНК оригами, а также открытый флакон (свежий) 10 мл тетраэтил ортосиликат (TEOS) и еще один флакон 10 мл 25% гидроксида аммония (NH4OH) в desiccator, на перфорированной платформе. Установите флаконы вблизи и на противоположных сторонах образцов. Предпочтительно использовать колбу пробки или аналогичные плоские пьедестал слегка поднять фишки с платформы.
ВНИМАНИЕ: Как NH4OH и TEOS вредны в случае контакта с кожей и их пары могут вызвать раздражение обоих глаз и органов дыхания. Используйте в хорошо проветриваемой области и носить защитные перчатки, защиту глаз и защитную одежду. - Печать камеры и инкубировать в течение 20 часов при комнатной температуре. Это будет расти SiO2 пленки на участках, где ДНК оригами структур не расположены, создавая 10-20 нм узорной маски с ДНК оригами формы отверстия(Рисунок 4).
- Удалите образцы из камеры после инкубации. Хранить в крытом контейнере. Обработка может быть приостановлена здесь. Утилизировать использованные TEOS и NH4OH. Партия кремнезема гель может быть использована 2-3 раза, если он хранится запечатаны внутри desiccator между использованиями и используется в течение 2-3 недель.
10. Реактивное ионное травление (RIE) СиО2 и a-Si(рисунок 3E)
- Поместите чипы в реактивное ионное травление (RIE) оборудования.
- Настройка параметров травления только etch 2-5 nm SiO2 для того, чтобы выявить слой A-Si под отверстиями в маске SiO2. Точные настройки должны быть определены экспериментально для индивидуального оборудования. Параметры, используемые здесь, представлены в таблице 3. Запустите анизотропные SiO2 плазменные травления программы.
- Настроили параметры травления, чтобы пробить слой 50 нм а-Си. Параметры, используемые здесь, снова представлены в таблице 3. Запустите изотропную программу плазменного травления a-Si.
- Удалите образцы из оборудования RIE и хранить покрыты. Обработка может быть снова приостановлена здесь.
11. Физическое осаждение паров (PVD) металлов(рисунок 3F)
- Загрузите чипы в камеру испарения инструмента PVD.
- Выберите целевой металл. Во-первых, выбрать клей металла. Здесь используется 2 нм хрома (Cr).
- Настройка программы контроля толщины для целевого материала и толщины. Метод управления зависит от инструмента. Здесь используется микробаланс кварцевого кристалла (ККМ). Измеренная толщина корректируется по плотности материала цели и q-фактору и должна быть исправлена экспериментально определенным инструментарием фактором, который специфичен для устройства и каждого целевого материала.
- Запустите электронный луч, выровняйте луч к цели и увеличьте ток луча до достижения скорости осаждения 0,05 нм/с. Испариться до достижения окончательной толщины 2 нм.
- Выберите второй целевой металл (например, золото) без вентиляции камеры или прерывания процесса. Перебои или вентиляция позволят клею металла, чтобы начать окисление и уменьшить его удобство использования в качестве клея.
- Повторите шаги от 11,3 до 11,4. Испаряется до 20 нм достигается. Это позволит создать ДНК оригами формы металлической структуры через SiO2 маска отверстия с общей высотой 22 нм.
- Вотим камеру и удалите образцы.
- Обработка может быть приостановлена здесь, если образцы хранятся покрыты.
12. Подъем-офф с гидрофторной кислотой (HF)(Рисунок 3G)
- Налейте 50% HF основе etchant раствор в подходящий пластиковый контейнер. Нет HCl должны быть использованы для смеси, так как HCl будет etch Cr в образце.
ВНИМАНИЕ: HF является чрезвычайно коррозионной, вызывает сильное раздражение и ожоги и может быть фатальным при контакте с кожей или при вдыхании. Используйте HF только в специальном капоте дыма или проветриваемой мокрой скамейке с защитным фартуком, химически устойчивыми перчатками и козырьком лица, или иным образом полной химической защитой. - Погрузите образцы в hF-etchant и аккуратно перемешайте с помощью пластиковых пинцетов.
- Подождите, пока слой SiO2 вытравить полностью и металлический слой, чтобы отделить. Время будет заметно меняться в зависимости от плотности отверстий маски. Большее количество отверстий будет переводить на более быстрое травление. Если металлический слой трудно отслаиваться, можно использовать краткую ультразвуковую от 5 до 10 с.
- После того, как металлическая пленка отсоединяется, промойте образцы двойной дистиллированной водой и изопропанолом.
- После промывочного промывки высушите образцы с потоком азота так же, как и инструктировать для подготовки к субстрату (шаг 5). Избегайте контакта пинцета с центром чипа, так как это может разрушить сформированные наноструктуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться и обрабатываться здесь.
13. RIE оставшихся a-Si(Рисунок 3H)
- Поместите чипы в реактивное ионное травление (RIE) оборудования.
- Настройка параметров травления для тщательного удаления всех 50 нм a-Si. Параметры могут быть такими же, как в шаге 10, но немного больше времени травления (40 с) могут быть использованы для обеспечения удаления всех a-Si. Смотрите таблицу 3 для параметров, используемых здесь. Запустите изотропную программу плазменного травления a-Si, чтобы удалить оставшиеся a-Si.
- Удалите образцы из оборудования RIE и хранить покрыты. Это завершит обработку образцов.
14. Атомная силовая микроскопия (AFM)
ПРИМЕЧАНИЕ: Атомная микроскопия силы и сканирующая электронная микроскопия могут быть использованы для мониторинга успеха роста пленки и узора, а также для изображения сложенных структур ДНК оригами(Рисунок 2B, C). Следующий этап подготовки образца может быть пропущен, если будут изображены обработанные образцы из Шагов 5-13.
- Подготовка образцов для AFM
- Для изображения сложенной ДНК оригами, возьмите чип слюды субстрата.
- Прикрепите чип слюды к слайду стеклянного микроскопа с помощью клея.
- Приготовьте 10 зЛ раствора днк оригами, разбавив запас ДНК оригами в размере 20 нм 50 раз в 1x FOB до концентрации примерно 0,4 нм. Разбавление проводится для того, чтобы предотвратить переполненность субстрата.
- Очистите верхний слой листа слюды со слабой лентой, чтобы получить свежерасщепляемую, заряженную поверхность.
- Депозит разбавленного раствора ДНК оригами на свежерасщеленной слюды и инкубировать образец покрыты в течение 1 мин при комнатной температуре.
- После инкубации промойте поверхность 3-4 раза с помощью пипетки по 100 л дистиллированной воды. Это приводит только правильно адсорбировать оригами, чтобы остаться на поверхности.
- Депозит 100 л дистиллированной воды на поверхности слюды.
- Наклоните и резко нажмите микроскоп слайд на столе, чтобы отделить большую часть воды.
- Повторите этот цикл стирки 3-4 раза.
- Тщательно высушите образец потоком азота сразу после мытья. Образец затем готов для изображения AFM.
- Поместите образцы ДНК оригами или обработанные чипы в AFM и выполните сканирование. Размер сканирования 1-10 мкм подходит для правильного разрешения структур.
15. Сканирование электронной микроскопии (SEM)
- Поместите образцы в SEM. Обработанные чипы могут быть использованы, как они есть (дальнейшая подготовка образца не требуется).
- Выберите напряжение ускорения. Используйте низкое напряжение (5-10 кВ) для уменьшения зарядного эффекта, так как образец субстрата (Al2O3 или SiN) является изолятором.
- Сканирование любых областей, представляющих интерес. Минимизация времени сканирования, чтобы уменьшить зарядку и избежать осаждения загрязнения.
Representative Results
Схематическая фигура конструкции bowtie DNA оригами и его структурные детали показаны на рисунке 1. Агарозгель электрофорекс и AFM используются для анализа ДНК оригами складывания и качества очищения ПЭГ (Рисунок 2). Процесс потока шагов нанолитографии отображается на рисунке 3. Представитель AFM изображения после SiO2 маска роста показаны на рисунке 4 (этот шаг изображен на рисунке 3D), в то время как SEM изображения окончательного наноструктуры металла можно увидеть на рисунке 5 (этот шаг изображен в Рисунок 3H). Рисунок 6 демонстрирует оптическую функциональность металлических наноструктур, шаблонированных оригами bowtie DNA.
| Концентрация компонента складного буфера (FOB) | |||||
| Трис | Уксусная кислота | Эдта | Хлорид магния | Ph | |
| 2.5x FOB | 100 | 47.5 | 2.5 | 31.25 | 8,3 евро |
| 1x FOB | 40 | 19 | 1 | 12.5 | 8,3 евро |
Таблица 1: Состав складного буфера (FOB).
| Диапазон температуры -oC | Скорость охлаждения |
| 90-70 | -0,2 кВ / 8 с |
| 70-60 | -0.1 C / 8 s |
| 60-27 | -0,1 кв/2 с |
| 12 | Удерживайте до тех пор, пока не остановить |
Таблица 2: Тепловой пандус для складных оригами bowtie. После аннулирования, оригами будет храниться при 12 oC до тех пор, пока программа не будет остановлена вручную.
| Параметры PECVD и RIE | ||||||
| Газа | Поток газа (sccm) | Камерное давление (mTorr) | Мощность РФ (W) | Температура -оС | Длительность (s) | |
| PECVD а-Си | 5% SiH4 в N2 | 500 | 1000 | 15 | 250 | 90 |
| O2 плазменная обработка | O2 | 50 | 40 | 200 | 30 | 1200 |
| RIE СиО2 | CHF3 | 25 | ||||
| Ar | 25 | 30 | 100 | 25 | 10-22 | |
| RIE а-Си | O2 | 8 | ||||
| SF6 | 100 | 90 | 50 | 30 | 35 | |
| RIE оставшихся a-Si | O2 | 8 | ||||
| SF6 | 100 | 90 | 50 | 30 | 35-40 |
Таблица 3: Параметры процесса для осаждения химических паров с плазмой (PECVD) и реактивного ионного травления (RIE). Параметры процесса для этих устройств специфичны для отдельных инструментов, и их, возможно, потребуется адаптировать при использовании.
Рисунок 1: Дизайн bowtie ДНК оригами. (A) Схематическое представление конструкции bowtie оригами, в котором основная структура показана как двойные силари и polyT-свесы изображены как волнистые линии. (B) Скриншот части bowtie оригами дизайн в программном обеспечении caDNAno. Красные кресты обозначают базовую пару, пропускающуюдля коррекции поворота, и добавлены Свесы T 8,5, чтобы предотвратить тупое базовое укладку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Характеристика структуры днк оригами bowtie. (A) Электрофорус геля Агарозе структуры bowtie до и после поли (этиленгликоль) (PEG) очистки. 7249 нуклеотидов длинные эшафот используется в качестве эталона. (B) Атомная микроскопия силы (AFM) изображение структур bowtie перед очищением. (C) AFM изображение bowtie структур после очищения PEG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схема потока процесса изготовления (размеры не в масштабе). (A) Кости и очистить субстрат. (B) Депозит слой а-Si плазменного химического осаждения пара (PECVD). «Можно использовать дополнительный жертвенный слой под a-Si, чтобы позволить подъем-офф с etchant, кроме HF. (C) Лечить поверхность образца с O2 плазмы и депозит ДНК оригами на него. (D) Выращивайте маску SiO2 в ошикаторе. (E) Etch тонкий слой SiO2 и через a-Si под ним реактивным ионным травлением (RIE). (F) Депозит металла через маску при физическом осаждении пара (PVD). (G) Лифт-офф с HF. (H) удалить оставшиеся a-Si RIE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель AFM изображения SiO2 фильм с ДНК оригами формы картины. (A) 10 мкм х 10 мкм области сканирования демонстрирует высокую урожайность формирования шаблона. (B) Ближе 3 мкм х 3 мкм сканирование показывает точные индивидуальные модели в SiO2 пленки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представитель сканирования электронной микроскопии (SEM) изображения металлических наноструктур, шаблонированных с структурно различных оригами ДНК. (A) Крестообразные ДНК оригами, т.е. так называемые Seeman плитки оригами54. (B) Боути антенны. (C) Chiral двойной L (CDL) структур. Вставкам показаны отдельные структуры с размером коробки 150 нм х 150 нм. Урожайность изготовления точных структур составляет до 76% для bowtie оригами и 50% для других структур отображается здесь34. Эта цифра была адаптирована и изменена из Shen et al.34. Цифра воспроизводится с разрешения авторов и публикуется Американской ассоциацией содействия развитию науки, 2018 год. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Представитель оптических/функциональных свойств полученных наноструктур. (A) Локализованные поверхностные плазмон резонанс (LSPR) измерения отдельных золотых bowtie структуры с различной поляризации (цвет закодирован как оранжевый и синий). Твердые линии измеряются спектрами, а разбитые линии являются результатами моделирования. Вставки показывают SEM-изображение измеренной частицы (слева) и модель, используемую для моделирования (справа). (B) Поверхность расширенной Раман спектроскопии (SERS) родамина 6G и 2,2-бипиридин измеряется на поверхности, покрытой bowtie наноструктур. Базовый уровень каждого образца показывает уровень сигнала при отсутствии наноструктур. Эта цифра была адаптирована и изменена из Shen et al.34. Цифра воспроизводится с разрешения авторов и публикуется Американской ассоциацией содействия развитию науки, 2018 год. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Файл CaDNAno Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: m13mp18 последовательность Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Степпель пряди последовательность Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Протокол обеспечивает большую свободу и точность в форме производимых наноструктур. Изменяя конструкцию ДНК оригами, можно контролировать форму металлических наноструктур. Окончательная, точная форма металлических конструкций дополнительно определяется шагом роста маски (Шаг 9) и в меньшей степени травлением маски (Шаг 10), если оно не будет анизотропным. Если время роста маски будет достаточно продлено, отверстия в маске начнут закрываться. Это может быть использовано, чтобы опустить тонкие особенности некоторых структур и размеры контрольного разрыва, как показано в Shen et al.34 с разделенными треугольниками оригами bowtie(Рисунки 5B). И наоборот, более тонкие формы можно лучше сохранить за счет сокращения времени роста оксида. Это означает, что можно настроить оптические свойства, отображаемые на рисунке 6,не только путем изменения используемого дизайна оригами, но и путем настройки siO2 роста пленки.
Если толщина маски значительно изменена, это изменение также должно быть отражено в шаге SiO2 RIE. Только очень тонкий слой SiO2 должен быть выгравирован (2-5 нм), чтобы едва пробить через отверстия маски. Это самая чувствительная и важная часть всего процесса. Так как время травления является чрезвычайно коротким, только 10-20 с, точные настройки должны быть экспериментально определены при первой попытке с новым оборудованием. Это также верно для шага 10.4, как некоторые SiO2 также травления во время a-Si травления. Степень вытравленного SiO2 определяется селективностью используемых параметров а-Си etch, оборудованием и даже индивидуальными калибровками оборудования. Следует позаботиться о том, чтобы не вытравить весь слой SiO2 в течение этих двух процессов.
Другим чувствительным шагом является рост SiO2. Процесс роста зависит как от влажности камеры, так и от текущей активности используемого TEOS. TEOS деградирует, когда адсорбирует воду из воздуха, заставляя ее становиться менее эффективной с возрастом. Это может проявляться как значительно медленнее, менее контролируемые темпы роста в течение нескольких месяцев даже при надлежащем хранении химического вещества. 34 Если образуется слой SiO2, то слой тоньше, чем предполагалось, это может указывать на проблему с TEOS, а не с влажностью камеры. В то время как более низкая влажность может также привести к снижению темпов роста и более тонкой пленке, полученная пленка также должна быть более гладкой, чем обычно. Между тем грубый зернистый и грубый слой, наоборот, указывает на проблему с высокой влажностью.
Кроме того, можно выполнить этот протокол на любом другом свободно подобранных субстрата с двумя требованиями: он должен терпеть как HF травления (Шаг 12) и 200-300 градусов по Цельсию температуры PECVD (Шаг 6). Температура может быть безопасно снижена до 100 градусов по Цельсию для PECVD a-Si, если используется более чувствительный субстрат, но HF не избежать, если протокол соблюдается точно так, как описано. Чтобы обойти HF, потребуется применение дополнительного жертвенного слоя. Если требование офорта HF будет удалено, этот протокол станет совместимым с более широким выбором субстратных материалов и металлов.
Поскольку этот протокол состоит из широко используемых и надежных процессов микро- и нанофабрикивания, он может быть объединен с любым количеством других протоколов микрофабрикации, где необходимы небольшие размеры объектов и сложные металлические фигуры. В ближайшем будущем, особенно с приходом недорогих ДНК оригами массового производства31, есть потенциал для этого метода для облегчения общего использования и высокой пропускной нанопаттернирования для интерфейса нанофотоники и плазмоники55 .
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Академией Финляндии (проекты 286845, 308578, 303804, 267497), Фондом Джейн и Аатоса Эркко и Фондом Сигрида Джуселиуса. Эта работа проводилась в рамках программы Академических Центров передового опыта (2014-2019 гг.). Мы признаем предоставление объектов и технической поддержки Аалто университета биоэкономики объектов и OtaNano - Наномикроскопия центр (Aalto-NMC) и Micronova Nanofabrication Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Honeywell | 40289H | Semiconductor grade ULSI, ≥ 99.5 % |
| Agarose | Fisher Bioreagents | 1036603 | Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide | Fisher Chemical | 10652251 | 25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91 |
| BRANSON 5510 | Branson | Ultrasonic bath | |
| Dimension Icon | Bruker | Atomic force microscope | |
| Electron-beam evaporator IM-9912 | Instrumentti Mattila | Evaporator for PVD | |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E8751 | Fluorescent dye for DNA staining |
| Eon Microplate spectrophotometer | BioTek | UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements | |
| Gel Doc XR+ Documentation System | BioRad | Gel imaging system | |
| Gel Loading Dye, Blue (6×) | New England Biolabs | B7021S | Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis |
| G-storm GS1 Thermal cycler | Gene Technologies | ||
| HBR 4 | IKA | Heating bath | |
| Hydrofluoric acid | Honeywell | 40213H | Semiconductor grade, 49.5-50.5 % |
| Isopropanol | Honeywell | 40301H | Semiconductor grade VLSI, ≥ 99.8 % |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥ 98 % |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | ||
| Plasmalab 80+ PECVD | Oxford Instruments | PECVD system | |
| Plasmalab 80+ RIE | Oxford Instruments | RIE system | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 89510 | BioUltra, 8,000 |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | ||
| Sapphire substrate (Al2O3) | University Wafer | Thickness: 430 μm, Polish: DSP, Size: 50.8 mm | |
| Sigma VP | Zeiss | Scanning electron microscope | |
| Silica gel | Merck | 1019691000 | With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm |
| Single-stranded Scaffold DNA, type p7249 | Tilibit Nanosystems | At 100 nM concentration | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥ 99.0 % |
| Staple strands (oligonucleotides) | Integrated DNA Technologies | Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water | |
| TAE buffer (50×) pH 8.0 | VWR Chemicals | 444125D | Electran Electrophoresis grade |
| Take3 micro-volume plate | BioTek | Used for DNA origami concentration measurements | |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma Aldrich | 86578 | ≥ 99.0 % (GC) |
References
- Seeman, N. C., Sleiman, H. F. DNA nanotechnology. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17068 (2017).
- Linko, V., Dietz, H. The enabled state of DNA nanotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 555-561 (2013).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Hong, F., Zhang, F., Liu, Y., Yan, H. DNA Origami: Scaffolds for Creating Higher Order Structures. Chemical Reviews. 117 (20), 12584-12640 (2017).
- Maune, H. T., et al. Self-assembly of carbon nanotubes into two-dimensional geometries using DNA origami templates. Nature Nanotechnology. 5 (1), 61-66 (2010).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5 (2), 121-126 (2010).
- Kuzyk, A., et al. DNA-based self-assembly of chiral plasmonic nanostructures with tailored optical response. Nature. 483 (7389), 311-314 (2012).
- Zhang, T., et al. 3D DNA Origami Crystals. Advanced Materials. 30 (28), 1800273 (2018).
- Julin, S., et al. DNA origami directed 3D nanoparticle superlattice via electrostatic assembly. Nanoscale. 11 (10), 4546-4551 (2019).
- Fu, J., Liu, M., Liu, Y., Yan, H. Spatially-Interactive Biomolecular Networks Organized by Nucleic Acid Nanostructures. Accounts of Chemical Research. 45 (8), 1215-1226 (2012).
- Linko, V., et al. DNA-based enzyme reactors and systems. Nanomaterials. 6 (8), 139 (2015).
- Ramakrishnan, S., Subramaniam, S., Stewart, A. F., Grundmeier, G., Keller, A. Regular Nanoscale Protein Patterns via Directed Adsorption through Self-Assembled DNA Origami Masks. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (45), 31239-31247 (2016).
- Grossi, G., Jaekel, A., Andersen, E. S., Saccà, B. Enzyme-functionalized DNA nanostructures as tools for organizing and controlling enzymatic reactions. MRS Bulletin. 42 (12), 920-924 (2017).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Li, S., et al. A DNA nanorobot functions as a cancer therapeutic in response to a molecular trigger in vivo. Nature Biotechnology. 36 (3), 258-264 (2018).
- Zhao, Y. -X., et al. DNA origami delivery system for cancer therapy with tunable release properties. ACS Nano. 6 (10), 8684-8691 (2014).
- Kollmann, F., et al. Superstructure-Dependent Loading of DNA Origami Nanostructures with a Groove-Binding Drug. ACS Omega. 3 (8), 9441-9448 (2018).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nature Chemistry. 3 (2), 103-113 (2011).
- Ijäs, H., Nummelin, S., Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. Dynamic DNA Origami Devices: from Strand-Displacement Reactions to External-Stimuli Responsive Systems. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2114 (2018).
- Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Advanced Materials. 25 (32), 4386-4396 (2013).
- Linko, V., Ora, A., Kostiainen, M. A. DNA Nanostructures as Smart Drug-Delivery Vehicles and Molecular Devices. Trends in Biotechnology. 33 (10), 586-594 (2015).
- Jiang, Q., Liu, S., Liu, J., Wang, Z. G., Ding, B. Rationally Designed DNA-Origami Nanomaterials for Drug Delivery In Vivo. Advanced Materials. , (2018).
- Shen, B., Linko, V., Dietz, H., Toppari, J. J. Dielectrophoretic trapping of multilayer DNA origami nanostructures and DNA origami-induced local destruction of silicon dioxide. Electrophoresis. 36 (2), 255-262 (2015).
- Kuzyk, A., Jungmann, R., Acuna, G. P., Liu, N. DNA Origami Route for Nanophotonics. ACS Photonics. 5 (4), 1151-1163 (2018).
- Liu, N., Liedl, T. DNA-Assembled Advanced Plasmonic Architectures. Chemical Reviews. 118 (6), 3032-3053 (2018).
- Bathe, M., Rothemund, M. DNA Nanotechnology: A Foundation for Programmable Nanoscale Materials. MRS Bulletin. 42 (12), 882-888 (2017).
- Pilo-Pais, M., Acuna, G. P., Tinnefeld, P., Liedl, T. Sculpting light by arranging optical components with DNA nanostructures. MRS Bulletin. 42 (12), 936-942 (2017).
- Graugnard, E., Hughes, W. L., Jungmann, R., Kostiainen, M. A., Linko, V. Nanometrology and super-resolution imaging with DNA. MRS Bulletin. 42 (12), 951-959 (2017).
- Zhong, J., et al. Metallized DNA nanolithography for encoding and transferring spatial information for graphene patterning. Nature Communications. 4, 1663 (2013).
- Zhang, G., Surwade, S. P., Zhou, F., Liu, H. DNA nanostructure meets nanofabrication. Chemical Society Reviews. 42 (7), 2488-2496 (2013).
- Praetorius, F., Kick, B., Behler, K. L., Honemann, M. N., Weuster-Botz, D., Dietz, H. Biotechnological mass production of DNA origami. Nature. 552 (7683), 84-87 (2017).
- Linko, V., et al. One-step large-scale deposition of salt-free DNA origami nanostructures. Scientific Reports. 5, 15634 (2015).
- Arbabi, A., Horie, Y., Bagheri, M., Faraon, A. Dielectric metasurfaces for complete control of phase and polarization with subwavelength spatial resolution and high transmission. Nature Nanotechnology. 10 (11), 937-943 (2015).
- Shen, B., et al. Plasmonic nanostructures through DNA-assisted lithography. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (26), 5001-5006 (2009).
- Ke, Y., et al. Multilayer DNA Origami Packed on a Square Lattice. Journal of the American Chemical Society. 131 (43), 15903-15908 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Kim, D. -N., Kilchherr, F., Dietz, H., Bathe, M. Quantitative prediction of 3D solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures. Nucleic Acids Research. 40 (7), 2862-2868 (2011).
- Benson, E., et al. DNA rendering of polyhedral meshes at the nanoscale. Nature. 523 (7561), 441-444 (2015).
- Veneziano, R., et al. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6923), 1534 (2016).
- Linko, V., Kostiainen, M. A. Automated design of DNA origami. Nature Biotechnology. 34 (8), 826-827 (2016).
- Nummelin, S., Kommeri, J., Kostiainen, M. A., Linko, V. Evolution of Structural DNA Nanotechnology. Advanced Materials. 30 (24), 1703721 (2018).
- Maffeo, C., Yoo, J., Aksimentiev, A. De novo reconstruction of DNA origami structures through atomistic molecular dynamics simulation. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3013-3019 (2016).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Shaw, A., Benson, E., Högberg, B. Purification of Functionalized DNA Origami Nanostructures. ACS Nano. 9 (5), 4968-4975 (2015).
- Kuzyk, A., Yurke, B., Toppari, J. J., Linko, V., Törmä, P. Dielectrophoretic Trapping of DNA Origami. Small. 4 (4), 447-450 (2008).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), 40 (2013).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Ramakrishnan, S., Ijäs, H., Linko, V., Keller, A. Structural stability of DNA origami nanostructures under application-specific conditions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 342-349 (2018).
- Kielar, C., et al. On the Stability of DNA Origami Nanostructures in Low-Magnesium Buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
- Surwade, S. P., et al. Nanoscale growth and patterning of inorganic oxides using DNA nanostructure templates. Journal of the American Chemical Society. 135 (18), 6778-6781 (2013).
- Shen, B., Linko, V., Tapio, K., Kostiainen, M. A., Toppari, J. J. Custom-shaped metal nanostructures based on DNA origami silhouettes. Nanoscale. 7 (26), 11267-11272 (2015).
- Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline Two-Dimensional DNA-Origami Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 50 (1), 264-267 (2011).
- Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA Origami Nanophotonics and Plasmonics at Interfaces. Langmuir. 34 (49), 14911-14920 (2018).
