Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att skapa diskreta och exakta oorganiska nanostrukturer på substrat med hjälp av DNA origami former som vägledande mallar. Metoden demonstreras genom att skapa plasmoniska guld bowtie-formade antenner på ett transparent substrat (safir).
Abstract
Strukturell DNA nanoteknik ger en livskraftig väg för att bygga nerifrån och upp med hjälp av DNA som byggmaterial. Den vanligaste DNA nanotillverkning tekniken kallas DNA origami, och det möjliggör hög genomströmning syntes av noggranna och mycket mångsidiga strukturer med nanometer-nivå precision. Här är det visat hur den rumsliga informationen av DNA origami kan överföras till metalliska nanostrukturer genom att kombinera bottom-up DNA origami med konventionellt används uppifrån och ner litografi metoder. Detta möjliggör tillverkning av miljarder små nanostrukturer i ett steg på utvalda substrat. Metoden visas med bowtie DNA origami för att skapa metalliska bowtie-formade antenn strukturer på kisel nitrid eller safir substrat. Metoden bygger på selektiv tillväxt av ett kiseloxid skikt ovanpå origami deposition substrat, vilket resulterar i en mönkning mask för följande litografiska steg. Dessa nanostrukturutrustade ytor kan användas ytterligare som molekylära sensorer (t. ex. ytförstärkt Raman-spektroskopi (SERS)) och i diverse andra optiska tillämpningar vid det synliga våglängdsområdet på grund av de små funktions storlekarna (sub-10 nm). Tekniken kan utökas till andra material genom metodändringar. Därför kan de resulterande optiskt aktiva ytorna finna användning i utvecklingen av metamaterial och metasurfaces.
Introduction
Strukturell DNA nanoteknik har snabbt utvecklats under det senaste decenniet1,2, och den mest inflytelserika utvecklingen på området har utan tvekan varit uppfinningen av DNA origami3,4. DNA origami tekniken tillåter tillverkning av praktiskt taget alla nanoform med exakta strukturella funktioner3,4. Denna kraftfulla metod kan användas i (sub) nanometer-exakta rumsliga arrangemang och förankring av andra nano-objekt, såsom kolnanorör5, metall nanopartiklar6,7,8, 9, enzymer/proteiner10,11,12,13 och terapeutiska material14,15,16,17 . Viktigare, dessa strukturer är inte bara statiska, men de kan också programmeras att agera på ett dynamiskt sätt18,19. De otaliga tillämpningar av DNA origami sträcker sig från läkemedelsleverans20,21,22 till molekylär elektronik/plasmonics5,23,24, 25 och från materialvetenskap26,27 till ny avbildning och kalibrerings tekniker28.
Förutom de tillämpningar som nämns ovan, kan den extrema rumsliga upplösningen av DNA origami former utnyttjas i nanopatterning och delikat nanoskala litografi29,30. Detta protokoll beskriver en litografi metod för att skapa diskreta och exakta oorganiska nanostrukturer på substrat med hjälp av DNA origami mallar. Dessa mallar kan produceras effektivt i olika former och i stora mängder31, och deponeras utan ansträngning på valda substrat i stora skalor32. Dessa egenskaper tillåter en mycket parallell tillverkning av miljarder nanostrukturer i ett steg i motsats till vanliga men ganska långsam elektronstråle litografi eller andra scanning-baserade nanotillverkning tekniker.
Häri, tillverkningsprocessen visas genom att skapa guld bowtie-formade strukturer på kisel nitrid och safir substrat; med andra ord, den rumsliga informationen av DNA origami överförs till helt metalliska nanostrukturer. Som diskuteras här, tekniken är inte begränsad till den valda bowtie DNA origami struktur eftersom metoden möjliggör användning av praktiskt taget alla DNA origami form. Dessutom, med metodiska modifieringar, kan tekniken utökas till olika metaller och substrat som banar väg mot tillverkning av metasurfaces33.
Ytorna mönstrade med DNA origami-medierad tillverkning kan fungera som mångsidiga sensorer; de kan till exempel användas i ytförstärkt Raman-spektroskopi (SERS). Som ett resultat av de små dimensionerna hos de enskilda nanoformerna kan de skapade ytorna finna användningar i optiska och plasmoniska tillämpningar vid det synliga våglängdsområdet.
Protocol
1. utformning av DNA origami
Anmärkning: i detta protokoll, en nanopatterning process beskrivs med hjälp av en tvådimensionell (2D) bowtie DNA origami struktur (figur 1)34. För att designa en ny DNA origami form, Följ riktlinjerna nedan:
- Designa önskad form och den erforderliga häftning strand sekvenser av DNA origami med caDNAno35. För att producera en platt, Single-Layer origami, anställa torget gitter alternativet för caDNAno och manuellt justera crossover avstånd genom att hoppa över vissa baser i konstruktionen (se figur 1 och kompletterande cadnano fil) för att ta bort den strukturella twist resulterande från torget gitter förpackning36,37.
- Utvidga ändarna av varje DNA-Helix med strängar som innehåller Poly-T (8 NT) överhäng; Detta kommer att förhindra multimerization av objekten genom trubbiga-end Base-stapling interaktioner (figur 1 och kompletterande cadnano fil).
- Kör en beräkningsmässig analys av designen. Cando38,39 kan användas för att förutsäga den tredimensionella (3D) form och strukturell styvhet av DNA origami. CanDo är också ett användbart verktyg för att iterera antalet Base hoppar behövs för twist korrigering och att justera designen därefter.
- I caDNAno, välja den föredragna ställningen längd och generera häfta strängar som behövs för att vika strukturen. För bowtie struktur, den 7249 NT Long M13mp18 byggnadsställning och 205 unika häfttrådar används (se kompletterande cadnano fil).
Obs: det finns också andra beräkningsverktyg tillgängliga för att designa DNA origami strukturer40,41,42,43. Beroende på det valda verktyget/programvaran kan även andra simuleringsverktyg användas43,44.
2. montering av DNA origami
- Gör beståndet av häftklammer genom att blanda lika mängder av alla oligonukleotides behövs för bowtie struktur (totalt 205 häftklamrar)34. Oligonukleotiderna bör alla ha samma initiala koncentration (t. ex. 100 μM i RNase fritt vatten).
- Förbered DNA origami Folding reaktionsblandningen i 100 μl kvantiteter i ett 0,2 ml PCR-rör genom att blanda 20 μl av M13mp18 byggnadsställning strand (typ p7249, vid 100 nm), 40 μl av stapelvara stamlösning, där varje del är vid 500 Nm (vilket ger ~ 10X molar överskott av häftklamrar jämfört till ställningen) och 40 μL 2,5 x hopfällbar buffert (FOB). FOB innehåller Tris-ättiksyra-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffert (TAE) kompletteras med MgCl2. Se tabell 1 för KONCENTRATIONERNA av fob-komponenter.
- Anneal reaktionsblandningen i en termocyklern från 90 ° c till 27 ° c. Använd den termiska fällbara rampen som visas i tabell 2.
3. rening av DNA origami
Obs: den överskjutande mängden av häfttrådar kan tas bort från DNA origami lösningen med en icke-förstörande poly (etylenglykol) (PEG) reningsmetod. Protokollet är anpassat från Stahl et al.45.
- Späd 200 μL av sammansatta DNA origami strukturer med 600 μL 1x FOB (se tabell 1) för att få en startvolym på 800 μl.
- Blanda den utspädda DNA origami lösningen 1:1 med 800 μL av PEG nederbörd buffert (15% PEG 8000 (w/v), 1x TAE, 505 mM NaCl) och blanda grundligt genom pipettering fram och tillbaka.
- Centrifugera blandningen i 30 min vid 14 000 x g och rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en pipett.
- Tillsätt 200 μL 1x FOB och blanda försiktigt genom pipettering. En annan mängd 1x FOB kan också tillsättas för att få önskad DNA origami koncentrationen.
- För att lös åter DNA origami strukturer (liten transparent pellet i botten av röret), inkubera PEG renas DNA origami strukturer över natten vid rumstemperatur.
- Uppskatta DNA origami koncentrationen efter PEG rening genom att mäta absorbans vid en våglängd av 260 Nm med hjälp av en UV/VIS spektrofotometer. Använd Beer-Lambert-lagen och en utrotningskoefficient på 1,1 ∙ 108 M-1 cm-1 för beräkningen6. Typisk DNA origami koncentration efter PEG rening är 15-20 nM.
- Förvara PEG renas DNA origami strukturer vid 4 ° c. DNA origami strukturer är oftast stabila i månader så stora mängder av lager kan förberedas för senare användning.
Obs: den överskjutande mängden häftklamrar kan också tas bort med hjälp av andra reningstekniker46, såsom spinn-filtrering47, hastighet zonindelad centrifugering48 och aguppstod gel utvinning49. DNA origami strukturer är stabila i en mängd olika buffertlösningar50, och om det behövs, kan lagringsmediet ändras efter PEG rening genom spinn filtrering51.
4. agaros gel elektrofores
Obs: kvaliteten på vikningen och avlägsnande av överskott stapelfibrer strängar kan verifieras med hjälp av agaros gel elektrofores.
- Bered en ~ 2% (w/v) Agros gel genom att tillsätta 1 g Agreste och 45 mL 1x TAE till en Erlenmeyer-kolv. Värm blandningen i en mikrovågsugn tills aguppstod är helt upplöst, och en klar lösning produceras.
- Kyl ner lösningen under rinnande vatten tills kolven är bekväm att röra vid (50 – 60 ° c).
- Tillsätt 5 ml 110 mm mgcl2 och 40 μl av etidiumbromid bromid (0,58 mg ml-1) till lösningen och skaka blandningen försiktigt.
Försiktighet: ethidium bromid är en potentiell cancerframkallande och bör hanteras varsamt. - Ställ upp gel gjutning facket och häll vätskan aguppstod i gjutning facket. Låt gelen stelna i rumstemperatur i minst 30 min.
- Ta bort gelen från kast brickan och placera den i en gel elektrofores kammare. Fyll kammaren med löpbuffert (1x TAE med 11 mM MgCl2).
- Tillsätt 1 μL 6x gel laddnings färg per 5 μL provlösning och blanda noggrant. Fyll på proverna genom att noggrant Pipettera den önskade mängden av provlösningarna i separata gel fickor.
- Kör aguppstod gel vid en konstant spänning på 95 V för 45 min. Håll gelen elektrofores kammare på ett isbad för körningen för att undvika värmeskador på gelen.
- Visualisera gelen under ultraviolett ljus med hjälp av ett gel avbildningssystem (figur 2a).
5. substrat beredning (figur 3A)
ANMÄRKNINGAR: följande steg utförs alla i ett rent rum, med undantag för SiO2 -tillväxten (steg 9). Rengörings stegen kan också ersättas med en standard Piranha-lösningsbaserad rengöring om denna process inte är tillräckligt för att ta bort alla rester från underlaget.
- Skär 7 mm x 7 mm chips från en wafer som ska användas som substrat. För synd, Använd en kiselsåg, en diamant fräs penna eller ett liknande redskap. Tärning Sapphire (Al2O3) kommer att kräva ett specialiserat verktyg eller sågblad. Spånstorleken behöver inte vara exakt.
- Rengöra spånorna.
- Sänk ned de tärnade spånorna i ett glas med hett aceton (aceton uppvärmt till 52 ° c) och håll dem uppvärmda i minst 15 min. beroende på grundmaterialets start renhet kan en längre tid behövas.
- Medan de fortfarande är i den varma aceton badet, försiktigt gnugga markerna med en bomullstuss för att mekaniskt ta bort eventuella rester filmer.
- Med hjälp av pincett, lyfta markerna från den heta aceton och använda en tvättflaska för att skölja dem med rumstemperatur aceton.
- Sänk ner spånorna i ett glas med isopropanol och ultraljud i 2 min.
- Lyft ut spånorna från isopropanol med pincett och torka dem omedelbart och grundligt med ett kväveflöde. Vidrör och håll bara spånorna på sidorna och kanterna, eftersom de områden som täcks av pincetten inte torkar ordentligt och lämnar potentiellt rester och annan kontaminering på kontaktytorna. För bästa resultat, Använd så högt flöde som möjligt och håll spånytorna parallellt med flödesriktningen.
- Förvara spånorna i en täckt behållare inuti renrummet för senare användning.
6. plasma-förstärkt kemisk förångningsdeposition (PECVD) av amorf kisel (a-Si) skikt (figur 3B)
- Placera spånorna i PECVD-utrustningen.
- Ställ in deponerings parametrarna för att växa ungefär 50 nm av Amorft kisel (a-Si). Exakta inställningar varierar beroende på utrustnings modell och kalibrering. Se tabell 3 för de parametrar som används här. Kör a-Si deposition program för att växa lagret.
- Efter bearbetning, förvara spånorna i en täckt behållare i standard rena rumsförhållanden.
7. syrgas plasma behandling av a-Si-skiktet (figur 3B)
Anmärkning: detta steg kommer att göra underlaget ytan något negativt laddad och hydrofila, så att DNA origami strukturer kan senare effektivt adsorberas till ytan med hjälp av ytterligare magnesium joner.
- Placera spånorna i den reaktiva Jon etsning (RIE)-utrustningen.
- Ställ in etsnings parametrarna för att generera syre plasma. Igen, exakta inställningar varierar beroende på utrustnings modell och kalibrering. Se tabell 3 för de parametrar som används här. Kör syrgas plasma behandlingsprogrammet.
- Fortsätt till nästa steg omedelbart eftersom effekterna av behandlingen kommer att försämras snabbt. Typiskt, substrat bör användas inom de närmaste 30 min efter plasma behandling.
8. deposition av DNA origami (figur 3C)
- Förbered en DNA origami blandning för avsättning genom att blanda 5 μL av vikt/renad DNA origami lösning (~ 20 nM) med 4 μL 1x FOB och 1 μL av 1 M MgCl2. Den resulterande lösningen innehåller ~ 10 nM DNA origami och ungefär 100 mM av mg2 +.
- Sätt in 10 μL av DNA origami blandningen på ett syre plasma-behandlat chip och inkubera täckt i 5 min vid rumstemperatur. Täcker förhindrar oavsiktlig torkning och hjälpmedel för att ta bort främmande salt och DNA origami strukturer senare.
- Efter inkubering tvättar du ytan genom att först Pipettera 100 μL destillerat vatten (t. ex. MilliQ) på chipet. Skölj vattnet fram och tillbaka några gånger med pipetten, samtidigt som du undviker att röra vid mitten av chippet. Ta bort det mesta av vattnet från ytan med pipetten. Detta orsakar endast korrekt adsorberat origami att stanna kvar på ytan.
- Upprepa denna tvättcykel (steg 8,3) 3 till 4 gånger.
- Efter tvättning, torka provet omedelbart med ett kväveflöde. Gör detta på samma sätt som torkning i substrat beredning (steg 5). Det är viktigt att torka provet så grundligt som möjligt.
Obs: tätheten av deponerade strukturer och därmed tätheten av metallnanostrukturer kan ändras genom att justera koncentrationen av DNA origami och mg2 + i deposition lösning. Högre mg2 + koncentration förbättrar DNA origami vidhäftning och därmed ökar densiteten, men det kommer så småningom också orsaka AGGLOMERERING av DNA origami strukturer. Sålunda, främst DNA origami koncentrationen bör justeras först.
9. tillväxt av SiO2 -masken (figur 3D)
Obs: detta steg kan utföras utanför renrum. Följande version ger en negativ ton mönster, men det är möjligt att ändra processen för att ge ett positivt ton mönster i stället. Den SiO2 tillväxtprocessen är anpassad från surwade et al.52, som utvecklats ytterligare av författarna53, och slutligen optimerad för detta protokoll.
- Ta en förtätningsbar exsickator (1,5 L), en petriskål som passar i exsickatorn (tillval) och en perforerad platta som kan fungera som en plattform inuti exsickatorn.
- Ta 100 g kiselgel och blanda den med 30 g destillerat vatten i petriskål eller direkt i exsickatorn. Gör detta steg helst minst 24 h i förväg för att låta kiselgel att stabilisera.
Anmärkning: Detta används för att kontrollera fuktigheten inuti exsickatorn och därmed även tillväxttakten och morfologin i SiO2 -filmen. Högre luftfuktighet ger högre hastighet och grövre struktur. Alternativt kan kiselgel botas i ett klimat testkammare. - Placera kiselgel i exsickatorn och separera den med den perforerade plattan.
- Placera spånorna med adsorberat DNA origami samt en öppen injektionsflaska (färsk) 10 mL Tetraetylorthosilicat (TEOS) och en annan injektionsflaska med 10 mL 25% ammoniumhydroxid (NH4OH) i exsickatorn, på den perforerade plattformen. Ställ in injektionsflaskorna nära och på motsatta sidor av proverna. Använd gärna en kolv kork eller en liknande platt piedestal att något höja spånorna från plattformen.
Varning: både NH4Oh och Teos är skadliga vid hudkontakt och deras ångor kan orsaka irritation på både ögon och andningsorgan. Använd i ett väl ventilerat utrymme och Använd skyddshandskar, skyddsglasögon och skyddskläder. - Försegla kammaren och inkubera i 20 timmar vid rumstemperatur. Detta kommer att växa en SiO2 film på de områden där DNA origami strukturer inte ligger, skapa en 10-20 nm mönstrad mask med DNA origami formade hål (figur 4).
- Ta bort proverna från kammaren efter inkubering. Förvaras i en täckt behållare. Bearbetningen kan pausas här. Avyttra de använda TEOS och NH4oh. Parti kiselgel kan användas 2-3 gånger om den hålls förseglad inuti exsickatorn mellan användningar och används inom 2-3 veckor.
10. reaktiv jonetsning (RIE) av SiO2 och a-Si (figur 3E)
- Placera spånorna i den reaktiva Jon etsning (RIE)-utrustningen.
- Ställ in etsnings parametrarna till endast etch 2-5 nm i SiO2 för att avslöja a-Si-skiktet under hålen i Sio2 -masken. Exakta inställningar måste bestämmas experimentellt för den enskilda utrustningen. De parametrar som används här presenteras i tabell 3. Kör anisotropisk Sio2 plasmaetsning program.
- Ställ in etsnings parametrarna för att tränga igenom 50 nm a-Si-skiktet. De parametrar som används här presenteras igen i tabell 3. Kör isotropiskt a-Si plasmaetsning program.
- Ta bort prover från RIE-utrustning och förvara täckt. Bearbetningen kan avbrytas igen här.
11. fysikalisk ångdeposition (PVD) av metaller (figur 3F)
- Fyll på spånorna i PVD-instrumentets avdunstnings kammare.
- Välj ett mål metal. Välj först en självhäftande metall. Här används 2 nm krom (CR).
- Ställ in tjocklek kontrollprogram för mål material och tjocklek. Kontrollmetoden är instrument beroende. Här används en kvartskristall Microbalance (QCM). Den uppmätta tjockleken justeras med mål materialets densitet och Z-faktor och måste korrigeras med en experimentellt bestämd verktygs faktor som är specifik för enheten och varje mål material.
- Starta elektronstrålen, rikta in strålen mot målet och öka ljusstrålen tills en deposition på 0,05 nm/s uppnås. Avdunstas tills en slutlig tjocklek på 2 nm har uppnåtts.
- Välj ett andra mål metall (t. ex. guld) utan att avluftning kammaren eller avbryta processen. Avbrott eller ventilation gör det möjligt för den adhesiva metallen att börja oxiderande och minska dess användbarhet som ett lim.
- Upprepa steg 11,3 till 11,4. Avduns tills 20 nm har uppnåtts. Detta kommer att skapa en DNA origami formad metall struktur genom SiO2 mask hål med en total höjd av 22 nm.
- Ventilera kammaren och ta bort proverna.
- Bearbetningen kan pausas här om proverna lagras täckta.
12. Lyft med fluorvätesyra (HF) (figur 3G)
- Häll 50% HF-baserad Etant lösning i en lämplig plastbehållare. Ingen HCl bör användas för blandningen, eftersom HCl skulle etch CR i provet.
FÖRSIKTIGHET: HF är extremt frätande, orsakar svår irritation och brännskador och kan vara dödligt vid hudkontakt eller vid inandning. Använd HF endast i en särskild draghuv eller ventilerad våt bänk med skyddande förkläde, kemikaliebeständiga handskar och visir, eller på annat sätt fullständigt kemikalieskydd. - Doppa proverna i HF-baserade etsmedlet och rör försiktigt med plast pincett.
- Vänta på SiO2 -skiktet till etch helt och metall skiktet att lossa. Tiden kommer att variera märkbart beroende på densiteten hos maskens hål. Ett högre antal hål kommer att översättas till snabbare etsning. Om metall skiktet är svårt att lossna, kort ultraljud för 5 till 10 s kan användas.
- När metall filmen lossnar, skölj proverna med dubbeldestillerat vatten och isopropanol.
- Efter sköljning, torka proverna med ett kväveflöde på samma sätt som instruerats för substrat preparatet (steg 5). Undvik pincett kontakt med chip Center, eftersom det kan förstöra bildade nanostrukturer.
Obs: prover kan lagras och bearbetning suspenderade här.
13. RIE återstående a-Si (figur 3H)
- Placera spånorna i den reaktiva Jon etsning (RIE)-utrustningen.
- Ställ in etsnings parametrarna för noggrann borttagning av alla 50 nm i a-Si. Parametrarna kan vara samma som i steg 10, men en något längre etsning tid (40 s) kan användas för att säkerställa avlägsnande av alla a-Si. Se tabell 3 för de parametrar som används här. Kör isotropiskt a-Si plasmaetsning program för att ta bort kvarvarande a-Si.
- Ta bort prover från RIE-utrustning och förvara täckt. Detta kommer att avsluta prov bearbetningen.
14. atomkraft mikroskopi (AFM)
Obs: Atomic Force mikroskopi och scanning elektronmikroskopi kan användas för att övervaka framgången för film tillväxt och mönkning samt till bild vikta DNA origami strukturer (figur 2B, C). Följande exempel förberedelsesteg kan hoppas över om bearbetade prover från steg 5-13 avbildas.
- Provberedning för AFM
- För att avbilda den vikta DNA origami, ta ett chip av glimmer substrat.
- Fäst glimmerkretsen på ett glas Mikroskop bild med ett lim.
- Förbered 10 μL av DNA origami lösning genom att späda ~ 20 nM DNA origami lager 50 gånger i 1x FOB till en koncentration av cirka 0,4 nM. Utspädning utförs för att förhindra överbeläggning av underlaget.
- Skala det översta lagret av glimmer arket bort med svag tejp för att få en nyligen klyvs, laddade yta.
- Deponera den utspädda DNA origami lösningen på den nyligen klyvs glimmer och inkubera provet täckt i 1 min vid rumstemperatur.
- Efter inkubering, tvätta ytan 3-4 gånger med 100 μL destillerat vatten med hjälp av en pipett. Detta orsakar endast korrekt adsorberat origami att stanna kvar på ytan.
- Sätt in 100 μL destillerat vatten på glimmerytan.
- Luta och tryck skarpt på Mikroskop glaset på bordet för att lossa det mesta av vattnet.
- Upprepa denna tvättcykel 3-4 gånger.
- Torka provet noggrant med ett kväveflöde omedelbart efter tvättning. Provet är sedan redo för AFM Imaging.
- Placera DNA origami prover eller bearbetade chips i en AFM och utföra skanningar. En skanningsstorlek på 1-10 μm är lämplig för att korrekt lösa strukturerna.
15. scanning elektronmikroskopi (SEM)
- Placera proverna i en SEM. De bearbetade markerna kan användas som de är (ytterligare provberedning behövs inte).
- Välj accelerations spänningen. Använd låga spänningar (5-10 kV) för att minska laddnings effekterna eftersom prov substratet (Al2O3 eller sin) är en isolator.
- Skanna alla områden av intresse. Minimera skannings tider för att minska laddningen och för att undvika deposition av kontaminering.
Representative Results
En schematisk siffra på bowtie DNA origami design och dess strukturella detaljer visas i figur 1. Aguppstod gel elektrofores och AFM används för att analysera DNA origami vikning och kvaliteten på PEG rening (figur 2). Processflödet för nanolithografistegen visas i figur 3. Representativa AFM bilder efter SiO2 mask tillväxt visas i figur 4 (detta steg avbildas i figur 3D), medan SEM-bilder av de slutliga metallnanostrukturerna kan ses i figur 5 (detta steg avbildas i Figur 3H). Figur 6 visar den optiska funktionaliteten hos den metalliska nanostrukturer mallbaserat av bowtie DNA origami.
| Vikbuffert (FOB) komponentkoncentrationer [mM] | |||||
| Tris | Ättiksyra | Edta | Magnesiumklorid | Ph | |
| 2.5 x FOB | 100 | 47,5 | 2,5 | 31,25 | ~ 8, 3 |
| 1x FOB | 40 | 19 | 1 | 12,5 | ~ 8, 3 |
Tabell 1: vikningsbuffertens sammansättning (FOB).
| Temperaturområde [oC] | Kylhastighet |
| 90-70 | -0,2 ° c/8 s |
| 70-60 | -0,1 ° c/8 s |
| 60-27 | -0,1 ° c/2 s |
| 12 | Håll ned tills stoppad |
Tabell 2: termisk ramp för bowtie origami vikning. Efter glödgning, origami kommer att lagras vid 12 oC tills programmet stoppas manuellt.
| PECVD-och RIE-parametrar | ||||||
| Gas | Gas flöde [SCCM] | Kammartryck [mTorr] | RF-effekt [W] | Temperatur [oC] | Varaktighet [s] | |
| PECVD av a-Si | 5% SiH4 i N2 | 500 | 1000 | 15 | 250 | 90 |
| O2 plasma behandling | O2 | 50 | 40 | 200 | 30 | 1200 |
| RIE av SiO2 | CHF3 | 25 | ||||
| Ar | 25 | 30 | 100 | 25 | 10-22 | |
| RIE av a-Si | O2 | 8 | ||||
| SF6 | 100 | 90 | 50 | 30 | 35 | |
| RIE av resterande a-Si | O2 | 8 | ||||
| SF6 | 100 | 90 | 50 | 30 | 35-40 |
Tabell 3: process parametrar för plasma-förstärkt kemisk ångdeposition (PECVD) och reaktiv jonetsning (Rie). Processparametrarna för dessa enheter är specifika för enskilda instrument och de kan behöva anpassas när de används.
Figur 1: design av bowtie DNA origami. (A) schematisk representation av bowtie origami design där kärn strukturen visas som dubbla alfahelixar och Polyt-överhäng avbildas som vågiga linjer. (B) skärmdump av en del av bowtie origami design i cadnano programvaran. De röda kors betecknar bas paret hoppa för twist korrigering, och T8-överhäng läggs till för att förhindra trubbiga-end Base-stapling. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: karaktärisering av bowtie DNA origami struktur. A) agaros gel-elektrofores av bowtie-strukturen före och efter poly (etylenglykol) (PEG) rening. Den 7249 nukleotider lång byggnadsställning används som referens. Batomkraft mikroskopi (AFM) bild av bowtie strukturer före rening. (C) AFM bild av bowtie strukturer efter PEG rening. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: system för tillverkningsprocess flöde (dimensionerna är inte i skala). (A) tärningar och Rengör underlaget. (B) deponera ett a-Si-skikt genom plasmaförstärkt kemisk förångningsdeposition (pecvd). * Det är möjligt att anställa ytterligare ett offer skikt under a-Si för att möjliggöra lyft av med andra etsmedel än HF. (C) behandla provet ytan med O2 plasma och insättning DNA origami på den. (D) odla Sio2 -masken i exsickator. (E) etch ett tunt skikt av Sio2 och genom a-Si under den genom reaktiv JONETSNING (Rie). (F) deponera metall genom masken genom fysisk ångdeposition (PVD). (G) lyft av med HF. (H) ta bort återstående a-Si av Rie. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa AFM-bilder av Sio2 -film med DNA origami-formade mönstret. (A) 10 μm x 10 μm skanningsområde visar den höga avkastningen av mönstret bildas. (B) en tätare skanning på 3 μm x 3 μm visar de exakta individuella mönstren i Sio2 -filmen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativ scanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av metalliska nanostrukturer mallbaserat med strukturellt olika DNA origami. (A) KORSFORMADE DNA origami, dvs, så kallade Seeman kakel origami54. (B) bowtie-antenner. C) kirala dubbel-l (CDL) strukturer. Insets visar enskilda konstruktioner med kartong storlekar på 150 Nm x 150 Nm. Tillverkningen avkastningen av exakta strukturer är upp till 76% för bowtie origami och ~ 50% för de andra strukturer som visas här34. Denna siffra har anpassats och modifierats från Shen et al.34. Figurera reproduceras med tillåtelse av författarna och publicerat av Amerikananslutningen för befordran av vetenskap, 2018. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa optiska/funktionella egenskaper hos resulterande nanostrukturer. (A) lokaliserad yta Plasmon resonans (lspr) mätningar av en individuell guld bowtie struktur med olika polarisering (färgkodade som orange och blå). De heldragna linjerna mäts spektra och de streckade linjerna är simuleringsresultat. Insets visar SEM-bilden av den uppmätta partikeln (vänster) och den modell som används för simulering (höger). (B) ytförstärkt Raman-spektroskopi (SERS) av rodamin 6G och 2, 2-bipyridin mätt på en yta täckt med bowtie nanostrukturer. Baslinjen för varje prov visar signalnivån när nanostrukturerna saknades. Denna siffra har anpassats och modifierats från Shen et al.34. Figurera reproduceras med tillåtelse av författarna och publicerat av Amerikananslutningen för befordran av vetenskap, 2018. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: CaDNAno fil vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande fil 2: m13mp18 sekvens vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande fil 3: häftning strand sekvens vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Protokollet ger stor frihet och noggrannhet i form av producerade nanostrukturer. Genom att ändra utformningen av DNA origami, form av metall nanostrukturer kan styras. Den slutliga, exakta formen av metallkonstruktioner är dessutom bestäms av masken tillväxt steg (steg 9) och i mindre grad av masken etsning (steg 10) bör det inte vara Anisotrop. Om maskens tillväxt tid förlängs tillräckligt, kommer hålen i masken att börja bli stängda. Detta kan användas för att utelämna de tunnaste dragen i vissa strukturer och kontroll gap storlekar, som visas i Shen et al.34 med separerade trianglar av bowtie origami (Figur 5b). Omvänt, tunnare former kan bevaras bättre genom att förkorta oxid tillväxt tid. Detta innebär att det är möjligt att finjustera de optiska egenskaperna som visas i figur 6, inte bara genom att ändra den använda origami design, men också genom att trimma Sio2 film tillväxt.
Om mask tjockleken ändras avsevärt, måste denna förändring också återspeglas i SiO2 steg. Endast ett mycket tunt skikt av SiO2 bör etsad (2-5 nm) att knappt tränga igenom maskhålen. Detta är den känsligaste och mest avgörande delen av hela processen. Eftersom etsning tiden är extremt kort, bara 10-20 s, måste exakta inställningar experimentellt bestäms när första försöket med ny utrustning. Detta gäller även för steg 10,4 som vissa SiO2 är också etsad under a-Si etsning. Omfattningen av etsad SiO2 bestäms av selektiviteten hos de använda a-Si etch parametrar, utrustning och även individuell utrustning kalibreringar. Försiktighet bör iakttas för att inte etch bort hela SiO2 -skiktet under dessa två processer.
Ett annat känsligt steg är SiO2 -tillväxten. Tillväxtprocessen är beroende av både kammar fuktigheten och den aktuella aktiviteten hos de använda TEOS. TEOS försämras när det adsorber vatten från luften, vilket gör att det blir mindre effektivt med åldern. Detta kan manifestera som en betydligt långsammare, mindre kontrollerbar tillväxttakt inom månader även med korrekt lagring av kemikalien. 34 om det resulterande Sio2 -skiktet är tunnare än avsett, kan detta tyda på ett problem med Teos snarare än kammar luftfuktighet. Även en lägre luftfuktighet kan också resultera i lägre tillväxttakt och tunnare film, den resulterande filmen bör också vara smidigare än normalt. Under tiden ett grovt kornigt och grovt skikt skulle omvänt indikerar ett problem med hög luftfuktighet.
Det är också möjligt att utföra detta protokoll på alla andra fritt valda substrat med två krav: det måste tolerera både HF etsning (steg 12) och 200-300 ° c temperaturer av PECVD (steg 6). Temperaturen kan sänkas på ett säkert sätt till 100 ° c för PECVD av a-Si om ett känsligare substrat används, men HF kan inte undvikas om protokollet följs exakt enligt beskrivningen. För att kringgå HF, skulle tillämpningen av ett ytterligare offer skikt krävas. Om kravet på HF etsning avlägsnas, skulle detta protokoll bli förenligt med ett bredare urval av substratmaterial och metaller.
Eftersom detta protokoll består av vanligt förekommande och robusta mikro-och nanotillverkning processer, kan det kombineras med valfritt antal andra mikrofabrikationsprotokoll där små funktions storlekar och komplexa metall former önskas. Inom en snar framtid, särskilt med det kommande av låg kostnad DNA origami massproduktion31, det finns potential för denna metod för att underlätta både allmän användning och hög genomströmning nanopatterning för gränssnittsbaserad nanofotonik och plasmonik55 .
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Finlands Akademi (projekten 286845, 308578, 303804, 267497), Jane och Aatos Erkkos stiftelse samt Sigrid Jusélius stiftelse. Arbetet utfördes under Academy of Excellence-programmet (2014 – 2019). Vi erkänner tillhandahållandet av faciliteter och teknisk support av Aalto-universitetets bioekonomi anläggningar och OtaNano – Nanomicroscopy Center (Aalto-NMC) och Micronova Nanofabrication Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Honeywell | 40289H | Semiconductor grade ULSI, ≥ 99.5 % |
| Agarose | Fisher Bioreagents | 1036603 | Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide | Fisher Chemical | 10652251 | 25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91 |
| BRANSON 5510 | Branson | Ultrasonic bath | |
| Dimension Icon | Bruker | Atomic force microscope | |
| Electron-beam evaporator IM-9912 | Instrumentti Mattila | Evaporator for PVD | |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E8751 | Fluorescent dye for DNA staining |
| Eon Microplate spectrophotometer | BioTek | UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements | |
| Gel Doc XR+ Documentation System | BioRad | Gel imaging system | |
| Gel Loading Dye, Blue (6×) | New England Biolabs | B7021S | Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis |
| G-storm GS1 Thermal cycler | Gene Technologies | ||
| HBR 4 | IKA | Heating bath | |
| Hydrofluoric acid | Honeywell | 40213H | Semiconductor grade, 49.5-50.5 % |
| Isopropanol | Honeywell | 40301H | Semiconductor grade VLSI, ≥ 99.8 % |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥ 98 % |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | ||
| Plasmalab 80+ PECVD | Oxford Instruments | PECVD system | |
| Plasmalab 80+ RIE | Oxford Instruments | RIE system | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 89510 | BioUltra, 8,000 |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | ||
| Sapphire substrate (Al2O3) | University Wafer | Thickness: 430 μm, Polish: DSP, Size: 50.8 mm | |
| Sigma VP | Zeiss | Scanning electron microscope | |
| Silica gel | Merck | 1019691000 | With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm |
| Single-stranded Scaffold DNA, type p7249 | Tilibit Nanosystems | At 100 nM concentration | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥ 99.0 % |
| Staple strands (oligonucleotides) | Integrated DNA Technologies | Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water | |
| TAE buffer (50×) pH 8.0 | VWR Chemicals | 444125D | Electran Electrophoresis grade |
| Take3 micro-volume plate | BioTek | Used for DNA origami concentration measurements | |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma Aldrich | 86578 | ≥ 99.0 % (GC) |
References
- Seeman, N. C., Sleiman, H. F. DNA nanotechnology. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17068 (2017).
- Linko, V., Dietz, H. The enabled state of DNA nanotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 555-561 (2013).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Hong, F., Zhang, F., Liu, Y., Yan, H. DNA Origami: Scaffolds for Creating Higher Order Structures. Chemical Reviews. 117 (20), 12584-12640 (2017).
- Maune, H. T., et al. Self-assembly of carbon nanotubes into two-dimensional geometries using DNA origami templates. Nature Nanotechnology. 5 (1), 61-66 (2010).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5 (2), 121-126 (2010).
- Kuzyk, A., et al. DNA-based self-assembly of chiral plasmonic nanostructures with tailored optical response. Nature. 483 (7389), 311-314 (2012).
- Zhang, T., et al. 3D DNA Origami Crystals. Advanced Materials. 30 (28), 1800273 (2018).
- Julin, S., et al. DNA origami directed 3D nanoparticle superlattice via electrostatic assembly. Nanoscale. 11 (10), 4546-4551 (2019).
- Fu, J., Liu, M., Liu, Y., Yan, H. Spatially-Interactive Biomolecular Networks Organized by Nucleic Acid Nanostructures. Accounts of Chemical Research. 45 (8), 1215-1226 (2012).
- Linko, V., et al. DNA-based enzyme reactors and systems. Nanomaterials. 6 (8), 139 (2015).
- Ramakrishnan, S., Subramaniam, S., Stewart, A. F., Grundmeier, G., Keller, A. Regular Nanoscale Protein Patterns via Directed Adsorption through Self-Assembled DNA Origami Masks. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (45), 31239-31247 (2016).
- Grossi, G., Jaekel, A., Andersen, E. S., Saccà, B. Enzyme-functionalized DNA nanostructures as tools for organizing and controlling enzymatic reactions. MRS Bulletin. 42 (12), 920-924 (2017).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Li, S., et al. A DNA nanorobot functions as a cancer therapeutic in response to a molecular trigger in vivo. Nature Biotechnology. 36 (3), 258-264 (2018).
- Zhao, Y. -X., et al. DNA origami delivery system for cancer therapy with tunable release properties. ACS Nano. 6 (10), 8684-8691 (2014).
- Kollmann, F., et al. Superstructure-Dependent Loading of DNA Origami Nanostructures with a Groove-Binding Drug. ACS Omega. 3 (8), 9441-9448 (2018).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nature Chemistry. 3 (2), 103-113 (2011).
- Ijäs, H., Nummelin, S., Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. Dynamic DNA Origami Devices: from Strand-Displacement Reactions to External-Stimuli Responsive Systems. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2114 (2018).
- Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Advanced Materials. 25 (32), 4386-4396 (2013).
- Linko, V., Ora, A., Kostiainen, M. A. DNA Nanostructures as Smart Drug-Delivery Vehicles and Molecular Devices. Trends in Biotechnology. 33 (10), 586-594 (2015).
- Jiang, Q., Liu, S., Liu, J., Wang, Z. G., Ding, B. Rationally Designed DNA-Origami Nanomaterials for Drug Delivery In Vivo. Advanced Materials. , (2018).
- Shen, B., Linko, V., Dietz, H., Toppari, J. J. Dielectrophoretic trapping of multilayer DNA origami nanostructures and DNA origami-induced local destruction of silicon dioxide. Electrophoresis. 36 (2), 255-262 (2015).
- Kuzyk, A., Jungmann, R., Acuna, G. P., Liu, N. DNA Origami Route for Nanophotonics. ACS Photonics. 5 (4), 1151-1163 (2018).
- Liu, N., Liedl, T. DNA-Assembled Advanced Plasmonic Architectures. Chemical Reviews. 118 (6), 3032-3053 (2018).
- Bathe, M., Rothemund, M. DNA Nanotechnology: A Foundation for Programmable Nanoscale Materials. MRS Bulletin. 42 (12), 882-888 (2017).
- Pilo-Pais, M., Acuna, G. P., Tinnefeld, P., Liedl, T. Sculpting light by arranging optical components with DNA nanostructures. MRS Bulletin. 42 (12), 936-942 (2017).
- Graugnard, E., Hughes, W. L., Jungmann, R., Kostiainen, M. A., Linko, V. Nanometrology and super-resolution imaging with DNA. MRS Bulletin. 42 (12), 951-959 (2017).
- Zhong, J., et al. Metallized DNA nanolithography for encoding and transferring spatial information for graphene patterning. Nature Communications. 4, 1663 (2013).
- Zhang, G., Surwade, S. P., Zhou, F., Liu, H. DNA nanostructure meets nanofabrication. Chemical Society Reviews. 42 (7), 2488-2496 (2013).
- Praetorius, F., Kick, B., Behler, K. L., Honemann, M. N., Weuster-Botz, D., Dietz, H. Biotechnological mass production of DNA origami. Nature. 552 (7683), 84-87 (2017).
- Linko, V., et al. One-step large-scale deposition of salt-free DNA origami nanostructures. Scientific Reports. 5, 15634 (2015).
- Arbabi, A., Horie, Y., Bagheri, M., Faraon, A. Dielectric metasurfaces for complete control of phase and polarization with subwavelength spatial resolution and high transmission. Nature Nanotechnology. 10 (11), 937-943 (2015).
- Shen, B., et al. Plasmonic nanostructures through DNA-assisted lithography. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (26), 5001-5006 (2009).
- Ke, Y., et al. Multilayer DNA Origami Packed on a Square Lattice. Journal of the American Chemical Society. 131 (43), 15903-15908 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Kim, D. -N., Kilchherr, F., Dietz, H., Bathe, M. Quantitative prediction of 3D solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures. Nucleic Acids Research. 40 (7), 2862-2868 (2011).
- Benson, E., et al. DNA rendering of polyhedral meshes at the nanoscale. Nature. 523 (7561), 441-444 (2015).
- Veneziano, R., et al. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6923), 1534 (2016).
- Linko, V., Kostiainen, M. A. Automated design of DNA origami. Nature Biotechnology. 34 (8), 826-827 (2016).
- Nummelin, S., Kommeri, J., Kostiainen, M. A., Linko, V. Evolution of Structural DNA Nanotechnology. Advanced Materials. 30 (24), 1703721 (2018).
- Maffeo, C., Yoo, J., Aksimentiev, A. De novo reconstruction of DNA origami structures through atomistic molecular dynamics simulation. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3013-3019 (2016).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Shaw, A., Benson, E., Högberg, B. Purification of Functionalized DNA Origami Nanostructures. ACS Nano. 9 (5), 4968-4975 (2015).
- Kuzyk, A., Yurke, B., Toppari, J. J., Linko, V., Törmä, P. Dielectrophoretic Trapping of DNA Origami. Small. 4 (4), 447-450 (2008).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), 40 (2013).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Ramakrishnan, S., Ijäs, H., Linko, V., Keller, A. Structural stability of DNA origami nanostructures under application-specific conditions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 342-349 (2018).
- Kielar, C., et al. On the Stability of DNA Origami Nanostructures in Low-Magnesium Buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
- Surwade, S. P., et al. Nanoscale growth and patterning of inorganic oxides using DNA nanostructure templates. Journal of the American Chemical Society. 135 (18), 6778-6781 (2013).
- Shen, B., Linko, V., Tapio, K., Kostiainen, M. A., Toppari, J. J. Custom-shaped metal nanostructures based on DNA origami silhouettes. Nanoscale. 7 (26), 11267-11272 (2015).
- Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline Two-Dimensional DNA-Origami Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 50 (1), 264-267 (2011).
- Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA Origami Nanophotonics and Plasmonics at Interfaces. Langmuir. 34 (49), 14911-14920 (2018).
