Summary
Her beskriver vi en protokoll for å skape diskrete og nøyaktige uorganiske nanostrukturer på underlag ved hjelp av DNA Origami figurer som veiledende maler. Metoden er demonstrert ved å skape plasmonic gull Bowtie antenner på en gjennomsiktig substrat (safir).
Abstract
Strukturelle DNA-nanoteknologi gir en levedyktig rute for å bygge fra bunnen opp ved hjelp av DNA som konstruksjonsmateriale. Den vanligste DNA nanofabrication teknikken kalles DNA Origami, og det gir høy gjennomstrømming syntese av nøyaktige og svært allsidige strukturer med nanometer-nivå presisjon. Her er det vist hvordan romlig informasjon av DNA Origami kan overføres til metalliske nanostrukturer ved å kombinere bunnen opp DNA Origami med konvensjonelt brukt ovenfra og ned litografi tilnærminger. Dette tillater fabrikasjon av milliarder av ørsmå nanostrukturer i ett trinn på utvalgte underlag. Metoden er demonstrert ved hjelp av Bowtie DNA Origami for å skape metalliske Bowtie antenne strukturer på silisium nitride eller safir underlag. Metoden er avhengig av selektiv vekst av en silisium oksid lag på toppen av Origami deponering underlaget, og dermed resulterer i et mønster maske for følgende litografiske trinn. Disse nanostructure flatene kan videre brukes som molekylære sensorer (f. eks overflate-forbedret Raman spektroskopi (SERS)) og i ulike andre optiske applikasjoner på den synlige bølgelengdeområdet på grunn av den lille funksjonen størrelser (sub-10 NM). Teknikken kan utvides til andre materialer gjennom metodisk modifikasjoner; Derfor kan de resulterende optisk aktive overflater finne bruk i utvikling av metamaterialer og metasurfaces.
Introduction
Strukturelle DNA nanoteknologi har raskt utviklet seg i løpet av de siste ti år1,2, og den mest innflytelsesrike utviklingen i feltet har uten tvil vært oppfinnelsen av DNA Origami3,4. DNA Origami teknikken tillater fabrikasjon av praktisk talt alle nanoshape med nøyaktig strukturelle egenskaper3,4. Denne kraftige metoden kan brukes i (sub) nanometer-presis romlig ordning og forankring av andre nano-objekter, for eksempel karbon nanorør5, metall nanopartikler6,7,8, 9, enzymer/proteiner10,11,12,13 og terapeutiske materialer14,15,16,17 . Viktigst, disse strukturene er ikke bare statiske, men de kan også programmeres til å opptre på en dynamisk måte18,19. De utallige anvendelser av DNA Origami spenner fra narkotika levering20,21,22 til molekylær Electronics/plasmonics5,23,24, 25 og fra Materials Science26,27 til romanen Imaging og kalibrering teknikker28.
I tillegg til programmene som er nevnt ovenfor, den ekstreme romlig oppløsning av DNA Origami figurer kan bli utnyttet i nanopatterning og delikat nanoskala litografi29,30. Denne protokollen beskriver en litografi metode for å lage diskrete og nøyaktige uorganiske nanostrukturer på underlag ved hjelp av DNA Origami maler. Disse malene kan produseres effektivt i ulike former og i store mengder31, og deponeres uanstrengt på utvalgte underlag i store skalaer32. Disse egenskapene tillater en svært parallell fabrikasjon av milliarder av nanostrukturer i ett trinn i motsetning til vanlig, men heller langsom elektronstråle litografi eller andre skanning-baserte nanofabrication teknikker.
Heri, fabrikasjon forarbeide er bevist av skaper gullet Bowtie-formet strukturer opp på Silicon nitride og safir underlag; med andre ord, den romlige informasjonen om DNA Origami er overført til helt metallisk nanostrukturer. Som diskutert her, er teknikken ikke begrenset til den valgte Bowtie DNA Origami struktur siden metoden gjør det mulig å bruke nesten alle DNA Origami form. Videre, med metodisk modifikasjoner, kan teknikken utvides til ulike metaller og underlag som banet vei mot fabrikasjon av metasurfaces33.
Overflatene mønstret med DNA Origami-mediert fabrikasjon kan tjene som allsidige sensorer; de kan for eksempel brukes i overflate forbedrede Raman-spektroskopi (SERS). Som et resultat av de små dimensjonene til den enkelte nanoshapes, kan de opprettede overflatene finne bruksområder i optiske og plasmonic anvendelser ved den synlige bølgelengdeområdet.
Protocol
1. design av DNA Origami
Merk: i denne protokollen, en nanopatterning prosess er beskrevet ved hjelp av en todimensjonal (2D) Bowtie DNA Origami struktur (figur 1)34. For å designe en ny DNA Origami form, Følg retningslinjene nedenfor:
- Design ønsket form og de nødvendige stift strand sekvenser av DNA Origami bruker caDNAno35. For å produsere en flat, Single-Layer Origami, ansette torget gitteret alternativet av caDNAno og manuelt justere crossover mellomrom ved å hoppe noen baser i design (se figur 1 og supplerende caDNAno fil) for å fjerne den strukturelle vri resulterende fra torget gitteret pakking36,37.
- Forleng endene av hver DNA-Helix med tråder som inneholder Poly-T (8 NT) overheng; Dette vil hindre multimerization av objektene gjennom Butt-end base-stabling interaksjoner (figur 1 og supplerende caDNAno fil).
- Kjør en beregningsorientert analyse av utformingen. CanDo38,39 kan brukes til å forutsi tredimensjonale (3D) form og strukturelle stivhet av DNA Origami. CanDo er også et nyttig verktøy for å gjenta antall Base hopper nødvendig for vri korreksjon og for å justere design tilsvarende.
- I caDNAno, velge foretrukket stillas lengde og generere stiften tråder som trengs for å brette strukturen. For Bowtie struktur, 7249 NT lange M13mp18 stillaset og 205 unike stift tråder brukes (se supplerende caDNAno fil).
Merk: det finnes også andre beregningsorientert verktøy tilgjengelig for å designe DNA Origami strukturer40,41,42,43. Avhengig av valgt verktøy/programvare, kan andre simuleringsverktøy også brukes43,44.
2. montering av DNA Origami
- Gjør bestanden av stift tråder ved å blande like mye av alle oligonukleotider som trengs for Bowtie struktur (totalt 205 stifter)34. Oligonukleotider skal alle ha samme innledende konsentrasjon (f.eks. 100 μM i RNase fritt vann).
- Forbered DNA Origami folding reaksjonsblandingen i 100 til μL mengder i en 0,2 mL PCR rør ved å blande 20 μL av M13mp18 stillas strand (type p7249, ved 100 nM), 40 μL av stifte lagerløsning, der hver tråd er på 500 nM (som gir ~ 10x molar overskudd av stifter sammenlignet til stillaset) og 40 μL av 2,5 x sammenleggbar buffer (FOB). FOB inneholder Tris-eddiksyre-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer (TAE) supplert med MgCl2. Se tabell 1 for KONSENTRASJONER av FOB-komponenten.
- Anneal reaksjonsblandingen i en thermocycler fra 90 ° c til 27 ° c. Bruk den termiske folde rampen som er presentert i tabell 2.
3. rensing av DNA Origami
Merk: det overskytende beløpet av stift tråder kan fjernes fra DNA Origami løsningen ved hjelp av en ikke-destruktiv Poly (etylen glykol) (PEG) rensing metoden. Protokollen er tilpasset fra Stahl et al.45.
- Fortynne 200 μL av monterte DNA Origami-strukturer med 600 μL av 1x FOB (se tabell 1) for å oppnå et start volum på 800 μL.
- Bland den fortynnede DNA Origami løsningen 1:1 med 800 μL av PEG utfelling buffer (15% PEG 8000 (w/v), 1x TAE, 505 mM NaCl) og bland godt med pipettering frem og tilbake.
- Sentrifuger blandingen i 30 min ved 14 000 x g og romtemperatur.
- Fjern supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
- Tilsett 200 μL av 1x FOB og bland forsiktig ved pipettering. En annen mengde 1x FOB kan også legges til for å oppnå ønsket DNA Origami-konsentrasjon.
- For å redissolve DNA Origami strukturer (liten gjennomsiktig pellet i bunnen av røret), ruge den PEG renset DNA Origami strukturer over natten ved romtemperatur.
- Beregn DNA Origami konsentrasjonen etter PEG rensing ved å måle absorbansen i en bølgelengde på 260 NM ved hjelp av en UV/Vis spektrofotometer. Bruk Beer-Lambert loven og en utryddelse koeffisient på 1,1 ∙ 108 M-1 cm-1 for beregning6. Typisk DNA Origami konsentrasjon etter PEG rensing er 15-20 nM.
- Oppbevar PEG-renset DNA Origami strukturer ved 4 ° c. DNA Origami strukturer er vanligvis stabile i månedsvis så store mengder lager kan være forberedt på senere bruk.
Merk: det overskytende beløpet av stift tråder kan også fjernes ved hjelp av andre rensing teknikker46, som spin-filtrering47, rate sonebasert sentrifugering48 og agarose gel utvinning49. DNA Origami strukturer er stabile i en rekke buffer løsninger50, og om nødvendig, kan lagringsmediet endres etter at Peg rensing gjennom spin filtrering51.
4. Agarose gel elektroforese
Merk: kvaliteten på folding og fjerning av overflødig stift tråder kan verifiseres ved hjelp av agarose gel elektroforese.
- Forbered en ~ 2% (w/v) agarose gel ved å legge 1 g agarose og 45 mL 1x TAE til en Erlenmeyer kolbe. Varm blandingen i en mikrobølgeovn til agarose er helt oppløst, og en klar løsning er produsert.
- Kjøl ned oppløsningen under rennende vann til flasken er behagelig å berøre (50 – 60 ° c).
- Tilsett 5 mL 110 mM MgCl2 og 40 μL av etidiumbromid bromide oppløsning (0,58 mg ml-1) til oppløsningen og rist blandingen forsiktig.
FORSIKTIG: Etidiumbromid bromide er et mulig kreftfremkallende stoff og bør håndteres med forsiktighet. - Sett opp gel avstøpning skuffen og hell væsken agarose inn i Casting skuffen. La gelen stivne i romtemperatur i minst 30 min.
- Fjern gelen fra Casting skuffen og plasser den i en gel elektroforese kammer. Fyll kammeret med løpe buffer (1x TAE med 11 mM MgCl2).
- Tilsett 1 μL av 6 ganger gel lasting fargestoff per 5 μL prøve løsning og bland godt. Legg i prøvene ved å nøye pipettering den ønskede mengden av prøve løsningene i separate gel-lommer.
- Kjør agarose gel med en konstant spenning på 95 V for 45 min. Hold gel elektroforese kammer på et is bad for å kjøre for å unngå varmeskade på gel.
- Visualiser gelen under ultrafiolett lys ved hjelp av en gel Imaging system (figur 2a).
5. substrat forberedelse (Figur 3A)
Merk: følgende trinn er utført i et rent rom, med unntak av SiO2 vekst (trinn 9). Rengjøringen trinnene kan også erstattes med en standard Piranha-løsning basert rengjøring Hvis denne prosessen er ikke nok til å fjerne alle rester fra underlaget.
- Klipp 7 mm x 7 mm chips fra en kjeks som skal brukes som et substrat. For SiN, bruk en silisium sag, en diamant kutter penn eller et lignende redskap. Dicing safir (Al2O3) vil kreve et spesialisert verktøy eller sag blad. Chip størrelse trenger ikke å være nøyaktig.
- Rengjøring av sjetongene.
- Dypp terninger sjetonger i et glass med varm aceton (aceton oppvarmet til 52 ° c) og holde dem oppvarmet i minst 15 min. avhengig av Start renslighet av underlaget, en lengre tid kan være nødvendig.
- Mens de er fortsatt i varme aceton bad, forsiktig gni chips med en bomullsdott å mekanisk fjerne eventuelle rester filmer.
- Ved hjelp av pinsett, løft chips fra varme aceton og bruke en vaskeflaske for å skylle dem med romtemperatur aceton.
- Dypp sjetongene i et glass med isopropanol og ultrasonicate i 2 min.
- Løft chips ut fra isopropanol med pinsett og tørk dem umiddelbart og grundig ved hjelp av en nitrogen flyt. Bare berør og hold sidene og kantene på sjetongene, da områder dekket av pinsett ikke tørker skikkelig, slik at potensielt rester og annen forurensning på kontaktområder. For best resultat, bruk så høy flow som mulig og hold chip overflater parallelt med strømningsretningen.
- Oppbevar sjetongene i en dekket beholder inne i renrom for senere bruk.
6. plasma forbedret kjemisk damp deponering (PECVD) av amorfe silisium (a-si) lag (Figur 3B)
- Plasser sjetongene i PECVD-utstyret.
- Sette opp deponering parametrene å vokse omtrent 50 NM av amorfe silisium (a-si). Nøyaktige innstillinger varierer etter utstyrs modell og kalibrering. Se tabell 3 for parametrene som er brukt her. Kjør a-si deponering program for å vokse laget.
- Etter behandling, Oppbevar sjetongene i en overbygd beholder i standard rene romforhold.
7. oksygen plasma behandling av a-si-laget (Figur 3B)
Merk: dette trinnet vil gjøre underlaget overflaten litt negativt ladet og hydrofile, slik at DNA Origami strukturer kan senere effektivt adsorberes til overflaten ved hjelp av flere magnesium ioner.
- Plasser sjetongene i det reaktive (Rite) utstyret.
- Sett opp etsing parametere for å generere oksygen plasma. Igjen, nøyaktige innstillinger varierer etter utstyrs modell og kalibrering. Se tabell 3 for parametrene som er brukt her. Kjør oksygen plasma behandlingsprogrammet.
- Fortsett til neste trinn umiddelbart som virkningene av behandlingen vil svekkes raskt. Vanligvis bør underlaget brukes i løpet av de neste 30 min etter plasma behandling.
8. deponering av DNA Origami (Figur 3C)
- Forbered et DNA Origami blanding for deponering ved å blande 5 μL av foldet/renset DNA Origami løsning (~ 20 nM) med 4 μL av 1x FOB og 1 μL av 1 M MgCl2. Den resulterende løsningen inneholder ~ 10 nM DNA Origami og omtrent 100 mM av mg2 +.
- Depositum 10 μL av DNA Origami blandingen på en oksygen plasma-behandlet chip og ruge dekket i 5 min ved romtemperatur. Tildekking hindrer utilsiktet tørking og hjelpemidler i å fjerne overflødig salt og DNA Origami strukturer senere.
- Etter inkubasjons, vask overflaten ved første pipettering 100 μL av destillert vann (f.eks. MilliQ) på brikken. Skyll vannet frem og tilbake noen ganger med pipette, samtidig som du unngår å berøre midten av brikken. Fjern det meste av vannet fra overflaten med pipette. Dette fører til bare riktig adsorberes Origami å forbli på overflaten.
- Gjenta denne vaskesyklusen (trinn 8,3) 3 til 4 ganger.
- Etter vask, tørk prøven umiddelbart med en nitrogen flyt. Gjør dette på samme måte som tørking i underlaget forberedelse (trinn 5). Det er viktig å tørke prøven så grundig som mulig.
Merk: tettheten av avsatt strukturer og dermed tettheten av metall nanostrukturer kan endres ved å justere konsentrasjonen av DNA Origami og mg2 + i deponering løsning. Høyere mg2 + konsentrasjon forbedrer DNA Origami vedheft og dermed øker tettheten, men det vil til slutt også føre til AGGLOMERERING av DNA Origami strukturer. Således bør primært DNA Origami konsentrasjonen justeres først.
9. vekst av SiO2 maske (Figur 3D)
Merk: dette trinnet kan utføres utenfor renrom. Følgende versjon vil gi en negativ tone mønster, men det er mulig å endre prosessen for å gi et positivt-tone mønster i stedet. Den SiO2 vekstprosessen er tilpasset fra Surwade et al.52, utviklet videre av forfatterne53, og til slutt optimalisert for denne protokollen.
- Ta en sealable desikator (1,5 L), en Petri rett som passer inne i desikator (valgfritt) og en perforert plate som kan fungere som en plattform inne i desikator.
- Ta 100 g av silica gel og bland den med 30 g destillert vann i Petri parabolen eller direkte i desikator. Gjør dette trinnet fortrinnsvis minst 24 timer i forveien for å tillate silica gel å stabilisere.
Merk: Dette brukes til å kontrollere fuktigheten inne i desikator og derfor også vekstraten og morfologi av SiO2 film. Høyere luftfuktighet resulterer i høyere rente og grovere struktur. Alternativt kan silica gel kureres i en klimatiske testkammer. - Plasser silica gel i desikator og skill den med perforert plate.
- Plasser chips med adsorberes DNA Origami samt et åpent hetteglass med (frisk) 10 mL av Tetraethyl orthosilicate (TEOS) og et annet hetteglass med 10 mL 25% ammonium natriumhydroksid (NH4Oh) i desikator, på perforert plattform. Sett hetteglassene nær og på hver sin side av prøvene. Fortrinnsvis bruke en kolbe kork eller en lignende flat pidestall til litt heve chips fra plattformen.
FORSIKTIG: begge NH4Oh og TEOS er skadelige i tilfelle hudkontakt og deres damper kan forårsake irritasjon i både øyne og respiratoriske organer. Bruk på et godt ventilert område og bruk vernehansker, øyebeskyttelse og verneklær. - Forsegle kammeret og ruge i 20 timer ved romtemperatur. Dette vil vokse en SiO2 film på de områdene hvor DNA Origami strukturene ikke er plassert, og skaper en 10-20 NM mønstret maske med DNA Origami formede hull (Figur 4).
- Fjern prøvene fra kammeret etter inkubasjons. Oppbevares i en beholder som dekkes. Behandlingen kan stanses midlertidig her. Kast den brukte TEOS og NH4Oh. Den batch av silica gel kan brukes 2-3 ganger hvis den holdes forseglet inne i desikator mellom bruk og brukes innen 2-3 uker.
10. reaktiv ion etsing (Rite) av SiO2 og a-si (Figur 3E)
- Plasser sjetongene i det reaktive (Rite) utstyret.
- Sett opp etsende parametre for å bare etse 2-5 NM av SiO2 for å avdekke a-si-laget under hullene i Sio2 masken. Nøyaktige innstillinger må fastsettes eksperimentelt for det enkelte utstyret. Parametrene som brukes her er presentert i tabell 3. Kjør Anisotrop SiO2 plasma etsing programmet.
- Sett opp etsing parametrene å Pierce gjennom 50 NM a-si lag. Parametrene som brukes her er igjen presentert i tabell 3. Kjør isotropic a-si plasma etsing program.
- Fjern prøvene fra Rite-utstyr og oppbevar det tildekket. Behandlingen kan igjen bli suspendert her.
11. fysisk damp deponering (PVD) av metaller (Figur 3F)
- Legg sjetongene inn i fordampning kammeret til PVD-instrumentet.
- Velg et mål metall. Først velger du et selvklebende metall. Her brukes 2 NM krom (CR).
- Definer tykkelse kontrollprogram for målet materiale og tykkelse. Kontroll metoden er instrument avhengig. Her brukes en kvartskrystall mikrovekt (QCM). Den målte tykkelsen justeres ved mål materialtetthet og Z-faktor og må korrigeres av en eksperimentelt bestemt verktøy faktor som er spesifikk for enheten og hvert mål materiale.
- Start elektron bjelken, justere strålen til målet og øke stråle strøm til en deponering rate på 0,05 NM/s er nådd. Fordampe til en endelig tykkelse på 2 NM er nådd.
- Velg en annen mål metall (f. eks gull) uten ventilering av kammeret eller avbryte prosessen. Avbrudd eller lufting vil tillate limet metall for å starte oksiderende og redusere sin brukervennlighet som et klebemiddel.
- Gjenta trinn 11,3 til 11,4. Fordamper til 20 NM er nådd. Dette vil skape en DNA Origami formet metall struktur gjennom SiO2 maske hullene med en total høyde på 22 NM.
- Vent kammeret og fjern prøvene.
- Behandlingen kan stanses midlertidig her hvis prøvene er lagret dekket.
12. løft med flussyre syre (HF) (Figur 3G)
- Hell 50% HF-basert etsemiddelet løsning i en egnet plastbeholder. Ingen HCl bør brukes for blandingen, siden HCl ville etse CR i utvalget.
FORSIKTIG: HF er svært etsende, forårsaker alvorlig irritasjon og brannskader, og kan være dødelig på hudkontakt eller ved innånding. Bruk kun HF i en dedikert avtrekksvifte eller ventilert våt benk med et beskyttende forkle, kjemikaliebestandige hansker og ansikts visir, eller på annen måte full kjemisk beskyttelse. - Dypp prøvene i HF-baserte etsemiddelet og rør forsiktig med plastikk pinsett.
- Vent til SiO2 laget til etch helt og metallet laget for å løsne. Tiden vil variere merkbart avhengig av tettheten av maske hullene. Et høyere antall hull vil oversette til raskere etsing. Hvis metall laget er vanskelig å skrelle av, kan kort ultralydbehandling for 5 til 10 s brukes.
- Når metall filmen løsner, skyll prøvene med dobbel destillert vann og isopropanol.
- Etter skylling, tørk prøvene med en nitrogen strømning på samme måte som instruert for underlaget forberedelse (trinn 5). Unngå pinsett kontakt med chip sentrum, som det kan ødelegge dannet nanostrukturer.
Merk: prøvene kan oppbevares og behandles suspendert her.
13. Rite av gjenværende a-si (Figur 3H)
- Plasser sjetongene i det reaktive (Rite) utstyret.
- Sett opp etsing parametere for grundig fjerning av alle 50 NM i a-si. Parametrene kan være de samme som i trinn 10, men en litt lengre etsing tid (40 s) kan brukes til å sikre fjerning av alle a-si. Se tabell 3 for parametrene som er brukt her. Kjør isotropic a-si plasma etsing program for å fjerne gjenværende a-si.
- Fjern prøvene fra Rite-utstyr og oppbevar det tildekket. Dette vil konkludere med prøve behandling.
14. Atomic Force mikroskopi (AFM)
Merk: Atomic Force mikroskopi og skanning elektron mikroskopi kan brukes til å overvåke suksessen til film vekst og mønstre, samt til bildet foldet DNA Origami strukturer (figur 2B, C). Følgende prøve Forberedelses trinn kan hoppes over hvis behandlede eksempler fra trinn 5-13 er avbildet.
- Prøveforberedelse for AFM
- For å avbilde foldet DNA Origami, ta en chip av glimmer substrat.
- Fest glimmer chip til et glass mikroskop lysbilde ved hjelp av et klebemiddel.
- Forbered 10 μL av DNA Origami løsning ved å fortynne ~ 20 nM DNA Origami lager 50 ganger i 1x FOB til en konsentrasjon på ca 0,4 nM. Den fortynning er utført for å hindre overbefolkning underlaget.
- Skrell det øverste laget av glimmer ark av med svak tape for å få en fersk kløyvde, ladet overflate.
- Sett inn den fortynnede DNA Origami-løsningen på den ferske kløyvde glimmer og ruge prøven dekket i 1 min ved romtemperatur.
- Etter inkubasjons, vask overflaten 3-4 ganger med 100 μL av destillert vann ved hjelp av en pipette. Dette fører til bare riktig adsorberes Origami å forbli på overflaten.
- Depositum 100 μL av destillert vann på glimmer overflaten.
- Vipp og trykk skarpt på mikroskop glasset på bordet for å løsne det meste av vannet.
- Gjenta denne vaskesyklusen 3-4 ganger.
- Tørk prøven grundig med en nitrogen strømning umiddelbart etter vask. Prøven er da klar for AFM Imaging.
- Plasser DNA Origami prøvene eller behandlet sjetonger i en AFM og utføre skanninger. En skannestørrelse på 1-10 μm er egnet til å løse strukturene riktig.
15. skanning elektron mikroskopi (SEM)
- Plasser prøvene i en SEM. De behandlede sjetongene kan brukes som de er (ytterligere prøve forberedelser er ikke nødvendig).
- Velg akselerasjons spenningen. Bruk lav spenning (5-10 kV) for å redusere lade effekten siden prøve underlaget (Al2O3 eller sin) er en isolator.
- Skann alle områder av interesse. Minimer skanne tiden for å redusere ladingen og unngå å bli forurenset.
Representative Results
En skjematisk figur av Bowtie DNA Origami design og dens strukturelle detaljer er vist i figur 1. Agarose gel elektroforese og AFM brukes til å analysere DNA Origami folding og kvaliteten på PEG rensing (figur 2). Prosessflyten for de nanolithography trinnene vises i Figur 3. Representative AFM bilder etter SiO2 maske vekst er vist i Figur 4 (dette trinnet er avbildet i Figur 3D), mens SEM bilder av den endelige metall nanostrukturer kan sees i figur 5 (dette trinnet er avbildet i Figur 3H). Figur 6 demonstrerer den optiske funksjonaliteten til den metalliske nanostrukturer mal av den Bowtie DNA Origami.
| Konsentrasjoner av folding buffer (FOB) komponent [mM] | |||||
| Tris | Eddiksyre | Edta | Magnesium klorid | Ph | |
| 2.5 x FOB | 100 | 47,5 | 2,5 | 31,25 | ~ 8, 3 |
| 1x FOB | 40 | 19 | 1 | 12,5 | ~ 8, 3 |
Tabell 1: sammensetning av folde bufferen (FOB).
| Temperaturområde [oC] | Kjøle hastighet |
| 90-70 | -0,2 ° c/8 s |
| 70-60 | -0,1 ° c/8 s |
| 60-27 | -0,1 ° c/2 s |
| 12 | Hold til stoppet |
Tabell 2: termisk rampe for Bowtie Origami folding. Etter annealing, vil Origami bli lagret ved 12 oC til programmet er manuelt stoppet.
| PECVD-og Rite-parametere | ||||||
| Gass | Gas strømmen [SCCM] | Kammer trykk [mTorr] | RF-kraft [W] | Temperatur [oC] | Varighet [s] | |
| PECVD av a-si | 5% SiH4 i N2 | 500 | 1000 | 15 | 250 | 90 |
| O2 plasma behandling | O2 | 50 | 40 | 200 | 30 | 1200 |
| Rite av SiO2 | 3 CHF | 25 | ||||
| Ar | 25 | 30 | 100 | 25 | 10-22 | |
| Rite av a-si | O2 | 8 | ||||
| SF6 | 100 | 90 | 50 | 30 | 35 | |
| Rite av gjenværende a-si | O2 | 8 | ||||
| SF6 | 100 | 90 | 50 | 30 | 35-40 |
Tabell 3: prosessparametre for plasma forbedret kjemisk damp deponering (PECVD) og reaktiv ion etsing (Rite). Prosessparametrene for disse enhetene er spesifikke for individuelle instrumenter, og de må kanskje tilpasses når de brukes.
Figur 1: design av Bowtie DNA Origami. (A) skjematisk fremstilling av den Bowtie Origami-designen der kjerne strukturen vises som doble helikser og polyT-overheng fremstilles som bølgete linjer. (B) skjermbilde av en del av Bowtie Origami design i caDNAno programvare. Den røde kors betegne basen paret hoppe for vri korreksjon, og T8-overheng er lagt for å hindre Butt-end base-stabling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: KARAKTERISERING av Bowtie DNA Origami struktur. (A) Agarose gel elektroforese av Bowtie strukturen før og etter Poly (etylen glykol) (PEG) rensing. Den 7249 nukleotider lange stillaset brukes som referanse. (B) Atomic Force MIKROSKOPI (AFM) bilde av Bowtie strukturer før rensing. (C) AFM bilde av Bowtie strukturer etter Peg rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjema for fabrikasjon prosessflyt (dimensjonene er ikke i skala). (A) terninger og rengjør underlaget. (B) sette inn et a-si-lag ved plasma forbedret kjemisk damp DEPONERING (PECVD). * Det er mulig å ansette et ekstra offer lag under a-si for å muliggjøre lift-off med etsemiddelet annet enn HF. (C) behandle prøveoverflaten med O2 plasma og innskudd DNA Origami på den. (D) Grow Sio2 masken i desikator. (E) etse et tynt lag av Sio2 og gjennom a-si under det av REAKTIV ion etsing (Rite). (F) sette metall gjennom masken av fysisk damp DEPONERING (PVD). (G) løft-av med HF. (H) Fjern gjenværende a-si ved Rite. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative AFM bilder av Sio2 film med DNA Origami formet mønster. (A) 10 μm x 10 μm skanning området viser høy avkastning av mønsteret formasjon. (B) en nærmere 3 μm x 3 μm-skanning viser de nøyaktige individuelle mønstrene i Sio2 -filmen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative skanning elektron mikroskopi (SEM) bilder av metallisk NANOSTRUKTURER mal med strukturelt forskjellig DNA Origami. (A) Cross-formet DNA Origami, dvs. såkalte Aphonoplema flis Origami54. (B) Bowtie antenner. (C) chiral dobbel L (CDL) strukturer. Det er enkelt å vise individuelle strukturer med boks størrelser på 150 NM x 150 NM. Den fabrikasjon yield av eksakte strukturer er opp til 76% for Bowtie Origami og ~ 50% for de andre strukturene som vises her34. Dette tallet er tilpasset og modifisert fra Shen et al.34. Figuren gjengis med tillatelse fra forfatterne og utgitt av The American Association for fremming av vitenskap, 2018. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representative optiske/funksjonelle egenskaper for resulterende nanostrukturer. (A) lokaliserte overflaten Plasmon RESONANS (LSPR) målinger av en individuell gull Bowtie struktur med ulike polarisering (fargekodet som oransje og blå). De solide linjene måles Spectra, og de stiplede linjene er simulerings resultater. Innlagt viser SEM-bildet av den målte partikkel (venstre) og modellen som brukes for simulering (til høyre). (B) overflate forbedret Raman SPEKTROSKOPI (SERS) av rhodamine 6G og 2, 2-bipyridine målt på en overflate dekket med Bowtie nanostrukturer. Grunnlinjen for hvert utvalg viser signalnivået når nanostrukturer var fraværende. Dette tallet er tilpasset og modifisert fra Shen et al.34. Figuren gjengis med tillatelse fra forfatterne og utgitt av The American Association for fremming av vitenskap, 2018. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: CaDNAno-fil Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: m13mp18 sekvens Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: stift strand sekvens Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Protokollen gir stor frihet og nøyaktighet i form av produserte nanostrukturer. Ved å endre utformingen av DNA Origami, formen på metall nanostrukturer kan styres. Den endelige, eksakte formen på metallkonstruksjoner er i tillegg bestemmes av masken vekst trinn (trinn 9) og i mindre grad av masken etsing (trinn 10) bør det ikke være Anisotrop. Hvis maske vekst tiden forlenges nok, vil hullene i masken begynne å bli lukket. Dette kan brukes til å utelate de tynneste funksjonene i noen strukturer og kontroll gap størrelser, som demonstrert i Shen et al.34 med separerte trekanter av Bowtie Origami (figurer 5B). Omvendt kan tynnere figurer bli bedre bevart ved å forkorte oksid vekst tid. Dette betyr at det er mulig å tune de optiske egenskapene som vises i figur 6, ikke bare ved å endre den brukte Origami design, men også ved tuning av Sio2 film vekst.
Hvis maske tykkelsen endres betydelig, må denne endringen også gjenspeiles i SiO2 Rite-trinnet. Bare et svært tynt lag av SiO2 bør være etset (2-5 NM) for å knapt Pierce gjennom masken hullene. Dette er den mest følsomme og avgjørende del av hele prosessen. Siden etsing tiden er ekstremt kort, bare 10-20 s, må eksakte innstillinger være eksperimentelt bestemmes når første forsøk med nytt utstyr. Dette gjelder også for trinn 10,4 som noen SiO2 er også etset under a-si etsing. Omfanget av etset SiO2 bestemmes av selektivitet av brukte a-si etch parametere, utstyr og til og med individuelle utstyr kalibreringer. Forsiktighet bør utvises ikke å etse bort hele SiO2 lag i løpet av disse to prosessene.
En annen følsom trinn er SiO2 vekst. Vekstprosessen er avhengig av både kammer fuktigheten og den gjeldende aktiviteten til den brukte TEOS. TEOS forringer som det absorberer vann fra luften, slik at den blir mindre effektiv med alderen. Dette kan manifestere som en betydelig tregere, mindre kontrollerbar vekstrate i løpet av måneder selv med riktig lagring av kjemiske. 34 hvis det resulterende Sio2 -laget er tynnere enn tiltenkt, kan dette indikere et problem med TEOS i stedet for kammer fuktighet. Mens en lavere luftfuktighet kan også føre til lavere vekst og tynnere film, den resulterende filmen bør også være jevnere enn normalt. Imens en grovkornet og grov lag ville motsatt indikere et problem med høy luftfuktighet.
Det er også mulig å utføre denne protokollen på et fritt valgt substrat med to krav: det må tåle både HF etsing (Trinn 12) og 200-300 ° c temperaturer på PECVD (trinn 6). Temperaturen kan trygt senkes til 100 ° c for PECVD av a-si hvis et mer følsomt substrat brukes, men HF kan ikke unngås hvis protokollen følges nøyaktig som beskrevet. For å omgå HF, vil anvendelsen av en ekstra offerplasser være nødvendig. Hvis kravet til HF-etsing fjernes, vil denne protokollen bli kompatibel med et bredere utvalg av substrat materialer og metaller.
Ettersom denne protokollen består av brukte og robuste mikro-og nanofabrication prosesser, kan det kombineres med en rekke andre microfabrication protokoller der små har størrelser og komplekse metallformer er ønsket. I nær framtid, spesielt med den kommende av lave kostnader DNA Origami masse-produksjon31, det er potensial for denne metoden for å lette både generell bruk og høy gjennomstrømming nanopatterning for grensesnitt-baserte Nanofotonikk og plasmonics55 .
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Academy of Finland (prosjekter 286845, 308578, 303804, 267497), Jane og langgong Erkko Foundation, og Sigrid Jusélius Foundation. Dette arbeidet ble utført under Academy of Finland Centers of Excellence program (2014 – 2019). Vi anerkjenner levering av fasiliteter og teknisk støtte ved Aalto University Bioøkonomi fasiliteter og OtaNano – Nanomicroscopy Center (Aalto-NMC) og Micronova Nanofabrication Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Honeywell | 40289H | Semiconductor grade ULSI, ≥ 99.5 % |
| Agarose | Fisher Bioreagents | 1036603 | Low-EEO, multi-purpose and molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide | Fisher Chemical | 10652251 | 25 % ammonia solution, Certified AR for Analysis, d = 0.91 |
| BRANSON 5510 | Branson | Ultrasonic bath | |
| Dimension Icon | Bruker | Atomic force microscope | |
| Electron-beam evaporator IM-9912 | Instrumentti Mattila | Evaporator for PVD | |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E8751 | Fluorescent dye for DNA staining |
| Eon Microplate spectrophotometer | BioTek | UV/Vis spectrophotometer used for DNA origami concentration measurements | |
| Gel Doc XR+ Documentation System | BioRad | Gel imaging system | |
| Gel Loading Dye, Blue (6×) | New England Biolabs | B7021S | Bromophenol blue-based loading dye for agarose gel electrophoresis |
| G-storm GS1 Thermal cycler | Gene Technologies | ||
| HBR 4 | IKA | Heating bath | |
| Hydrofluoric acid | Honeywell | 40213H | Semiconductor grade, 49.5-50.5 % |
| Isopropanol | Honeywell | 40301H | Semiconductor grade VLSI, ≥ 99.8 % |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥ 98 % |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | ||
| Plasmalab 80+ PECVD | Oxford Instruments | PECVD system | |
| Plasmalab 80+ RIE | Oxford Instruments | RIE system | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 89510 | BioUltra, 8,000 |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | ||
| Sapphire substrate (Al2O3) | University Wafer | Thickness: 430 μm, Polish: DSP, Size: 50.8 mm | |
| Sigma VP | Zeiss | Scanning electron microscope | |
| Silica gel | Merck | 1019691000 | With indicator (orange gel), granulate ~1-3 mm |
| Single-stranded Scaffold DNA, type p7249 | Tilibit Nanosystems | At 100 nM concentration | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥ 99.0 % |
| Staple strands (oligonucleotides) | Integrated DNA Technologies | Sequences can be ordered e.g. at 100 micromolar in Rnase-free water | |
| TAE buffer (50×) pH 8.0 | VWR Chemicals | 444125D | Electran Electrophoresis grade |
| Take3 micro-volume plate | BioTek | Used for DNA origami concentration measurements | |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma Aldrich | 86578 | ≥ 99.0 % (GC) |
References
- Seeman, N. C., Sleiman, H. F. DNA nanotechnology. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17068 (2017).
- Linko, V., Dietz, H. The enabled state of DNA nanotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 555-561 (2013).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Hong, F., Zhang, F., Liu, Y., Yan, H. DNA Origami: Scaffolds for Creating Higher Order Structures. Chemical Reviews. 117 (20), 12584-12640 (2017).
- Maune, H. T., et al. Self-assembly of carbon nanotubes into two-dimensional geometries using DNA origami templates. Nature Nanotechnology. 5 (1), 61-66 (2010).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5 (2), 121-126 (2010).
- Kuzyk, A., et al. DNA-based self-assembly of chiral plasmonic nanostructures with tailored optical response. Nature. 483 (7389), 311-314 (2012).
- Zhang, T., et al. 3D DNA Origami Crystals. Advanced Materials. 30 (28), 1800273 (2018).
- Julin, S., et al. DNA origami directed 3D nanoparticle superlattice via electrostatic assembly. Nanoscale. 11 (10), 4546-4551 (2019).
- Fu, J., Liu, M., Liu, Y., Yan, H. Spatially-Interactive Biomolecular Networks Organized by Nucleic Acid Nanostructures. Accounts of Chemical Research. 45 (8), 1215-1226 (2012).
- Linko, V., et al. DNA-based enzyme reactors and systems. Nanomaterials. 6 (8), 139 (2015).
- Ramakrishnan, S., Subramaniam, S., Stewart, A. F., Grundmeier, G., Keller, A. Regular Nanoscale Protein Patterns via Directed Adsorption through Self-Assembled DNA Origami Masks. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (45), 31239-31247 (2016).
- Grossi, G., Jaekel, A., Andersen, E. S., Saccà, B. Enzyme-functionalized DNA nanostructures as tools for organizing and controlling enzymatic reactions. MRS Bulletin. 42 (12), 920-924 (2017).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Li, S., et al. A DNA nanorobot functions as a cancer therapeutic in response to a molecular trigger in vivo. Nature Biotechnology. 36 (3), 258-264 (2018).
- Zhao, Y. -X., et al. DNA origami delivery system for cancer therapy with tunable release properties. ACS Nano. 6 (10), 8684-8691 (2014).
- Kollmann, F., et al. Superstructure-Dependent Loading of DNA Origami Nanostructures with a Groove-Binding Drug. ACS Omega. 3 (8), 9441-9448 (2018).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nature Chemistry. 3 (2), 103-113 (2011).
- Ijäs, H., Nummelin, S., Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. Dynamic DNA Origami Devices: from Strand-Displacement Reactions to External-Stimuli Responsive Systems. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2114 (2018).
- Li, J., Fan, C., Pei, H., Shi, J., Huang, Q. Smart Drug Delivery Nanocarriers with Self-Assembled DNA Nanostructures. Advanced Materials. 25 (32), 4386-4396 (2013).
- Linko, V., Ora, A., Kostiainen, M. A. DNA Nanostructures as Smart Drug-Delivery Vehicles and Molecular Devices. Trends in Biotechnology. 33 (10), 586-594 (2015).
- Jiang, Q., Liu, S., Liu, J., Wang, Z. G., Ding, B. Rationally Designed DNA-Origami Nanomaterials for Drug Delivery In Vivo. Advanced Materials. , (2018).
- Shen, B., Linko, V., Dietz, H., Toppari, J. J. Dielectrophoretic trapping of multilayer DNA origami nanostructures and DNA origami-induced local destruction of silicon dioxide. Electrophoresis. 36 (2), 255-262 (2015).
- Kuzyk, A., Jungmann, R., Acuna, G. P., Liu, N. DNA Origami Route for Nanophotonics. ACS Photonics. 5 (4), 1151-1163 (2018).
- Liu, N., Liedl, T. DNA-Assembled Advanced Plasmonic Architectures. Chemical Reviews. 118 (6), 3032-3053 (2018).
- Bathe, M., Rothemund, M. DNA Nanotechnology: A Foundation for Programmable Nanoscale Materials. MRS Bulletin. 42 (12), 882-888 (2017).
- Pilo-Pais, M., Acuna, G. P., Tinnefeld, P., Liedl, T. Sculpting light by arranging optical components with DNA nanostructures. MRS Bulletin. 42 (12), 936-942 (2017).
- Graugnard, E., Hughes, W. L., Jungmann, R., Kostiainen, M. A., Linko, V. Nanometrology and super-resolution imaging with DNA. MRS Bulletin. 42 (12), 951-959 (2017).
- Zhong, J., et al. Metallized DNA nanolithography for encoding and transferring spatial information for graphene patterning. Nature Communications. 4, 1663 (2013).
- Zhang, G., Surwade, S. P., Zhou, F., Liu, H. DNA nanostructure meets nanofabrication. Chemical Society Reviews. 42 (7), 2488-2496 (2013).
- Praetorius, F., Kick, B., Behler, K. L., Honemann, M. N., Weuster-Botz, D., Dietz, H. Biotechnological mass production of DNA origami. Nature. 552 (7683), 84-87 (2017).
- Linko, V., et al. One-step large-scale deposition of salt-free DNA origami nanostructures. Scientific Reports. 5, 15634 (2015).
- Arbabi, A., Horie, Y., Bagheri, M., Faraon, A. Dielectric metasurfaces for complete control of phase and polarization with subwavelength spatial resolution and high transmission. Nature Nanotechnology. 10 (11), 937-943 (2015).
- Shen, B., et al. Plasmonic nanostructures through DNA-assisted lithography. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (26), 5001-5006 (2009).
- Ke, Y., et al. Multilayer DNA Origami Packed on a Square Lattice. Journal of the American Chemical Society. 131 (43), 15903-15908 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Kim, D. -N., Kilchherr, F., Dietz, H., Bathe, M. Quantitative prediction of 3D solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures. Nucleic Acids Research. 40 (7), 2862-2868 (2011).
- Benson, E., et al. DNA rendering of polyhedral meshes at the nanoscale. Nature. 523 (7561), 441-444 (2015).
- Veneziano, R., et al. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6923), 1534 (2016).
- Linko, V., Kostiainen, M. A. Automated design of DNA origami. Nature Biotechnology. 34 (8), 826-827 (2016).
- Nummelin, S., Kommeri, J., Kostiainen, M. A., Linko, V. Evolution of Structural DNA Nanotechnology. Advanced Materials. 30 (24), 1703721 (2018).
- Maffeo, C., Yoo, J., Aksimentiev, A. De novo reconstruction of DNA origami structures through atomistic molecular dynamics simulation. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3013-3019 (2016).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Shaw, A., Benson, E., Högberg, B. Purification of Functionalized DNA Origami Nanostructures. ACS Nano. 9 (5), 4968-4975 (2015).
- Kuzyk, A., Yurke, B., Toppari, J. J., Linko, V., Törmä, P. Dielectrophoretic Trapping of DNA Origami. Small. 4 (4), 447-450 (2008).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), 40 (2013).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Ramakrishnan, S., Ijäs, H., Linko, V., Keller, A. Structural stability of DNA origami nanostructures under application-specific conditions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 342-349 (2018).
- Kielar, C., et al. On the Stability of DNA Origami Nanostructures in Low-Magnesium Buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
- Surwade, S. P., et al. Nanoscale growth and patterning of inorganic oxides using DNA nanostructure templates. Journal of the American Chemical Society. 135 (18), 6778-6781 (2013).
- Shen, B., Linko, V., Tapio, K., Kostiainen, M. A., Toppari, J. J. Custom-shaped metal nanostructures based on DNA origami silhouettes. Nanoscale. 7 (26), 11267-11272 (2015).
- Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline Two-Dimensional DNA-Origami Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 50 (1), 264-267 (2011).
- Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. DNA Origami Nanophotonics and Plasmonics at Interfaces. Langmuir. 34 (49), 14911-14920 (2018).
