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Immunology and Infection

मानवीकृत इम्यूनोडेफिजेंट माउस मॉडल में क्रोनिक, एक्यूट और रीएक्टिवेटेड एचआईवी संक्रमण

doi: 10.3791/60315 Published: December 3, 2019

Summary

यहां वर्णित मानवीकृत चूहों में एचआईवी संक्रमण की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए तीन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हैं । पहला पुरानी संक्रमण घटनाओं के अध्ययन की अनुमति देता है, जबकि दो उत्तरार्द्ध प्राथमिक संक्रमण या वायरल पुनर्सक्रियण के बाद तीव्र घटनाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

Abstract

मानवीकृत NOD/SCID/IL-2 रिसेप्टर-चेननल चूहों मानव प्रतिरक्षा की कुछ विशेषताओं को संक्षिप्त करता है, जिसका संक्रामक रोगों पर बुनियादी और पूर्व नैदानिक अनुसंधान में शोषण किया जा सकता है । यहां वर्णित एचआईवी संक्रमण की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मानवीकृत प्रतिरक्षा चूहों के तीन मॉडल हैं । पहला नवजात चूहों में CD34+ हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के इंट्राहेपेटिक इंजेक्शन पर आधारित है, जो कई रक्त और लिम्फोइड ऊतक-सीमित कोशिकाओं के पुनर्गठन के लिए अनुमति देता है, जिसके बाद संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण होता है। यह मॉडल संक्रमण के बाद 36 सप्ताह तक निगरानी की अनुमति देता है और इसलिए इसे पुरानी मॉडल कहा जाता है। दूसरे और तीसरे मॉडल को तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल के रूप में जाना जाता है, जिसमें परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को वयस्क चूहों में इंट्रापेरिटोनी इंजेक्शन दिया जाता है। तीव्र मॉडल में, एक स्वस्थ दाता से कोशिकाओं को इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से engrafted किया जाता है, जिसके बाद संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण होता है। अंत में, पुनर्सक्रियण मॉडल में, एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी के तहत एचआईवी संक्रमित दाता से कोशिकाओं को इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से संजोर्गेटेड किया जाता है। इस मामले में, माउस में एक दवा मुक्त वातावरण वायरस पुनर्सक्रियण और वायरल लोड में वृद्धि के लिए अनुमति देता है। यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल एचआईवी संक्रमण के मानवीकृत, इम्यूनोडिफिजेंट माउस मॉडल के लिए पारंपरिक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं ।

Introduction

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मानवीकृत NOD/SCID/interleukin (IL)-2 रिसेप्टर-चेननल (इसके बाद huNS के रूप में संदर्भित श्रृंखलानल)माउस मॉडल व्यापक रूप से संक्रमण, ऑटोइम्युनिटी, और कैंसर के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही दवाओं और मानव सेल आधारित चिकित्सा1,2के पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए । ये चूहे एक गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (NOD) पृष्ठभूमि पर आधारित हैं, जिसमें आईएल-2 रिसेप्टर-चेन लोकस (आईएल-2, आईएल-4, आईएल-7, आईएल-9, आईएल-15 और आईएल-21 के लिए आम-श्रृंखला) में स्सिड म्यूटेशन और लक्षित उत्परिवर्तन के साथ, जो माउस टी-, बी-, और प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओंकेविकास में गंभीर हानि को प्रेरित करता है । इस प्रकार, वे मानव ऊतक, मानव सीडी 34+ हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) और मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs)3,4,5के एनग्राफमेंट का समर्थन करते हैं। इसके अलावा, स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), ग्रैनुलोसाइट/मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) जैसे मानव हेमेटोपोइटिक कारकों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति, और आईएल-3 मानव माइलॉयड आबादी6,7,8के एनग्राफमेंट को बढ़ावा देता है ।

एचआईवी अध्ययन के लिए, कई huNS-श्रृंखलानल माउस मॉडल का वर्णन किया गया है, जो माउस तनाव में अलग, मानव कोशिकाओं के प्रकार का इस्तेमाल किया, engraftment के लिए ऊतकों के प्रकार, और कोशिकाओं की उत्पत्ति (यानी, स्वस्थ बनाम। एचआईवी संक्रमित दाता)9,10. मूल तनाव, हालांकि, मानव कोशिकाओं के उच्च स्तर के कारण व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और संक्रमण के बाद वायरल प्रतिकृति का उपयोग किया जाता है, जिसमें संदर्भ एचआईवी तनाव11,12,13होता है। मानव हेमेटोपोइटिक कारकों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ इसी तरह के इम्यूनोडिफिएंट माउस उपभेदों (उदाहरण के लिए, NOG-EXL या NSG-SGM3) या मानव जिगर और थाइमस ऊतकों (बोन मैरो-यकृत-थाइमस [BLT] चूहों) के प्रत्यारोपण के साथ एचआईवी रोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में माइलॉयड आबादी की भूमिका का मूल्यांकन करने, इन ऊतकों पर एचआईवी के प्रभाव, और वायरल जलाशयों के रूप में उनकी भागीदारी14,15के लिए उपयोगी हैं । इसके अलावा, मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) अणुओं की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ कुछ उपभेदों, साथ ही बीएलटी चूहों का उपयोग एचआईवी संक्रमण16,17के लिए टी-सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

सामान्य तौर पर, इन चूहों में, मानवीकरण सेलुलर मूल, वितरण मार्ग (इंट्रापेरिटोनियल, इंट्राहेपेटिक, नसों, इंट्राकार्डियक) औरमाउस उम्र पर निर्भर करताहै। कोशिका मूल के बारे में, मानव CD34+ एचएससी गर्भनाल रक्त, भ्रूण जिगर, या जुटाए परिधीय रक्त से प्राप्त नवजात शिशु या युवा चूहों3,21में इंजेक्शन किया जा सकता है । इसके अलावा, वयस्क-चेननल चूहों को पीबीएमसी (यहां, जिसे हू-पीबीएल-एनएस-चेननल चूहों के रूप में जाना जाता है) के इंजेक्शन द्वारा मानवीय कृत किया जा सकता है, जिससे रक्त में इन कोशिकाओं के अस्थायी परिसंचरण, द्वितीयक लिम्फोइड अंग, और सूजनऊतक22,23,24।

यहां वर्णित एचआईवी संक्रमण के अध्ययन के लिए huNS कीस्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। पहला पुराना मॉडल है, जिसमें एक स्वस्थ दाता से गर्भनाल रक्त से प्राप्त मानव CD34+ HSCs नवजात चूहों में इंजेक्शन हैं, मानव प्रतिरक्षा प्रणाली पुनर्गठन के 14 सप्ताह के बाद एक संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण के बाद । यह मॉडल संक्रमण के बाद ~ 36 सप्ताह तक चूहों की निगरानी की अनुमति देता है। दूसरा मॉडल एक तीव्र मॉडल है, जिसमें एक स्वस्थ दाता से प्राप्त पीबीएमसीएस वयस्क एनएस-चेननल चूहों में इंजेक्ट किए जाते हैं, इसके बाद माउस में मानव टी-सेल विस्तार के 3 सप्ताह के बाद संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण होता है। अंत में, तीसरा मॉडल पुनर्सक्रियण मॉडल है, जिसमें दमनकारी एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (एआरटी) के तहत एचआईवी संक्रमित दाता से प्राप्त पीबीएमसीएस वयस्क एनएस-चेननल चूहों में इंजेक्ट किए जाते हैं। इस मामले में, एक दवा मुक्त वातावरण वायरल पुनर्सक्रियण और वायरल लोड में वृद्धि के लिए अनुमति देता है। दो बाद मॉडल engraftment के बाद ~ 9 सप्ताह तक के लिए निगरानी की अनुमति देते हैं ।

कुल मिलाकर, ये तीन मॉडल विषाणु अध्ययन, उपन्यास दवाओं के पूर्व-नैदानिक अध्ययन, और वैश्विक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर एचआईवी संक्रमण प्रभावों के मूल्यांकन के लिए उपयोगी हैं। यह भी विचार करना महत्वपूर्ण है कि एचआईवी संक्रमित मानवीकृत चूहों के उपयोग के लिए किसी भी प्रयोग से पहले संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) के साथ-साथ संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा समीक्षा और अनुमोदन की आवश्यकता होती है । यह सुनिश्चित करता है कि अध्ययन खतरनाक जैविक सामग्री के उपयोग और प्रयोगात्मक जानवरों की मानवीय हैंडलिंग के लिए सभी आंतरिक और बाहरी संस्थागत नियमों का पालन करता है ।

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Protocol

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इस काम में, सभी पशु देखभाल और प्रक्रियाओं की समीक्षा की और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा मैरीलैंड स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल संख्या १०१८०१७, १०१८०१८, और ०३१८००९) में मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. नवजात चूहों के मानव CD34+ एचएससी engraftment

  1. हमेशा डिस्पोजेबल पर्सनल प्रोटेक्शन इक्विपमेंट (पीपीई) का इस्तेमाल करें, जिसमें बाँझ स्क्रब्स, दस्ताने, डेडिकेटेड शूज, शू कवर, मास्क, चश्मे, हेयर/दाढ़ी बोनट और बाँझ लैब कोट शामिल हैं ।
  2. एक प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत आरपीएमआई 1640 मीडिया 10% एफबीएस के 10 एमएल में जमे हुए सीडी 34+ एचएससी (सामग्री की तालिकादेखें) के 1 x 106 को फिर से निलंबित करें और बाँझ स्थितियों को बनाए रखें।
  3. गिनती करने के लिए निलंबन के 10 μL का उपयोग करें (कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या की उपस्थिति को आश्वस्त करने के लिए) और एक हीमोसाइटोमीटर में धुंधला नीले बहिष्कार tripan द्वारा सेल व्यवहार्यता की जांच करें ।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 न्यूनतम के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अधिनेता को त्यागें और ठंड में 1x पीबीएस को आवश्यक एकाग्रता (सीडी 34+ एचएससी के 1.4 x 105 में 50 μL) में फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को इंजेक्शन तक बर्फ पर रखें।
  5. ब्रीडर पिंजरे से बिस्तर सामग्री की एक छोटी राशि के साथ एक बाँझ 100 मिमी2 पेट्री डिश में 1-4 दिन पुराने दोनों लिंगों के एनएस चेन नल पिल्ले प्लेस ( एनएस चेननल पिल्ले) । इसके अतिरिक्त, प्राप्तकर्ता पिल्ले पर किसी भी विदेशी गंध को आगे मुखौटा करने के लिए हाथों के बीच साफ बिस्तर रगड़ें।
    नोट: यह विदेशी गंध को कम करता है पिल्ले पर गर्भवती किया जा रहा है, जिससे प्रक्रिया के बाद पिंजरों में वापस अपने पिल्ले स्वीकार माताओं की संभावना में सुधार ।
  6. पेट्री डिश को एक साफ परिवहन पिंजरे में रखें और पर्यावरण से पिल्ले की रक्षा के लिए पिंजरे को एक साफ माउस माइक्रोआइपिलेटर पिंजरे में रखें। विकिरण कक्ष में पारगमन करते समय बाहरी प्रकाश के लिए जानवरों के जोखिम से बचने के लिए एक कवर पैड के साथ परिवहन पिंजरे को कवर करें।
  7. 137 सीएस स्रोत के संपर्क में आने से 100 सीजी पूरे शरीर विकिरण (डब्ल्यूबीआई) के साथ विकिरणित पिल्ले। कीटाणुनाशक समाधान के साथ विकिरणके इंटीरियर को साफ करें, चूहों को विकिरणमें रखें, और टर्नटेबल चालू करें ताकि सभी पिल्ले सजातीय रूप से विकिरणित हों। विकिरण प्रक्रिया शुरू करने के लिए विकिरण को बंद करें और पावर स्विच दबाएं। विकिरण समय पूरा होने तक प्रतीक्षा करें और चूहों को तुरंत हटा दें।
    नोट: चूंकि विकिरण चूहों में तनाव उत्पन्न नहीं करता है, इसलिए पिछले संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है।
  8. विकिरण प्रक्रिया के बाद 2-4 घंटे, एक ठंडा बाँझ पेट्री बर्फ पर बाँझ धुंध के साथ कवर पकवान के अंदर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में पिल्ले जगह है, जब तक एनेस्थेटाइज्ड (~ 5-10 min) । जब सकल आंदोलन बंद हो जाते हैं तो पर्याप्त संज्ञाहरण प्राप्त होता है।
  9. सेल निलंबन के 50 माइक्रोन और प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत सीडी 34+ एचएससी के 1.4 x 105 के साथ एक संलग्न सुई (29 जी, 0.5") के साथ सिरिंज लोड करें।
  10. हेपेटिक इंजेक्शन के माध्यम से engraftment के लिए, अंगूठे और सूचकांक उंगलियों के साथ पिल्ले को नियंत्रित करें। माउस संयम (~ 30-45 एस) को कम करने के लिए, एक अन्वेषक पिल्ला पकड़ और इंजेक्शन प्रशासन, और दूसरा अन्वेषक एचएससी निलंबन के साथ सिरिंज लोड है । इंजेक्शन साइट को 70% अल्कोहल के साथ साफ करें और सीधे यकृत में कोशिकाओं के 50 माइक्रोन वितरित करें। लिवर को पूरी तरह से भेदी से बचने के लिए इंजेक्शन लगाते समय उथले सुई कोण का उपयोग करें। एक नियंत्रण के रूप में, जिगर में 1x PBS के 50 μL के साथ चूहों सुई।
  11. वसूली की अनुमति देने के लिए 1-5 मिन के लिए बाँझ धुंध के साथ कवर एक पूर्व गर्म बाँझ पेट्री पकवान पर पिल्ले रखें। 20 डिग्री सेल्सियस पर कृंतक के लिए एक अवरक्त वार्मिंग पैड का उपयोग कर पकवान पूर्व गर्म यह सुनिश्चित करने के लिए कि पिल्ले अधिक गर्म नहीं किया जाएगा ।
  12. अपने माता-पिता को पिल्ले लौटाने से तुरंत पहले, नरभक्षी या पिल्ले की अस्वीकृति से बचने के लिए, अंगूठे और तर्जनी उंगलियों का उपयोग करके, मेंथॉल-और यूकेलिप्टस आधारित मरहम की एक छोटी राशि लागू करें।
  13. हर दिन पिंजरों की जांच करें, इस तरह के सूखी त्वचा, कोई खिला, दाने, और एलोपेसिया के रूप में पिल्ले में भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GVHD) के किसी भी संकेत की तलाश में । यदि इनमें से कोई भी संकेत मनाया जाता है तो जानवरों को इच्छामृत्यु दें।
  14. 3 सप्ताह की उम्र में चूहों को छुड़ाना, उन्हें लिंग द्वारा समूहीकृत करना। प्रति पिंजरे में 5 से अधिक जानवरन न डालें। 14 सप्ताह की उम्र में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिधीय रक्त में engraftment सत्यापित करें।
    नोट: engraftment की सफलता दर 80%-100% के बीच है।

2. किशोर चूहों के मानव PBMC engraftment

  1. तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल के लिए, 6-8 सप्ताह पुराने एनएस को इंजेक्ट करें- चेननल चूहे इंट्रापेरिटोनी मानव पीबीएसी के साथ एक स्वस्थ दाता या एचआईवी संक्रमित रोगी से प्राप्त होते हैं जो क्रमशः एआरटी के अधीन थे। दोनों मॉडलों में, नियंत्रण के रूप में एचआईवी संक्रमण (नकली) के बिना एक स्वस्थ दाता से PBMCs के साथ इंजेक्शन चूहों शामिल हैं ।
  2. बाँझ घनत्व ढाल माध्यम के 5 mL में पूरे रक्त की परत 15 mL एक 50 मीटर शंकुई ट्यूब में।
  3. आरटी में 30 मिन के लिए ४०० x g पर अपकेंद्रित्र, ब्रेक के बिना, घनत्व ढाल माध्यम के साथ मिश्रित बनने से बफी कोट से बचने के लिए ।
  4. ध्यान से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अंश को इकट्ठा करें (घनत्व ढाल मध्यम और अलौकिक के बीच) और बफी कोट को 1x पीबीएस के 10 एमएल वाली 15 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। आरटी में 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  5. अधिनायक को त्यागें और शेष लाल रक्त कोशिकाओं को एकेसी बफर के 5 मिलील के साथ ले जाकर हटा दें। आरटी में 4 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  6. आरटी में 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। 1x पीबीएस या आरपीएमआई 1640 मीडियम के 10 मीटर में सुपरनेट ेंट और रिसस्पेंड करें।
  7. कोशिकाओं की गिनती करने और हीमोसाइटोमीटर में नीले बहिष्कार धुंधला द्वारा व्यवहार्यता की जांच करने के लिए सेल निलंबन के 10 μL का उपयोग करें। आमतौर पर, 95% से अधिक व्यवहार्यता के साथ रक्त के प्रत्येक 1 मिलील के लिए 1-2 x 106 कोशिकाएं प्राप्त की जाती हैं।
  8. आरटी में 10 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुपरनेटेंट को त्यागें और सेल संख्या को आवश्यक एकाग्रता में समायोजित करें (इस मामले में, 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन में 3.5 x 106 कोशिकाएं)।
  9. एक प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत 1x पीबीएस के 200 माइक्रोन में पीबीएमसी के 3.5 x 106 के साथ एक संलग्न सुई (28 जी, 0.5") के साथ सिरिंज लोड करें।
  10. माउस को पिंजरे से निकालें और पूंछ से पकड़ें ताकि यह जाल को पकड़ सके, कोमल कर्षण को पीछे लगा सके। फिर, जानवर के कंधों पर इंडेक्स और अंगूठे की उंगलियों को रखें, गर्दन की ढीली त्वचा को हथियाने और अपनी पीठ को स्थिर करने के लिए मध्यमा उंगली का उपयोग करें।
  11. माउस सिर को वापस स्लाइड करें ताकि इसकी पीठ सिर के ऊपर हो। इससे पेट की गुहा में आंत पिछड़े हुए हैं और इंजेक्शन के दौरान आंतरिक अंगों को पंचर करने का खतरा कम हो जाता है।
  12. इंजेक्शन साइट को 70% अल्कोहल से साफ करें।
  13. कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने से पहले पेट की दीवार और एस्पिरेट के माध्यम से चरण 2.9 में उपयोग की जाने वाली सिरिंज को भेदें, यदि कोई सामग्री एस्पिरेटेड है, तो सिरिंज को हटा दें और इसे त्याग दें। अन्यथा, इंट्रापेरिटोनियल गुहा में कोशिकाओं को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें, सिरिंज को हटा दें और इसे त्याग दें। चूहों को नियंत्रित करने के लिए 1x पीबीएस इंजेक्ट करें।
  14. जानवर को उसके पिंजरे में लौटा दें।
  15. इंजेक्शन के बाद 3 सप्ताह में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिधीय रक्त में engraftment सत्यापित करें।

3. पोस्ट-एन्ग्राफमेंट केयर

  1. कान टैगिंग द्वारा चूहों की पहचान करें।
  2. संकट के नैदानिक संकेतों के लिए प्रत्येक प्रक्रिया के बाद इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले चूहों को प्रति दिन बारीकी से 2x का निरीक्षण करें।
  3. मानव कोशिकाओं प्रत्यारोपण के बाद, GVHD के लिए चूहों की निगरानी करें। नवजात, किशोर और वयस्क चूहों में जीवीएचडी लक्षणों की निगरानी के लिए, शरीर के वजन के उपाय के अलावा त्वचा रोग (यानी, रंग, सूखापन, दाने, एलोपेसिया) की उपस्थिति के लिए जानवरों का मूल्यांकन करें। जानवरों का मूल्यांकन करें जो जल्दी इच्छामृत्यु पर विचार करने के लिए पशुचिकित्सा द्वारा इन संकेतों को दिखाते हैं।

4. एचआईवी संक्रमण प्रक्रिया और नकली संक्रमण प्रक्रिया

नोट: पुराने और तीव्र मॉडल के लिए, चूहों क्रमशः 14 सप्ताह और सप्ताह 3 के बाद engraftment में एचआईवी बीएएल संदर्भ तनाव से संक्रमित हैं । एचआईवी के साथ इंजेक्शन निचले पेट के चतुर्भुज में इंट्रापेरिटोनी प्रशासित किया जाता है।

  1. एबीएसएल2 प्रक्रियाओं के बाद BSL2 अलमारियाँ में 28 जी 0.5 "सुई का उपयोग करके, सिरिंज में वायरस/पीबीएस की लोडिंग प्रक्रिया को करें। इंजेक्शन वायरस की कुल मात्रा बाँझ RPMI १६४० के २०० μL में १५,००० औसत ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID५०)है ।
  2. माउस को पिंजरे से निकालें और इसे अपनी पूंछ से पकड़ें ताकि यह जाल को पकड़ सके, कोमल कर्षण को पीछे लगा सके। इसके बाद इंडेक्स फिंगर और अंगूठे को जानवर के कंधों पर रखें, गर्दन की ढीली त्वचा को हथियाने और पीठ को स्थिर करने के लिए मिडिल फिंगर का इस्तेमाल करें।
  3. माउस सिर को वापस स्लाइड करें ताकि इसकी पीठ उसके सिर से ऊपर हो। इससे पेट की गुहा में आंत पिछड़े हुए हैं और इंजेक्शन के दौरान आंतरिक अंगों को पंचर करने का खतरा कम हो जाता है।
  4. चूहों को पेट के निचले बाएं/दाएं चतुर्भुज में पूर्व-गीला अल्कोहल पैड से साफ करें। बाँझ आरपीएमआई 1640 के 200 माइक्रोन में निहित एचआईवी बाल वायरस के 15,000 TCID50 इंजेक्ट करें।
  5. इंजेक्शन के बाद, माउस को अपने घर पिंजरे में वापस कर दें।

5. रेट्रोऑर्बिटल पंचर द्वारा रक्त संग्रह

नोट: रेट्रोऑर्बिटल रक्तस्राव रक्त के तेजी से संग्रह के लिए अनुमति देता है, जिससे समग्र संग्रह समय को कम किया जा सकता है और मानव लिम्फोसाइट मार्कर की स्थिरता में वृद्धि होती है। चूहों के खून को इकट्ठा करने के लिए EDTA ट्यूब का उपयोग करें।

  1. पुराने मॉडल में, एचएससी इंजेक्शन के बाद 14 सप्ताह में, रेट्रोऑर्बिटल नस के माध्यम से रक्त एकत्र करते हैं। तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल में, पीबीएमसी इंजेक्शन के बाद 3 सप्ताह में इस प्रक्रिया को करें।
  2. एक जैव सुरक्षा हुड वर्ग B2 में रक्त संग्रह से पहले आइसोफ्लोरीन साँस लेना के 250 μL का उपयोग कर जानवरों को एनेस्थेटइज़ करें जो बाहरी रूप से शामिल किया जाता है।
  3. इमारत के बाहर एक स्पष्ट 1 एल जार में एक तार जाल के नीचे कपास पैड में Isoflurane बांटना । जाल का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि जानवर आइसोफ्लोरीन से भरे पैड से संपर्क नहीं करते हैं, जो त्वचा की जलन और संभावित अधिक खुराक का कारण बन सकता है क्योंकि आइसोफ्लोरीन भी त्वचा के माध्यम से अवशोषित हो जाता है। इसके अलावा, अंगों की चोटों से बचने के लिए जाल और जानवर के बीच एक नरम कागज तौलिया डाल दिया।
  4. एक बार जार आइसोफ्लोरीन (इसे जोड़ने के बाद लगभग 1 न्यूनतम) के साथ संतृप्त हो जाने के बाद, जानवर को पेश करें और श्वसन दर का निरीक्षण करें, जो तब कम हो जाएगी। संज्ञाहरण के एक गहरे विमान के नैदानिक संकेत के लिए जांच करें, जिसमें एक दक्षिणपंथी पलटा (धीरे-धीरे जार को टिपकरने पर) की कमी और सकल आंदोलनों की कमी शामिल है। जैसे ही जानवर पूरी तरह से आराम कर रहा है और टो चुटकी पलटा की कमी के रूप में रक्तस्राव प्रक्रिया शुरू करें।
    नोट: चूंकि Isoflurane वाष्पित हो जाता है, अगर संज्ञाहरण के कोई संकेत नहीं देखा जाता है और अधिक दवा बांटना ।
  5. आवर्कक्ष रक्तस्राव के लिए, माउस बाहरी जुगलबंदी नस कौडल को अंगूठे के साथ मंडीबल में दबाएं, और उसी हाथ से, धीरे-धीरे ऊपरी पलक को इंडेक्स फिंगर से ऊंचा करें।
  6. आंखके मध्यस्थ कैंटस में एक हेमेटोक्रिट ट्यूब डालें और इसे वेंट्रोलेटरल दिशा में तब तक निर्देशित करें जब तक कि रक्त प्रवाह शुरू न हो जाए।
  7. कम से कम 100 माइक्रोन रक्त एकत्र करें। एक बार रक्त की वांछित मात्रा प्राप्त होने के बाद (जानवर के शरीर के वजन के 1% से अधिक मात्रा नहीं), बाहरी जुगुलर दबाव को बंद कर दें और हेमेटोक्रिट ट्यूब को हटा दें।
  8. भरोसा दिलाएं कि हेमोस्टेसिस कम से कम 30 एस के लिए बाँझ धुंध का उपयोग करके आंख पर सीधा दबाव लागू करके पूरा हो गया है।
  9. आंखों में टेट्रासीन की बूंदें लगाएं। जानवर की निगरानी करें जब तक कि यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद न हो जाए और उसे वापस पिंजरे में रखें।
    नोट: एकत्र रक्त के 100 μL मानव CD45+ और अन्य रक्त कोशिका आबादी के engraftment के स्तर के मूल्यांकन के साथ-साथ प्लाज्मा वायरल लोड के मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है।

6. एनग्राफमेंट स्तर और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण की स्क्रीनिंग

  1. पूरे रक्त के लिए एक पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला प्रोटोकॉल का पालन करें, जिसमें फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले मानव एंटीबॉडी (सुझाए गए प्रवाह पैनल के लिए, सामग्री की तालिकादेखें), लाल रक्त कोशिकाओं और धोने केचरण13,15के लिसिस का ऊष्मायन शामिल है।
    नोट: engraftment के स्तर की स्क्रीनिंग के लिए, एक मानव विरोधी CD45 एंटीबॉडी शामिल हैं । तुलना के लिए, एक एंटी-माउस सीडी45 एंटीबॉडी का भी उपयोग किया जा सकता है। मुआवजा नियंत्रण के साथ-साथ एक ही एंटीबॉडी मिश्रण, बिना रंजित माउस और मानव रक्त के नमूनों के साथ सना हुआ मानव रक्त नमूना, और अभिकर्मकों की क्रॉस-रिएक्टिविटी का परीक्षण करने के लिए गैर-मानवीय नियंत्रण शामिल करें। धुंधला करने के बाद, हमेशा कुछ पृष्ठभूमि संकेत होता है; हालांकि, सभी सकारात्मक संकेतस्पष्ट रूप से नकारात्मक और क्रॉस-रिएक्टिव नियंत्रण से प्रतिष्ठित हैं।
  2. एक उपयुक्त प्रवाह साइटोमीटर में, लिम्फोसाइट गेट (एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए) पर कम से कम 10,000 घटनाओं का अधिग्रहण करें। डुप्लिकेट अपवर्जन के बाद फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, मानव सीडी 45+ कोशिकाओं के साथ-साथ ब्याज की अन्य सेल आबादी का प्रतिशत निर्धारित करें।

7. प्लाज्मा वायरल लोड का मूल्यांकन

  1. संक्रमण के बाद प्रति सप्ताह एचआईवी संक्रमित जानवरों 1x में वायरल लोड का मूल्यांकन करें।
  2. पुनर्कक्षीय रक्तस्राव (लगभग 100 माइक्रोनल) के बाद, एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज में 3 मिन के लिए 3,500 x ग्राम पर एंटीकोगुलेटेड रक्त के केंद्रीकरण के बाद सुपरनेटेंट एकत्र करके प्लाज्मा प्राप्त करें। पैलेट का इस्तेमाल ब्लड सेल फेनोटाइपिंग के लिए किया जाता है।
  3. प्लाज्मा के 40 माइक्रोन से आरएनए प्राप्त करने के लिए एक वाणिज्यिक वायरल आरएनए निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
  4. पहले स्ट्रेन संश्लेषण मिश्रण (सामग्री की तालिकादेखें) और एचआईवी गैग प्राइमर SK431 का उपयोग करके आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित करें।
  5. एचआईवी गैग प्राइमर SK38/SK39 और फ्लोरोसेंट ग्रीन रंगों (जैसे, SYBR ग्रीन) का उपयोग करके मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का प्रदर्शन करें जैसा कि पिछले अध्ययनों में वर्णित13,25है ।

8. एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी का प्रशासन

  1. मौखिक एआरटी को संक्रमण के कम से कम 3 सप्ताह बाद प्रशासित करें, जब पुरानी, तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल में उच्च वायरल लोड देखा जाता है।
  2. मनुष्यों और चूहों के लिए क्रमशः37और 3 के किमी मूल्यों के अनुसार, टेनोफोविर डाइसोप्रोक्सिल फ्यूमैरेट (टीडीएफ), एम्ट्रिसिटाबिन (एफटीसी), और राल्टेग्राविर (आरएएलए) की खुराक की गणना करें। आमतौर पर, टीडीएफ, एफटीसी और आरएएल की मानव-समतुल्य खुराक क्रमशः 617 मिलीग्राम/किलो/दिन, 40.7 मिलीग्राम/किलो/दिन और 164 मिलीग्राम/किलो/दिन होती है।
  3. पीने के पानी में प्रशासन के लिए, दवा की गोलियों को क्रश और पानी की बोतल में संबंधित राशि जोड़ें, यह सुनिश्चित करना है कि पिंजरे में प्रत्येक माउस अपनी दैनिक खुराक प्राप्त करता है । चूंकि दवा पाउडर बोतल में तलछट बना सकता है, इसलिए सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए समय-समय पर पानी की बोतल हिलाएं।
  4. ताजा घुली दवाओं के साथ हर हफ्ते पानी की बोतल बदलें।
  5. वायरल लोड और CD4: CD8 अनुपात में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए कला दीक्षा के बाद हर हफ्ते या हर 2 सप्ताह में रेट्रोऑर्बिटल नस के माध्यम से रक्त एकत्र करें।

9. माउस इच्छामृत्यु, माध्यमिक लिम्फोइड अंगों का संग्रह, और मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का अलगाव

  1. इच्छामृत्यु तीन मानवीकृत माउस मॉडल में किया जाता है, समय-समय पर संक्रमण के समय के साथ, या प्रयोग के अंत में।
  2. सीओ2 एस्फिक्सेशन द्वारा वयस्क चूहों की इच्छामृत्यु करें, इसके बाद सर्वाइकल अव्यवस्था। asphyxiation के लिए, एक गैर-प्री-चार्ज्ड चैंबर का उपयोग करें, फिक्स्ड प्रेशर रेगुलेटर के साथ एक वाणिज्यिक सिलेंडर से सीओ2 को वितरित करें और लाइन प्रतिबंधक में 2013 AVMA दिशानिर्देशों का अनुपालन करने के लिए चैंबर वॉल्यूम/मिनट के 20%-30% के भीतर गैस प्रवाह को नियंत्रित करें।
  3. श्वसन गिरफ्तारी की निगरानी के लिए सीओ2 प्रवाह बनाए रखें (जो 5 मिन तक ले सकता है), इसके बाद इच्छामृत्यु को आश्वस्त करने के लिए सर्वाइकल अव्यवस्था।
  4. एक भौतिक विधि (यानी, तेज कैंची का उपयोग करके) द्वारा नवजात ों और एलटी; 7 दिन पुराने को इच्छामृत्यु दें।
  5. एक्सिलरी, मध्यस्थ, और मेसेंट्रिक लिम्फ नोड्स (जो आमतौर पर मनाए जाते हैं) की कल्पना करें और उन्हें चिमटी और तेज कैंची के साथ निकालें। इसके अलावा तिल्ली निकालें, पेरिटोनियल गुहा के ऊपरी बाईं ओर में स्थित है।
  6. बाँझ आरपीएमआई 1640 मध्यम युक्त 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में लिम्फॉइड ऊतकजमा करें।
  7. 50 मीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करते हुए, 70 मिमी पोर आकार नायलॉन सेल छलनी में लिम्फोनॉइड ऊतकों को तुरंत संसाधित करें। ऊतकों को एस्पिरेट न करें।
  8. कोशिकाओं को फ़िल्टर करने की सुविधा के लिए 1% एफबीएस के साथ पूरक आरपीएमआई 1640 मध्यम के 5 मिलील के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  9. ऊतक विसग्रीकरण के बाद, एक माइक्रोसेंट्रिकफ्यूज में 10 मिन के लिए 3,500 x ग्राम पर कोशिकाओं के निलंबन को केंद्रित करें।
  10. अधिनेता को त्यागें और 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  11. कोशिकाओं के निलंबन को 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बाँझ घनत्व ढाल माध्यम का 500 माइक्रोन हो।
  12. एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज में 3 मिन के लिए 3,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, ब्रेक के बिना, बफी कोट को घनत्व ढाल माध्यम के साथ मिश्रण से रोकने के लिए
  13. ध्यान से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अंश को इकट्ठा करें (घनत्व ढाल मध्यम और अलौकिक के बीच) और बफी कोट को 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन युक्त 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। 3 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  14. शेष लाल रक्त कोशिकाओं को एकेसी बफर के 500 माइक्रोन के साथ लायस करके हटा दें, जो आरटी में 4 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग करते हैं।
  15. 3 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। 1x पीबीएस या मीडियम के 1 एमएल में सुपरनेटेंट को त्यागें और फिर से सस्पेंड करें।

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Representative Results

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जैसा कि ऊपर वर्णित है, एचएससी इंजेक्शन (पुरानी मॉडल) के बाद या 3 सप्ताह के बाद पीबीएमसी इंजेक्शन (तीव्र और पुनः सक्रियण मॉडल) पर, चूहों को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मानव कोशिकाओं के भ्रष्टाचार के स्तर की स्क्रीनिंग के लिए ब्लेड किया जाता है। 1) मानव CD45+ कोशिकाओं के पुनर्गठन और 2) CD4+ और CD8+ टी कोशिकाओं के प्रतिशत के मूल्यांकन के लिए एक प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति चित्रा 1में दिखाया गया है । आमतौर पर, संफ़्टिंग का स्तर (मानव सीडी 45+ कोशिकाओं का प्रतिशत) CD34+ एचएससी इंजेक्शन के बाद 10%-80% से होता है और इंजेक्शन और माउस तनाव के मार्ग पर निर्भर करता है, अन्य पहले वर्णित कारकों के बीच(चित्रा 1बी)। पीबीएमसी इंजेक्शन के बाद, engraftment का स्तर (मानव सीडी 45+ या सीडी 3+ कोशिकाओं का प्रतिशत) 5%-65% से लेकर होता है, माउस उपभेदों(चित्रा 1बी)के बीच मतभेदों के साथ भी। इसके अलावा, एक स्वस्थ बनाम एचआईवी संक्रमित दाता से प्राप्त पीबीएमसी के साथ इंजेक्शन चूहों के बीच कुछ मतभेद, मनाया जा सकता है(चित्रा 1डी)। आमतौर पर, एचआईवी संक्रमण के लिए, सक्रिय वायरल प्रतिकृति के लिए 5%-10% से ऊपर के एनग्राफमेंट का स्तर पर्याप्त होता है।

महत्वपूर्ण बात यह है कि हू-पीबीएल-एनएस की एक विशेषता-चेननल माउस मॉडल सेल एनग्राफमेंट के कुछ हफ्तों के भीतर ज़ेनोजेनिक जीवीएचडी का विकास है, क्योंकि मानव टी-सेल मान्यता के कारण मूत्र प्रमुख हिस्टोअनुकूली परिसर (एमएचसी) अणु23। यह प्रक्रिया स्पष्ट है, यहां तक कि 3 सप्ताह के बाद पीबीएमसी इंजेक्शन, बाल और वजन घटाने(चित्रा 2ए, बी)जैसे संकेतों के साथ-साथ एचएलए-डीआर और सीडी 38(चित्रा 2सी, डी)जैसे टी-कोशिकाओं में सक्रियण मार्कर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति से भी स्पष्ट है। दूसरी ओर, मानव सीडी 34+ एचएससी के साथ इंजेक्शन चूहों में जीवएचडी अधिक धीरे-धीरे विकसित किया जाता है और सीधे एनग्राफमेंट के प्रारंभिक स्तर से सहसंबद्ध है।

एचआईवी संक्रमण के बाद, प्लाज्मा वायरल लोड में तेजी से वृद्धि होती है, आमतौर पर 2-3 सप्ताह के बाद संक्रमण का पता लगाया जा रहा है, दोनों पुरानी और तीव्र मॉडल(चित्रा 3ए, बी),पुनर्सक्रियण मॉडल(चित्रा 3सी)में इसी तरह के काइनेटिक्स के साथ। वायरल लोड में वृद्धि सीडी 4: सीडी 8 अनुपात(चित्रा 3डी, ई, एफ)में कमी के साथ मेल खाती है। इन परिवर्तनों को नियंत्रण चूहों (एचआईवी संक्रमण के बिना, चित्रा 3)में नहीं देखा जाता है। ध्यान दें, हू-पीबीएल-एनएस-चेननल माउस मॉडल में, सीडी 4 का प्रारंभिक उलटा: सीडी8 अनुपात देखा जा सकता है, निगरानी समय के साथ पुनर्गठित किया जा रहा है(चित्रा 3ई, एफ)। अंत में, यदि एआरटी एचआईवी संक्रमित चूहों को प्रशासित किया जाता है, तो वायरल लोड के दमन के साथ-साथ सीडी 4 में वसूली: सीडी8 अनुपात की उम्मीद है, जो असंक्रमित नियंत्रणों में उन लोगों के समान स्तर तक पहुंच ता है(चित्रा 3ए, सी, डी, एफ)। आमतौर पर, उपचार के 2-3 सप्ताह के बाद, वायरल लोड में कमी और सीडी 4 में वृद्धि: सीडी 8 अनुपात पुरानी, तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल में मनाया जाता है। यदि यह नहीं देखा जाता है, दवा की खुराक और प्रशासन के मार्ग एक मूल्यांकन की जरूरत है ।

Figure 1
चित्रा 1: मानव CD45+ और टी-कोशिकाओं के एनग्राफमेंट स्तर ों के मूल्यांकन के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति। (A)गेटिंग रणनीति मानव CD45+ (huCD45), CD3+, CD4+,और CD8+ टी-कोशिकाओं के प्रतिशत की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, जो 14 सप्ताह में कॉर्ड ब्लड सीडी34+ एचएससी के साथ इंजेक्शन के बाद huNS में श्रृंखलाशून्य चूहों । संख्या प्रत्येक जनसंख्या के प्रतिशत को इंगित करता है । (ख)एनग्राफमेंट का प्रतिनिधि स्तर (huCD45+ कोशिकाओं का प्रतिशत) huNS में,-चेननल (एन = 6) और आईएल-3 और जीएम-सीएसएफ (huNOG-EXL, n = 6) की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ एक समान इम्यूनोडिफिएंट तनाव, जैसा कि पहले15की सूचना दी गई थी । (ग)एनग्राफमेंट का प्रतिनिधि स्तर (huCD3+ कोशिकाओं का प्रतिशत) हू-पीबीएल-एनएस-चेननल और हू-पीबीएल-एसजीएम3 चूहों (एनएस- चेननल चूहों एससीएफ, जीएम-सीएसएफ और आईएल-3 की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ), सप्ताह 3 में एक स्वस्थ दाता (तीव्र मॉडल, एन = 7 और एन = 8, क्रमशः) से PBMCs के साथ इंजेक्शन के बाद। (घ)एचएआरटी-पीबीएल-एनएसजी-एसजी3 चूहों में एनग्राफमेंट का प्रतिनिधि स्तर (huCD3+ कोशिकाओं का प्रतिशत) एक स्वस्थ या एचआईवी संक्रमित रोगी से पीबीएमसी के साथ इंजेक्शन के बाद जो एआरटी (पुनः सक्रियण मॉडल, एन = 10 और एन = 12, क्रमशः) के तहत था। बी-डी में, रेखा औसत इंगित करती है, और मान-व्हिटनी परीक्षण का पी-मूल्य दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हू-पीबीएल-एनएस-चेननल माउस मॉडल में जीवीएचडी का विकास। (A)एक स्वस्थ दाता से पीबीएमसी के साथ इंजेक्शन के बाद 7 सप्ताह में दो प्रतिनिधि हू-पीबीएल-एनएसजी-एसजीएम3 चूहों में बाल झड़ना । (ख)निगरानी समय भर में माउस शरीर के वजन घटाने के लिए एक स्वस्थ दाता (एन = 10) और एचआईवी संक्रमित रोगी (एन = 12) से PBMC के साथ इंजेक्शन hu-PBL-NSG-SGM3 चूहों में वजन शुरू करने के प्रतिशत को सामान्यीकृत । (C)एक स्वस्थ दाता से पीबीएमसी के साथ इंजेक्शन से एचएलए-डीआर और सीडी38 में डीएचए-डीआर+ और सीडी8+ टी-कोशिकाओं में एचएलए-डीआर और सीडी38 के प्रतिनिधि अभिव्यक्ति (सप्ताह 7 के बाद-एनग्राफमेंट) । संख्या प्रत्येक जनसंख्या के प्रतिशत को इंगित करता है । (घ)सीडी4+ और सीडी8+ टी-कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रतिशत जो एचएलए-डीआर + सीडी38 + एचएएलए-डीआर + सीडी38 + हैं, एक स्वस्थ दाता से पीबीएमसी के साथ इंजेक्शन लगाए गए एचएएलए-डीआर+ सीडी38+ हैं । चूहों में इंजेक्शन से पहले कोशिकाओं में, एचएलए-डीआर+ सीडी38+ सीडी4+ और सीडी8+ टी-कोशिकाओं का स्तर क्रमशः 2.0% और 5.7% था। बी और डी में मीडियन और इंटरक्वार्टटाइल रेंज दिखाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: वायरल लोड और CD4 के प्रतिनिधि परिवर्तन: एचएवाई संक्रमण के बाद और एआरटी परिचय के बाद एचएनस में सीडी8 अनुपात- चेननल चूहों। (ए, डी) CD4: सीडी8 अनुपात और प्लाज्मा एचआईवी बीएएल (लाल डॉट्स और लाइन, एन = 3) के साथ संक्रमण के बाद huNS में श्रृंखलानल चूहों में लोड, जो गर्भनाल रक्त CD34+ एचएससीडी के साथ इंजेक्शन के 14 सप्ताह के बाद किया गया । असंक्रमित नियंत्रण (पीबीएस-इंजेक्शन) भी शामिल थे (हरी डॉट्स और लाइन, एन = 5) । (B, ई) प्लाज्मा वायरल लोड और CD4: एचआईवी बीएएल (लाल डॉट्स और लाइन, एन = 4) के साथ संक्रमण के बाद एचएयू-पीबीएल-एनएसजी-SGM3 चूहों में सीडी8 अनुपात, जो एक स्वस्थ दाता (तीव्र मॉडल) से पीबीएमसी के साथ इंजेक्शन के बाद 3 सप्ताह में किया गया था । असंक्रमित नियंत्रण (पीबीएस-इंजेक्शन) को भी शामिल किया गया था (हरी डॉट्स और लाइन, एन = 3)। (C और F) प्लाज्मा वायरल लोड और CD4: एचयू-पीबीएल-एनएसजी-SGM3 चूहों में सीडी8 अनुपात एक एचआईवी संक्रमित दाता (लाल डॉट्स और लाइन, एन = 9) या स्वस्थ दाता (हरी डॉट्स और लाइन, एन = 10) (पुनर्सक्रियन मॉडल) से PBMCs के साथ इंजेक्शन । सभी मामलों में, औसत और इंटरक्वैरी रेंज दिखाई जाती है। ए-सी में, धराशायी रेखा परख (१५० प्रतियां/mL) का पता लगाने की सीमा को इंगित करती है । अज्ञेय वायरल लोड वाले नमूनों के लिए, पता लगाने की सीमा के आधे हिस्से के बराबर मूल्य सौंपा गया था । डी-एफ में, धराशायी रेखा सीडी4: सीडी8 अनुपात को 1 का इंगित करती है। ए, सी, डी और एफ में, ग्रे बॉक्स एआरटी के प्रशासन के साथ समय इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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मानवीकरण के लिए इम्यूनोडिफेंट माउस उपभेदों के विकास में महत्वपूर्ण प्रगति हासिल की गई है, जिसमें कई विभिन्न विकल्प हैं जिनका उपयोग अनुसंधान हित1के अनुसार किया जा सकता है। बशर्ते यहां एचआईवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए तीन अलग-अलग मॉडलों में नियोजित होने वाले एनएस-चेननल चूहों और आनुवंशिक रूप से इसी तरह के उपभेदों के मानवीकरण के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल है। पहले प्रायोगिक दृष्टिकोण में, विकिरणित नवजात चूहों को मानव सीडी 34+ एचएससी के साथ इंजेक्ट किया जाता है, जिसे गर्भनाल रक्त, भ्रूण यकृत, या जुटाया जा सकता है परिधीय रक्त3,21से प्राप्त किया जा सकता है। एनएस-चेननल चूहों का उपयुक्त विकिरण एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह माउस बोन मैरो और अन्य जनक कोशिकाओं को समाप्त करता है, जिससे मानव कोशिका आबादी के कुशल पुनर्गठन की अनुमति होती है। हालांकि, कुछ रिपोर्टों में विभिन्न माउस उपभेदों में मानव कोशिकाओं के पुनर्गठन का सबूत है, विकिरण27के बिना । इस संबंध में, विकिरण की उचित खुराक प्रदान की जानी चाहिए, क्योंकि एनएस-चेननल चूहे रेडियोसेंसिटिव हैं, और उच्च विकिरण21,28को थाइमिक लिम्पश्रद्धांजलि को प्रेरित कर सकता है।

अन्य महत्वपूर्ण कदम और कारक जो एनग्राफमेंट के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं, उनमें इंजेक्शन (इंट्राहेपेटिक, नसों में, इंट्राकार्डियक), चूहों की उम्र, सीडी 34+ एचएससी की शुद्धता का प्रतिशत और ऑपरेटर विशेषज्ञता29का मार्ग शामिल है। हू-पीबीएल-एनएस-चेननल माउस मॉडल के आधार पर दूसरे और तीसरे दृष्टिकोण में, कुछ महत्वपूर्ण कारकों में इंजेक्शन (इंट्रापेरिटोनियल, नसों, इंट्रास्पलिक), चूहों की उम्र और इंजेक्शन वाली मानव कोशिकाओं की संख्या का मार्ग शामिल है, जो इंजेक्शन के अंतिम स्तर को प्रभावित कर सकता है। इस उत्तरार्द्ध कारक के बारे में, कई अध्ययनों ने22,23,30के लिए 5-10 x 106 पीबीएमसी का उपयोग किया है, जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल 3.5 x 106 पीबीएमसी के उपयोग का सुझाव देता है। ध्यान दें, कोशिकाओं की यह संख्या टी-कोशिकाओं के पुनर्गठन के लिए और एचआईवी प्रतिकृति दोनों तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल में पर्याप्त है, और जीवएचडी23के विकास में भी देरी करती है। फिर भी, जांचकर्ताओं को अनुसंधान उद्देश्यों के अनुसार मानवीयकरण की स्थिति का अनुकूलन करना चाहिए । इसके अलावा, एचएनएस-चेननल चूहों के संक्रमण के लिए उपयोग किए जाने वाले एचआईवी तनाव को मान्य करना महत्वपूर्ण है। यहां, R5 ट्रॉपिक एचआईवी-1 बीएएल तनाव का उपयोग किया जाता है, जो huNS-श्रृंखलानल चूहों में वायरल प्रतिकृति के उच्च स्तर की पैदावार करता है। अन्य रिपोर्टर उपभेदों, जैसे लूसिफ़ेरेज या फ्लोरोसेंट प्रोटीन वाले, एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं31के एकल सेल विश्लेषण के लिए भी उपयुक्त हैं ।

कुल मिलाकर, सीडी 34+ एचएससी के साथ एनग्राफमेंट के बाद HUNS-चेननल माउस मॉडल में तीन प्रमुख सीमाएं सबूत हैं। सबसे पहले, एक मानव थाइमिक पर्यावरण की अनुपस्थिति के कारण, टी-कोशिकाओं को मूत्र एमएचसी अणुओं के संदर्भ में शिक्षित किया जाता है, जो उनके टी-सेल रिसेप्टर्स के माध्यम से बाद में एंटीजन-विशिष्ट उत्तेजना को रोकते हैं। यह मुद्दा एचआईवी-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एनएस-चेननल माउस मॉडल के उपयोग को सीमित करता है। फिर भी, इस सीमा को एचएलए अणुओं16,17की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ बीएलटी चूहों या एनएस-चेननल चूहों के उपयोग से दूर किया जा सकता है। दूसरा, आम तौर पर एनएस-चेननल माउस मॉडल में माइलॉयड आबादी का खराब पुनर्गठन होता है, जो इन सबसेटों के अध्ययन को सीमित करता है जिनकी एंटीजन-प्रस्तुति और एचआईवी संक्रमण14,15के रोगजनन के संदर्भ में प्रासंगिकता होती है। इस मामले में, हेमेटोपोइटिक कारकों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति वाले माउस उपभेदों के उपयोग की सिफारिश8,15,32की है।

तीसरा, माध्यमिक लिम्फोइड ऊतकों में लिम्फोड कूप संरचनाओं का 1) खराब विकास होता है और 2) तृतीयक लिम्फोइड ऊतकों की कमी है, जो जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के निम्न स्तर (यानी, ह्यूएनएस-चेननल चूहों में डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं) से संबंधित है जो कूलिक33के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह मुद्दा huNS में एक गरीब विनोदी प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है-श्रृंखलानल माउस मॉडल३४। फिर भी, कुछ रिपोर्टों ने ह्यूएनएस में कूप जैसी संरचनाओं के विकास का सबूत दिया है, -चेननल चूहों4,जबकि तिल्ली- और लिम्फ नोड-सीमित कूपल्युलर टी-कोशिकाएं (कूप-होमिंग केमोकिन रिसेप्टर सीएक्ससीआर5 को व्यक्त करना) का पता huNS-चेननल चूहों और संबंधित उपभेदों15)में किया जाता है। फिर, 1) BLT चूहों या 2 का उपयोग) हेमेटोपोइटिक कारकों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ माउस उपभेदों और/या एचएलए अणुओं की अभिव्यक्ति के साथ माइलॉयड आबादी के पुनर्गठन में सुधार कर सकते हैं, संगठित माध्यमिक और तृतीयक लिम्फोइड संरचनाओं के विकास, और प्रभावी टी सेल और बी सेल प्रतिक्रियाओं8,३५,३६

CD34+ एचएससी-ह्यूमन्ड एनएस-चेननल माउस मॉडल की सीमाओं के समान, एंटीजन-विशिष्ट टी-सेल और विनोदी प्रतिक्रियाओं, माइलॉयड आबादी की अनुपस्थिति, और हू-पीबीएल-एनएस-चेननल चूहों में संगठित लिम्फोइड संरचनाओं की कमी है। इसके अलावा, हू-पीबीएल-एनएस की एक महत्वपूर्ण सीमा -श्रृंखलानल माउस मॉडल (एचआईवी संक्रमण के तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल) निगरानी के लिए छोटी खिड़की है, क्योंकि ये चूहे ज़ेनोजेनिक जीवएचडी23विकसित करते हैं। जीवीएचडी का विकास प्रतिरक्षा आबादी के अवांछित फेनोटाइपिक और कार्यात्मक परिवर्तनों को भी प्रेरित कर सकता है, जो रोगजनक प्रक्रिया23,37में निहित है। बहरहाल, इस मॉडल को सरल और अधिक सुलभ होने का लाभ है, विशेष रूप से यह देखते हुए कि मानव PBMCs अधिक आसानी से स्वस्थ या एचआईवी संक्रमित दाताओं३८से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, रोगियों से सीधे प्राथमिक कोशिकाओं का इंजेक्शन दाता की कोशिका-या रोगजनक-आंतरिक स्थितियों के अध्ययन के लिए उपयोगी है, जैसे वायरल दवा प्रतिरोध उत्परिवर्तन या दाता-विशिष्ट प्रतिरक्षा परिवर्तन। नोट के, पुनर्सक्रियण मॉडल के लिए, एचआईवी पुनर्सक्रियण एजेंटों के साथ इन विट्रो परख चूहों३९में इंजेक्शन से पहले PBMCs की प्रतिक्रिया की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है । कुछ संस्थानों के लिए एक और सीमा यह है कि इस काम के नियमों के कारण एचआईवी संक्रमित जानवरों को संभालने के लिए BSL2 + सुविधाओं की आवश्यकता है ।

एचएनएस-चेननल माउस मॉडल में एचआईवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए अन्य पशु मॉडलों की तुलना में कुछ फायदे हैं, जैसे सिमियन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस से संक्रमित अमानवीय वानरों। उदाहरण के लिए, huNS -चेननल चूहों जीन नॉकआउट या ट्रांसजेनिक उपभेदों के निर्माण की अनुमति देते हैं, जो विशिष्ट जीन लक्ष्यों के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, huNS में प्राथमिक मानव कोशिकाओं का उपयोग-श्रृंखलानल चूहों संभावित प्रजातियों-विशिष्ट प्रतिबंधों से बचा जाता है, जैसे कि अमानवीय वानरों में इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन का मामला, जो एंटीवायरल प्रतिक्रिया और संक्रमण के पाठ्यक्रम को प्रभावित कर सकता है40। इस प्रकार, संक्रमण के गतिज huNS के बीच अत्यधिक सुसंगत हैं- चेननल चूहों। अंत में, huNS -चेननल माउस मॉडल कम महंगे हैं, जटिल कोर सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है, और अधिक सुलभ हैं।

संक्षेप में, CD34+ एचएससी-ह्यूमनाइज्ड और हू-पीबीएल-एनएस-चेननल माउस मॉडल एचआईवी संक्रमण में पुरानी, तीव्र और पुनर्सक्रियन घटनाओं के अध्ययन के लिए विभिन्न प्रकार की संभावनाएं प्रदान करते हैं। इन मॉडलों की उपरोक्त सीमाओं की मान्यता और पार करने के साथ, एनएस-चेननल चूहों का उपयोग विरोलॉजिकल, इम्यूनोलॉजिकल और ड्रग प्री-क्लीनिकल अध्ययनों के साथ-साथ जीनोम संपादन और सेल-आधारित इम्यूनोथेरपी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आईएचवी क्लीनिकल डिवीजन इंटरनल फंड्स ने जेसीजेड को सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

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References

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Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).More

Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

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