Summary
Описаны три экспериментальных подхода к изучению динамики ВИЧ-инфекции у гуманизированных мышей. Первый позволяет изучать события хронической инфекции, в то время как два последних позволяет для изучения острых событий после первичной инфекции или вирусной реактивации.
Abstract
Гуманизированный рецептор NOD/SCID/IL-2, который являетсянулевой мыши, резюмирует некоторые особенности иммунитета человека, которые могут быть использованы в фундаментальных и доклинических исследованиях инфекционных заболеваний. Здесь описаны три модели гуманизированных иммунодефицитных мышей для изучения динамики ВИЧ-инфекции. Первая основана на внутрипечетической инъекции CD34и гематопоиетических стволовых клеток у новорожденных мышей, что позволяет восстановить несколько кровяных и лимфоидных тканей, ограниченных клетками, а затем инфекцию с эталонным штаммом ВИЧ. Эта модель позволяет контролировать до 36 недель после инфекции и, следовательно, называется хронической модели. Вторая и третья модели называются острыми и реактивационными моделями, в которых периферийные моноядерные клетки крови интраперитонеально вводятся взрослым мышам. В острой модели клетки здорового донора прививаются через интраперитонеальный путь, за которым следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ. Наконец, в модели реактивации клетки ВИЧ-инфицированного донора в рамках антиретровирусной терапии прививаются по внутриперегитонне. В этом случае безнаркотическая среда в мыши позволяет реактивацию вируса и увеличение вирусной нагрузки. В представленных здесь протоколах описывается обычный экспериментальный подход к гуманизированным, иммунодефицитным моделям мыши ВИЧ-инфекции.
Introduction
Гуманизированный NOD/SCID/interleukin (IL)-2 рецептора Q-цепиnull (в дальнейшем именуемый huNS q-цепнойnull) мышь модель была широко использована для изучения патогенеза инфекций, аутоиммунных и раковых заболеваний, а также для доклинических исследований лекарств и человеческих клеточных терапии1,2. Эти мыши основаны на не-ожирения диабетической (NOD) фон, с научной мутации и целенаправленной мутации на рецепторЕ IL-2-цепь локус (общий q-цепи для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, и IL-21), которые вызывают серьезные нарушения в развитии мыши T-, B-, и природных киллеров (NK)1. Таким образом, они поддерживают прививок человеческих тканей, человеческих CD34и гематопоитических стволовых клеток (HSCs), и человеческих периферических клеток крови (PBMCs)3,4,5. Кроме того, трансгенное выражение гематопоитических факторов человека, таких как фактор стволовых клеток (СКФ), гранулоцит/макрофаг колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF), и IL-3 способствует инпланировке популяций миелоидов человека6,7,8.
Для исследований в области ВИЧ, несколько huNS-цепинулевой мыши модели были описаны, которые отличаются в штамм мыши, тип человеческих клеток, используемых, тип тканей для прививки, и происхождение клеток (т.е., здоровые против. ВИЧ-инфицированный донор)9,10. Оригинальный штамм, однако, широко используется из-за высокого уровня человеческих клеток прививок и вирусной репликации после инфекции с эталонным штаммом ВИЧ11,12,13. Аналогичные иммунодефицитные штаммы мыши с трансгенным выражением гематопоитических факторов человека (например, NOG-EXL или NSG-SGM3) или с имплантатами тканей печени человека и тимуса (костного мозга-печени-тимуса (BLT) мышей) полезны для оценки роли популяций миелоидов в анти-ВИЧ иммунный ответ, воздействие ВИЧ на эти ткани, и их участие в качестве вирусных резервуаров14,15. Кроме того, некоторые штаммы с трансгенным выражением молекул антигена лейкоцитов человека (HLA), а также BLT мышей, могут быть использованы для изучения Т-клеток ответ на ВИЧ-инфекцию16,17.
В целом, у этих мышей гуманизация зависит от клеточного происхождения, маршрута родов (интраперитонеальный, внутрипеченевой, внутривенной, внутривенной, внутрисердечной) и мышиного возраста на момент прививки18,19,20. Что касается происхождения клеток, человека CD34и HSC, полученных из пуповинной крови, печени плода, или мобилизованной периферической крови могут быть введены в новорожденных или молодых мышей3,21. Кроме того, взрослыенулевые мыши могут быть гуманизированы путем инъекции PBMC (здесь, именуемые hu-PBL-NS q-цепнойнулевой мышей), что позволяет височной циркуляции этих клеток в крови, вторичных лимфоидных органов, и воспаленные ткани22,23,24.
Описан освоенным здесь подробный протокол для создания huNS-цепинулевая мышь модели для изучения ВИЧ-инфекции. Во-первых, это хроническая модель, в которой человека CD34и HSCs, полученных из пуповинной крови от здорового донора вводятся у новорожденных мышей, а затем инфекции с эталонным штаммом ВИЧ после 14 недель восстановления иммунной системы человека. Эта модель позволяет контролировать мышей в течение 36 недель после заражения. Вторая модель представляет собой острую модель, в которой ПБМК, полученных от здорового донора, вводятся у взрослыхнюловых мышей NS и цепи, за которой следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ после 3 недель расширения Т-клеток человека в мыши. Наконец, третьей моделью является модель реактивации, в которой ПБМК, полученные от ВИЧ-инфицированного донора в рамках подавлятельной антиретровирусной терапии (АРТ), вводятся взрослым н.п. цепинулевых мышей. В этом случае безнаркотическая среда позволяет реактивацию вирусной терапии и увеличению вирусной нагрузки. Две последние модели позволяют осуществлять мониторинг в течение 9 недель после прививки.
В целом, эти три модели полезны для вирусологических исследований, доклинических исследований новых препаратов и оценки воздействия ВИЧ-инфекции на глобальный иммунный ответ. Важно также учитывать, что использование ВИЧ-инфицированных гуманизированных мышей требует рассмотрения и одобрения Со стороны Институционального комитета по биобезопасности (IBC), а также Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) перед любым экспериментом. Это гарантирует, что исследование следует всем внутренним и внешним институциональным нормам использования опасного биологического материала и гуманной обработки экспериментальных животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В этой работе все процедуры по уходу за животными и процедуры выполнялись в соответствии с протоколами, рассмотренными и утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Университета Мэриленда (протокольные номера 1018017, 1018018 и 0318009).
1. Человек CD34- HSC прививка новорожденных мышей
- Всегда используйте одноразовые средства индивидуальной защиты (PPE), в том числе стерильные скрабы, перчатки, специальную обувь, бахилы, маску, очки, капот для волос/бороды и стерильные лабораторные пальто.
- Повторно приостановить 1 х 106 замороженных CD34и HSCs (см. Таблица материалов) в 10 мл RPMI 1640 сми 10% FBS под сертифицированным шкафом биобезопасности и поддерживать стерильные условия.
- Используйте 10 зЛ подвески для подсчета (для обеспечения наличия ожидаемого количества клеток) и проверить жизнеспособность клеток путем trypan синий исключение окрашивания в гемоцитометр.
- Центрифуга при температуре 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта и приостановите в холодном 1x PBS до требуемой концентрации (1,4 х 105 cd34и HSCs в 50 Л). Держите клетки на льду до инъекций.
- Поместите щенков (NS-цепнойnull щенки обоих полов от 1-4 дней) в стерильные 100 мм2 Петри блюдо вместе с небольшим количеством постельных принадлежностей материала из клетки заводчика. Кроме того, руб чистые постельные принадлежности между руками для дальнейшей маскировки любых посторонних запахов на получателей щенков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это сводит к минимуму посторонние запахи время пропитанной на щенков, тем самым улучшая шансы матерей, принимающих их щенков обратно в клетки после процедуры. - Положите чашку Петри в чистую транспортную клетку и поместите клетку в чистую клетку микроизолатора мыши, чтобы защитить щенков от окружающей среды. Обложка транспортной клетки с крышкой площадку, чтобы избежать воздействия животных на внешний свет во время транзита в облучение комнате.
- Облученные щенки с 100 cGy облучение всего тела (WBI) при воздействии 137 Cs источника. Очистите интерьер обилия дезинфицирующим раствором, поместите мышей в облучение и включите поворотный круг так, чтобы все щенки облучались однородно. Закройте облучение и нажмите выключатель питания, чтобы инициировать процесс облучения. Подождите, пока время облучения будет завершено и немедленно удалить мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку облучение не генерирует стресс у мышей, предыдущая анестезия не требуется. - 2-4 ч после процедуры облучения, поместите щенков в шкаф биобезопасности внутри охлажденной стерильной чашке Петри, покрытой стерильной марлей на льду, пока анестезируется (5–10 мин). Достаточная анестезия достигается, когда грубые движения прекращаются.
- Загрузите шприц с прикрепленной иглой (29 G, 0.5") с 50 qL суспензии клетки и 1.4 x 105 CD34и HSCs под сертифицированным шкафом биобезопасности.
- Для прививки через печеночные инъекции, сдерживайте детенышей большим и указательным пальцами. Чтобы свести к минимуму удерживание мыши (30-45 с), пусть один следователь держать щенка и управлять инъекции, и второй следователь загрузить шприц с Подвеской HSC. Очистите место инъекции с 70% алкоголя и доставить 50 л клеток непосредственно в печень. Используйте неглубокий угол иглы при инъекциях, чтобы избежать полного пирсинга печени. В качестве контроля, вводить мышей с 50 Л 1x PBS в печень.
- Поместите щенков на предварительно разогретую стерильную чашку Петри, покрытую стерильной марлей в течение 1-5 мин, чтобы можно было восстановиться. Предварительно разогреть блюдо с помощью инфракрасного потепления площадку для грызунов при 20 градусов по Цельсию, чтобы убедиться, что щенки не будут чрезмерно нагреваться.
- Непосредственно перед возвращением детенышей к родителям, применять небольшое количество ментол- и эвкалипта основе мази, используя большой и указательный пальцы, к морде обоих родителей, чтобы избежать каннибализма или отказа от детенышей.
- Проверяйте клетки каждый день, ища любые признаки трансплантата против хозяина болезни (GVHD) в щенках, таких как сухая кожа, без кормления, сыпь, и облысение. Эвтаназия животных, если любой из этих признаков наблюдаются.
- Мышей wean в возрасте 3 недель, группируя их по полу. Не кладите более 5 животных на клетку. Проверить прививки в периферической крови с помощью цитометрии потока в 14 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешность прививок составляет от 80%-100%.
2. Человеческий PBMC прививок несовершеннолетних мышей
- Для острого и реактивации моделей, вводить 6-8 недельных NS-цепиnull мышей интраперитонева с человеческими ПБМК, полученных от здорового донора или ВИЧ-инфицированного пациента, который был под АРТ, соответственно. В обе их модели, включают мышей вводили с ПБМК от здорового донора без ВИЧ-инфекции (обман) в качестве контроля.
- Слой 15 мл цельной крови в 5 мл стерильной плотности градиента среды в 50 мл конической трубки.
- Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин на RT, без тормозов, чтобы избежать буффи пальто становится смешанным с плотностью градиента среды.
- Тщательно соберите фракцию моноядерных клеток (между градиентной средой и супернатантом плотности) и перенесите шубу в 15 мл центрифуги, содержащую 10 мл 1x PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT.
- Откажитесь от супернатанта и удалите оставшиеся красные кровяные тельца, лизацией с 5 мл буфера ACK, добавленного в пеллетные клетки. Инкубировать в течение 4 мин на RT.
- Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT. Отбросьте супернатант и отбросьте в 10 мл 1x PBS или RPMI 1640 среды.
- Используйте 10 зЛ суспензии клетки для подсчета клеток и проверки жизнеспособности путем trypan синий исключение окрашивания в гемоцитометр. Как правило, 1-2 х 106 клеток получаются на каждые 1 мл крови, с более чем 95% жизнеспособности.
- Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT. Отбросьте супернатант и отрегулируйте номер клетки до необходимой концентрации (в этом случае 3,5 х 106 ячеек в 200 кл. 1x PBS).
- Загрузите шприц с прикрепленной иглой (28 G, 0.5) с 3.5 x 106 PBMCs в 200 ЗЛ 1x PBS под сертифицированным шкафом биобезопасности.
- Снимите мышь из клетки и удерживайте ее за хвост, чтобы она сжимала сетку, применяя нежную тягу назад. Затем поместите указательные и пальцы большого пальца на плечи животного, захватив свободную кожу шеи и используя средний палец, чтобы стабилизировать спину.
- Сдвиньте голову мыши назад так, чтобы ее спина была над головой. Это позволяет внутренности в брюшной полости быть смещены назад и снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции.
- Очистите место инъекции с 70% алкоголя.
- Проникайте в шприц, используемый в шаге 2.9 через брюшную стенку и аспирировать перед введением клеток, если какой-либо материал аспирируется, удалить шприц и отказаться от него. В противном случае, вводить клетки медленно в интраперитонеальной полости, удалить шприц и отбросить его. Вводят 1x PBS для борьбы с мышами.
- Верните животное в клетку.
- Проверить прививки в периферической крови по течению цитометрии на 3 недели после инъекции.
3. Послетрансплантационный уход
- Определите мышей по пометке уха.
- Наблюдайте мышей используемых в этих экспериментах близко 2x в день после каждой процедуры для клинических знаков дистресса.
- После трансплантации клеток человека, контролировать мышей для GVHD. Для мониторинга симптомов ГВХД у новорожденных, несовершеннолетних и взрослых мышей, оценить животных на появление кожных заболеваний (например, цвет, сухость, сыпь, облысение), в дополнение к измерению веса тела. Оцените животных, которые показывают эти признаки ветеринаром рассмотреть ранней эвтаназии.
4. Процедура ВИЧ-инфекции и процедура фиктивной инфекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Для хронических и острых моделей, мыши инфицированы ШТАММом ВИЧ-бейл на 14-й и 3-й неделе после трансплантации, соответственно. Инъекции с ВИЧ вводятся интраперитоневом виде в нижние брюшные квадранты.
- Выполните процесс загрузки вируса/PBS в шприцы, используя 28 G 0.5 " иглу, в шкафах BSL2 после процедур ABSL2. Общее количество вводимого вируса составляет 15 000 медианных инфекционных доз культуры тканей (TCID50) в 200 л стерильных RPMI 1640.
- Снимите мышь из клетки и удерживайте ее за хвост, чтобы она сжимала сетку, применяя нежную тягу назад. Затем поместите указательный палец и большой палец на плечи животного, хватая свободную кожу шеи и используя средний палец, чтобы стабилизировать спину.
- Сдвиньте голову мыши назад так, чтобы ее спина была над головой. Это позволяет внутренности в брюшной полости быть смещены назад и снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции.
- Очистите мышей с предварительно увлажненным алкоголем колодки в левом нижнем / правом квадранте живота. Вводят 15 000 TCID50 вируса ВИЧ-балов, содержащегося в 200 Зл стерильных RPMI 1640.
- После инъекции верните мышь в домашнюю клетку.
5. Сбор крови путем ретроорбитального прокола
ПРИМЕЧАНИЕ: Ретроорбитальные кровотечения позволяют быстро ездовые крови, тем самым уменьшая общее время сбора и повышая стабильность маркеров лимфоцитов человека. Используйте трубки EDTA для сбора крови мышей.
- В хронической модели, на 14 недель после инъекции HSC, собирать кровь через ретроорбитальные вены. В острой и реактивации моделей, выполнить эту процедуру на 3 недели после инъекции PBMC.
- Анестезия животных с помощью 250 л изофлюранинга до сбора крови в биобезопасности капот класса B2, который продуктивается изветины изофруранов.
- Распределите Isoflurane в ватные палочки под проволочной сеткой в прозрачной 1 L банку в биобезопасности кабинет вентилируемые за пределами здания. Использование сетки гарантирует, что животные не контактируют с пропитанной изофровной прокладкой, которая может вызвать раздражение кожи и потенциальное переутомление, так как изофруран также поглощается через кожу. Кроме того, положить мягкое бумажное полотенце между сеткой и животных, чтобы избежать травм конечностей.
- После того, как банку насыщенизомана (примерно 1 мин после его добавления), ввести животное и наблюдать скорость дыхания, которая будет увеличиваться, то уменьшается. Проверьте на клиническое указание на глубокую плоскость анестезии, которая включает в себя отсутствие выправа рефлекс (при опрокидывании банку мягко) и отсутствие валовых движений. Начните процедуру кровотечения, как только животное полностью расслаблено и не хватает щепотки ногой рефлекс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Так как изофлуран испаряется, обойтись больше наркотиков, если никаких признаков анестезии не наблюдается. - Для ретроорбитального кровотечения прижмите мышь внешней яремной вены caudal к нижней челюсти с большим пальцем, и с той же рукой, осторожно поднять верхнее веко с указательным пальцем.
- Вставьте гематокриттрубкую трубку в медиальную канту с глаз и направьте ее в вентролатеральном направлении до тех пор, пока кровь не начнет меняться.
- Соберите не менее 100 кл крови. После получения желаемого объема крови (объем не превышает 1% массы тела животного) прекратите внешнее яремное давление и удалите гематократную трубку.
- Убедитесь, что гемостаз завершается, применяя прямое давление на глаз с помощью стерильной марли в течение как минимум 30 с.
- Нанесите тетракаин капли в глаз. Мониторинг животного, пока он полностью оправился от анестезии и поместить его обратно в клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: 100 л собранной крови используется для оценки уровня прививки человекаCD45 и других популяций клеток крови, а также для оценки плазменной вирусной нагрузки.
6. Скрининг уровня прививок и анализа цитометрии потока
- Следуйте обычной цитометрии потока окрашивания протокол для всей крови, которая включает в себя инкубацию фторхромных маркировки античеловеческих антител (для предлагаемой панели потока, см. Таблица материалов), а затем лиза красных кровяных телец и стирки шаги13,15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для скрининга уровня прививок, включите античеловеческое антитело CD45. Для сравнения, антитела CD45 антимышки также могут быть использованы. Включите контроль компенсации, а также образец крови человека, окрашенный той же смесью антител, неокрашенные образцы крови мыши и человека, и негуманизированный контроль для проверки перекрестной реактивности реагентов. После окрашивания всегда есть какой-то фоновый сигнал; однако все позитивные сигналы четко отличаются от отрицательных и кросс-реактивных элементов управления. - В соответствующем цитометре потока, приобрести по крайней мере 10000 событий на воротах лимфоцитов (FSC-A против SSC-A). Для анализа цитометрии потока, после дублирования исключения, определить процент человеческих клеток CD45и, а также других групп клеток, представляющих интерес.
7. Оценка плазменной вирусной нагрузки
- Оцените вирусную нагрузку у ВИЧ-инфицированных животных в 1 раз в неделю после заражения.
- После ретроорбитального кровотечения (примерно 100 л) получить плазму, собирая супернатант после центрифугации антикоагулягированной крови при 3500 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге. Гранулы используются для фенотипирования клеток крови.
- Используйте коммерческий вирусный комплект для извлечения РНК (см. Таблица материалов)для получения РНК от 40 qL плазмы.
- Преобразуйте РНК в кДНК с помощью первой смеси синтеза штамма (см. Таблица материалов)и кляп ВИЧ грунтовки SK431.
- Выполните количественные ПЦР в реальном времени с использованием ВИЧ Gag праймеры SK38/SK39 и флуоресцентные зеленые красители (например, SYBR зеленый), как описано в предыдущих исследованиях13,25.
8. Применение антиретровирусной терапии
- Администрирование оральной АРТ по крайней мере через 3 недели после инфицирования, когда наблюдается высокая вирусная нагрузка, в хронических, острых и реактивационных моделях.
- Рассчитайте дозы тенофовир дисопроксил фуумарат (TDF), эмтрицитабин (FTC), и raltegravir (RAL), в соответствии с км значения 37 и 3 для людей и мышей, соответственно26. Как правило, эквивалентные человеку дозы TDF, FTC и RAL составляют 61,7 мг/кг/день, 40,7 мг/кг/день и 164 мг/кг/день, соответственно.
- Для введения в питьевой воде, раздавить таблетки наркотиков и добавить соответствующее количество в бутылку с водой, гарантируя, что каждая мышь в клетке приобретает свою суточную дозу. Так как порошок препарата может образовывать осадок в бутылке, периодически встряхивая бутылку воды для достижения однородной подвески.
- Каждую неделю меняйте бутылку с водой свежерастворимыми препаратами.
- Сбор крови через ретроорбитальные вены каждую неделю или каждые 2 недели после начала АРТ для оценки изменений в вирусной нагрузке и соотношении CD4:CD8.
9. Эвтаназия мыши, сбор вторичных лимфоидных органов и изоляция моноядерных клеток
- Эвтаназия выполняется в трех гуманизированных моделях мышей, периодически вдоль инфекционного времени, или в конце эксперимента.
- Выполните эвтаназию взрослых мышей с помощью CO2 асфиксии, а затем вывихшей шейки матки. Для удушья используйте незаряженную камеру, распределите CO2 из коммерческого цилиндра с регулятором фиксированного давления и в линию ограничителя, контролирующего поток газа в пределах 20%-30% от объема камеры/минуты в соответствии с руководящими принципами AVMA 2013 года.
- Поддержание потока CO2 для мониторинга остановки дыхания (который может занять до 5 минут), а затем вывих шейки матки для обеспечения эвтаназии.
- Эвтаназия новорожденных злт;7 дней назад физическим методом (т.е. с помощью острых ножниц).
- Визуализируйте подмышечные, медиалистические и мезентерические лимфатические узлы (которые обычно наблюдаются) и извлекайте их с помощью пинцета и острых ножниц. Также извлеките селезенку, расположенную в верхней левой стороне перитонеальной полости.
- Депозит лимфоидных тканей в 1,5 мл центрифуговых труб, содержащих стерильные RPMI 1640 среды.
- Немедленно обработайте лимфоидные ткани в 70-миллиметровом поро-размерном нейлоновом штамме, собирая клетки в трубке 50 мл. Не аспирируйте ткани.
- Вымойте клетки с 5 мл RPMI 1640 среды дополнили 1% FBS для облегчения фильтрации клеток.
- После дезагрегации тканей центрифугия клеток суспензия на 3500 х г в течение 10 мин в микроцентрифуге.
- Откажитесь от супернатанта и resuspend клетки с 500 Зл 1x PBS.
- Перенесите подвеску клеток в центрифужную трубку 1,5 мл, содержащую 500 л стерильной среды градиента плотности.
- Центрифуга при 3500 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге, без тормозов, чтобы предотвратить баффи пальто от смешивания с плотностью градиента среды
- Тщательно соберите фракцию моноядерных клеток (между градиентной средой и супернатантом плотности) и перенесите шубу в центрифугу мощностью 1,5 мл, содержащую 500 л 1x PBS. Центрифуга при 3000 х г в течение 3 мин.
- Удалите оставшиеся эритроциты, лизинируя 500 qL буфера ACK, инкубируя в течение 4 минут на RT.
- Центрифуга при 3000 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант и отбросьте в 1 мл 1x PBS или среднего.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как описано выше, в 14 недель после HSC инъекции (хроническая модель) или на 3 недели после PBMC инъекции (острые и реактивации моделей), мышей кровоточат для скрининга уровня человеческих клеток прививок потокцитометрии. Репрезентативная стратегия gating для оценки 1) человека CD45- реконституция клеток и 2) процент CD4и CD8- Т-клеток показана на рисунке 1A. Как правило, уровень прививки (в процентах от человеческих CD45и клеток) колеблется от 10%-80% после инъекции CD34и HSC и зависит от маршрута инъекций и мыши штамма, среди других ранее описанных факторов(Рисунок 1B). После инъекции PBMC уровень прививки (в процентах отклеток CD45 или CD3) колеблется от 5%-65%, также с различиями между штаммами мыши(рисунок 1B). Кроме того, некоторые различия между мышами, вводимыми pbMC, полученными от здорового и ВИЧ-инфицированного донора, можно наблюдать(рисунок 1D). Как правило, для ВИЧ-инфекции, уровни прививки выше 5%-10% достаточно для активной репликации вируса.
Важно отметить, что характерной чертой hu-PBL-NS-цепинулевой мыши модели является развитие ксеногенных GVHD в течение нескольких недель после клеточного прививок, в связи с человеческим Т-клеток признание мурин основных гистосовместимости комплекса (MHC) молекул23. Этот процесс очевиден, даже после 3 недель после инъекции PBMC, по таким признакам, как волосы и потеря веса(Рисунок 2A,B), а также увеличение экспрессии маркеров в Т-клетки, такие как HLA-DR и CD38 (Рисунок 2C, D). С другой стороны, GVHD более медленно развивается у мышей, вводимых с человеческим CD34и HSC и напрямую коррелирует с начальный уровень прививки.
После ВИЧ-инфекции, наблюдается быстрый рост плазменной вирусной нагрузки, как правило, обнаруживаются после 2-3 недель после инфекции, как в хронических и острых моделей(Рисунок 3A,B), с аналогичными кинетики в модели реактивации (Рисунок 3C). Увеличение вирусной нагрузки совпадает со снижением соотношения CD4:CD8(рисунок 3D,E,F). Эти изменения не наблюдаются в контроль мышей (без ВИЧ-инфекции, Рисунок 3). Следует отметить, что в модели нулевоймыши hu-PBL-NS-цепи можно наблюдать начальную инверсию соотношения CD4:CD8, которая была восстановлена по времени мониторинга(рисунок 3E,F). Наконец, если АРТ вводят ВИЧ-инфицированным мышам, ожидается подавление вирусной нагрузки, а также восстановление в соотношении CD4:CD8, достигающее уровней, аналогичных тем, которые находятся в неинфицированных средствах управления(рисунок 3A,C,D,F). Как правило, после 2-3 недель лечения, снижение вирусной нагрузки и увеличение соотношения CD4:CD8 наблюдается в хронических, острых и реактивационных моделей. Если этого не наблюдается, дозы препарата и маршрут введения нуждается в оценке.
Рисунок 1: Представительная стратегия gating для оценки уровней прививок человека CD45 и Т-клеток. (A) Стратегия Gating, используемая для скрининга процента человека CD45 (huCD45),CD3,CD4, иCD8 , и CD8 - Т-клетки в huNS-цепиnull мышей, на неделе 14 после инъекции с пуповинной крови CD34и HSCs. Цифры указывают процент каждого населения. (B) Представитель ные уровни прививки (в процентах от huCD45и клеток) в huNS q-цепиnull (n No 6) и аналогичный иммунодефицитный штамм с трансгенным выражением IL-3 и GM-CSF (huNOG-EXL, n No 6), как сообщалось ранее15. (C) Представитель ные уровни прививки (процент huCD3и клеток) в hu-PBL-NS-цепиnull и hu-PBL-SGM3 мышей (NS q-цепиnull мышей с трансгенной экспрессией SCF, GM-CSF, и IL-3), на неделе 3 после инъекции с PBMCs от здорового донора (острая модель, n 7 и n 8, соответственно). (D) Представитель ные уровни прививки (в процентах от huCD3и клеток) в hu-PBL-NSG-SGM3 мышей после инъекции с ПБМК от здорового или ВИЧ-инфицированного пациента, который был под АРТ (модель реактивации, no 10 и n 12, соответственно). В B-D строка указывает медиану, и отображается p-значение теста Манн-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Разработка GVHD в модели нулевой мыши hu-PBL-NS. (A) Выпадение волос у двух представительных мышей hu-PBL-NSG-SGM3, на 7 неделе после инъекции PBMC от здорового донора. (B) Потеря веса тела мыши на протяжении всего времени мониторинга нормализовалась до процента стартового веса у мышей hu-PBL-NSG-SGM3, вводили с помощью PBMC от здорового донора (n No 10) и ВИЧ-инфицированного пациента (n No 12). (C) Представитель выражение (на неделе 7 после трансплантации) HLA-DR и CD38 вCD4 и CD8- Т-клеток от hu-PBL-NSG-SGM3 мышей вводили с PBMCs от здорового донора. Цифры указывают процент каждого населения. (D) Представитель проценты CD4и CD8- Т-клеток, которые HLA-DRCD38 - в hu-PBL-NSG-SGM3 мышей вводят с PBMC от здорового донора. Примечательно, что в клетках до инъекций на мышей уровни HLA-DRи CD38cd38 и CD8и Т-клеток составили 2,0% и 5,7%, соответственно. В B и D отображается средний и межквартильный диапазон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные изменения вирусной нагрузки и соотношения CD4:CD8 у мышей huNS q-цепиnull после ВИЧ-инфекции и после введения АРТ. (A, D) Соотношение CD4:CD8 и плазменная вирусная нагрузка у хун-энд-цепинулевых мышей после заражения ВИЧ-балами (красные точки и линия, n No 3), которые были выполнены после недели 14 инъекций с пуповинной кровью CD34и HSCd. Неинфицированные элементы управления (PBS-впрыскиваемые) также были включены (зеленые точки и линии, n No 5). (B, E) Плазменная вирусная нагрузка и соотношение CD4:CD8 у мышей hu-PBL-NSG-SGM3 после заражения ВИЧ-балем (красные точки и линия, n No 4), которое было выполнено на неделе 3 после инъекции PBMC от здорового донора (острая модель). Неинфицированные элементы управления (PBS-впрыскиваемые) также были включены (зеленые точки и линии, n No 3). (C и F) Плазменная вирусная нагрузка и соотношение CD4:CD8 у мышей hu-PBL-NSG-SGM3, вводили ПБМК от ВИЧ-инфицированного донора (красные точки и линии,. 9) или здорового донора (зеленые точки и линии, n - 10) (модель реактивации). Во всех случаях отображается средний и межквартильный диапазон. В A-C пунктирной линии указывается предел обнаружения ассея (150 копий/мл). Для образцов с необнаруживаемой вирусной нагрузкой было назначено значение, равное половине предела обнаружения. В D-F пунктирная линия указывает на соотношение CD4:CD8 1. В A, C, D и F серая коробка указывает время с администрированием АРТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важные достижения были достигнуты в развитии иммунодефицитных штаммов мыши для гуманизации, с рядом различных вариантов, которые могут быть использованы в соответствии с интересом исследования1. Здесь приведен общий протокол для гуманизации н.с. цепинулевых мышей и генетически аналогичных штаммов, которые будут использоваться в трех различных моделей для изучения ВИЧ-инфекции. В первом экспериментальном подходе облученные новорожденные мыши вводят сяпованные с помощью cd34и HSCs человека, которые могут быть получены из пуповинной крови, печени плода, или мобилизованной периферической крови3,21. Соответствующее облучениенэнд-цепных нулевых мышей является критическим шагом, так как оно устраняет костный мозг мыши и другие клетки-прародители, позволяя эффективно восстановить популяции клеток человека. Тем не менее, некоторые доклады свидетельствуют о восстановлении человеческих клеток в различных штаммов мыши, без облучения27. В связи с этим, надлежащие дозы облучения должны быть предоставлены, так как NS q-цепинулевых мышей являются радиочувствительными, и высокий q-облучение может вызвать тимический лимфогенез21,28.
Другие критические шаги и факторы, которые могут повлиять на уровень прививки включают маршрут инъекции (внутрипеченевого, внутривенного, внутрисердечного), мышей возраста, процент чистоты CD34и HSCs, и оператор экспертизы29. Во втором и третьем подходах, основанных на моделях нулевоймыши hu-PBL-NS, некоторые критические факторы включают маршрут инъекций (интраперитонеальный, внутривенный, интраспелин), возраст мышей и количество инъекционных клеток человека, которые могут влиять на конечный уровень прививки. Что касается этого последнего фактора, несколько исследований использовали 5-10 х 106 PBMCs для прививки22,23,30, в то время как настоящий протокол предлагает использование 3,5 х 106 PBMCs. Следует отметить, что это количество клеток достаточно для восстановления Т-клеток и для репликации ВИЧ, как в острой и реактивации моделей, а также задерживает развитие GVHD23. Тем не менее, исследователи должны оптимизировать условия гуманизации в соответствии с целями исследования. Кроме того, важно проверить штамм ВИЧ, используемый для заражения хуня и цепинулевых мышей. Здесь используется штамм R5 tropic HIV-1 BaL, который дает высокий уровень репликации вируса у хун-цепныхнулевых мышей. Другие штаммы репортера, такие как те, которые содержат люциферазу или флуоресцентные белки, также подходят для одноклеточного анализа ВИЧ-инфицированных клеток31.
В целом, три основных ограничения проявляются в huNS-цепинулевой мыши моделей после прививки с CD34и HSC. Во-первых, из-за отсутствия тимической среды человека, Т-клетки образованы в контексте молекул Murine MHC, сдерживая последующую антиген-специфическую стимуляцию через свои Т-клеточные рецепторы. Этот вопрос ограничивает использование моделейнулевой мыши NS q-цепи для изучения реакции Т-клеток, специфичных для ВИЧ-специфических. Тем не менее, это ограничение может быть преодолено с помощью BLT мышей или NS цепинулевой мышей с трансгенной экспрессией молекул HLA16,17. Во-вторых, как правило, существует плохая реконституция популяций миелоидов в NS цепинулевой мыши моделей, ограничивая изучение этих подмножеств, которые имеют отношение в контексте антиген-презентации и патогенеза ВИЧ-инфекции14,15. В этом случае рекомендуется использовать штаммы мыши с трансгенным выражением гематопогетических факторов8,15,32.
В-третьих, есть 1) плохое развитие лимфоидных фолликулов структур во вторичных лимфоидных тканей и 2) отсутствие третичных лимфоидных тканей, что связано с низким уровнем врожденных иммунных клеток (т.е., дендритные клетки в huNS- цепьнулевых мышей), которые имеют решающее значение для развития фолликулов33. Этот вопрос связан с плохой юмористической реакции в huNS цепинулевой мыши модели34. Тем не менее, некоторые доклады свидетельствуют о развитии фолликула-подобных структур в huNS-цепи null мышей4, в то время как селезенка- и лимфатические узлы ограничены фолликулярных Т-клеток (выражение фолликул-находной хемоцин рецептор CXCR5) обнаружены в huNS цепинулевых мышей и связанных с ними штаммов 15). Опять же, использование 1) BLT мышей или 2) мыши штаммов с трансгенным выражением гематопогетических факторов и / или с выражением молекул HLA может улучшить восстановление популяций миелоидов, развитие организованных вторичных и третичных лимфоидных структур, а также эффективные Т-клеточные и B-клеточные ответы8,35,36.
Подобно ограничениям CD34- HSC-гуманизированных моделейнлигеш-цепи null мыши, есть отсутствие антиген-специфических Т-клеток и юмористических реакций, отсутствие миелоидных популяций, а также организованные лимфоидные структуры в hu-PBL-NS-цепнойнулевой мышей. Кроме того, важным ограничением модели нулевоймыши hu-PBL-NS (острые и реактивационные модели ВИЧ-инфекции) является коротким окном для мониторинга, так как у этих мышей развивается ксеногенный GVHD23. Развитие GVHD может также вызвать нежелательные фенотипические и функциональные изменения иммунных популяций, присущие патогенный процесс23,37. Тем не менее, эта модель имеет то преимущество, что проще и доступнее, особенно с учетом того, что человеческие ПБМС легче приобрести у здоровых или ВИЧ-инфицированных доноров38. Кроме того, инъекция первичных клеток непосредственно от пациентов полезна для изучения клеточных или патогенно-внутренних состояний донора, таких как вирусные мутации лекарственной устойчивости или донорские специфические иммунные изменения. Следует отметить, что для модели реактивации, in vitro анализы с агентами реактивации ВИЧ могут быть выполнены для подтверждения реакции ПБМК перед инъекцией в мышей39. Еще одним ограничением для некоторых учреждений является то, что эта работа требует BSL2 "объектов для обработки ВИЧ-инфицированных животных в соответствии с правилами.
Модели нулевоймыши huNS и цепи имеют некоторые преимущества по сравнению с другими моделями животных для изучения ВИЧ-инфекции, таких как нечеловеческие приматы, инфицированные вирусом иммунодефицита симиана. Например, мыши huNS q-цепиnull позволяют творение нокаута гена или трансгенных штаммов, которые позволяют оценить конкретные цели гена. Кроме того, использование первичных человеческих клеток в huNS q-цепинулевых мышей позволяет избежать возможных видов конкретных ограничений, таких как случай интерферона стимулировали гены у нечеловеческих приматов, которые могут влиять на противовирусную реакцию и ход инфекции40. Таким образом, кинетика инфекции очень согласована между мышами huNS q-цепьюnull. Наконец, модели нулевоймыши huNS и цепи являются менее дорогостоящими, не требуют сложных основных средств и более доступны.
Таким образом, модели cd34и HSC-humanized и hu-PBL-NS q-chainnull mouse предлагают различные возможности для изучения хронических, острых и реактивационных событий при ВИЧ-инфекции. С признанием и преодолением вышеупомянутых ограничений этих моделей, использование н.э.-цепинулевых мышей может быть мощным инструментом для вирусологических, иммунологических и лекарственных доклинических исследований, а также для редактирования генома и клеточной иммунотерапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана IHV клинического отдела внутренних средств в JC.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
Clear jar | Amazon | 77977 | |
Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
FACS lysing solution | BD | 340202 | |
FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
Micro pipettes | |||
Microcentrifuge | Eppendorf | ||
Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).