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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

Published: December 3, 2019 doi: 10.3791/60315
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

Summary

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Abstract

Camundongosanulosos humanizados no nod/scid/il-2 receptor nulos recapitulam algumas características da imunidade humana, que podem ser exploradas em pesquisas básicas e pré-clínicas sobre doenças infecciosas. Aqui estão três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV. O primeiro é baseado na injeção intrahepática de CD34+ células-tronco hematopoiéticas em camundongos recém-nascidos, o que permite a reconstituição de várias células confinadas no sangue e tecido linfóide, seguida de infecção por uma cepa de HIV de referência. Este modelo permite o monitoramento por até 36 semanas após a infecção e, portanto, é chamado de modelo crônico. O segundo e o terceiro modelos são referidos como os modelos agudos e de reativação, nos quais as células mononucleares periféricas do sangue são injetadas intraperitoneally em camundongos adultos. No modelo agudo, as células de um doador saudável são enxertadas através da rota intraperitoneal, seguidas de infecção por uma cepa de HIV de referência. Finalmente, no modelo de reativação, as células de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral são enxertadas através da rota intraperitoneal. Neste caso, um ambiente livre de drogas no mouse permite a reativação do vírus e um aumento na carga viral. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a abordagem experimental convencional para modelos de camundongos humanizados e imunodeficientes da infecção pelo HIV.

Introduction

O modelo humanizado de camundongos nod/SCID/interleucina (IL)-2 receptor diminuidor (doravante referido como huNS γ-cadeianulo)modelo de camundongo tem sido amplamente utilizado para estudar a patogênese de infecções, autoimunidade e câncer, bem como para estudos pré-clínicos de drogas e terapias baseadas em células humanas1,2. Estes camundongos são baseados em um fundo diabético não obeso (NOD), com a mutação cidacada e mutação direcionada no locus il-2 receptor matador-cadeia (massa de turma comum de turma t-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que induzem um grave prejuízo no desenvolvimento de células t-, b-e-assassino natural (NK) do ratoT-,B-e natural (NK) . Assim, eles suportam o enxerto de tecido humano, CD34 humano+ células-tronco hematopoiéticas (HSCs), e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs)3,4,5. Além disso, a expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos, como fator de células-tronco (SCF), fator estimulante da colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e IL-3 promove o enxerto das populações mieloides humanas6,7,8.

Para estudos de HIV, vários modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS foram descritos, que diferem na cepa do camundongo, tipo de células humanas usadas, tipo de tecidos para o enxerto e origem das células (ou seja, saudável vs. Doador infectado pelo HIV)9,10. A cepa original, no entanto, é amplamente utilizada devido aos altos níveis de enxerto de células humanas e replicação viral após a infecção com uma referência da cepa HIV11,12,13. Cepas de camundongos imunodeficientes semelhantes com expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos (por exemplo, RATOS NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou com implantes de tecidos do fígado humano e do timo (camundongos de medula óssea-fígado-timo [BLT]) são úteis para avaliar o papel das populações mieloides na resposta imune anti-HIV, efeitos do HIV nesses tecidos e sua participação como reservatórios virais14,15. Além disso, algumas cepas com expressão transgênica de moléculas de antígeno leukócito humano (HLA), bem como camundongos BLT, podem ser usadas para estudar a resposta das células T à infecção pelo HIV16,17.

Em geral, nesses camundongos, a humanização depende da origem celular, da rota de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiac) e da idade do rato no momento do enxerto18,19,20. Em relação à origem celular, CD34+ HSC humano derivado de sangue do cordão umbilical, fígado fetal ou sangue periférico mobilizado pode ser injetado em camundongos recém-nascidos ou jovens3,21. Além disso, camundongosnulos adultos da cadeia de γ podem ser humanizados pela injeção de PBMC (aqui, referido como camundongosnulos da cadeia de metodolses de cadeia de metodolses hu-PBL-NS), permitindo a circulação temporal dessas células no sangue, órgãos linfoidos secundários e tecidos inflamados22,23,24.

Descrito aqui é um protocolo detalhado para o estabelecimento de modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS para o estudo da infecção pelo HIV. O primeiro é o modelo crônico, em que cd34 humanos+ HSCs derivados do sangue do cordão umbilical de um doador saudável são injetados em camundongos recém-nascidos, seguido de infecção com uma cepa de REFERÊNCIA HIV após 14 semanas de reconstituição do sistema imunológico humano. Este modelo permite a monitoração dos ratos por até ~36 semanas após a infecção. O segundo modelo é um modelo agudo, no qual pbmcs derivados de um doador saudável são injetados em adultos ns- cadeia de ratosnulos, seguido por infecção com uma referência da estirpe de HIV após 3 semanas de expansão de células T humanas no mouse. Finalmente, o terceiro modelo é o modelo de reativação, no qual os PBMCs derivados de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral supressiva (TARV) são injetados em camundongosnulos adultos da cadeia de metodols. Neste caso, um ambiente livre de drogas permite a reativação viral e aumento da carga viral. Os dois últimos modelos permitem o monitoramento por até ~9 semanas após o enxerto.

No geral, esses três modelos são úteis para estudos virológicos, estudos pré-clínicos de novos medicamentos e avaliação dos efeitos da infecção pelo HIV na resposta imune global. Também é importante considerar que o uso de camundongos humanizados infectados pelo HIV requer revisão e aprovação pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC), bem como pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) antes de qualquer experimento. Isso garante que o estudo siga todas as regulamentações institucionais internas e externas para o uso de material biológico perigoso e manuseio humano de animais experimentais.

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Protocol

Neste trabalho, todos os cuidados e procedimentos para animais foram realizados de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland (números de protocolo 1018017, 1018018 e 0318009).

1. Enxertia humana de CD34+ HSC de camundongos recém-nascidos

  1. Use sempre o equipamento de proteção pessoal descartável (PPE), incluindo esfrega estéreis, luvas, sapatas dedicadas, tampas de sapata, máscara, óculos de proteção, capota do cabelo/barba, e revestimentos de laboratório estéreis.
  2. Resuspenda 1 x 106 de CD34+ HSCs congelados (ver Tabela de Materiais)em 10 mL de mídia RPMI 1640 10% FBS um armário de biossegurança certificado e manter condições estéreis.
  3. Use 10 μL da suspensão para contar (para assegurar a presença do número esperado de células) e verifique a viabilidade celular por coloração de exclusão azul trypan em um hemocytometer.
  4. Centrífuga a 400 x g por 15 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatant e resuspenda no frio 1x PBS para a concentração necessária (1,4 x 105 de CD34+ HSCs em 50 μL). Mantenha as células no gelo até a injeção.
  5. Coloque os filhotes (NS γ-cadeianulo filhotes de ambos os sexos de 1-4 dias de idade) em um estéril 100 mm2 Placa de Petri, juntamente com uma pequena quantidade de material de cama da gaiola criador. Além disso, esfregue a cama limpa entre as mãos para mascarar ainda mais quaisquer odores estranhos sobre os filhotes receptores.
    NOTA: Isto minimiza os odores extrangeiros que estão sendo impregnados nos filhotes de cachorro, desse modo melhorando as possibilidades das mães que aceitam seus filhotes de cachorro de novo em gaiolas após o procedimento.
  6. Coloque a placa de Petri em uma gaiola de transporte limpo e coloque a gaiola em uma gaiola microisolator de rato limpo para proteger os filhotes do meio ambiente. Cubra a gaiola de transporte com uma almofada de cobertura para evitar a exposição de animais à luz externa, enquanto em trânsito para a sala de irradiação.
  7. Irradiar filhotes com 100 cGy irradiação corporal inteira (WBI) pela exposição a uma fonte de 137 Cs. Limpe o interior do irradiador com solução desinfetante, coloque os ratos no radiador e ligue a plataforma giratória para que todos os filhotes sejam irradiados homogeneamente. Feche o radiador e pressione o interruptor de energia para iniciar o processo de irradiação. Espere até que o tempo de irradiação seja concluído e retire imediatamente os ratos.
    NOTA: Desde que a irradiação não gera o esforço nos ratos, a anestesia precedente não é exigida.
  8. 2-4 h após o procedimento de irradiação, coloque os filhotes em um armário de biossegurança dentro de uma placa de Petri estéreis refrigerados coberto com gaze estéril no gelo, até anestesiar (~ 5-10 min). Anestesia suficiente é alcançada quando os movimentos brutos cessam.
  9. Carregue a seringa com uma agulha anexada (29 G, 0,5) com 50 μL da suspensão celular e 1,4 x 105 de CD34+ HSCs o armário certificado de biossegurança.
  10. Para o enxerto via injeção hepática, contenha os filhotes com o polegar e os dedos indicadores. Para minimizar a contenção do mouse (~ 30-45 s), deixe um investigador segurar o filhote e administrar a injeção, e ter o segundo investigador carregar a seringa com a suspensão HSC. Limpe o local da injeção com 70% de álcool e entregue 50 μL de células diretamente no fígado. Use um ângulo de agulha raso ao injetar para evitar perfurar completamente o fígado. Como controle, injete camundongos com 50 μL de 1x PBS no fígado.
  11. Coloque os filhotes em uma placa de Petri estéril pré-aquecida coberta com gaze estéril por 1-5 min para permitir a recuperação. Pré-aqueça o prato usando uma almofada de aquecimento infravermelho para roedores a 20 °C para garantir que os filhotes não serão mais aquecidos.
  12. Imediatamente antes de devolver os filhotes para seus pais, aplique uma pequena quantidade de pomada à base de mentol e eucalipto, usando o polegar e os dedos indicadores, ao cnout de ambos os pais para evitar canibalismo ou rejeição dos filhotes.
  13. Verifique as gaiolas todos os dias, procurando quaisquer sinais de doença enxerto versus hospedeiro (GVHD) nos filhotes, como pele seca, sem alimentação, erupção cutânea e alopecia. Eutanásia os animais se algum desses sinais são observados.
  14. Ratos de wean em 3 semanas da idade, agrupando os pelo género. Não coloque mais de 5 animais por gaiola. Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria fluída aos 14 semanas de idade.
    NOTA: A taxa de sucesso do enxerto é entre 80%-100%.

2. Enxerto de PBMC humano de camundongos juvenis

  1. Para os modelos agudos e de reativação, injete camundongosnulos de 6-8 semanas de idade na cadeia de metodos nulos de NS intraperitoneally com PBMCs humanos derivados de um doador saudável ou paciente infectado pelo HIV que estava TAR, respectivamente. Em ambos os modelos, incluem camundongos injetados com PBMCs de um doador saudável sem infecção pelo HIV (farsa) como controles.
  2. Camada 15 mL de sangue inteiro em 5 mL de gradiente de densidade estéril médio em um tubo cônico de 50 mL.
  3. Centrífuga a 400 x g por 30 min no RT, sem freios, para evitar que o casaco buffy se misturasse com o meio de gradiente de densidade.
  4. Coletar cuidadosamente a fração de células mononucleares (entre o gradiente de densidade médio e supernatant) e transferir o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de 1x PBS. Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT.
  5. Descarte o supernatant e remova os glóbulos vermelhos restantes lysing com 5 mL do amortecedor de ACK adicionado às pilhas pelleted. Incubar por 4 min em RT.
  6. Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT. Descarte o supernatant e resuspenda em 10 mL de 1x PBS ou RPMI 1640 médio.
  7. Use 10 μL da suspensão celular para contar as células e verificar a viabilidade por coloração de exclusão azul trypan em um hemocytometer. Normalmente, 1-2 x 106 células são obtidas para cada 1 mL de sangue, com mais de 95% de viabilidade.
  8. Centrífuga a 300 x g por 10 min na RT. Descarte o supernatant e ajuste o número celular para a concentração necessária (neste caso, 3,5 x 106 células em 200 μL de 1x PBS).
  9. Carregue a seringa com uma agulha anexada (28 G, 0,5) com 3,5 x 106 de PBMCs em 200 μL de 1x PBS um armário certificado de biossegurança.
  10. Retire o mouse da gaiola e segure-o pela cauda para que ele possa segurar a malha, aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o indicador e os dedos do polegar sobre os ombros do animal, agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar as costas.
  11. Deslize a cabeça do rato para trás de modo que sua parte traseira esteja acima da cabeça. Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfuração dos órgãos internos durante a injeção.
  12. Limpe o local da injeção com 70% de álcool.
  13. Penetre a seringa usada na etapa 2.9 através da parede abdominal e aspira antes de injetar as pilhas, se algum material é aspirado, remova a seringa e rejeite-a. Caso contrário, injetar as células lentamente na cavidade intraperitoneal, remover a seringa e descartá-lo. Injetar 1x PBS para controlar ratos.
  14. Devolva o animal à sua gaiola.
  15. Verifique o enxerto no sangue periférico por citometria de fluxo em 3 semanas após a injeção.

3. Cuidados pós-enxerto

  1. Identifique ratos por marcação de ouvido.
  2. Observe os camundongos usados nesses experimentos de perto 2x por dia após cada procedimento para sinais clínicos de angústia.
  3. Após o transplante de células humanas, monitore camundongos para GVHD. Para monitorar os sintomas de GVHD em camundongos recém-nascidos, juvenis e adultos, avalie os animais para o aparecimento de doença sofra (ou seja, cor, secura, erupção cutânea, alopecia), além da medida de peso corporal. Avalie os animais que mostram estes sinais por um veterinário para considerar a eutanásia adiantada.

4. Procedimento de infecção pelo HIV e procedimento de infecção simulada

NOTA: Para os modelos crônicos e agudos, os ratos são contaminados com a tensão da referência de HIV BaL na semana 14 e na semana 3 borne-engraftment, respectivamente. As injeções com HIV são administradas intraperitoneally nos quadrantes abdominais mais baixos.

  1. Realize o processo de carregamento do vírus/PBS em seringas, usando uma agulha de 28 G 0.5", em armários BSL2 que seguem procedimentos ABSL2. A quantidade total de vírus injetado é 15.000 dose infecciosa mediana da cultura do tecido (TCID50)em 200 μL de RPMI estéril 1640.
  2. Retire o mouse da gaiola e segure-o por sua cauda para que ele possa segurar a malha, aplicando tração suave para trás. Em seguida, coloque o dedo indicador e o polegar sobre os ombros do animal, agarrando a pele solta do pescoço e usando o dedo médio para estabilizar as costas.
  3. Deslize a cabeça do rato para trás de modo que sua parte traseira esteja acima de sua cabeça. Isso permite que as vísceras na cavidade abdominal sejam deslocadas para trás e reduz o risco de perfuração de órgãos internos durante a injeção.
  4. Limpe os ratos com uma almofada de álcool pré-wetted no quadrante esquerdo/direito mais baixo do abdômen. Injetar 15.000 TCID50 do vírus HIV BaL contido em 200 μL de RPMI estéril 1640.
  5. Após a injeção, devolva o rato à sua gaiola em casa.

5. Coleta de sangue por punção retroorbital

NOTA: O sangramento retroorbital permite a coleta rápida de sangue, reduzindo assim o tempo de coleta geral e aumentando a estabilidade dos marcadores de linfócitos humanos. Use tubos EDTA para coletar sangue de camundongos.

  1. No modelo crônico, às 14 semanas de injeção pós-HSC, recolher o sangue via veia retroorbital. Nos modelos agudos e de reativação, realize este procedimento a 3 semanas após a injeção de PBMC.
  2. Anestesie os animais usando 250 μL de inalação de isoflurano antes da coleta de sangue em uma classe B2 de capa de biossegurança que é canalizada externamente.
  3. Dispense o Isoflurane em almofadas de algodão uma malha de arame em um frasco 1 L claro em um armário de biossegurança ventilado fora do edifício. O uso da malha garante que os animais não entrem em contato com a almofada encharcado de isoflurano, o que pode causar irritação da pele e potencial overdose, uma vez que o isoflurano também é absorvido através da pele. Além disso, coloque uma toalha de papel macia entre a malha e o animal para evitar lesões nos membros.
  4. Uma vez que o frasco é saturado com isoflurane (aproximadamente 1 min depois de adicioná-lo), introduzir o animal e observar a taxa respiratória, que irá aumentar, em seguida, diminuir. Verifique se há indicação clínica de um plano profundo de anestesia, que inclui a falta de um reflexo de endireitamento (ao derrubar jar suavemente) e falta de movimentos grosseiros. Comece o procedimento de sangramento assim que o animal está completamente relaxado e sem o reflexo pitada do dedo do dedo do dedo do dodo.
    NOTA: Desde isoflurane evapora, dispensar mais drogas se não houver sinais de anestesia são observados.
  5. Para o sangramento retroorbital, pressione o mouse externo jugular veia caudal para a mandíbula com o polegar, e com a mesma mão, gentilmente elevar a pálpebra superior com o dedo indicador.
  6. Insira um tubo hematocrito no canthus medial do olho e direcione-o em uma direção ventrolateral até que o sangue comece a girar.
  7. Recolher pelo menos 100 μL de sangue. Uma vez que o volume desejado de sangue é obtido (um volume não mais do que o 1% do peso corporal do animal), interromper a pressão jugular externa e remover o tubo de hematócrito.
  8. Assegure que a hemostasis está completa aplicando a pressão direta no olho usando uma gaze estéril para um mínimo de 30 s.
  9. Aplique gotas de tetracaína no olho. Monitore o animal até que ele tenha recuperado completamente da anestesia e colocá-lo de volta na gaiola.
    NOTA: Os 100 μL de sangue coletado são utilizados para a avaliação do nível de enxerto de CD45 humano+ e outras populações de células sanguíneas, bem como para a avaliação da carga viral de plasma.

6. Triagem do nível de enxerto e análise de citometria de fluxo

  1. Siga um protocolo convencional de coloração de citometria de fluxo para sangue inteiro, que inclui a incubação de anticorpos anti-humanos com rótulofluorocromático (para painel de fluxo sugerido, ver Tabela de Materiais), seguido pela lisose dos glóbulos vermelhos e lavar os passos13,15.
    NOTA: Para a triagem do nível de enxerto, inclua um anticorpo CD45 anti-humano. Para a comparação, um anticorpo CD45 anti-mouse também pode ser usado. Inclua controles de compensação, bem como uma amostra de sangue humano manchada com a mesma mistura de anticorpos, amostras de camundongos e sangue humano não manchadas e controle não humanizado para testar a reatividade cruzada dos reagentes. Após a coloração, há sempre algum sinal de fundo; no entanto, todos os sinais positivos são claramente distinguidos de controles negativos e multi-reativos.
  2. Em um citometro de fluxo apropriado, adquirir pelo menos 10.000 eventos no portão linfócito (FSC-A vs SSC-A). Para análise de citometria de fluxo, após exclusão duplicada, determine a porcentagem de células CD45+ células humanas, bem como outras populações celulares de interesse.

7. Avaliação da carga viral de plasma

  1. Avalie a carga viral em animais infectados pelo HIV 1x por semana após a infecção.
  2. Após o sangramento retroorbital (aproximadamente 100 μL), obtenha plasma coletando o supernatant após centrífugação do sangue anticoagulado a 3.500 x g por 3 min em uma microcentrífuga. A pelota é usada para a infiltração das células sanguíneas.
  3. Use um kit de extração de RNA viral comercial (ver Tabela de Materiais)para obter RNA de 40 μL de plasma.
  4. Converta rna em cDNA usando a primeira mistura de síntese de cepa (ver Tabela de Materiais)e primer de mordaça do HIV SK431.
  5. Realize PCR quantitativo em tempo real usando primers HIV Gag SK38/SK39 e corantes verdes fluorescentes (por exemplo, verde SYBR) como descrito em estudos anteriores13,25.

8. Administração de terapia antirretroviral

  1. Administrar a TARA oral pelo menos 3 semanas após a infecção, quando a alta carga viral é observada, nos modelos crônicos, agudos e de reativação.
  2. Calcule as doses de tenofovir disoproxil fumarate (TDF), emtricitabina (FTC) e raltegravir (RAL), de acordo com valores km de 37 e 3 para humanos e camundongos, respectivamente26. Normalmente, as doses equivalentes a humanos de TDF, FTC e RAL são de 61,7 mg/kg/dia, 40,7 mg/kg/dia e 164 mg/kg/dia, respectivamente.
  3. Para a administração em água potável, esmagar comprimidos de drogas e adicionar a respectiva quantidade na garrafa de água, garantindo que cada rato na gaiola adquire sua dose diária. Uma vez que o pó de droga pode formar sedimentos na garrafa, periodicamente agitar a garrafa de água para conseguir suspensão homogênea.
  4. Mude a garrafa de água toda semana com drogas recém-dissolvidas.
  5. Coletar o sangue via veia retroorbital a cada semana ou a cada 2 semanas após a iniciação art para avaliar as mudanças na carga viral e cd4:cd8 relação.

9. Eutanásia do rato, coleção de órgãos secundários do linfóide, e isolação de pilhas mononuclear

  1. A eutanásia é realizada nos três modelos de camundongos humanizados, periodicamente ao longo do tempo de infecção, ou no final do experimento.
  2. Realize a eutanásia de camundongos adultos por asfixia de CO2, seguida pela luxação cervical. Para asfixia, use uma câmara não pré-carregada, dispense CO2 de um cilindro comercial com regulador de pressão fixa e restrição de linha controlando o fluxo de gás dentro de 20%-30% do volume/minuto da câmara para cumprir as diretrizes da AVMA de 2013.
  3. Mantenha o fluxo de CO2 para a parada respiratória de monitoramento de >60 (que pode levar até 5 min), seguido pela luxação cervical para garantir a eutanásia.
  4. Eutanásia neonatos <7 dias de idade por um método físico (ou seja, usando tesoura afiada).
  5. Visualize os gânglios linfáticos axillary, mediastinal e mesentéricos (que são tipicamente observados) e extrai-os com uma pinça e uma tesoura afiada. Também extraia o baço, localizado no lado superior esquerdo da cavidade peritoneal.
  6. Deposite os tecidos linfóides em tubos de centrífuga de 1,5 mL contendo rpmi estéril 1640 médio.
  7. Processe imediatamente os tecidos linfóides em um filtro de células de nylon do tamanho de um poros de 70 mm, coletando as células em um tubo de 50 mL. Não aspiratee os tecidos.
  8. Lave as células com 5 mL de RPMI 1640 médio complementado com 1% FBS para facilitar a filtragem de células.
  9. Após a desagregação do tecido, centrífuga as células de suspensão em 3.500 x g por 10 min em uma microcentrífuga.
  10. Descarte o supernatant e resuspenda as células com 500 μL de 1x PBS.
  11. Transfira a suspensão das células para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de gradiente de densidade estéril.
  12. Centrífuga a 3.500 x g por 3 min em uma microcentrífuga, sem freio, para evitar que o casaco buffy se misturasse com o meio de gradiente de densidade
  13. Coletar cuidadosamente a fração de células mononucleares (entre o gradiente de densidade médio e supernatant) e transferir o casaco buffy para um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de 1x PBS. Centrífuga a 3.000 x g por 3 min.
  14. Retire os restantes glóbulos vermelhos, lysing com 500 μL de amortecimento ACK, incubando por 4 min em RT.
  15. Centrífuga a 3.000 x g por 3 min. Descarte o supernatant e resuspenda em 1 mL de 1x PBS ou médio.

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Representative Results

Conforme descrito acima, em 14 semanas de injeção pós-HSC (modelo crônico) ou em 3 semanas de injeção pós-PBMC (modelos agudos e de reativação), os ratos são sangrados para a triagem do nível de enxerto de células humanas por citometria de fluxo. Uma estratégia representativa de gating para a avaliação de 1) CD45 humano+ células reconstituição e 2) porcentagem de CD4+ e CD8+ Células T é mostrado na Figura 1A. Normalmente, o nível de enxerto (porcentagem de CD45+ células humanas) varia de 10%a 80% após a injeção de CD34+ HSC e depende da rota de injeção e tensão do camundongo, entre outros fatores previamente descritos (Figura 1B). Após a injeção de PBMC, o nível de enxerto (percentual de CD45humano + ou CD3+ células) varia de 5%-65%, também com diferenças entre as cepas do mouse (Figura 1B). Além disso, algumas diferenças entre camundongos injetados com PBMC derivadas de um doador saudável versus infectado pelo HIV, podem ser observadas(Figura 1D). Normalmente, para a infecção pelo HIV, os níveis de enxerto acima de 5%-10% são suficientes para a replicação viral ativa.

Importante, uma característica de hu-PBL-NS γ-corrente modelosde camundongos nulos é o desenvolvimento de GVHD xenogênico dentro de algumas semanas após o enxerto celular, devido ao reconhecimento de células T humanas do complexo de histocompatibilidade murine principal (MHC) moléculas23. Este processo é evidente, mesmo após 3 semanas de injeção pós-PBMC, por sinais como perda de cabelo e peso(Figura 2A,B),bem como pelo aumento da expressão de marcadores de ativação em células T, como HLA-DR e CD38 (Figura 2C,D). Por outro lado, o GVHD é mais lentamente desenvolvido em camundongos injetados com CD34+ HSC humano e está diretamente correlacionado com o nível inicial de enxerto.

Após a infecção pelo HIV, há um rápido aumento na carga viral de plasma, geralmente detectável após 2-3 semanas após a infecção, tanto nos modelos crônicos quanto agudos(Figura 3A,B),com cinética semelhante no modelo de reativação (Figura 3C). O aumento da carga viral coincide com uma diminuição na relação CD4:CD8(Figura 3D, E,F). Essas mudanças não são observadas em camundongos controle (sem infecção pelo HIV, Figura 3). De nota, no modelo de ratonulo hu-PBL-NS, uma inversão inicial da razão CD4:CD8 pode ser observada, sendo reconstituída ao longo do tempo de monitoramento(Figura 3E,F). Finalmente, se a TAR é administrada a camundongos infectados pelo HIV, espera-se uma supressão da carga viral, bem como a recuperação na relação CD4:CD8, atingindo níveis semelhantes aos em controles não infectados (Figura 3A,C,D,F). Normalmente, após 2-3 semanas de tratamento, uma diminuição na carga viral e aumento na relação CD4:CD8 é observada nos modelos crônicos, agudos e de reativação. Se isso não for observado, as doses de medicamentos e o caminho da administração precisam de uma avaliação.

Figure 1
Figura 1: Estratégia representativa de gating para avaliação dos níveis de enxerto de CD45+ e células T humanas. (A) Estratégia de Gating utilizada para a triagem do percentual de CD45humano + (huCD45), CD3+, CD4+, e CD8+ Células T em camundongos huNS cadeia de resíduosde areia, na semana 14 após injeção com sangue do cordão umbilical CD34+ HSCs. Os números indicam a porcentagem de cada população. (B) Níveis representativos de enxerto (percentual de huCD45+ células) na cadeia de chapas huNSanuladas (n = 6) e uma cepa imunodeficiente semelhante com expressão transgênica de IL-3 e GM-CSF (huNOG-EXL, n = 6), conforme relatado anteriormente15. (C) Níveis representativos de enxerto (percentual de huCD3+ células) em camundongos hu-PBL-NS γ-chainnull e hu-PBL-SGM3 (ns rede de ratosnulos com expressão transgênica de SCF, GM-CSF e IL-3), na semana 3 após injeção com PBMCs de um doador saudável (modelo agudo, n = 7 e n = 8, respectivamente). (D)Níveis representativos de enxerto (porcentagem de huCD3+ células) em camundongos hu-PBL-NSG-SGM3 após injeção com PBMCs de um paciente saudável ou infectado pelo HIV que estava TAR (modelo de reativação, n = 10 e n = 12, respectivamente). Em B-D, a linha indica a mediana, e o p-valor do teste de Mann-Whitney é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Desenvolvimento de GVHD no modelonulo do rato nulo da massa de blíndo-ns do hu-PBL-NS. (A)Perda de cabelo em dois camundongos hu-PBL-NSG-SGM3 representativos, na semana 7 após injeção com PBMC de um doador saudável. (B) Perda de peso corporal do rato durante todo o tempo de monitoramento normalizado para a porcentagem de peso inicial em hu-PBL-NSG-SGM3 camundongos injetados com PBMC de um doador saudável (n = 10) e paciente infectado pelo HIV (n = 12). (C) Expressão representativa (na semana 7 pós-engraftment) de HLA-DR e CD38 em CD4+ e CD8+ Células T de camundongos hu-PBL-NSG-SGM3 injetados com PBMCs de um doador saudável. Os números indicam a porcentagem de cada população. (D)Percentagens representativas de CD4+ e CD8+ células T que são HLA-DR+ CD38+ em camundongos hu-PBL-NSG-SGM3 injetados com PBMC de um doador saudável. Nota, nas células antes da injeção em camundongos, os níveis de HLA-DR+ CD38+ CD4+ e CD8+ Células T foram de 2,0% e 5,7%, respectivamente. Em B e D, a faixa mediana e interquartile é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Alterações representativas da carga viral e da relação CD4:CD8 em camundongosnulos da cadeia de meandres huNS após a infecção pelo HIV e após a introdução da TARV. (A, D) CD4:CD8 relação e plasma carga viral em huNS γ-cadeia de ratosnulos após a infecção com HIV BaL (pontos vermelhos e linha, n = 3), que foram realizados após a semana 14 de injeção com sangue do cordão umbilical CD34+ HSCd. Controles não infectados (PBS injetado) também foram incluídos (pontos verdes e linha, n = 5). (B, E) Carga viral de plasma e relação CD4:CD8 em camundongos hu-PBL-NSG-SGM3 após infecção por HIV BaL (pontos vermelhos e linha, n = 4), que foi realizada na semana 3 após injeção com PBMC de um doador saudável (modelo agudo). Também foram incluídos os controles não infectados (injetados na PBS) (pontos verdes e linha, n = 3). (C e F) Carga viral de plasma e rácio CD4:CD8 em camundongos hu-PBL-NSG-SGM3 injetados com PBMCs de um doador infectado pelo HIV (pontos vermelhos e linha, n = 9) ou doador saudável (pontos verdes e linha, n = 10) (modelo de reativação). Em todos os casos, a faixa mediana e interquartil é mostrada. Em A-C, a linha tracejada indica o limite de detecção do ensaio (150 cópias/mL). Para amostras com carga viral indetectável, um valor igual a metade do limite de detecção foi atribuído. Em D-F, a linha tracejada indica uma relação CD4:CD8 de 1. Em A, C, D e F, a caixa cinza indica o tempo com a administração da TARV. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

Avanços importantes foram alcançados no desenvolvimento de cepas de camundongos imunodeficientes para a humanização, com uma série de opções diferentes que podem ser usadas de acordo com o interesse da pesquisa1. Desde que aqui é um protocolo geral para a humanização de ratosnulos da cadeia de metodos e cepas geneticamente semelhantes a serem empregadas em três modelos diferentes para estudar a infecção pelo HIV. Na primeira abordagem experimental, camundongos recém-nascidos irradiados são injetados com CD34+ HSCs humanos, que podem ser derivados do sangue do cordão umbilical, fígado fetal ou sangue periférico mobilizado3,21. A irradiação apropriada de camundongosnulos da cadeia de metodos é um passo crítico, pois elimina a medula óssea do rato e outras células progenitoras, permitindo uma reconstituição eficiente das populações de células humanas. No entanto, alguns relatos evidenciaram a reconstituição de células humanas em diferentes cepas de camundongos, sem irradiação27. A este respeito, devem ser fornecidas doses adequadas de irradiação, uma vez que os camundongosnulos da cadeia de metodos são radiosensíveis, e a alta irradiação de γ-irradiation pode induzir o linfogémia timico21,28.

Outras etapas críticas e fatores que podem afetar o nível de enxenxerto incluem a via de injeção (intrahepática, intravenosa, intracardiac), idade de camundongos, percentual de pureza de CD34+ HSCs e experiência do operador29. Na segunda e terceira abordagens baseadas em modelos de camundongosnulos hu-PBL-NS, alguns fatores críticos incluem a via de injeção (intraperitoneal, intravenosa, intrasplenic), idade dos camundongos e número de células humanas injetadas, o que pode influenciar o nível final de enxerto. Em relação a este último fator, vários estudos têm utilizado 5-10 x 106 PBMCs para enxerto22,23,30,enquanto o protocolo atual sugere o uso de 3,5 x 106 PBMCs. De notar, esse número de células é suficiente para a reconstituição das células T e para a replicação do HIV, tanto nos modelos agudos quanto de reativação, e também atrasa o desenvolvimento do GVHD23. No entanto, os investigadores devem otimizar as condições de humanização de acordo com os objetivos da pesquisa. Além disso, é importante validar a cepa hiv usada para infecção de camundongosnulos da cadeia de metodos com massa de huNS. Aqui, a cepa R5 tropic HIV-1 BaL é usada, que produz altos níveis de replicação viral em camundongosnulos da cadeia de metodos com chapas de huNS. Outras cepas de repórter, como aquelas que contêm luciferase ou proteínas fluorescentes, também são adequadas para análise de células únicas de células infectadas pelo HIV31.

No geral, três grandes limitações são evidenciadas em modelos de camundongosnulos da cadeia de meandres huNS após enxerto com CD34+ HSC. Primeiro, devido à ausência de um ambiente de tímico humano, as células T são educadas no contexto das moléculas de Murine MHC, restringindo a estimulação específica de antígeno subsequente através de seus receptores de células T. Esta questão limita o uso de modelos de camundongosnulos da cadeia de ns para estudar a resposta de células T específicas ao HIV. No entanto, essa limitação pode ser superada pelo uso de camundongos BLT ou camundongosnulos da cadeia de metodos com ns com expressão transgênica de moléculas HLA16,17. Em segundo lugar, normalmente há má reconstituição das populações mieloides em modelos de camundongosnulos da cadeia de ns, limitando o estudo desses subconjuntos que têm relevância no contexto da apresentação de antígenos e patogênese da infecção pelo HIV14,15. Neste caso, recomenda-se o uso de cepas de camundongos com expressão transgênica de fatores hematopoiéticos8,15,32.

Em terceiro lugar, há um 1) mau desenvolvimento de estruturas do folículo linfóide nos tecidos linfóides secundários e 2) falta de tecidos linfóides terciários, que está relacionado com os baixos níveis de células imunes inatas (ou seja, células dendríticas em camundongosnulos da cadeia de casíncitos huNS) que são fundamentais para o desenvolvimento de folículos33. Esta questão está associada a uma má resposta humoral em huNS γ-cadeianulo modelosde camundongos 34. No entanto, alguns relatos evidenciaram o desenvolvimento de estruturas semelhantes a folículos em camundongos nulos huNS divisão decorrelação 4, enquanto as células T foliculares confinadas em glóbulos e linfáticos (expressando o receptor de quimiokine de folículo-homing CXCR5) são detectadas em camundongosnulos da cadeia de metodolse sancionais huNS e cepas relacionadas15). Mais uma vez, o uso de 1) camundongos BLT ou 2) cepas de camundongos com expressão transgênica de fatores hematopoiéticos e/ou com expressão de moléculas hla pode melhorar a reconstituiçãodas populações mieloides, desenvolvimento de estruturas linfoidas secundárias e terciárias organizadas e respostas eficazes de células T e células B8,35,36.

Semelhante às limitações dos modelos de camundongos nulos de cadeia de nstanoizados NS, antígeno e S.C., há uma falta de respostas de célulaS T e humoras específicas por antígenos, ausência de populações mieloides e estruturas linfoidas organizadas em camundongosnulos da cadeia de metodols de hu-PBL-NS. Além disso, uma importante limitação do modelo de camundongo nulo hu-PBL-NS-cadeiade metodolque (modelos agudos e reativação da infecção pelo HIV) é a janela curta para monitoramento, uma vez que esses camundongos desenvolvem GVHD xenogênico23. O desenvolvimento da GVHD também pode induzir alterações perenotípicas e funcionais indesejadas das populações imunes, inerentes ao processo patogênico23,37. No entanto, este modelo tem a vantagem de ser mais simples e mais acessível, especialmente considerando que os PBMCs humanos são mais facilmente adquiridos de doadores saudáveis ou infectados pelo HIV38. Além disso, a injeção de células primárias diretamente dos pacientes é útil para o estudo de condições celulares ou patogênicas intrínsecas do doador, como mutações de resistência a medicamentos virais ou alterações imunológicas específicas do doador. De notar, para o modelo de reativação, ensaios in vitro com agentes de reativação do HIV podem ser realizados para corroborar a resposta dos PBMCs antes da injeção em camundongos39. Outra limitação para algumas instituições é que este trabalho requer instalações BSL2+ para lidar com animais infectados pelo HIV devido a regulamentos.

Os modelos de camundongosnulos da cadeia huNS tiverem algumas vantagens em comparação com outros modelos animais para o estudo da infecção pelo HIV, como primatas não humanos infectados pelo vírus da imunodeficiência símia. Por exemplo, camundongos nulos da cadeia de metodos huNSpermitem a criação de nocautes genéticos ou cepas transgênicas, o que permite a avaliação de alvos genéticos específicos. Além disso, o uso de células humanas primárias em camundongosnulos da cadeia de metodos ehuNS evita possíveis restrições específicas de espécies, como o caso de genes estimulados por interferon em primatas não humanos, o que pode influenciar a resposta antiviral e o curso da infecção40. Assim, a cinética da infecção é altamente consistente entre camundongosnulos da cadeia de metodos com massa de gisso. Finalmente, os modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS são menos caros, não exigem instalações centrais complexas e são mais acessíveis.

Em resumo, os modelos de camundongosnulos cd34+ hsc-humanizados e hu-PBL-NS oferecem uma variedade de possibilidades para o estudo de eventos crônicos, agudos e de reativação na infecção pelo HIV. Com o reconhecimento e a superação das limitações acima mencionadas desses modelos, o uso de camundongosnulos da cadeia de metodos podem ser uma ferramenta poderosa para estudos pré-clínicos virológicos, imunológicos e medicamentosos, bem como para edição do genoma e imunoterapias à base de células.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos internos da divisão clínica do IHV para a JCZ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

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