Summary
Beskrevet her er tre eksperimentelle tilgange til at studere dynamikken i HIV-infektion i humaniserede mus. Den første tillader studiet af kroniske infektions hændelser, mens de to sidstnævnte giver mulighed for undersøgelse af akutte hændelser efter primær infektion eller viral reaktivering.
Abstract
Humaniseret NOD/SCID/IL-2 receptor γ-kædeNull -mus rekapitulere nogle funktioner i menneskelig immunitet, som kan udnyttes i grundlæggende og præ-klinisk forskning om smitsomme sygdomme. Beskrevet her er tre modeller af humaniseret immundefekt mus til at studere dynamikken i HIV-infektion. Den første er baseret på intrahepatisk injektion af CD34+ hæmatopoietiske stamceller i nyfødte mus, som giver mulighed for rekonstitution af flere blod og lymfoide væv-indesluttet celler, efterfulgt af infektion med en reference hiv-stamme. Denne model tillader overvågning for op til 36 uger efter infektion og er derfor kaldes den kroniske model. Den anden og tredje model omtales som de akutte og reaktiverings modeller, hvor mononukleære celler i perifert blod intraperitonealt injiceres i voksne mus. I den akutte model, celler fra en sund donor er indpodet gennem intraperitoneal rute, efterfulgt af infektion med en reference HIV-stamme. Endelig indpodes celler fra en HIV-inficeret donor under antiretroviral behandling i reaktiverings modellen via intraperitoneal-ruten. I dette tilfælde, et stoffri miljø i musen giver mulighed for virus reaktivering og en stigning i viral belastning. Protokollerne her beskriver den konventionelle eksperimentelle tilgang til humaniserede, immunodedygtige musemodeller af HIV-infektion.
Introduction
Den humaniseret NOD/scid/interleukin (Il)-2 receptor γ-kædeNull (herefter benævnt huns γ-kædeNull) musemodel har været meget anvendt til at studere patogenesen af infektioner, autoimmunitet, og kræft, samt for prækliniske undersøgelser af narkotika og human celle-baserede terapier1,2. Disse mus er baseret på en ikke-overvægtige diabetiker (NOD) baggrund, med scid mutation og målrettet MUTATION på Il-2 receptor γ-kæde locus (fælles γ-kæde til Il-2, IL-4, IL-7, Il-9, Il-15, og Il-21), som inducerer en alvorlig svækkelse i udviklingen af mus T-, B-, og naturlige Killer (NK) celler1. Således, de støtter engraftment af humant væv, Human CD34+ hæmatopoietiske stamceller (hscs), og humant perifert blod mononukleære celler (pbmcs)3,4,5. Desuden, transgene ekspression af humane hæmatopoietiske faktorer, såsom stamcellefaktor (SCF), granulocyt/makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), og Il-3 fremmer engraftment af humane myeloid populationer6,7,8.
For HIV-studier er flere huNS γ-kædeNull -musemodeller blevet beskrevet, som varierer i muse stammen, typen af humane celler, type af væv til engraftment og oprindelsen af celler (dvs. sund vs. HIV-inficerede donor)9,10. Den oprindelige stamme, dog, er meget udbredt på grund af de høje niveauer af humane celler engraftment og viral replikation efter infektion med en reference hiv stamme11,12,13. Lignende immundefekt muse stammer med transgene ekspression af humane hæmatopoietiske faktorer (f. eks. nog-exl eller NSG-SGM3) eller med implantater af humant lever og thymus væv (knoglemarvs-lever-thymus [BLT] mus) er nyttige til at evaluere rollen af myeloid populationer i anti-hiv immunrespons, virkningerne af hiv på disse væv, og deres deltagelse som virale reservoirer14,15. Desuden kan nogle stammer med transgene udtryk af humane leukocytantigen (HLA) molekyler, samt BLT-mus, anvendes til at studere T-celle respons på hiv-infektion16,17.
Generelt, i disse mus, humanisering afhænger af cellulær oprindelse, levering rute (intraperitoneal, intrahepatisk, intravenøs, intracardiac) og mus alder på tidspunktet for engraftment18,19,20. Med hensyn til cellens oprindelse, Human CD34+ HSC afledt af navlestrengsblod, føtal lever, eller mobiliseret perifert blod kan injiceres i nyfødte eller unge mus3,21. Desuden kan voksne γ-kædeNull -mus være humaniseret ved injektion af PBMC (her benævnt Hu-PBL-NS γ-ChainNull -mus), der tillader den tidsmæssige cirkulation af disse celler i blodet, sekundære lymfoide organer og betændede væv22,23,24.
Beskrevet her er en detaljeret protokol til etablering af huNS γ-kædeNull -musemodeller til studiet af hiv-infektion. Den første er den kroniske model, hvor humane CD34 + hscs afledt af navlestrengsblod fra en sund donor injiceres i nyfødte mus, efterfulgt af infektion med en reference HIV- stamme efter 14 ugers humant immunsystem rekonstitution. Denne model tillader overvågning af mus for op til ~ 36 uger efter infektion. Den anden model er en akut model, hvor Pbmc'er afledt af en sund donor injiceres i voksne NS γ-kædeNull -mus, efterfulgt af infektion med en reference hiv-stamme efter 3 ugers menneskelig T-celle ekspansion i musen. Endelig er den tredje model reaktiverings modellen, hvor Pbmc'er afledt af en HIV-inficeret donor under suppressiv antiretroviral behandling (ART) injiceres i voksne NS γ-kædedeNull -mus. I dette tilfælde, et stoffri miljø giver mulighed for viral reaktivering og stigning i den virale belastning. De to sidstnævnte modeller tillader overvågning i op til ~ 9 uger efter engraftment.
Samlet set er disse tre modeller nyttige for virologiske undersøgelser, prækliniske undersøgelser af nye lægemidler, og evaluering af HIV-infektion virkninger på den globale immunrespons. Det er også vigtigt at overveje, at brugen af HIV-inficerede, humaniserede mus kræver gennemgang og godkendelse af det institutionelle biosikkerheds udvalg (IBC) samt af Udvalget for institutionel dyrepleje og-anvendelse (IACUC) før ethvert eksperiment. Dette sikrer, at undersøgelsen følger alle interne og eksterne institutionelle regler for anvendelse af farligt biologisk materiale og human håndtering af forsøgsdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I dette arbejde blev alle dyrepasning og-procedurer udført i henhold til protokoller, der blev gennemgået og godkendt af Udvalget for institutionel dyrepleje og-anvendelse (IACUC) ved University of Maryland School of Medicine (protokolnummer 1018017, 1018018 og 0318009).
1. Human CD34+ HSC engraftment af nyfødte mus
- Brug altid engangsudstyr til personlig beskyttelse (PPE), herunder sterile scrubs, handsker, dedikerede sko, sko betræk, maske, beskyttelsesbriller, hår/skæg hjelm og sterile Lab frakker.
- Re-suspendere 1 x 106 af frosne CD34+ hscs (Se tabel over materialer) i 10 ml rpmi 1640 medier 10% FBS under et certificeret biosikkerhed kabinet og opretholde sterile forhold.
- Brug 10 μL af suspensionen til at tælle (for at sikre tilstedeværelsen af det forventede antal celler) og kontrollere cellelevedygtighed ved trypan og et blå udelukkelse farvning i et hemocytometer.
- Centrifugeres ved 400 x g i 15 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten kasseres og resuspenderes i kold 1x PBS til den ønskede koncentration (1,4 x 105 af CD34+ Hscs i 50 μl). Opbevar cellerne på is indtil injektion.
- Placer pup (NS γ-kædeNull pup af begge køn fra 1 – 4 dage gamle) i en steril 100 mm2 Petri skål sammen med en lille mængde strøelse materiale fra opdrætter bur. Derudover gnide ren strøelse mellem hænderne for yderligere at maskere eventuelle fremmede lugte på modtageren pup.
Bemærk: dette minimerer fremmede lugte, der imprægneres på hvalpenerne, hvilket forbedrer chancerne for, at mødre accepterer deres unger tilbage i bure efter proceduren. - Sæt Petri skålen i en ren transport bur og placere buret i en ren mus microisolator bur for at beskytte pup fra miljøet. Dæk transport buret med en dækplade for at undgå, at dyrene udsættes for eksternt lys, mens de er i transit til bestrålings rummet.
- Irradiate pup med 100 cGy hele kroppen bestråling (WBI) ved udsættelse for en 137 cs kilde. Rengør det indre af irradiatoren med desinfektions opløsningen, Placer musene i irradiatoren, og tænd for drejeskiven, så alle unger bestråles homogent. Luk irradiatoren, og tryk på afbryderkontakten for at starte bestrålings processen. Vent, indtil bestrålings tiden er afsluttet, og fjern straks musene.
Bemærk: da bestråling ikke genererer stress i musene, er tidligere anæstesi ikke påkrævet. - 2 – 4 h efter bestråling procedure, sted pup i et biosikkerhed kabinet inde i en kølet steril Petri skål dækket med steril gaze på is, indtil bedøvet (~ 5 – 10 min). Der opnås tilstrækkelig anæstesi, når brutto bevægelserne ophører.
- Læg sprøjten med en påsat nål (29 G, 0,5 ") med 50 μL af cellesuspensionen og 1,4 x 105 af CD34+ hscs under det certificerede biosikkerheds kabinet.
- For engraftment via hepatisk injektion, begrænse pup med tommelfingeren og pege fingre. For at minimere muse fastholdelsesanordningen (~ 30 – 45 s) skal en undersøger holde hvalpen og administrere injektionen og lade den anden investigator indlæse sprøjten med HSC-suspensionen. Rengør injektionsstedet med 70% alkohol og Levér 50 μL af cellerne direkte ind i leveren. Brug en overfladisk nål vinkel, når indsprøjtning for at undgå helt piercing leveren. Som en kontrol, injicere mus med 50 μL 1x PBS i leveren.
- Placer hvalpena på en præ-opvarmet steril Petri skål dækket med steril gaze i 1 – 5 min at tillade nyttiggørelse. Pre-Warm skålen ved hjælp af en infrarød opvarmning pad for gnavere ved 20 ° c for at sikre, at pup ikke vil blive over-varmet.
- Umiddelbart før returnere pup til deres forældre, anvende en lille mængde af mentol-og eukalyptus-baserede salve, ved hjælp af tommel-og pege fingre, til snude af begge forældre for at undgå kannibalisme eller afvisning af hvalpener.
- Check bure hver dag, på udkig efter eventuelle tegn på graft-versus-Host sygdom (GVHD) i pup såsom tør hud, ingen fodring, udslæt, og alopeci. Euthanize dyrene, hvis nogen af disse tegn er observeret.
- WEAN mus på 3 uger af alder, gruppere dem efter køn. Anbring ikke mere end 5 dyr pr. bur. Bekræft engraftment i det perifere blod ved flow cytometri ved 14 ugers alderen.
Bemærk: succesraten for engraftment er mellem 80%-100%.
2. humant PBMC-engraftment af unge mus
- For de akutte og regenererings modeller injiceres 6 – 8 ugers gamle NS γ-kædeNull -mus intraperitonealt med humane pbmcs afledt af en sund donor eller HIV-inficerede patient, der var under art, hhv. I begge modeller, omfatter mus injiceres med PBMCs fra en sund donor uden HIV-infektion (Sham) som kontrol.
- Der sættes 15 mL fuldblod i 5 mL steril tætheds gradient medium i et 50 mL konisk rør.
- Centrifuge ved 400 x g i 30 min ved rt, uden bremser, for at undgå Buffy coat fra at blive blandet med tætheden gradient medium.
- Saml forsigtigt fraktionen af mononukleare celler (mellem massefylde gradient mediet og supernatanten) og Overfør Buffy coat til et 15 mL centrifugeglas, der indeholder 10 mL 1x PBS. Centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved rt.
- Supernatanten kasseres, og de resterende røde blodlegemer fjernes ved lyserende med 5 ml ACK-buffer, som tilsættes de pelleterede celler. Inkuber i 4 minutter ved RT.
- Centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved rt. kassér supernatanten og resuspension i 10 ml 1x PBS eller rpmi 1640 medium.
- Brug 10 μL af cellesuspensionen til at tælle cellerne og kontrollere levedygtigheden ved trypan og et blå udelukkelse farvning i et hemocytometer. Typisk, 1 – 2 x 106 celler er opnået for hver 1 ml blod, med mere end 95% levedygtighed.
- Centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved rt. kassér supernatanten, og Juster celle nummeret til den ønskede koncentration (i dette tilfælde 3,5 x 106 celler i 200 μl 1x PBS).
- Læg sprøjten med en påsat nål (28 G, 0,5 ") med 3,5 x 106 PBMCs i 200 ΜL 1x PBS under et certificeret biosikkerheds kabinet.
- Fjern musen fra buret og holde det ved halen, så det kan gribe masken, anvende blide trækkraft bagud. Derefter placere indekset og tommelfingre på skuldrene af dyret, snuppe den løse hud af halsen og ved hjælp af den midterste finger til at stabilisere ryggen.
- Skub musen hovedet tilbage, så ryggen er overhovedet. Dette gør det muligt for organer i bughulen at blive forskubbet bagud og reducerer risikoen for punktering af de indre organer under injektionen.
- Rengør injektionsstedet med 70% alkohol.
- Trænge ind i sprøjten, der anvendes i trin 2,9 gennem bugvæggen og Aspirér før injektion af cellerne, hvis noget materiale aspireres, skal du fjerne sprøjten og kassere den. Ellers injiceres cellerne langsomt i intraperitoneal hulen, Fjern sprøjten og kassér den. Injicer 1x PBS for at styre mus.
- Returner dyret til dets bur.
- Verificer engraftment i perifert blod ved flow cytometri efter 3 ugers injektion.
3. pleje efter engraftment
- Identificer mus ved øremærkning.
- Observere musene, der anvendes i disse eksperimenter tæt 2x per dag efter hver procedure for kliniske tegn på angst.
- Efter transplantation af humane celler, Overvåg mus for GVHD. Til overvågning af GVHD symptomer hos nyfødte, unge og voksne mus, evaluere dyr for udseendet af hudsygdom (dvs. farve, tørhed, udslæt, alopeci), foruden kropsvægt foranstaltning. Evaluere dyr, der viser disse tegn af en dyrlæge til at overveje tidlig eutanasi.
4. HIV-infektion procedure og Sham infektion procedure
Bemærk: for de kroniske og akutte modeller, mus er inficeret med HIV-BaL referencestamme i uge 14 og uge 3 post-engraftment, hhv. Injektioner med HIV administreres intraperitonealt ind i de nedre abdominale kvadranter.
- Udfør lastning processen af virus/PBS i sprøjter, ved hjælp af en 28 G 0,5 "nål, i BSL2 kabinetter efter ABSL2 procedurer. Den totale mængde virus, der injiceres, er 15.000 median vævskultur infektiøs dosis (TCID50) i 200 ΜL STERIL rpmi 1640.
- Fjern musen fra buret og hold den ved halen, så den kan gribe masken, anvende blide trækkraft bagud. Derefter placere pegefingeren og tommelfingeren på skuldrene af dyret, snuppe den løse hud i halsen og ved hjælp af den midterste finger til at stabilisere ryggen.
- Skub musen hovedet tilbage, så ryggen er overhovedet. Dette gør det muligt for organer i bughulen at blive forskubbet bagud og reducerer risikoen for punktering indre organer under injektion.
- Rengør musene med en præ-befugtet sprit pude i nederste venstre/højre kvadrant i maven. Injicer 15.000 TCID50 af hiv-BaL-virus indeholdt i 200 ΜL STERIL rpmi 1640.
- Efter injektion skal du returnere musen til sit hjem bur.
5. blod opsamling ved retroorbital punktering
Bemærk: Retroorbital blødning giver mulighed for hurtig samling af blod, hvilket reducerer den samlede indsamlings tidspunkt og øger stabiliteten af humane lymfocyt markører. Brug EDTA rør til at indsamle mus blod.
- I den kroniske model, ved 14 uger efter HSC injektion, indsamle blodet via retroorbital vene. I de akutte og reaktiverings modeller, udføre denne procedure på 3 uger post-PBMC injektion.
- Anæstetisere dyrene ved hjælp af 250 μl isofluran indånding før blod opsamling i en biosikkerheds hætte klasse B2, der er kanaliseret klima eksternt.
- Isofluranen dispenserer i bomulds puder under et trådnet i en klar 1 L krukke i et biosikkerhedskabinet, der er ventileret uden for bygningen. Brugen af masken sikrer, at dyrene ikke kontakter isofluran-Soaked pad, som kan forårsage hudirritation og potentiel overdosering, da isofluran også absorberes gennem huden. Også sætte et blødt papir håndklæde mellem mesh og dyr for at undgå lemmer skader.
- Når krukken er mættet med isofluran (ca. 1 min efter tilsætning), introducere dyret og observere respiratorisk hastighed, som vil stige derefter falde. Check for den kliniske indikation af en dyb plan af anæstesi, som omfatter manglen på en opretnings refleks (ved deponering krukke forsigtigt) og mangel på brutto bevægelser. Start blødningen procedure, så snart dyret er helt afslappet og mangler tåen knivspids refleks.
Bemærk: da isofluran fordamper, dispenserer flere lægemidler, hvis der ikke observeres tegn på anæstesi. - For retroorbital blødning, skal du trykke musen ekstern jugulære vene caudal til mandiblen med tommelfingeren, og med den samme hånd, forsigtigt løfte det øvre øjenlåg med pegefingeren.
- Indsæt et hæmatokrit rør i den mediale canthus af øjet og dirigere det i en ventrolaterale retning, indtil blodet begynder at fluxing.
- Saml mindst 100 μL blod. Når den ønskede mængde blod er opnået (et volumen ikke mere end 1% af dyrets legemsvægt), afbryde det udvendige jugulære tryk og fjerne hæmatokrit røret.
- Forsikre, at hæmostase er komplet ved at anvende det direkte tryk på øjet ved hjælp af en steril gaze i mindst 30 s.
- Påfør tetracain dråber i øjet. Overvåge dyret, indtil det er helt genvundet fra anæstesi og placere den tilbage i buret.
Bemærk: 100 μL af indsamlet blod anvendes til evaluering af niveauet af engraftment af human CD45+ og andre blodlegemer populationer, samt til evaluering af plasma viral Load.
6. screening af engraftment-niveau og flow cytometri-analyse
- Følg en konventionel flow flowcytometri-farvnings protokol for fuldblod, som omfatter inkubation af fluorokrom-mærkede anti-humane antistoffer (for foreslået flow panel, se tabel over materialer), efterfulgt af lyse af røde blodlegemer og vaske trin13,15.
Bemærk: til screening af niveauet af engraftment, omfatte en anti-Human CD45 antistof. Til sammenligningen kan der også anvendes et anti-Mouse CD45-antistoffer. Inkluder kompensations kontrol såvel som en menneskelig blodprøve farvet med samme antistof sammensætning, uplettet mus og humane blodprøver og ikke-humaniseret kontrol for at teste reagenserne på tværs af reaktivitet. Efter farvning, er der altid nogle baggrunds signal; alle positive signaler adskiller sig imidlertid klart fra negative og tvær reaktive kontroller. - I et passende flow cytometer, erhverve mindst 10.000 hændelser på lymfocyt Gate (FSC-A vs. SSC-a). For flow cytometri analyse, efter duplikeret udelukkelse, bestemme procentdelen af humane CD45+ celler samt andre cellepopulationer af interesse.
7. evaluering af plasma virusbelastning
- Vurder den virale belastning i HIV-inficerede dyr 1x pr. uge efter infektion.
- Efter retroorbital blødning (ca. 100 μL), opnås plasma ved at samle supernatanten efter centrifugering af det blod fortyndede blodet ved 3.500 x g i 3 minutter i en mikrocentrifuge. Pellet bruges til blod celle fænoskrivning.
- Brug et kommercielt viral RNA-ekstraktions udstyr (Se tabel over materialer) for at opnå RNA fra 40 μl plasma.
- Konverter RNA til cDNA ved hjælp af den første stamme syntese mix (Se tabel over materialer) og hiv gag primer SK431.
- Udfør kvantitativ real-time PCR ved hjælp af hiv-gag primere SK38/SK39 og fluorescerende grønne farvestoffer (f. eks. sybr grøn) som beskrevet i tidligere undersøgelser13,25.
8. administration af antiretroviral behandling
- Administrere oral ART mindst 3 uger efter infektion, når høj viral belastning observeres, i de kroniske, akutte, og reaktiverings modeller.
- Doserne af tenofovirdisoproxilfumarat (TDF), emtricitabin (FTC) og raltegravir (RAL) beregnes i henhold til km værdier på 37 og 3 for mennesker og mus, henholdsvis26. Typisk, de humane-ækvivalente doser af TDF, FTC, og RAL er 61,7 mg/kg/dag, 40,7 mg/kg/dag, og 164 mg/kg/dag, hhv.
- Til administration i drikkevand, knuse medicin tabletter og tilsæt den respektive mængde i vandflasken, sikre, at hver mus i buret erhverver sin daglige dosis. Da lægemiddel pulveret kan danne sediment i flasken, ryste vandflasken periodisk for at opnå homogen suspension.
- Skift vandflasken hver uge med frisk opløste stoffer.
- Indsamle blodet via retroorbital vene hver uge eller hver 2 uger efter kunst initiering at evaluere ændringer i viral Load og CD4: CD8 ratio.
9. mus eutanasi, indsamling af sekundære lymfoide organer, og isolering af mononukleare celler
- Eutanasi udføres i de tre humaniserede musemodeller, periodisk langs infektionstiden, eller ved afslutningen af eksperimentet.
- Udfør eutanasi af voksne mus ved CO2 kvælning, efterfulgt af livmoderhalsen dislokation. For kvælning, brug et ikke-forladet kammer, dispensere CO2 fra en kommerciel cylinder med fast trykregulator og i linje restriktor kontrollere gasstrømmen inden for 20%-30% af kammeret volumen/minut for at overholde 2013 avma retningslinjer.
- Opretholde CO2 flow for > 60 s overvågning respirationsstop (som kan tage op til 5 min), efterfulgt af livmoderhalsen dislokation at forsikre eutanasi.
- Euthanize nyfødte < 7 dage gammel ved en fysisk metode (dvs. ved hjælp af skarp saks).
- Visualisere axillær, mediastinal, og mesenteriske lymfeknuder (som typisk observeres) og udtrække dem med pincet og skarp saks. Også ekstrakt milten, placeret i øverste venstre side af peritonealdialyse hulrum.
- Det lymfoide væv aflejes i 1,5 mL centrifugeglas indeholdende sterilt RPMI 1640 medium.
- Straks behandle lymfoide væv i en 70 mm porestørrelse nylon celle Strainer, indsamle cellerne i en 50 mL rør. Du må ikke aspirere vævene.
- Cellerne vaskes med 5 mL RPMI 1640-medium suppleret med 1% FBS for at lette cellefiltrering.
- Efter vævs disaggregation centrifugeres cellerne suspension ved 3.500 x g i 10 minutter i en mikrocentrifuge.
- Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes med 500 μL 1x PBS.
- Cellerne opslæmning overføres til et 1,5 mL centrifugeglas, der indeholder 500 μL steril tætheds gradient medium.
- Der centrifugeres ved 3.500 x g i 3 minutter i en mikrocentrifuge uden bremse for at forhindre, at Buffy-belægningen blandes med massefylde gradient mediet
- Saml forsigtigt fraktionen af mononukleare celler (mellem massefylde gradient mediet og supernatanten) og Overfør Buffy coat til et 1,5 mL centrifugeglas, der indeholder 500 μL 1x PBS. Centrifugeres ved 3.000 x g i 3 min.
- Fjern de resterende røde blodlegemer ved lyserende med 500 μl ACK buffer, inkuberet i 4 min ved rt.
- Centrifugeres ved 3.000 x g i 3 min. kassér supernatanten og resuspension i 1 ml 1x PBS eller medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet ovenfor, ved 14 uger efter HSC injektion (kronisk model) eller 3 uger efter PBMC injektion (akut og reaktiverings modeller), er musene blødte for screening af niveauet af humane celler engraftment ved flow cytometri. En repræsentativ gating-strategi for evaluering af 1) humane CD45+ celler rekonstitution og 2) procentdel af CD4+ og CD8+ T-celler er vist i figur 1A. Typisk varierer niveauet af engraftment (procentdel af humane CD45+ celler) fra 10%-80% efter CD34+ HSC injektion og afhænger af injektions vejen og muse stammen, blandt andre tidligere beskrevne faktorer (figur 1B). Efter PBMC injektion varierer niveauet af engraftment (procentdel af humane CD45+ eller CD3+ celler) fra 5%-65%, også med forskelle mellem muse stammerne (figur 1B). Desuden kan der observeres visse forskelle mellem mus, der injiceres med PBMC afledt af en sund versus en HIV-inficeret donor, (figur 1D). Normalt, for HIV-infektion, niveauer af engraftment over 5%-10% er nok til aktiv viral replikation.
Det er vigtigt, at en Karakteristik af Hu-PBL-NS γ-ChainNull -musemodeller er udviklingen af xenogene gvhd inden for få uger efter celle engraftment, på grund af den humane T-celle genkendelse af murine Major komplekse Complex (MHC) molekyler23. Denne proces er indlysende, selv efter 3 uger efter PBMC injektion, af tegn såsom hår og vægttab (figur 2A, B), samt af den øgede ekspression af aktiverings markører i T-celler som HLA-DR og CD38 (figur 2C, D). På den anden side er GVHD mere langsomt udviklet i mus injiceres med human CD34+ HSC og er direkte korreleret med det oprindelige niveau af engraftment.
Efter HIV-infektion er der en hurtig stigning i plasma virusbelastningen, som sædvanligvis detekteres efter 2 – 3 uger efter infektion, både i de kroniske og akutte modeller (figur 3a, B), med lignende kinetik i Reaktiverings modellen (figur 3C). Stigningen i viral belastning falder sammen med et fald i CD4: CD8 ratio (figur 3D, E, F). Disse ændringer er ikke observeret i kontrol mus (uden HIV-infektion, figur 3). Af note, i hu-PBL-NS γ-kædeNull musemodel, en indledende INVERSION af CD4: CD8 ratio kan observeres, bliver rekonstitueret langs overvågning tid (figur 3E, F). Endelig, hvis kunst administreres til HIV-inficerede mus, en undertrykkelse af den virale belastning samt opsving i CD4: CD8 ratio forventes, at nå niveauer svarende til dem i ikke-inficerede kontroller (figur 3a, C, D, F). Typisk, efter 2 – 3 ugers behandling, et fald i viral belastning og stigning i CD4: CD8 ratio observeres i de kroniske, akutte, og reaktiverings modeller. Hvis dette ikke overholdes, skal lægemiddel doserne og administrationsvej evalueres.
Figur 1: repræsentativ gating-strategi for evaluering af engraftment-niveauerne for humane CD45+ og T-celler. A) gating-strategi, der anvendes til screening af procentdelen af humaneCD45 + (huCD45), CD3+,CD4 +og CD8+ T-celler i huns γ-ChainNull -mus, ved uge 14 efter injektion med navlestrengsblod CD34+ hscs. Tallene angiver procentdelen af hver population. B) repræsentative niveauer af engraftment (i procent af huCD45+ celler) i huns γ-kædenNull (n = 6) og en lignende immundefekt stamme med transgene ekspression af Il-3 og GM-CSF (hunog-exl, n = 6), som rapporteret tidligere15. C) repræsentative niveauer af engraftment (i procent af huCD3+ celler) i hu-PBL-NS γ-kædeNull -og hu-PBL-SGM3-mus (NS γ-kædeNull -mus med transgene EKSPRESSION af SCF, GM-CSF og Il-3), i uge 3 efter injektion med pbmcs fra en sund donor (henholdsvis akut model, n = 7 og n = 8). D) repræsentative niveauer af engraftment (i procent af huCD3+ celler) i hu-PBL-NSG-SGM3-mus efter injektion med pbmc'er fra en sund eller hiv-inficeret patient, som var under art (henholdsvis reaktiverings model, n = 10 og n = 12). I B – D angiver linjen medianen, og p-værdien af Mann-Whitney-testen vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: udvikling af GVHD i hu-PBL-NS γ-kædeNull -musemodel. (A) hårtab i to repræsentative Hu-PBL-NSG-SGM3-mus ved uge 7 efter injektion med PBMC fra en sund donor. (B) mus legemsvægt tab i hele overvågningstiden normaliseret til procentdelen af Startvægten i hu-PBL-NSG-SGM3 mus injiceres med PBMC fra en sund donor (n = 10) og HIV-inficerede patient (n = 12). C) repræsentativt udtryk (ved uge 7 efter engraftment) af HLA-DR og CD38 i CD4+ og CD8+ T-celler fra Hu-PBL-NSG-SGM3-mus, der injiceres med pbmc'er fra en sund donor. Tallene angiver procentdelen af hver population. D) repræsentative procentdele af CD4+ og CD8+ T-celler, der er HLA-DR+ CD38+ i hu-PBL-NSG-SGM3-mus, som injiceres med PBMC fra en sund donor. I celler før injektion i mus var niveauerne af HLA-DR+ CD38+ CD4+ og CD8+ T-celler henholdsvis 2,0% og 5,7%. I B og D vises median-og interkvartil-intervallet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative ændringer i viral Load og CD4: CD8 ratio i huNS γ-kædeNull -mus efter hiv-infektion og efter kunst introduktion. (A, D) CD4: CD8 ratio og plasma viral belastning i huNS γ-kædeNull -mus efter infektion med hiv-BaL (røde prikker og linje, n = 3), som blev udført efter uge 14 af injektion med navlestrengsblod CD34+ Hscd. ikke-inficerede kontroller (PBS-injiceres) blev også inkluderet (grønne prikker og linje, n = 5). (B, E) Plasma viral Load og CD4: CD8 ratio i hu-PBL-NSG-SGM3 mus efter infektion med HIV-BaL (røde prikker og linje, n = 4), som blev udført i uge 3 efter injektion med PBMC fra en sund donor (akut model). Ikke-inficerede kontroller (PBS-injiceret) var også inkluderet (grønne prikker og linje, n = 3). (C og F) Plasma viral Load og CD4: CD8 ratio i hu-PBL-NSG-SGM3 mus injiceres med Pbmc'er fra en HIV-inficerede donor (røde prikker og linje, n = 9) eller sund donor (grønne prikker og linje, n = 10) (reaktiverings model). I alle tilfælde vises median-og interkvartilintervallet. I A – C angiver den stiplede linje detektionsgrænsen for analysen (150 kopier/mL). Til prøver med ikke-detekterbar viral belastning blev der tildelt en værdi svarende til halvdelen af detektionsgrænsen. I D – F indikerer den stiplede linje en CD4: CD8 ratio på 1. I A, C, D og F angiver den grå boks tiden med administration af kunst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er opnået vigtige fremskridt i udviklingen af immunodedygtige muse stammer for humanisering, med en række forskellige muligheder, som kan anvendes i henhold til forskningsinteresse1. Forudsat her er en generel protokol til humanisering af NS γ-kædeNull -mus og genetisk lignende stammer, der skal anvendes i tre forskellige modeller til at studere hiv-infektion. I den første eksperimentelle tilgang injiceres bestrålede nyfødte mus med humane CD34+ hscs, som kan udledes af navlestrengsblod, føtal lever eller mobiliseret perifert blod3,21. Passende bestråling af NS γ-kædeNull -mus er et kritisk skridt, da det eliminerer musens knoglemarv og andre stamceller, hvilket muliggør effektiv rekonstitution af humane cellepopulationer. Men nogle rapporter har dokumenteret rekonstitution af humane celler i forskellige muse stammer, uden bestråling27. I denne forbindelse skal der gives passende doser af bestråling, da NS γ-kædeNull -mus er radio følsomme, og høj γ-bestråling kan inducere thymisk lymfomatose21,28.
Andre kritiske trin og faktorer, der kan påvirke niveauet af engraftment omfatter injektions vejen (intrahepatisk, intravenøs, intracardiac), mus alder, procentdel af renhed af CD34+ hscs, og operatør ekspertise29. I den anden og tredje tilgang baseret på hu-PBL-NS γ-kædeNull -musemodeller, nogle kritiske faktorer omfatter injektions vejen (intraperitoneal, intravenøs, intrasplenisk), mus alder, og antallet af humane celler injiceres, som kan påvirke det endelige niveau af engraftment. Med hensyn til sidstnævnte faktor har flere undersøgelser brugt 5 – 10 x 106 pbmcs til engraftment22,23,30, mens denne protokol foreslår anvendelse af 3,5 x 106 pbmcs. Bemærk, at dette antal celler er tilstrækkeligt til rekonstitution af T-celler og til HIVREPLIKATION, både i akutte og reaktiverings modeller, og forsinker også udviklingen af GVHD23. Ikke desto mindre bør efterforskerne optimere de humanisering betingelser i henhold til forskningsmålene. Desuden er det vigtigt at validere HIV-stammen, der anvendes til infektion af huNS γ-kædeNull -mus. Her anvendes R5 Tropic HIV-1 BaL stamme, som giver høje niveauer af viral replikation i huNS γ-kædeNull -mus. Andre reporter stammer, såsom dem, der indeholder der eller fluorescerende proteiner, er også egnet til en enkelt celle analyse af HIV-inficerede celler31.
Samlet set er der tre store begrænsninger, som fremgår af huNS γ-ChainNull -musemodeller efter engraftment med CD34+ HSC. For det første er T-cellerne på grund af fraværet af et humant thymisk miljø uddannet i forbindelse med murine MHC-molekyler, der begrunder efterfølgende antigen specifikke stimulation via deres T-celle receptorer. Dette problem begrænser brugen af NS γ-kædeNull -musemodeller til at STUDERE den hiv-specifikke T-celle respons. Ikke desto mindre kan denne begrænsning overvindes ved brug af BLT-mus eller NS γ-kædeNull -mus med transgene udtryk af HLA-molekyler16,17. For det andet er der typisk dårlig rekonstitution af myeloide populationer i NS γ-kædeNull -musemodeller, hvilket begrænser studiet af disse delsæt, der har relevans i forbindelse med antigen-præsentation og patogenese af hiv-infektion14,15. I dette tilfælde anbefales brugen af muse stammer med transgene udtryk af hæmatopoietiske faktorer8,15,32.
For det tredje er der en 1) dårlig udvikling af lymfoide follikel strukturer i det sekundære lymfoide væv og 2) mangel på tertiært lymfoid væv, som er relateret til de lave niveauer af medfødte immunceller (dvs. dendritiske celler i huNS γ-kædeNull -mus), der er afgørende for udviklingen af follikler33. Dette problem er forbundet med en dårlig humorale respons i huNS γ-kædeNull -musemodeller34. Ikke desto mindre har nogle rapporter dokumenteret udviklingen af follikel lignende strukturer i huNS γ-kædeNull -mus4, mens milt-og lymfeknude-indesluttet follikulært T-celler (der udtrykker follikel-homing CHEMOKINE receptor CXCR5) detekteres i huns γ-kædeNull -mus og beslægtede stammer15). Igen, brugen af 1) BLT mus eller 2) muse stammer med transgene udtryk af hæmatopoietiske faktorer og/eller med ekspression af HLA-molekyler kan forbedre rekonstitution af myeloid populationer, udvikling af organiserede sekundære og tertiære lymfoide strukturer, og effektiv T-celle og B-celle svar8,35,36.
Svarende til begrænsningerne af CD34+ HSC-HUMANISERET NS γ-kædeNull -musemodeller, der er en mangel på antigen-specifikke T-celle og humorale svar, fravær af myeloid populationer, og organiserede lymfoide strukturer i hu-PBL-NS γ-kædeNull mus. Desuden er en vigtig begrænsning af Hu-PBL-NS γ-kædensNull -musemodel (akutte og regenererings modeller for hiv-infektion) det korte vindue til overvågning, da disse mus udvikler xenogeneisk gvhd23. Udviklingen af gvhd kan også fremkalde uønskede fænotypiske og funktionelle ændringer af immun populationer, iboende af den patogene proces23,37. Ikke desto mindre har denne model den fordel at være enklere og mere tilgængelig, især i betragtning af at humane Pbm'er er lettere erhvervet fra raske eller HIV-inficerede donorer38. Desuden er injektion af primære celler direkte fra patienter nyttig for studiet af celle-eller patogen-iboende betingelser for donor, såsom viral Drug resistens mutationer eller donor-specifikke immun ændringer. Bemærk, for reaktiverings modellen, in vitro-assays med HIV reaktiverings midler kan udføres for at underbygge responsen af PBMCs før injektion i mus39. En anden begrænsning for nogle institutioner er, at dette arbejde kræver BSL2 + faciliteter til at håndtere HIV-inficerede dyr på grund af regler.
HuNS γ-kædenNull -musemodeller har nogle fordele i forhold til andre dyremodeller til at studere hiv-infektion, såsom ikke-menneskelige primater inficeret med Simian immundefektvirus. For eksempel, huNS γ-ChainNull -mus tillader oprettelse af gen knockout eller transgene stammer, som tillader evaluering af specifikke genmål. Desuden undgår brugen af primære humane celler i huNS γ-kædeNull -mus mulige artsspecifikke begrænsninger, såsom tilfælde af interferon-stimulerede gener i ikke-humane primater, som kan påvirke det antivirale respons og infektionsforløbet40. Således er infektionens kinetik meget konsistent mellem huNS γ-kædedeNull -mus. Endelig huNS γ-kædeNull -musemodeller er billigere, ikke kræver komplekse kernefaciliteter, og er mere tilgængelige.
Sammenfattende tilbyder CD34+ HSC-humanized og hu-PBL-NS γ-ChainNull -musemodeller en række muligheder for studiet af kroniske, akutte og REAKTIVERINGS hændelser i hiv-infektion. Med anerkendelsen og overvindelsen af ovennævnte begrænsninger af disse modeller, kan brugen af NS γ-kædeNull mus være et kraftfuldt værktøj til virologiske, immunologiske, og Drug prækliniske undersøgelser, samt for genomredigering og celle-baserede immunotherapies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de interne midler fra IHV Clinical division til JCZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
