Summary
本文介绍了三种研究人类小鼠HIV感染动态的实验方法。前者允许研究慢性感染事件，而后者允许研究原发感染或病毒重新激活后的急性事件。
Abstract
人性化NOD/SCID/IL-2受体+链空小鼠重述人体免疫的一些特征，在传染病的基础和临床前研究中可以加以利用。本文介绍了三种用于研究HIV感染动态的人性化免疫缺陷小鼠模型。第一种是基于CD34的肝内注射-在新生小鼠的造血干细胞，这允许重组几个血液和淋巴组织封闭细胞，其次是感染与参考HIV菌株。此模型允许在感染后长达 36 周的监测，因此称为慢性模型。第二和第三个模型称为急性和再激活模型，其中外周血单核细胞在成年小鼠中腹中注射。在急性模型中，来自健康供体的细胞通过腹管内途径移植，然后感染参考HIV菌株。最后，在复活模型中，来自抗逆转录病毒疗法的受艾滋病毒感染捐赠者的细胞通过腹内途径进行移植。在这种情况下，鼠标中的无药物环境允许病毒重新激活和增加病毒载量。此处提供的方案描述了对HIV感染的人性化免疫缺陷小鼠模型的传统实验方法。
Introduction
人性化的NOD/SCID/白细胞素（IL）-2受体+链空（以下简称huNS+链空）小鼠模型已被广泛用于研究感染、自身免疫和癌症的发病机制，以及药物和基于人体细胞的疗法1、2的临床前研究。这些小鼠基于非肥胖糖尿病（NOD）背景，在IL-2受体β链位点（IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21）的共发β链上具有杀伤性突变和靶向突变，这在小鼠T-、B-和自然杀伤细胞（NK）的发育中引起严重损害。因此，它们支持人体组织、人类CD34+造血干细胞（HSCs）和人类外周血单核细胞（PBMC）3、4、5的移植。 此外，人类造血因子的转基因表达，如干细胞因子（SCF）、粒细胞因子/巨噬细胞菌群刺激因子（GM-CSF）和IL-3促进人类骨髓群6、7、8的移植。
在HIV研究中，描述了几种HuNS-链空小鼠模型，这些模型在小鼠菌株、使用的人类细胞类型、用于移植的组织类型以及细胞的来源（即健康与） 之间有所不同。HIV感染者）9日，10日。原始菌株，然而，被广泛使用，由于高水平的人体细胞移植和病毒复制后感染与参考HIV菌株11，12，13。具有人类造血因子（如NOG-EXL或NSG-SGM3）或植入人类肝脏和胸腺组织（骨髓-肝-胸腺[BLT]小鼠）的类似免疫缺陷小鼠菌株，对于评估骨髓群在抗HIV免疫反应中的作用、HIV对这些组织的影响及其作为病毒库的参与非常有用。此外，一些具有转基因表达的人类白细胞抗原（HLA）分子，以及BLT小鼠，可用于研究T细胞对HIV感染的反应16，17。
一般来说，在这些小鼠中，人性化取决于细胞来源、分娩途径（腹内、内肝、静脉内、心脏内）和小鼠年龄，在移植时为18、19、20。关于细胞来源，从脐带血、胎儿肝脏或动员的外周血中提取的人类CD34+HSC可注射在新生儿或幼鼠3、21。此外，成人β链空小鼠可以通过注射PBMC（这里称为hu-PBL-NS+链空小鼠）进行人体化，允许这些细胞在血液、继发性淋巴器官和发炎组织22、23、24中进行时间循环。
本文介绍了建立HUNS+链空鼠模型以研究HIV感染的详细方案。第一种是慢性模型，其中从健康供体脐带血中提取的人类CD34+HC被注射到新生小鼠中，随后在人类免疫系统重组14周后感染参考HIV菌株。此模型允许在感染后长达 36 周对小鼠进行监测。第二个模型是急性模型，其中从健康捐赠者中提取的PBMC注射到成年NS+链空小鼠中，随后在小鼠中人类T细胞扩张3周后感染参考HIV菌株。最后，第三个模型是重新激活模型，其中从受艾滋病毒感染的捐赠者在抑制性抗逆转录病毒疗法（ART）下获得的PBMC注射到成人NS+链空小鼠中。在这种情况下，无药物环境允许病毒重新激活和增加病毒载量。后两种模型允许在移植后长达 9 周的监测。
总体而言，这三种模型对于病毒学研究、新药临床前研究以及HIV感染对全球免疫反应的影响评估都很有用。还必须考虑，使用感染艾滋病毒的人性化小鼠需要机构生物安全委员会（IBC）以及机构动物护理和使用委员会（IACUC）在进行任何实验之前进行审查和批准。这确保了该研究遵循所有内部和外部机构条例，规定使用危险生物材料和人道处理实验动物。
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Protocol
在这项工作中，所有动物护理和程序都按照马里兰大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准的协议进行（协议号1018017、1018018和0318009）。
1. 人类CD34=新生小鼠的HSC移植
- 始终使用一次性个人防护设备 （PPE），包括无菌磨砂、手套、专用鞋、鞋套、面罩、护目镜、头发/胡须发动机罩和无菌实验室外套。
- 在 10 mL 的 RPMI 1640 介质 10% FBS 中，在经过认证的生物安全柜下重新悬浮 1 x 106冷冻 CD34+ HSC（材料表），并保持无菌状态。
- 使用10μL的悬浮液计数（以确保细胞数量的预期数量），并通过在血细胞计中试青排除染色来检查细胞的生存能力。
- 在室温 （RT） 下，在 400 x g下离心 15 分钟。丢弃上清液，在冷1x PBS中重新悬浮至所需浓度（CD34的1.4 x 105 + 50 μL 中的HSCs）。将细胞放在冰上直到注射。
- 将幼犬（NS + 链从 1⁄4 天起的性别空幼崽）放入无菌的 100 mm2 Petri 盘中，以及饲养员笼中的少量床上用品。此外，在手之间擦干净床上用品，以进一步掩盖接收者小狗身上的任何异味。
注意：这最大限度地减少了被浸没在小狗身上的异味，从而增加了母亲在手术后接受其小狗回到笼子里的机会。 - 将培养皿放入干净的运输笼中，将笼子放在干净的小鼠微隔离笼中，以保护幼崽免受环境影响。用盖垫盖住运输笼，避免动物在运输至辐照室时暴露在外部光线下。
- 照射100 cGy全身照射（WBI）的小狗，暴露于137摄氏度源。用消毒液清洁辐照器内部，将小鼠放在辐照器中，然后打开转盘，使所有小狗都均匀地照射。关闭辐照器并按下电源开关以启动辐照过程。等待，直到辐照时间完成，并立即取出小鼠。
注：由于辐照不会在小鼠中产生压力，因此不需要以前的麻醉。 - 照射后2~4小时，将幼崽放在生物安全柜中，放入冰封无消毒纱布的冷冻无菌培养皿中，直到麻醉（约5~10分钟）。当总运动停止时，可以充分麻醉。
- 在认证的生物安全柜下，用连接的针头（29 G，0.5"）装载注射器，其中50 μL的细胞悬浮液和1.4 x 105的CD34+ HSC。
- 对于通过肝注射的移植，用拇指和食指约束小狗。为了尽量减少鼠标限制（±30~45秒），让一名调查员抱住小狗并注射，让第二个调查员用HSC悬架装载注射器。用70%酒精清洁注射部位，并将50μL的细胞直接输送到肝脏。注射时使用浅针角，以避免完全刺穿肝脏。作为对照，将小鼠50μL的1xPBS注射到肝脏中。
- 将幼崽放在预加热的无菌培养皿上，用无菌纱布覆盖1⁄5分钟，以便恢复。在20°C下为啮齿动物使用红外加热垫预加热，以确保幼崽不会过度加热。
- 在将幼崽送回父母之前，立即使用拇指和食指对父母双方进行少量薄荷和白玉兰软膏，以避免吃人或拒绝幼崽。
- 每天检查笼子，在小狗中寻找移植物与宿主疾病（GVHD）的任何迹象，如皮肤干燥、无喂食、皮疹和脱发。如果观察到任何这些迹象，则对动物实施安乐死。
- 在3周大时将小鼠分在一组。每个笼子放置的动物不要超过5只。在14周龄时通过流动细胞测定法验证外周血液的移植。
注：移植成功率在80%~100%之间。
2. 幼鼠的人类PBMC移植
- 对于急性和再激活模型，分别注射6~8周大的NS+链空小鼠，分别从健康捐赠者或HIV感染患者体内注射从健康捐赠者或HIV感染患者身上获得的PBMC。在这两种模型中，包括从健康捐赠者身上注射PBMC的小鼠，没有HIV感染（sham）作为对照。
- 将15mL的全血在5mL的无菌密度梯度培养基中放入50 mL锥形管中。
- 在 RT 下以 400 x g离心 30 分钟，无需踩刹车，以避免布漆与密度梯度介质混合。
- 仔细收集单核细胞（密度梯度介质和上清液之间的）的分数，并将布皮涂层转移到含有10 mL 1x PBS的15 mL离心管中。在 RT 下以 300 x g离心 10 分钟。
- 丢弃上清液，并通过向颗粒细胞中加入5 mL的ACK缓冲液来清除剩余的红血球。在 RT 孵育 4 分钟。
- 在RT下以300 x g离心10分钟。丢弃上清液，在10 mL的1x PBS或RPMI 1640介质中重新悬浮。
- 使用细胞悬浮液的10μL来计数细胞，并通过在血细胞计中试青排除染色来检查其可行性。通常，每1mL的血液获得1⁄2 x 106个细胞，可存活率超过95%。
- 在RT处以300 x g离心10分钟。丢弃上清液，并将细胞数调整到所需的浓度（在这种情况下，3.5 x 106个细胞在200 μL的1x PBS中）。
- 在经认证的生物安全柜下，用连接的针头（28 G，0.5"）与 3.5 x 106的 PBMC 一起装入 200 μL 的 1x PBS 中的注射器。
- 将鼠标从笼子中取出，用尾巴握住鼠标，以便它能够抓住网格，向后施加柔和的牵引。然后，将食指和拇指放在动物的肩膀上，抓住颈部松弛的皮肤，并用中指稳定背部。
- 向后滑动鼠标头，使其背面位于头部上方。这允许腹腔内内脏向后移位，并降低注射期间刺穿内脏的风险。
- 用 70% 酒精清洁注射部位。
- 在注射细胞前，将步骤 2.9 中使用的注射器穿透腹壁并吸气，如果有任何材料被吸出，则取出注射器并丢弃。否则，将细胞缓慢注射到腹腔内，取出注射器并丢弃。注射1xPBS来控制小鼠。
- 把动物送回笼子里。
- 在注射后3周内通过流动细胞测定法验证外周血液的移植。
3. 移植后护理
- 通过耳部标记识别小鼠。
- 观察这些实验中使用的小鼠，每次手术后每天2次密切观察临床痛苦迹象。
- 人体细胞移植后，监测小鼠的GVHD。为了监测新生儿、幼鼠和成年小鼠的GVHD症状，除了体重测量外，还评估动物出现皮肤病（即颜色、干燥、皮疹、脱发）。评估兽医显示这些迹象的动物，以考虑早期安乐死。
4. 艾滋病毒感染程序和虚假感染程序
注：对于慢性和急性模型，小鼠分别在第14周和第3周感染HIV BaL参考菌株。注射艾滋病毒在腹腔内注射到下腹部象限。
- 按照ABSL2程序，在BSL2机柜中使用28G 0.5"针将病毒/PBS加载到注射器中。注射的病毒总量为15，000中位组织培养感染剂量（TCID50），在无菌RPMI1640的200μL。
- 将鼠标从笼子中取出，用尾巴握住鼠标，以便它能够抓住网格，向后施加柔和的牵引。然后，将食指和拇指放在动物的肩膀上，抓住颈部松弛的皮肤，并用中指稳定背部。
- 向后滑动鼠标头，使其背面位于其头部上方。这允许腹腔内内脏向后移位，并降低注射期间穿刺内脏的风险。
- 在腹部左下/右象限用预湿酒精垫清洁小鼠。注射15，000 TCID50的HIV BaL病毒，该病毒包含在200μL无菌RPMI 1640中。
- 注射后，将鼠标返回到其家庭笼子。
5. 通过逆行穿刺采集血液
注：逆轨出血允许快速采集血液，从而减少整体采集时间，提高人类淋巴细胞标记的稳定性。使用 EDTA 管收集小鼠血液。
- 在慢性模型中，在HSC注射后14周，通过逆轨道静脉采集血液。在急性和再激活模型中，在PBMC注射后3周执行此程序。
- 在生物安全罩 B2 类（外部管道）中采集血液之前，使用 250 μL 的亚散二醇吸入对动物进行麻醉。
- 在建筑物外通风的生物安全柜中，将无卢兰放入铁丝网下的棉垫中。使用网格可确保动物不接触肌胶浸垫，这可能会导致皮肤刺激和潜在的过度用药，因为肌胶也通过皮肤被吸收。此外，在网眼和动物之间放一条软纸巾，以避免四肢受伤。
- 一旦罐子饱和了异苯可联（添加后约1分钟），引入动物并观察呼吸速率，呼吸速率会增大，然后降低。检查麻醉深平面的临床指示，包括缺乏正确的反射（轻轻倾斜罐子）和缺乏粗运动。一旦动物完全放松，缺乏脚趾捏反射，立即开始出血程序。
注：由于无卢兰蒸发，如果没有发现麻醉迹象，则多配药。 - 对于逆行出血，用拇指将鼠标外部颈静脉压到下颌，用同一只手，用食指轻轻抬起上眼睑。
- 将血球管插入眼睛的中直管，并引导其向腹侧方向，直到血液开始流动。
- 收集至少100μL的血液。一旦获得所需的血液量（体积不超过动物体重的1%），停止外部血管压力并取出血球管。
- 确保赫比塞完全，使用无菌纱布对眼睛施加直接压力至少30s。
- 在眼睛中涂抹四丁酸滴。监测动物，直到它完全从麻醉中恢复，并将其放回笼子里。
注：采集的血液的100μL用于评估人类CD45和其他血细胞的移植水平，以及评价血浆病毒载量。
6. 移植水平和流式细胞测定分析的筛选
- 遵循全血常规流式细胞测定染色方案，包括培养含氟铬标记的抗人抗体（对于建议的流动面板，见材料表），然后是红血球的解毒和洗涤步骤13，15。
注：用于筛查移植水平，包括抗人CD45抗体。为了进行比较，也可以使用抗小鼠CD45抗体。包括补偿控制以及沾有相同抗体混合物的人体血液样本、未染色的小鼠和人血样本，以及非人性化控制，以测试试剂的交叉反应性。染色后，总会有一些背景信号;但是，所有正信号都明显与负数和交叉反应控制区分开来。 - 在适当的流式细胞仪中，在淋巴细胞门上获取至少 10，000 个事件（FSC-A vs. SSC-A）。对于流式细胞测定分析，在重复排除后，确定人类CD45+细胞以及其他感兴趣的细胞群的百分比。
7. 血浆病毒载量评估
- 评估感染后每周1次的HIV感染动物的病毒载量。
- 在逆轨出血（约100μL）后，在微离心机中，在3，500 x g下收集抗凝血离心后，收集上清液，获得血浆3分钟。该颗粒用于血细胞象型。
- 使用商业病毒RNA提取试剂盒（见材料表）从40μL血浆中获取RNA。
- 使用第一个菌株合成混合物（见材料表）和HIV引物SK431将RNA转化为cDNA。
- 使用HIVGag引物SK38/SK39和荧光绿色染料（例如，SYBR绿色）进行定量实时PCR，如先前研究13、25所述。
8. 抗逆转录病毒疗法的管理
- 在慢性、急性和复活模型中，在感染后至少3周，当观察到高病毒载量时，管理口服ART。
- 根据人类和小鼠的Km值37和3，计算特诺福韦非氟辛酸（TDF）、埃特里比尼（FTC）和拉勒特格拉维尔（RAL）的剂量。通常，TDF、FTC 和 RAL 的等效剂量分别为 61.7 毫克/千克/天、40.7 毫克/千克/天和 164 毫克/千克/天。
- 在饮用水中给药时，粉碎药物片剂，并在水瓶中加入相应量，确保笼中每只小鼠获得每日剂量。由于药粉可能在瓶中形成沉淀物，定期摇动水瓶，实现均匀悬浮。
- 每周用新溶解的药物更换水瓶。
- 每周或抗逆转录病毒启动后每2周通过逆轨静脉采集血液，以评估病毒载量和CD4：CD8比率的变化。
9. 小鼠安乐死、收集继发性淋巴器官和分离单核细胞
- 安乐死在三个人性化的小鼠模型中执行，定期沿着感染时间进行，或在实验结束时进行。
- 通过CO2窒息对成年小鼠进行安乐死，然后进行宫颈脱位。对于窒息，使用非预充电腔室，从带有固定压力调节器的商业气缸中分配CO2，并在线限制器将气体流量控制在腔室体积/分钟的 20%-30%以内，以符合 2013 年 AVMA 准则。
- 保持CO2流量，以监测呼吸停止（可能需要长达5分钟），然后是宫颈脱位，以确保安乐死。
- 用物理方法（即使用锋利的剪刀）使新生儿使用<7天。
- 可视化的开形、中度和淋巴结（通常观察到），用钳子和锋利的剪刀提取它们。也提取脾脏，位于围肠腔的左上角。
- 将淋巴组织沉积在含有无菌 RPMI 1640 介质的 1.5 mL 离心管中。
- 立即在70毫米孔径尼龙细胞滤网中处理淋巴组织，在50 mL管中收集细胞。不要吸气组织。
- 用 5 mL 的 RPMI 1640 介质洗涤细胞，辅以 1% FBS，以方便细胞过滤。
- 组织分解后，将细胞悬浮在3，500 x g的微离心机中10分钟。
- 丢弃上清液，用 500 μL 的 1x PBS 重新悬浮细胞。
- 将细胞悬浮液转移到含有500μL无菌密度梯度培养基的1.5 mL离心管中。
- 在微型离心机中，在 3，500 x g下离心 3 分钟，无需制动，以防止布漆与密度梯度介质混合
- 仔细收集单核细胞（在密度梯度介质和上清液之间）的分数，并将布漆转移到含有500μL1x PBS的1.5 mL离心管中。在 3，000 x g下离心 3 分钟。
- 使用 500 μL ACK 缓冲液进行乳化，在 RT 孵育 4 分钟，取出剩余的红血球。
- 在3000 x g下离心3分钟，丢弃上清液，在1mL的1xPBS或介质中重新悬浮。
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Representative Results
如上所述，在HSC注射后14周（慢性模型）或PBMC注射后3周（急性和再活化模型）时，小鼠通过流动细胞测定筛选人体细胞移植水平。图1A显示了用于评估1人CD45+细胞重组和2）CD4+和CD8+T细胞百分比的代表性门控策略。通常，移植水平（人类CD45+细胞的百分比）在CD34+HSC注射后为10%-80%，取决于注射和小鼠菌株的路线，除上述其他因素外（图1B）。PBMC注射后，移植水平（人CD45+或CD3+细胞的百分比）在5%-65%之间，也与小鼠菌株之间的差异（图1B）。此外，从健康捐赠者和受HIV感染的捐赠者身上注射PBMC的小鼠之间也存在一些差异（图1D）。通常，对于艾滋病毒感染，超过5%~10%的移植水平足以进行主动病毒复制。
重要的是，hu-PBL-NS-链空小鼠模型的一个特征是在细胞移植后几周内发展异种性GVHD，由于人类T细胞识别的鼠主要组织相容性复合物（MHC）分子23。这个过程是显而易见的，即使在PBMC注射后3周，通过症状，如头发和体重减轻（图2A，B），以及激活标记在T细胞，如HLA-DR和CD38（图2C，D）增加表达。另一方面，GVHD在注射人类CD34+HSC的小鼠中发展得更慢，与初始移植水平直接相关。
HIV感染后，血浆病毒载量迅速增加，通常在感染后2-3周后可检测到，在慢性和急性模型中（图3A，B），在重新激活模型中具有类似的动力学（图3C）。病毒载量的增加与CD4：CD8比的下降（图3D，E，F） 相吻合。在对照小鼠中未观察到这些变化（无艾滋病毒感染，图3）。值得注意的是，在hu-PBL-NS+链空鼠标模型中，可以观察到CD4：CD8比的初始反转，并沿着监测时间进行重组（图3E，F）。最后，如果对感染艾滋病毒的小鼠施用抗逆转录病毒疗法，则预期CD4：CD8比率将抑制病毒载量和恢复，达到与未感染对照水平类似的水平（图3A、C、D、F）。通常，在治疗2~3周后，在慢性、急性和复活模型中观察到病毒载量减少和CD4：CD8比增加。如果不观察到这种情况，药物剂量和施用途径需要评估。
图1：用于评估人类CD45+和T细胞移植水平的代表性门控策略。（A） 在用脐带血CD34+HC注射后的第14周，用于筛选人类CD45+（huCD45）、CD3+、CD4+和CD8+T细胞的注射策略。 这些数字表示每个人口的百分比。（B） 在 HUNS + 链空（n = 6） 和具有 IL-3 和 GM-CSF 转基因表达的类似免疫缺陷菌株（huNOG-EXL， n = 6） 中的代表性移植水平（huCD45+细胞的百分比），如前15号报告的那样。（C） 在胡-PBL-NS + 链空小鼠（NS + 链空小鼠，具有SCF、GM-CSF和IL-3的转基因表达的NS +链空小鼠）中，在健康供体注射PBMC后的第3周（急性模型，n = 7和n= 8）中，具有代表性的移植水平（huCD3+细胞的百分比）。（D） 在使用抗逆转录病毒疗法的健康或HIV感染患者注射PBMC后，hu-PBL-NSG-SGM3小鼠的移植水平（huCD3+细胞的百分比）（复健模型，n = 10和n = 12）。在 B+D 中，线指示中位数，并显示 Mann-Whitney 测试的 p 值。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：在hu-PBL-NS+链空鼠标模型中GVHD的开发。（A） 两个有代表性的Hu-PBL-NSG-SGM3小鼠脱发，在健康捐赠者注射PBMC后的第7周。（B） 在整个监测期间，小鼠体重损失标准化为从健康捐赠者（n = 10）和HIV感染患者（n = 12）注射PBMC的hu-PBL-NSG-SGM3小鼠的起始体重百分比。（C） 在CD4+和CD8+T细胞中，从从健康捐赠者身上注射PBMC的小鼠的HLA-DR和CD38的代表性表达（在移植后第7周）。这些数字表示每个人口的百分比。（D） 在从健康捐赠者注射PBMC的小鼠中，HLA-DR+ CD38的CD4+和CD8+T细胞的代表性百分比。 值得注意的是，在注射小鼠前的细胞中，HLA-DR+ CD38+ CD4+ CD8+ T细胞的含量分别为2.0%和5.7%。在 B 和 D 中，显示了中位数和四分位数范围。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：HIV感染后和抗逆转录病毒治疗后HUNS+链空小鼠的病毒载量和CD4：CD8比的代表性变化。（A， D）CD4：CD8比率和血浆病毒载量在HuNS + 链空小鼠感染HIV BaL（红点和线，n = 3），这是在第14周注射后用脐带血CD34+ HSCd进行。未感染对照（PBS注射）也包括在内（绿点和线，n = 5）。（B， E）感染HIV BaL（红点和线，n = 4）后，hu-PBL-NSG-SGM3小鼠的血浆病毒载量和CD4：CD8比，在健康供体（急性模型）注射PBMC后第3周进行。还包括未感染的对照（PBS注射）（绿点和线，n = 3）。（C 和 F）在Hu-PBL-NSG-SGM3小鼠中注射来自HIV感染的捐赠者（红点和线，n = 9）或健康供体（绿点和线，n = 10）的PBMC小鼠的血浆病毒载量和CD4：CD8比率（重新激活模型）。在所有情况下，都显示中位数和四分位数范围。在 A+C 中，虚线表示检测极限（150 份/mL）。对病毒载量无法检测的样本，分配了等于检测限制一半的值。在 D+F 中，虚线表示 CD4：CD8 比率为 1。在 A、C、D 和 F 中，灰色框指示使用 ART 管理的时间。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在开发用于人性化的免疫缺陷小鼠菌株方面取得了重要进展，根据研究兴趣1，可以使用许多不同的选择。这里提供了一个一般方案，用于NS +链空小鼠和基因相似的菌株的人性化，用于三种不同的模型，用于研究艾滋病毒感染。在第一种实验方法中，辐照的新生小鼠被注射人类CD34+HSC，可以从脐带血、胎儿肝脏或动员的外周血3，21。适当照射NS +链空小鼠是一个关键步骤，因为它消除了小鼠骨髓和其他祖细胞，允许有效地重组人类细胞群。然而，一些报告已经证明，在不同的小鼠菌株中重组人类细胞，无需辐照27。在这方面，必须提供适当的辐照剂量，因为NS +链空小鼠对放射性敏感，高β-辐照可诱发胸腺淋巴血症21、28。
可能影响移植水平的其他关键步骤和因素包括注射途径（内肝、静脉内、心内）、小鼠年龄、CD34+ HSC 纯度百分比以及操作员专业知识29。在基于hu-PBL-NS-链空小鼠模型的第二和第三种方法中，一些关键因素包括注射途径（腹腔内、静脉内、静脉内）、小鼠年龄和注射的人类细胞数量，这会影响移植的最终水平。关于后一个因素，一些研究已经使用5×10 x 106 PBMC进行移植22，23，30，而目前的协议建议使用3.5 x 106 PBMC。值得注意的是，在急性和复活模型中，这个数量的细胞足以重建T细胞和艾滋病毒复制，并且也延缓了GVHD23的发展。尽管如此，研究者应该根据研究目标优化人性化条件。此外，验证用于感染huNS+链空小鼠的HIV菌株也非常重要。在这里，使用R5热带HIV-1 BaL菌株，在HuNS+链空小鼠中产生高水平的病毒复制。其他报告菌株，如含有荧光素酶或荧光蛋白的菌株，也适合对HIV感染细胞进行单细胞分析31。
总体而言，在使用 CD34+ HSC 的移植后，huNS + 链空鼠标模型存在三个主要限制。首先，由于缺乏人类胸腺环境，T细胞在小鼠MHC分子的环境中接受教育，通过T细胞受体抑制随后的抗原特异性刺激。此问题限制了 NS + 链空小鼠模型的使用，用于研究艾滋病毒特异性 T 细胞反应。尽管如此，这种限制可以通过使用BLT小鼠或NS+链空小鼠与HLA分子的转基因表达16，17克服。其次，在NS-链空小鼠模型中，骨髓群的重组通常较差，限制了这些与HIV感染抗原呈现和发病机制相关的子集的研究。在这种情况下，使用具有造血因子转基因表达的小鼠菌株建议8、15、32。
第三，有1）淋巴卵泡结构在继发性淋巴组织发育不良，2）缺乏三级淋巴组织，这与先天免疫细胞（即huNS +链空小鼠的树突状细胞）水平低有关，对卵泡的发展至关重要33。此问题与 huNS - 链空鼠标模型34中较差的体液反应有关。尽管如此，一些报告已经证明在huNS+链空小鼠4中发展卵泡状结构，而脾脏和淋巴结封闭卵泡T细胞（表达卵泡-结化化学受体CXCR5）在HUNS+链空小鼠和相关菌株15中检测到。再次，使用1）BLT小鼠或2）小鼠菌株与造血因子的转基因表达和/或与HLA分子的表达可以改善骨髓群的重组，发展有组织的二级和三级淋巴结构，以及有效的T细胞和B细胞反应8，35，36。
与CD34+HSC-人性化NS+链空鼠模型的局限性类似，在hu-PBL-NS+链空小鼠中缺乏抗原特异性T细胞和体液反应，缺乏骨髓群，以及有组织的淋巴结构。此外，hu-PBL-NS-链空小鼠模型（HIV感染的急性和再激活模型）的一个重要限制是监测的短窗口，因为这些小鼠发展异种性GVHD23。GVHD的发展也可能导致免疫人群的不受欢迎的人位和功能变化，这是致病过程23、37的固有。尽管如此，这种模式的优点是更简单和更容易获得，特别是考虑到人类PBMC更容易从健康或感染艾滋病毒的捐赠者38获得。此外，直接从患者注射原发细胞有助于研究供体的细胞或病原体内在条件，如病毒性耐药性突变或供体特异性免疫改变。值得注意的是，对于重新激活模型，在注射到小鼠39之前，可以用HIV复活剂进行体外检测，以证实PBMC的反应。一些机构的另一个限制是，这项工作要求BSL2+设施，以处理感染艾滋病毒的动物，根据法规。
与其他动物模型相比，HuNS-链空鼠模型具有一些研究HIV感染的模型，如感染模拟免疫缺陷病毒的非人类灵长类动物。例如，HuNS +链空小鼠允许产生基因敲除或转基因菌株，从而能够评估特定的基因靶点。此外，在huNS-链空小鼠中使用原生人细胞可以避免可能的物种特定限制，如非人类灵长类动物的干扰素刺激基因，这会影响抗病毒反应和感染过程40。因此，感染的动力学在huNS+链空小鼠之间高度一致。最后，HuNS + 链空鼠标模型成本更低，不需要复杂的核心设施，并且更易于访问。
总之，CD34– HSC-人性化和hu-PBL-NS+链空鼠标模型为研究HIV感染中的慢性、急性和再激活事件提供了多种可能性。随着对这些模型上述局限性的承认和克服，NS +链空小鼠的使用可能是病毒学、免疫学和药物临床前研究以及基因组编辑和基于细胞的免疫治疗的有力工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了IHV临床部门内部资金对JCZ的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
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