Summary
Beskrevet her er tre eksperimentelle tilnærminger for å studere dynamikken i HIV-smitte i humanisert mus. Den første tillater studiet av kroniske infeksjons hendelser, mens de to sistnevnte gjør det mulig for studiet av akutte hendelser etter primær infeksjon eller viral reaktivering.
Abstract
Humanisert NOD/SCID/IL-2 reseptor γ-null mus recapitulate noen funksjoner av menneskelig immunitet, som kan utnyttes i grunnleggende og pre-klinisk forskning på smittsomme sykdommer. Beskrevet her er tre modeller av humanisert immunodeficient mus for å studere dynamikken i HIV-smitte. Den første er basert på intrahepatic injeksjon av CD34+ blodkreft stamceller hos nyfødte mus, som gjør det mulig for rekonstituering av flere blod og lymfoide vev-trange celler, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning. Denne modellen gjør det mulig å overvåke i opptil 36 uker etter infeksjon, og derfor kalles den kroniske modellen. Den andre og tredje modellene er referert til som akutt og reaktivering modeller, der perifere blod mononukleære celler er intraperitonealt injisert i voksen mus. I den akutte modellen, celler fra en sunn donor er engrafted gjennom intraperitoneal ruten, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning. Til slutt, i reaktivering modellen, celler fra en HIV-smittet donor under antiretroviral terapi er engrafted via intraperitoneal ruten. I dette tilfellet gir et stoff-fritt miljø i musen for virus reaktivering og en økning i viral belastning. Protokollene gitt her beskriver den konvensjonelle eksperimentelle tilnærmingen for humanisert, immunodeficient mus modeller av HIV-smitte.
Introduction
Den humanisert NOD/SCID/interleukin (IL)-2 reseptor γ-kjedennull (heretter referert til som hunerne γ-Chainnull) mus modellen har vært mye brukt for å studere patogenesen av infeksjoner, autoimmunitet og kreft, samt for pre-kliniske studier av narkotika og menneskelig celle-baserte terapier1,2. Disse musene er basert på en ikke-obese diabetiker (NOD) bakgrunn, med scid mutasjon og målrettet MUTASJON på Il-2 reseptor γ-kjeden geometriske (felles γ-KJEDEN for Il-2, Il-4, Il-7, Il-9, Il-15, og Il-21), som induserer en alvorlig svekkelse i utviklingen av musen T-, B-, og naturlig Killer (NK) celler1. Dermed støtter de engraftment av menneskelig vev, humant CD34+ blodkreft stamceller (HSCs), og humant perifert blod mononukleære celler (pbmc)3,4,5. I tillegg, transgene uttrykk for menneskelig blodkreft faktorer, slik som stilk cellen faktoren (scf), granulocytt/macrophage koloni-stimulerende Factor (GM-CSF), og Il-3 fremmer engraftment av menneskelig myelogen bestander6,7,8.
For HIV-studier har flere hunerne γ-modeller mednull mus blitt beskrevet, noe som er forskjellig i belastningen på musen, type menneskelige celler som brukes, type vev for engraftment, og opprinnelsen til celler (dvs. sunn vs. HIV-smittet donor)9,10. Den opprinnelige belastningen, derimot, er mye brukt på grunn av de høye nivåene av menneskelige celler engraftment og viral replikering etter infeksjon med en referanse HIV-belastning11,12,13. Lignende immunodeficient mus stammer med transgene uttrykk for menneskelig blodkreft faktorer (f. eks, NOG-EXL eller NSG-SGM3) eller med implantater av menneskelig lever og thymus vev (benmarg-Liver-thymus [BLT] mus) er nyttige for å evaluere rollen til myelogen populasjoner i anti-HIV immunrespons, effekter av HIV på disse vev, og deres deltakelse som viral reservoarer14,15. Videre kan noen stammer med transgene uttrykk for humant leukocytter antigen (HLA) molekyler, samt BLT mus, brukes til å studere T-Cell respons på HIV-smitte16,17.
Generelt, i disse musene, menneskeliggjøring avhengig av mobilnettet opprinnelse, levering rute (intraperitoneal, intrahepatic, intravenøs, intrakardielle) og mus alder på tidspunktet for engraftment18,19,20. Når det gjelder cellen opprinnelse, Human CD34+ HSC avledet fra ledningen blod, fosterets lever, eller mobilisert perifert blod kan injiseres i nyfødte eller unge mus3,21. I tillegg voksne γ-kjedennull mus kan bli humanisert ved injeksjon av PBMC (her referert til som Hu-PBL-NS γ-kjedennull mus), slik at Temporal sirkulasjon av disse cellene i blodet, sekundære lymfoide organer, og betent vev22,23,24.
Beskrevet her er en detaljert protokoll for etablering av hunerne γ-kjedennull mus modeller for STUDIET av HIV-smitte. Den første er den kroniske modellen, der menneskelige CD34+ HSCs avledet fra ledningen blod fra en sunn donor injiseres i nyfødte mus, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning etter 14 uker av menneskelig immunsystem rekonstituering. Denne modellen gjør det mulig å overvåke mus i opptil ~ 36 uker etter smitte. Den andre modellen er en akutt modell, der Pbmc avledet fra en sunn donor injiseres i voksen NS γ-kjedennull mus, etterfulgt av infeksjon med en referanse HIV-belastning etter 3 uker av menneskelig T-celle ekspansjon i musen. Til slutt, den tredje modellen er reaktivering modellen, der Pbmc avledet fra en HIV-smittet donor under undertrykkende antiretroviral behandling (ART) injiseres i voksen NS γ-kjedennull mus. I dette tilfellet, et medikament fritt miljø tillater viral reaktivering og økning i viral belastning. De to sistnevnte modellene tillate overvåking i opptil ~ 9 uker etter engraftment.
Overall, disse tre modellene er nyttige for virological studier, pre-kliniske studier av romanen narkotika, og evaluering av HIV-smitteeffekter på global immunrespons. Det er også viktig å vurdere at bruk av HIV-infiserte humanisert mus krever gjennomgang og godkjenning av institusjonelle biosafety Committee (IBC) så vel som av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) før noen eksperiment. Dette sikrer at studien følger alle interne og eksterne institusjonelle forskrifter for bruk av farlig biologisk materiale og Human håndtering av forsøksdyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne arbeide, alle dyr bekymre og prosedyrer var utført alt etter protokoller anmelder og anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) for universitetet av Maryland skolen av medisin (protokollen numrene 1018017, 1018018, og 0318009).
1. Human CD34+ HSC engraftment av nyfødte mus
- Bruk alltid en gangs personlig verneutstyr (PPE), inkludert steril skrubb, hansker, dedikerte sko, sko deksler, maske, vernebriller, hår/skjegg panser og sterile laboratorie frakker.
- Re-suspendere 1 x 106 av frosne CD34+ HSCs (se tabell over materialer) i 10 ml RPMI 1640 Media 10% FBS under et sertifisert biosafety kabinett og opprettholde sterile forhold.
- Bruk 10 μL av suspensjonen til å telle (for å sikre tilstedeværelsen av forventet antall celler) og kontrollere celle levedyktighet ved trypan blå utelukkelse flekker i en hemocytometer.
- Sentrifuger ved 400 x g i 15 min ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten og resuspend i kald 1x PBS til ønsket konsentrasjon (1,4 x 105 CD34+ HSCs i 50 μL). Hold cellene på isen til injeksjon.
- Sted pups (NS γnull pups av begge to kjønn fra 1 – 4 dager gamle) i en steril 100 mm2 Petri tallerken jevnsides med en liten beløpet av bedding materiale fra det oppdretter bur. I tillegg gni rent sengetøy mellom hendene for å ytterligere maskere eventuelle utenlandske lukter på mottakeren valper.
NOTE denne minimere utenlandsk lukt tilværelse impregnert onto det pups, derved utviklende sjansene av mødrene aksepterer deres pups rygg i burene etter fremgangsmåten. - Putte det Petri fat i en feilfri transportbur og sted byrået inne en feilfri musen microisolator bur å beskytte pups fra miljøet. Dekk transportburet med en cover pad for å unngå eksponering av dyr til eksternt lys mens du er i transitt til bestråling rommet.
- Irradiate pups med 100 cGy hele kroppen bestråling (WBI) ved eksponering for en 137 cs kilde. Rengjør innsiden av irradiator med desinfiserende løsning, plasser mus i irradiator, og slå på dreieskiven slik at alle valper er bestrålt homogent. Lukk irradiator og trykk på strømbryteren for å starte bestråling prosessen. Vent til bestråling tiden er ferdig og umiddelbart fjerne mus.
Merk: siden bestråling ikke genererer stress i mus, er tidligere anestesi ikke nødvendig. - 2 – 4 timer etter bestråling prosedyren, plasserer valper i en biosafety kabinett inne i en kjølt steril Petri parabolen dekket med sterile gasbind på isen, til anesthetized (~ 5-10 min). Tilstrekkelig anestesi oppnås når brutto bevegelser opphøre.
- Legg sprøyten med en vedlagt nål (29 G, 0,5 ") med 50 μL av celle fjæringen og 1,4 x 105 av CD34+ HSCs under det sertifiserte biosafety-skapet.
- For engraftment via hepatic injeksjon, begrense valper med tommelen og pekefingeren. Å minimere musa selvbeherskelse (~ 30 – 45 s), utleie ettall etterforsker avholde det pup og administrere injeksjonen, og har den andre etterforsker belaste sprøyten med det HSC suspensjon. Rengjør injeksjonsstedet med 70% alkohol og levere 50 μL av celler direkte inn i leveren. Bruk en grunne nål vinkel når sprøytebruk for å unngå helt piercing leveren. Som en kontroll kan du injisere mus med 50 μL av 1x PBS i leveren.
- Plasser valpene på en pre-varmet sterile Petri parabolen dekket med sterile gasbind for 1-5 min for å tillate utvinning. Pre-Warm fatet ved hjelp av en infrarød oppvarming pad for gnagere ved 20 ° c for å sikre at valper ikke vil bli over-varmet.
- Med det samme tidligere retur det pups å deres foreldre, søke en liten beløpet av mentol-og eucalyptus-basert salve, benytter tommelfingeren og pekefingeren, å det snute av begge to foreldre å unngå kannibalisme eller avvisning av det pups.
- Sjekk burene hver dag, ser for alle underskriver av pode-mot-vert sykdommen (GVHD) inne det pups som tørr hud, nei mate, hud, og alopecia. Euthanize dyrene hvis noen av disse skiltene er observert.
- Avvenne mus på 3 ukers alder, gruppering dem etter kjønn. Ikke putte mer enn 5 dyrene per bur. Verifiser engraftment i perifert blod ved å flyte flowcytometri ved 14 ukers alder.
Merk: suksessraten på engraftment er mellom 80% – 100%.
2. Human PBMC engraftment av juvenile mus
- For akutt og reaktivering modeller, injisere 6 til 8 uke gamle NS γ-kjedennull mus intraperitonealt med menneskelige pbmc avledet fra en sunn DONOR eller HIV-smittet pasient som var under art, henholdsvis. I begge modeller, inkluderer mus injisert med Pbmc fra en sunn donor uten HIV-smitte (humbug) som kontroller.
- Lag 15 mL av hele blod i 5 mL steril tetthet gradient medium i en 50 mL konisk rør.
- Sentrifuger på 400 x g for 30 min ved RT, uten bremser, for å unngå Buffy pelsen fra å bli blandet med tettheten gradient medium.
- Forsiktig samle brøkdel av mononukleære celler (mellom tettheten gradient medium og supernatanten) og overføre Buffy pelsen til en 15 mL sentrifugerør som inneholder 10 mL av 1x PBS. Sentrifuger på 300 x g for 10 min ved RT.
- Forkast supernatanten og Fjern de gjenværende røde blodcellene ved å lysering med 5 mL ACK-buffer som er lagt til i de pelleted cellene. Ruge for 4 min ved RT.
- Sentrifuger på 300 x g for 10 min ved RT. kast supernatanten og resuspend i 10 ml 1x PBS eller RPMI 1640 medium.
- Bruk 10 μL av celle oppheng for å telle cellene og kontrollere levedyktigheten ved å trypan blå eksklusjon flekker i en hemocytometer. Vanligvis er 1 – 2 x 106 celler oppnådd for hver 1 ml blod, med mer enn 95% levedyktighet.
- Sentrifuger på 300 x g for 10 min ved RT. kast supernatanten og Juster celle nummeret til ønsket konsentrasjon (i dette tilfellet 3,5 x 106 celler i 200 μL av 1x PBS).
- Legg sprøyten med en nål (28 G, 0,5 ") med 3,5 x 106 av pbmc i 200 μL av 1x PBS under et sertifisert biosafety kabinett.
- Fjern musen fra buret og hold den ved halen slik at den kan gripe inn i mesh, bruke milde trekkraft bakover. Deretter plasserer indeksen og tommelen fingrene på skuldrene til dyret, ta tak i den løse huden på halsen og bruke langfingeren til å stabilisere ryggen.
- Skyv musen hodet tilbake slik at ryggen er over hodet. Dette gjør at innvollene i bukhulen skal forskyves bakover og reduserer risikoen for punktering indre organer under injeksjonen.
- Rengjør injeksjonsstedet med 70% alkohol.
- Gå inn i sprøyten som brukes i trinn 2,9 gjennom bukveggen og aspirer før du injiserer cellene, hvis noe materiale er pustende, Fjern sprøyten og kast den. Ellers injiserer cellene langsomt i intraperitoneal hulrom, Fjern sprøyten og kast den. Injiser 1x PBS for å kontrollere mus.
- Returner dyret til buret.
- Kontroller engraftment i perifert blod ved å strømme flowcytometri til 3 uker etter injeksjonen.
3. post-engraftment omsorg
- Identifiser mus ved øre merking.
- Observer musene som brukes i disse eksperimentene tett 2x per dag etter hver prosedyre for kliniske tegn på nød.
- Etter menneskelige celler transplantasjon, overvåke mus for GVHD. For å overvåke GVHD symptomer hos nyfødte, unge og voksne mus, evaluere dyr for utseendet av hudsykdommer (dvs. farge, tørrhet, hud, håravfall), i tillegg til kroppens vekt mål. Vurdere dyr som viser disse skiltene av en veterinær for å vurdere tidlig døds aktiv.
4. HIV-smitte prosedyre og humbug infeksjon prosedyre
Merk: for de kroniske og akutte modeller, mus er smittet med HIV BaL referanse belastningen ved uke 14 og uke 3 post-engraftment, henholdsvis. Injeksjoner med HIV administreres intraperitonealt inn i nedre abdominal kvadranter.
- Utfør laste prosessen av viruset/PBS i sprøyter, ved hjelp av en 28 G 0,5 "nål, i BSL2 skap etter ABSL2 prosedyrer. Den totale mengden av virus injisert er 15 000 median vevs kultur infeksjons dose (TCID50) i 200 μL av sterile RPMI 1640.
- Fjern musen fra buret og hold den ved halen slik at den kan gripe mesh, påføring forsiktig trekkraft bakover. Deretter plasserer pekefingeren og tommelen på skuldrene til dyret, ta tak i den løse huden på halsen og ved hjelp av langfingeren for å stabilisere ryggen.
- Skyv musen hodet tilbake slik at ryggen er over hodet. Dette gjør at innvollene i bukhulen skal forskyves bakover og reduserer risikoen for punktering indre organer under injeksjon.
- Rengjør mus med en pre-fuktet alkohol pad i nedre venstre/høyre kvadrant av magen. Injiser 15 000 TCID50 av HIV BaL viruset som finnes i 200 μL av steril RPMI 1640.
- Etter injeksjon, returnere musen til sin hjemme buret.
5. Blood samling av retroorbital punktering
Merk: Retroorbital blødning tillater rask innsamling av blod, og dermed redusere den totale samlings tiden og øke stabiliteten av menneskelige lymfocytter markører. Bruk EDTA-rør for å samle mus blod.
- I den kroniske modellen, ved 14 uker post-HSC injeksjon, samle blodet via retroorbital vene. I akutt og reaktivering modeller, utføre denne prosedyren på 3 uker etter PBMC injeksjon.
- Bedøve dyrene som bruker 250 μL av isoflurane inhalasjon før blodoppsamling i en biosafety hette klasse B2 som er ducted eksternt.
- Dispensere isoflurane i bomull pads under et netting i en klar 1 L krukke i et biosafety kabinett ventilert utenfor bygningen. Bruken av mesh sikrer at dyrene ikke kontakte isoflurane-gjennomvåt pad, som kan forårsake hudirritasjon og potensielle overdosering siden isoflurane absorberes også gjennom huden. Også sette en myk papir håndkle mellom mesh og dyr for å unngå lemmer skader.
- Når glasset er mettet med isoflurane (ca 1 min etter å ha lagt det), innføre dyret og observere respirasjonsfrekvensen, som vil øke deretter redusere. Sjekk for klinisk indikasjon på et dypt fly av anestesi, som inkluderer mangelen på en rettende refleks (ved tipping jar forsiktig) og mangel på brutto bevegelser. Start blødningen prosedyren så snart dyret er helt avslappet og mangler tå klype refleks.
Merk: siden isoflurane fordamper, dispensere mer stoff hvis ingen tegn til anestesi er observert. - For retroorbital blødning, trykk på musen eksterne halsen vene caudal til kjeven med tommelen, og med den samme hånden, forsiktig heve øvre øyelokk med pekefingeren.
- Sett et hematokrit rør inn i midtre canthus i øyet og rett det inn i en ventrolateral retning til blodet begynner å selvsmeltende.
- Samle minst 100 μL av blod. Når ønsket volum av blod er innhentet (et volum ikke mer enn 1% av kroppens vekt av dyret), avvikle ytre hals trykk og fjerne hematokrit røret.
- Forsikre deg om at hemostase er fullført ved å påføre direkte trykk på øyet ved hjelp av et sterilt gasbind i minst 30 s.
- Påfør tetrakain dråper i øyet. Monitor dyret før det har helt utvinnes fra anestesi og plassere den tilbake i buret.
Merk: 100 μL av innsamlet blod brukes til evaluering av nivået av engraftment av humant CD45+ og andre blodlegemer populasjoner, samt for evaluering av plasma viral belastning.
6. screening av engraftment nivå og Flow flowcytometri analyse
- Følg en konvensjonell Flow flowcytometri farging protokoll for hele blod, som inkluderer inkubasjons av fluorokromkonjugert-merket anti-menneskelige antistoffer (for foreslått Flow panel, se tabell over materialer), etterfulgt av lyse av røde blodlegemer og vasketrinn13,15.
Merk: for screening av nivået av engraftment, inkluderer en anti-humant CD45 antistoff. For sammenligning kan en anti-mus CD45 antistoff også brukes. Inkluder kompensasjon kontroller samt en menneskelig blodprøve farget med samme antistoff mix, unstained mus og menneskelige blodprøver, og ikke-humanisert kontroll for å teste kryss-reaktivitet av reagensene. Etter farging, det er alltid noe bakgrunns signal; Imidlertid er alle positive signaler klart skilles fra negative og kryss-reaktive kontroller. - I en passende Flow flowcytometer, erverve minst 10 000 hendelser på lymfocytter porten (FSC-A vs. SSC-a). For Flow flowcytometri analyse, etter duplikat eksklusjon, bestemme prosentandelen av menneskelige CD45+ celler samt andre celle populasjoner av interesse.
7. evaluering av plasma viral Last
- Evaluere viral belastning i HIV-infiserte dyr 1x per uke etter smitte.
- Etter retroorbital blødning (ca. 100 μL), Skaff plasma ved å samle supernatanten etter sentrifugering av anticoagulated blod ved 3 500 x g i 3 min i en mikrosentrifugen. Pellet brukes for blodlegemer bestemmelse av fenotype.
- Bruk en kommersiell viral RNA utvinning Kit (se tabell over materialer) for å få RNA fra 40 til μL av plasma.
- Konverter RNA til cDNA ved hjelp av den første strekk syntese mix (se tabell over materialer) og HIV gag primer SK431.
- Utføre kvantitativ sanntids PCR ved hjelp av HIV gag primere SK38/SK39 og fluorescerende grønne fargestoffer (f. eks SYBR grønn) som beskrevet i tidligere studier13,25.
8. administrering av antiretroviral behandling
- Administrere oral ART minst 3 uker etter smitte, når høy viral belastning er observert, i kroniske, akutte, og reaktivering modeller.
- Beregn doser av tenofovir tenofovirdisoproksilfumaratgruppen fumarat (TDF), emtricitabin (FTC), og raltegravir (RAL), ifølge km verdier av 37 og 3 for mennesker og mus, henholdsvis26. Vanligvis, det Human-ekvivalent doser av TDF, FTC, og RAL er 61,7 mg/kg/dag, 40,7 mg/kg/dag, og 164 mg/kg/dag, henholdsvis.
- For administrasjon i drikkevann, knuse narkotika tabletter og tilsett respektive beløp i vann flasken, slik at hver mus i buret får sin daglige dose. Siden stoffet pulver kan danne sediment i flasken, periodevis riste vann flasken for å oppnå homogen suspensjon.
- Endre vann flasken hver uke med ferske oppløste legemidler.
- Samle blodet via retroorbital vene hver uke eller hver 2 uker etter ART innvielse å evaluere endringer i viral belastning og CD4: CD8 ratio.
9. Mouse døds aktiv, samling av sekundære lymfoide organer, og isolering av mononukleære celler
- Døds aktiv er utført i de tre humanisert musemodeller, periodevis langs infeksjon tid, eller på slutten av eksperimentet.
- Utføre døds aktiv av voksne mus av CO2 kvelning, etterfulgt av cervical forvridning. For kvelning, bruk en ikke-precharged kammer, dispensere CO2 fra en kommersiell sylinder med fast trykk regulator og i tråd begrensning kontrollere gass strømmen innen 20%-30% av kammer volum/minutt til å OVERHOLDE 2013 AVMA retningslinjer.
- Oppretthold CO2 flow for > 60 s overvåking åndedretts arrest (som kan ta opp til 5 min), etterfulgt av cervical forvridning for å sikre dødsfall.
- Euthanize nyfødte < 7 dager gammel av en fysisk metode (dvs. ved hjelp av skarp saks).
- Visualiser aksillær, mediastinale og chrezbryzheechno lymfeknuter (som vanligvis observeres) og pakk dem med pinsett og skarp saks. Også trekke ut milten, som ligger i øvre venstre side av bukhulen.
- Sett inn det lymfoide vevet i 1,5 mL sentrifugerør som inneholder sterile RPMI 1640 medium.
- Umiddelbart behandle lymfoide vev i en 70 mm pore-størrelse nylon celle sil, samle cellene i en 50 mL tube. Ikke aspirer vevet.
- Vask cellene med 5 mL RPMI 1640 medium supplert med 1% FBS å lette celler filtrering.
- Etter at vevet Disaggregation, sentrifuger cellene suspensjonen på 3 500 x g for 10 min i en mikrosentrifugen.
- Kast supernatanten og resuspend cellene med 500 μL av 1x PBS.
- Overfør cellene suspensjonen til et 1,5 mL sentrifugerør inneholdende 500 μL av gradert medium med steril tetthet.
- Sentrifuger på 3 500 x g for 3 min i en mikrosentrifugen, uten brems, for å hindre at Buffy coat blander med tettheten gradient medium
- Forsiktig samle brøkdel av mononukleære celler (mellom tettheten gradient medium og supernatanten) og overføre Buffy pelsen til en 1,5 mL sentrifugerør som inneholder 500 μL av 1x PBS. Sentrifuger på 3 000 x g i 3 min.
- Fjern de resterende røde blodcellene ved lysering med 500 μL av ACK buffer, incubating for 4 min ved RT.
- Sentrifuger på 3 000 x g i 3 min. kast supernatanten og resuspend i 1 ml 1x PBS eller medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet ovenfor, på 14 uker post-HSC injeksjon (kronisk modell) eller 3 uker etter PBMC injeksjon (akutt og reaktivering modeller), er musene blødde for screening nivået av menneskelige celler engraftment ved flyt flowcytometri. En representativ gating strategi for evaluering av 1) Human CD45+ celler rekonstituering og 2) prosent av CD4+ og CD8+ T-celler er vist i figur 1A. Vanligvis varierer nivået av engraftment (prosent av menneskelig CD45+ celler) fra 10% – 80% etter CD34+ HSC injeksjon og avhenger av ruten av injeksjon og mus belastning, blant andre tidligere beskrevne faktorer (figur 1B). Etter PBMC injeksjon, nivået av engraftment (prosent av menneskelig CD45+ eller CD3+ celler) spenner fra 5%-65%, også med forskjeller mellom musen stammer (figur 1B). I tillegg kan noen forskjeller mellom mus injisert med PBMC avledet fra en sunn kontra en HIV-smittet donor, observeres (figur 1D). Vanligvis, for HIV-smitte, nivåer av engraftment over 5%-10% er nok for aktiv viral replikering.
Viktigere, en karakteristisk for Hu-PBL-NS γ-kjedennull mus modeller er utviklingen av xenogeneic GVHD innen et par uker etter celle engraftment, på grunn av den menneskelige T-celle anerkjennelse av murine store histocompatibility kompleks (MHC) molekyler23. Denne prosessen er tydelig, selv etter 3 uker etter PBMC injeksjon, ved tegn som hår og vekttap (figur 2A, B), så vel som av den økte uttrykk for aktiverings markører i T-celler som HLA-Dr og CD38 (figur 2C, D). På den annen side, GVHD er mer langsomt utviklet i mus injisert med menneskelige CD34+ HSC og er direkte korrelert med den opprinnelige nivået av engraftment.
Etter HIV-smitte, det er en rask økning i plasma viral belastning, vanligvis blir synlig etter 2-3 uker etter infeksjon, både i kroniske og akutte modeller (Figur 3a, B), med lignende Kinetics i reaktivering modellen (Figur 3C). Økningen i viral belastning sammenfaller med en nedgang i CD4: CD8 ratio (Figur 3D, E, F). Disse endringene er ikke observert i kontroll mus (uten HIV-smitte, Figur 3). Av notatet, i hu-PBL-NS γ-kjedennull musemodell, en innledende INVERSJON av CD4: CD8 ratio kan observeres, blir rekonstituert langs overvåking tid (Figur 3E, F). Til slutt, hvis ART administreres til HIV-infiserte mus, en undertrykkelse av viral Last samt utvinning i CD4: CD8 ratio er forventet, nådde nivåer som ligner på de i infisert kontroller (Figur 3a, C, D, F). Vanligvis, etter 2-3 ukers behandling, en reduksjon i viral belastning og økning i CD4: CD8 ratio er observert i kroniske, akutte, og reaktivering modeller. Hvis dette ikke overholdes, må legemiddel dosene og administrerings veien være en evaluering.
Figur 1: representativ gating strategi for evaluering av engraftment nivåer av menneskelig CD45+ og T-celler. (A) gating strategi som brukes for screening av prosentandelen av humant CD45+ (huCD45), CD3+, CD4+, og CD8+ T-celler i hunerne γ-Chainnull mus, ved uke 14 etter injeksjon med ledningen blod CD34+ HSCs. Tallene angir prosentandelen av hver populasjon. (B) representative nivåer av engraftment (prosent av huCD45+ celler) i hunerne γ-Chainnull (n = 6) og en lignende IMMUNODEFICIENT stamme med transgene uttrykk for Il-3 og GM-CSF (huNOG-EXL, n = 6), som rapportert tidligere15. (C) representative nivåer av engraftment (prosent av huCD3+ celler) i hu-PBL-NS γ-Chainnull og Hu-PBL-SGM3 mus (ns γ-Chainnull mus med transgene uttrykk for scf, GM-CSF, og Il-3), ved uke 3 etter injeksjon med pbmc fra en sunn donor (akutt modell, n = 7 og n = 8, henholdsvis). (D) representative nivåer av engraftment (prosentandel av huCD3+ celler) i hu-PBL-NSG-SGM3 mus etter injeksjon med pbmc fra en sunn eller HIV-smittet pasient som var under Art (reaktivering modell, n = 10 og n = 12, henholdsvis). I B – D indikerer linjen median, og p-verdien av mann-Whitney-testen vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: utvikling av GVHD i hu-PBL-NS γ mednull musemodell. (A) hårtap i to representative Hu-PBL-NSG-SGM3 mus, i uke 7 etter INJEKSJON med PBMC fra en sunn donor. (B) mus kroppen vekttap gjennom overvåking tid normalisert til prosentandelen av startvekt i hu-PBL-NSG-SGM3 mus INJISERT med PBMC fra en sunn donor (n = 10) og HIV-smittet pasient (n = 12). (C) representative uttrykk (ved uke 7 post-engraftment) av HLA-Dr og CD38 i CD4+ og CD8+ T-celler fra Hu-PBL-NSG-SGM3 mus injisert med pbmc fra en sunn donor. Tallene angir prosentandelen av hver populasjon. (D) representative PROSENTER av CD4+ og CD8+ T-celler som er HLA-Dr+ CD38+ i hu-PBL-NSG-SGM3 mus injisert med PBMC fra en sunn donor. Av notatet, i celler før injeksjon i mus, nivåene av HLA-DR+ CD38+ CD4+ og CD8+ T-celler var 2,0% og 5,7%, henholdsvis. I B og D vises median og interquartile rekkevidde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative endringer av viral Last og CD4: CD8 ratio i hunerne γ-kjedennull mus etter HIV-smitte og etter Art introduksjon. (A, D) CD4: CD8 ratio og plasma viral belastning i hunerne γ-kjedennull mus etter infeksjon med HIV BaL (røde prikker og linje, n = 3), som ble utført etter uke 14 av injeksjon med ledningen blod CD34+ HSCd. infisert kontroller (PBS-injisert) var også inkludert (grønne prikker og linje, n = 5). (B, E) Plasma viral belastning og CD4: CD8 ratio i hu-PBL-NSG-SGM3 mus etter infeksjon med HIV BaL (røde prikker og linje, n = 4), som ble utført ved uke 3 etter injeksjon med PBMC fra en sunn donor (akutt modell). Kontroller som ikke er infisert (PBS-injisert) var også inkludert (grønne prikker og linje, n = 3). (C og F) Plasma viral belastning og CD4: CD8 ratio i hu-PBL-NSG-SGM3 mus injisert med Pbmc fra en HIV-smittet donor (røde prikker og linje, n = 9) eller sunn donor (grønne prikker og linje, n = 10) (reaktivering modell). Median og interquartile rekkevidde vises i alle tilfeller. I A – C viser den stiplede linjen grensen for påvisning av analysen (150 eksemplarer/mL). Til prøver med undetectable viral belastning, en verdi lik en halvparten av grensen for påvisning ble tildelt. I D-F, indikerer den stiplede linjen en CD4: CD8 ratio på 1. I A, C, D og F, den grå boksen viser tiden med administrasjon av ART. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktige fremskritt har blitt oppnådd i utviklingen av immunodeficient mus stammer for menneskeliggjøring, med en rekke ulike alternativer som kan brukes i henhold til forskningen interesse1. Forutsatt her er en generell protokoll for menneskeliggjøring av NS γ-null mus og genetisk lignende stammer som skal benyttes i tre forskjellige modeller for å studere HIV-smitte. I den første eksperimentelle tilnærmingen, bestrålt nyfødte mus injiseres med humant CD34+ HSCs, som kan utledes fra ledningen blod, fosterets lever, eller mobilisert perifert blod3,21. Hensiktsmessig bestråling av NS γ-null mus er et kritisk trinn, da det eliminerer musen benmargen og andre stamceller, slik effektiv rekonstituering av menneskelige celle populasjoner. Men noen rapporter har dokumentert rekonstituering av menneskelige celler i forskjellige mus stammer, uten bestråling27. I denne forbindelse må det gis riktige doser av bestråling, siden NS-γ-null -mus er radiosensitive, og høy γ-bestråling kan indusere tymusatrofi lymphomagenesis21,28.
Andre viktige trinn og faktorer som kan påvirke nivået av engraftment inkluderer injeksjons veien (intrahepatic, intravenøs, intrakardielle), mus alder, prosentandel av renhet av CD34+ HSCs, og operatør kompetanse29. I den andre og tredje tilnærminger basert på Hu-PBL-NS γ avnull musemodeller, noen kritiske faktorer inkluderer injeksjons veien (intraperitoneal, intravenøs, intrasplenic), mus alder, og antall humane celler injisert, noe som kan påvirke det endelige nivået av engraftment. Når det gjelder denne sistnevnte faktoren, har flere studier brukt 5 – 10 x106 pbmc for engraftment22,23, mensden foreliggende protokollen antyder bruk av 3,5 x 106 pbmc. Av notatet, er dette antall celler tilstrekkelig for rekonstituering av T-celler og for HIV-replikering, både i akutt og reaktivering modeller, og også forsinkelser utviklingen av GVHD23. Likevel bør etterforskerne optimalisere menneskeliggjøring forhold i henhold til forsknings mål. Videre er det viktig å validere HIV-belastningen brukes til infeksjon av hunerne γ-kjedennull mus. Her brukes R5 Tropic HIV-1 BaL belastningen, som gir høye nivåer av viral replikasjon i hunerne γ-kjedennull mus. Andre reporter stammer, slik som de som inneholder luciferase eller fluorescerende proteiner, er også egnet for enkelt celle analyse av HIV-infiserte celler31.
Total, tre større begrensninger er bevist inne hunerne γ-lenkennull musen modeller fulgte ENGRAFTMENT med CD34+ HSC. Først, på grunn av fravær av en menneskelig tymusatrofi miljø, T-celler er utdannet i sammenheng med murine MHC molekyler, begrensende etterfølgende antigen-spesifikk stimulering via deres T-celle-reseptorer. Dette problemet begrenser bruken av NS γ-null mus modeller for å studere HIV-spesifikke T-celle respons. Likevel kan denne begrensningen overvinnes ved bruk av BLT-mus eller NS-γ mednull -mus med transgene-uttrykk for HLA molekyler16,17. Sekund, vanligvis er det dårlig rekonstituering av myelogen populasjoner i NS γ-kjedennull mus modeller, begrenser studiet av disse delsett som har relevans i forbindelse med antigen-presentasjon og patogenesen av HIV-smitte14,15. I dette tilfellet anbefales bruk av mus stammer med transgene uttrykk for blodkreft faktorer8,15,32.
Tredje, det er en 1) dårlig utvikling av lymfoide hårsekken strukturer i videregående lymfoide vev og 2) mangel på tertiær lymfoide vev, som er relatert til de lave nivåene av medfødte immunceller (dvs. dendrittiske celler i hunerne γ-kjedennull mus) som er avgjørende for utviklingen av hårsekkene33. Dette problemet er knyttet til en dårlig humoral svar i hunerne γ-kjedennull mus modeller34. Likevel, noen rapporter har dokumentert utvikling av hårsekken-lignende strukturer i hunerne γ-kjedennull mus4, mens milt-og lymfe node-trange follikulær T-celler (uttrykker hårsekken-homing chemokine reseptor CXCR5) oppdages i hunerne γ-kjedennull mus og relaterte stammer15). Igjen, bruk av 1) BLT mus eller 2) mus stammer med transgene uttrykk for blodkreft faktorer og/eller med uttrykk for HLA molekyler kan forbedre rekonstituering av myelogen populasjoner, utvikling av organiserte videregående og tertiær lymfoide strukturer, og effektiv T-celle og B-celle-svar8,35,36.
I likhet med begrensningene av CD34+ HSC-humanisert NS γ-kjedennull mus modeller, det er en mangel på antigen-spesifikke T-celle og humoral svar, fravær av myelogen populasjoner, og organiserte lymfoide strukturer i hu-PBL-NS γ-kjedennull mus. I tillegg er en viktig begrensning av Hu-PBL-NS γ-kjedennull musemodell (akutte og reaktivering modeller av HIV-smitte) det korte vinduet for overvåking, siden disse musene utvikler xenogeneic GVHD23. Utviklingen av GVHD kan også indusere uønskede fenotypiske og funksjonelle endringer av immun befolkninger, iboende i sykdomsfremkallende prosess23,37. Likevel, denne modellen har fordelen av å være enklere og mer tilgjengelig, spesielt med tanke på at menneskelige Pbmc er lettere ervervet fra friske eller HIV-smittede givere38. I tillegg er injeksjon av primær celler direkte fra pasienter nyttig for studiet av celle-eller patogen-iboende forhold av donor, slik som viral resistens mutasjoner eller donor-spesifikke immun endringer. For reaktivering av modellen kan in vitro-analyser med HIV-reaktivering utføres for å bekrefte responsen til Pbmc før injeksjon i mus39. En annen begrensning for noen institusjoner er at dette arbeidet krever BSL2 + anlegg for å håndtere HIV-infiserte dyr på grunn av regelverket.
Den hunerne γ-kjedennull mus modeller har noen fordeler i forhold til andre dyremodeller for å studere HIV-smitte, for eksempel nonhuman primater smittet med Simian immunsviktvirus. For eksempel, hunerne γ-null mus tillate etablering av gen knockout eller transgene stammer, som tillater evaluering av konkrete genet mål. I tillegg, bruk av primære menneskelige celler i hunerne γ-kjedennull mus unngår mulige arter-spesifikke restriksjoner, slik som tilfelle av interferon-stimulert gener i nonhuman primater, som kan påvirke antiviral respons og løpet av smitte40. Således, Kinetics av infeksjonen er høylig gjennomført imellom hunerne γ-lenkennull mus. Til slutt, hunerne γ-modellnull mus modeller er rimeligere, ikke krever komplekse kjernen fasiliteter, og er mer tilgjengelig.
Oppsummert CD34+ HSC-humanisert og Hu-PBL-NS γ-kjedennull mus modeller tilbyr en rekke muligheter for studiet av kroniske, akutte, og reaktivering hendelser i HIV-smitte. Med anerkjennelse og overvinne av de nevnte begrensningene av disse modellene, bruk av NS γ-null -mus kan være et kraftig verktøy for virological, immunologiske, og narkotika pre-kliniske studier, samt for Genova redigering og celle-baserte immunterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av IHV kliniske divisjon interne midler til JCZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
