Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Хроническая, острая и активированная ВИЧ-инфекция в гуманизированных иммунодефицитных моделях мыши

Published: December 3, 2019 doi: 10.3791/60315
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

Summary

Описаны три экспериментальных подхода к изучению динамики ВИЧ-инфекции у гуманизированных мышей. Первый позволяет изучать события хронической инфекции, в то время как два последних позволяет для изучения острых событий после первичной инфекции или вирусной реактивации.

Abstract

Гуманизированный рецептор NOD/SCID/IL-2, который являетсянулевой мыши, резюмирует некоторые особенности иммунитета человека, которые могут быть использованы в фундаментальных и доклинических исследованиях инфекционных заболеваний. Здесь описаны три модели гуманизированных иммунодефицитных мышей для изучения динамики ВИЧ-инфекции. Первая основана на внутрипечетической инъекции CD34и гематопоиетических стволовых клеток у новорожденных мышей, что позволяет восстановить несколько кровяных и лимфоидных тканей, ограниченных клетками, а затем инфекцию с эталонным штаммом ВИЧ. Эта модель позволяет контролировать до 36 недель после инфекции и, следовательно, называется хронической модели. Вторая и третья модели называются острыми и реактивационными моделями, в которых периферийные моноядерные клетки крови интраперитонеально вводятся взрослым мышам. В острой модели клетки здорового донора прививаются через интраперитонеальный путь, за которым следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ. Наконец, в модели реактивации клетки ВИЧ-инфицированного донора в рамках антиретровирусной терапии прививаются по внутриперегитонне. В этом случае безнаркотическая среда в мыши позволяет реактивацию вируса и увеличение вирусной нагрузки. В представленных здесь протоколах описывается обычный экспериментальный подход к гуманизированным, иммунодефицитным моделям мыши ВИЧ-инфекции.

Introduction

Гуманизированный NOD/SCID/interleukin (IL)-2 рецептора Q-цепиnull (в дальнейшем именуемый huNS q-цепнойnull) мышь модель была широко использована для изучения патогенеза инфекций, аутоиммунных и раковых заболеваний, а также для доклинических исследований лекарств и человеческих клеточных терапии1,2. Эти мыши основаны на не-ожирения диабетической (NOD) фон, с научной мутации и целенаправленной мутации на рецепторЕ IL-2-цепь локус (общий q-цепи для IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, и IL-21), которые вызывают серьезные нарушения в развитии мыши T-, B-, и природных киллеров (NK)1. Таким образом, они поддерживают прививок человеческих тканей, человеческих CD34и гематопоитических стволовых клеток (HSCs), и человеческих периферических клеток крови (PBMCs)3,4,5. Кроме того, трансгенное выражение гематопоитических факторов человека, таких как фактор стволовых клеток (СКФ), гранулоцит/макрофаг колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF), и IL-3 способствует инпланировке популяций миелоидов человека6,7,8.

Для исследований в области ВИЧ, несколько huNS-цепинулевой мыши модели были описаны, которые отличаются в штамм мыши, тип человеческих клеток, используемых, тип тканей для прививки, и происхождение клеток (т.е., здоровые против. ВИЧ-инфицированный донор)9,10. Оригинальный штамм, однако, широко используется из-за высокого уровня человеческих клеток прививок и вирусной репликации после инфекции с эталонным штаммом ВИЧ11,12,13. Аналогичные иммунодефицитные штаммы мыши с трансгенным выражением гематопоитических факторов человека (например, NOG-EXL или NSG-SGM3) или с имплантатами тканей печени человека и тимуса (костного мозга-печени-тимуса (BLT) мышей) полезны для оценки роли популяций миелоидов в анти-ВИЧ иммунный ответ, воздействие ВИЧ на эти ткани, и их участие в качестве вирусных резервуаров14,15. Кроме того, некоторые штаммы с трансгенным выражением молекул антигена лейкоцитов человека (HLA), а также BLT мышей, могут быть использованы для изучения Т-клеток ответ на ВИЧ-инфекцию16,17.

В целом, у этих мышей гуманизация зависит от клеточного происхождения, маршрута родов (интраперитонеальный, внутрипеченевой, внутривенной, внутривенной, внутрисердечной) и мышиного возраста на момент прививки18,19,20. Что касается происхождения клеток, человека CD34и HSC, полученных из пуповинной крови, печени плода, или мобилизованной периферической крови могут быть введены в новорожденных или молодых мышей3,21. Кроме того, взрослыенулевые мыши могут быть гуманизированы путем инъекции PBMC (здесь, именуемые hu-PBL-NS q-цепнойнулевой мышей), что позволяет височной циркуляции этих клеток в крови, вторичных лимфоидных органов, и воспаленные ткани22,23,24.

Описан освоенным здесь подробный протокол для создания huNS-цепинулевая мышь модели для изучения ВИЧ-инфекции. Во-первых, это хроническая модель, в которой человека CD34и HSCs, полученных из пуповинной крови от здорового донора вводятся у новорожденных мышей, а затем инфекции с эталонным штаммом ВИЧ после 14 недель восстановления иммунной системы человека. Эта модель позволяет контролировать мышей в течение 36 недель после заражения. Вторая модель представляет собой острую модель, в которой ПБМК, полученных от здорового донора, вводятся у взрослыхнюловых мышей NS и цепи, за которой следует инфекция с эталонным штаммом ВИЧ после 3 недель расширения Т-клеток человека в мыши. Наконец, третьей моделью является модель реактивации, в которой ПБМК, полученные от ВИЧ-инфицированного донора в рамках подавлятельной антиретровирусной терапии (АРТ), вводятся взрослым н.п. цепинулевых мышей. В этом случае безнаркотическая среда позволяет реактивацию вирусной терапии и увеличению вирусной нагрузки. Две последние модели позволяют осуществлять мониторинг в течение 9 недель после прививки.

В целом, эти три модели полезны для вирусологических исследований, доклинических исследований новых препаратов и оценки воздействия ВИЧ-инфекции на глобальный иммунный ответ. Важно также учитывать, что использование ВИЧ-инфицированных гуманизированных мышей требует рассмотрения и одобрения Со стороны Институционального комитета по биобезопасности (IBC), а также Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) перед любым экспериментом. Это гарантирует, что исследование следует всем внутренним и внешним институциональным нормам использования опасного биологического материала и гуманной обработки экспериментальных животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В этой работе все процедуры по уходу за животными и процедуры выполнялись в соответствии с протоколами, рассмотренными и утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Университета Мэриленда (протокольные номера 1018017, 1018018 и 0318009).

1. Человек CD34- HSC прививка новорожденных мышей

  1. Всегда используйте одноразовые средства индивидуальной защиты (PPE), в том числе стерильные скрабы, перчатки, специальную обувь, бахилы, маску, очки, капот для волос/бороды и стерильные лабораторные пальто.
  2. Повторно приостановить 1 х 106 замороженных CD34и HSCs (см. Таблица материалов) в 10 мл RPMI 1640 сми 10% FBS под сертифицированным шкафом биобезопасности и поддерживать стерильные условия.
  3. Используйте 10 зЛ подвески для подсчета (для обеспечения наличия ожидаемого количества клеток) и проверить жизнеспособность клеток путем trypan синий исключение окрашивания в гемоцитометр.
  4. Центрифуга при температуре 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (RT). Откажитесь от супернатанта и приостановите в холодном 1x PBS до требуемой концентрации (1,4 х 105 cd34и HSCs в 50 Л). Держите клетки на льду до инъекций.
  5. Поместите щенков (NS-цепнойnull щенки обоих полов от 1-4 дней) в стерильные 100 мм2 Петри блюдо вместе с небольшим количеством постельных принадлежностей материала из клетки заводчика. Кроме того, руб чистые постельные принадлежности между руками для дальнейшей маскировки любых посторонних запахов на получателей щенков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сводит к минимуму посторонние запахи время пропитанной на щенков, тем самым улучшая шансы матерей, принимающих их щенков обратно в клетки после процедуры.
  6. Положите чашку Петри в чистую транспортную клетку и поместите клетку в чистую клетку микроизолатора мыши, чтобы защитить щенков от окружающей среды. Обложка транспортной клетки с крышкой площадку, чтобы избежать воздействия животных на внешний свет во время транзита в облучение комнате.
  7. Облученные щенки с 100 cGy облучение всего тела (WBI) при воздействии 137 Cs источника. Очистите интерьер обилия дезинфицирующим раствором, поместите мышей в облучение и включите поворотный круг так, чтобы все щенки облучались однородно. Закройте облучение и нажмите выключатель питания, чтобы инициировать процесс облучения. Подождите, пока время облучения будет завершено и немедленно удалить мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку облучение не генерирует стресс у мышей, предыдущая анестезия не требуется.
  8. 2-4 ч после процедуры облучения, поместите щенков в шкаф биобезопасности внутри охлажденной стерильной чашке Петри, покрытой стерильной марлей на льду, пока анестезируется (5–10 мин). Достаточная анестезия достигается, когда грубые движения прекращаются.
  9. Загрузите шприц с прикрепленной иглой (29 G, 0.5") с 50 qL суспензии клетки и 1.4 x 105 CD34и HSCs под сертифицированным шкафом биобезопасности.
  10. Для прививки через печеночные инъекции, сдерживайте детенышей большим и указательным пальцами. Чтобы свести к минимуму удерживание мыши (30-45 с), пусть один следователь держать щенка и управлять инъекции, и второй следователь загрузить шприц с Подвеской HSC. Очистите место инъекции с 70% алкоголя и доставить 50 л клеток непосредственно в печень. Используйте неглубокий угол иглы при инъекциях, чтобы избежать полного пирсинга печени. В качестве контроля, вводить мышей с 50 Л 1x PBS в печень.
  11. Поместите щенков на предварительно разогретую стерильную чашку Петри, покрытую стерильной марлей в течение 1-5 мин, чтобы можно было восстановиться. Предварительно разогреть блюдо с помощью инфракрасного потепления площадку для грызунов при 20 градусов по Цельсию, чтобы убедиться, что щенки не будут чрезмерно нагреваться.
  12. Непосредственно перед возвращением детенышей к родителям, применять небольшое количество ментол- и эвкалипта основе мази, используя большой и указательный пальцы, к морде обоих родителей, чтобы избежать каннибализма или отказа от детенышей.
  13. Проверяйте клетки каждый день, ища любые признаки трансплантата против хозяина болезни (GVHD) в щенках, таких как сухая кожа, без кормления, сыпь, и облысение. Эвтаназия животных, если любой из этих признаков наблюдаются.
  14. Мышей wean в возрасте 3 недель, группируя их по полу. Не кладите более 5 животных на клетку. Проверить прививки в периферической крови с помощью цитометрии потока в 14 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешность прививок составляет от 80%-100%.

2. Человеческий PBMC прививок несовершеннолетних мышей

  1. Для острого и реактивации моделей, вводить 6-8 недельных NS-цепиnull мышей интраперитонева с человеческими ПБМК, полученных от здорового донора или ВИЧ-инфицированного пациента, который был под АРТ, соответственно. В обе их модели, включают мышей вводили с ПБМК от здорового донора без ВИЧ-инфекции (обман) в качестве контроля.
  2. Слой 15 мл цельной крови в 5 мл стерильной плотности градиента среды в 50 мл конической трубки.
  3. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин на RT, без тормозов, чтобы избежать буффи пальто становится смешанным с плотностью градиента среды.
  4. Тщательно соберите фракцию моноядерных клеток (между градиентной средой и супернатантом плотности) и перенесите шубу в 15 мл центрифуги, содержащую 10 мл 1x PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT.
  5. Откажитесь от супернатанта и удалите оставшиеся красные кровяные тельца, лизацией с 5 мл буфера ACK, добавленного в пеллетные клетки. Инкубировать в течение 4 мин на RT.
  6. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT. Отбросьте супернатант и отбросьте в 10 мл 1x PBS или RPMI 1640 среды.
  7. Используйте 10 зЛ суспензии клетки для подсчета клеток и проверки жизнеспособности путем trypan синий исключение окрашивания в гемоцитометр. Как правило, 1-2 х 106 клеток получаются на каждые 1 мл крови, с более чем 95% жизнеспособности.
  8. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин на RT. Отбросьте супернатант и отрегулируйте номер клетки до необходимой концентрации (в этом случае 3,5 х 106 ячеек в 200 кл. 1x PBS).
  9. Загрузите шприц с прикрепленной иглой (28 G, 0.5) с 3.5 x 106 PBMCs в 200 ЗЛ 1x PBS под сертифицированным шкафом биобезопасности.
  10. Снимите мышь из клетки и удерживайте ее за хвост, чтобы она сжимала сетку, применяя нежную тягу назад. Затем поместите указательные и пальцы большого пальца на плечи животного, захватив свободную кожу шеи и используя средний палец, чтобы стабилизировать спину.
  11. Сдвиньте голову мыши назад так, чтобы ее спина была над головой. Это позволяет внутренности в брюшной полости быть смещены назад и снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции.
  12. Очистите место инъекции с 70% алкоголя.
  13. Проникайте в шприц, используемый в шаге 2.9 через брюшную стенку и аспирировать перед введением клеток, если какой-либо материал аспирируется, удалить шприц и отказаться от него. В противном случае, вводить клетки медленно в интраперитонеальной полости, удалить шприц и отбросить его. Вводят 1x PBS для борьбы с мышами.
  14. Верните животное в клетку.
  15. Проверить прививки в периферической крови по течению цитометрии на 3 недели после инъекции.

3. Послетрансплантационный уход

  1. Определите мышей по пометке уха.
  2. Наблюдайте мышей используемых в этих экспериментах близко 2x в день после каждой процедуры для клинических знаков дистресса.
  3. После трансплантации клеток человека, контролировать мышей для GVHD. Для мониторинга симптомов ГВХД у новорожденных, несовершеннолетних и взрослых мышей, оценить животных на появление кожных заболеваний (например, цвет, сухость, сыпь, облысение), в дополнение к измерению веса тела. Оцените животных, которые показывают эти признаки ветеринаром рассмотреть ранней эвтаназии.

4. Процедура ВИЧ-инфекции и процедура фиктивной инфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для хронических и острых моделей, мыши инфицированы ШТАММом ВИЧ-бейл на 14-й и 3-й неделе после трансплантации, соответственно. Инъекции с ВИЧ вводятся интраперитоневом виде в нижние брюшные квадранты.

  1. Выполните процесс загрузки вируса/PBS в шприцы, используя 28 G 0.5 " иглу, в шкафах BSL2 после процедур ABSL2. Общее количество вводимого вируса составляет 15 000 медианных инфекционных доз культуры тканей (TCID50) в 200 л стерильных RPMI 1640.
  2. Снимите мышь из клетки и удерживайте ее за хвост, чтобы она сжимала сетку, применяя нежную тягу назад. Затем поместите указательный палец и большой палец на плечи животного, хватая свободную кожу шеи и используя средний палец, чтобы стабилизировать спину.
  3. Сдвиньте голову мыши назад так, чтобы ее спина была над головой. Это позволяет внутренности в брюшной полости быть смещены назад и снижает риск прокола внутренних органов во время инъекции.
  4. Очистите мышей с предварительно увлажненным алкоголем колодки в левом нижнем / правом квадранте живота. Вводят 15 000 TCID50 вируса ВИЧ-балов, содержащегося в 200 Зл стерильных RPMI 1640.
  5. После инъекции верните мышь в домашнюю клетку.

5. Сбор крови путем ретроорбитального прокола

ПРИМЕЧАНИЕ: Ретроорбитальные кровотечения позволяют быстро ездовые крови, тем самым уменьшая общее время сбора и повышая стабильность маркеров лимфоцитов человека. Используйте трубки EDTA для сбора крови мышей.

  1. В хронической модели, на 14 недель после инъекции HSC, собирать кровь через ретроорбитальные вены. В острой и реактивации моделей, выполнить эту процедуру на 3 недели после инъекции PBMC.
  2. Анестезия животных с помощью 250 л изофлюранинга до сбора крови в биобезопасности капот класса B2, который продуктивается изветины изофруранов.
  3. Распределите Isoflurane в ватные палочки под проволочной сеткой в прозрачной 1 L банку в биобезопасности кабинет вентилируемые за пределами здания. Использование сетки гарантирует, что животные не контактируют с пропитанной изофровной прокладкой, которая может вызвать раздражение кожи и потенциальное переутомление, так как изофруран также поглощается через кожу. Кроме того, положить мягкое бумажное полотенце между сеткой и животных, чтобы избежать травм конечностей.
  4. После того, как банку насыщенизомана (примерно 1 мин после его добавления), ввести животное и наблюдать скорость дыхания, которая будет увеличиваться, то уменьшается. Проверьте на клиническое указание на глубокую плоскость анестезии, которая включает в себя отсутствие выправа рефлекс (при опрокидывании банку мягко) и отсутствие валовых движений. Начните процедуру кровотечения, как только животное полностью расслаблено и не хватает щепотки ногой рефлекс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Так как изофлуран испаряется, обойтись больше наркотиков, если никаких признаков анестезии не наблюдается.
  5. Для ретроорбитального кровотечения прижмите мышь внешней яремной вены caudal к нижней челюсти с большим пальцем, и с той же рукой, осторожно поднять верхнее веко с указательным пальцем.
  6. Вставьте гематокриттрубкую трубку в медиальную канту с глаз и направьте ее в вентролатеральном направлении до тех пор, пока кровь не начнет меняться.
  7. Соберите не менее 100 кл крови. После получения желаемого объема крови (объем не превышает 1% массы тела животного) прекратите внешнее яремное давление и удалите гематократную трубку.
  8. Убедитесь, что гемостаз завершается, применяя прямое давление на глаз с помощью стерильной марли в течение как минимум 30 с.
  9. Нанесите тетракаин капли в глаз. Мониторинг животного, пока он полностью оправился от анестезии и поместить его обратно в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 100 л собранной крови используется для оценки уровня прививки человекаCD45 и других популяций клеток крови, а также для оценки плазменной вирусной нагрузки.

6. Скрининг уровня прививок и анализа цитометрии потока

  1. Следуйте обычной цитометрии потока окрашивания протокол для всей крови, которая включает в себя инкубацию фторхромных маркировки античеловеческих антител (для предлагаемой панели потока, см. Таблица материалов), а затем лиза красных кровяных телец и стирки шаги13,15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для скрининга уровня прививок, включите античеловеческое антитело CD45. Для сравнения, антитела CD45 антимышки также могут быть использованы. Включите контроль компенсации, а также образец крови человека, окрашенный той же смесью антител, неокрашенные образцы крови мыши и человека, и негуманизированный контроль для проверки перекрестной реактивности реагентов. После окрашивания всегда есть какой-то фоновый сигнал; однако все позитивные сигналы четко отличаются от отрицательных и кросс-реактивных элементов управления.
  2. В соответствующем цитометре потока, приобрести по крайней мере 10000 событий на воротах лимфоцитов (FSC-A против SSC-A). Для анализа цитометрии потока, после дублирования исключения, определить процент человеческих клеток CD45и, а также других групп клеток, представляющих интерес.

7. Оценка плазменной вирусной нагрузки

  1. Оцените вирусную нагрузку у ВИЧ-инфицированных животных в 1 раз в неделю после заражения.
  2. После ретроорбитального кровотечения (примерно 100 л) получить плазму, собирая супернатант после центрифугации антикоагулягированной крови при 3500 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге. Гранулы используются для фенотипирования клеток крови.
  3. Используйте коммерческий вирусный комплект для извлечения РНК (см. Таблица материалов)для получения РНК от 40 qL плазмы.
  4. Преобразуйте РНК в кДНК с помощью первой смеси синтеза штамма (см. Таблица материалов)и кляп ВИЧ грунтовки SK431.
  5. Выполните количественные ПЦР в реальном времени с использованием ВИЧ Gag праймеры SK38/SK39 и флуоресцентные зеленые красители (например, SYBR зеленый), как описано в предыдущих исследованиях13,25.

8. Применение антиретровирусной терапии

  1. Администрирование оральной АРТ по крайней мере через 3 недели после инфицирования, когда наблюдается высокая вирусная нагрузка, в хронических, острых и реактивационных моделях.
  2. Рассчитайте дозы тенофовир дисопроксил фуумарат (TDF), эмтрицитабин (FTC), и raltegravir (RAL), в соответствии с км значения 37 и 3 для людей и мышей, соответственно26. Как правило, эквивалентные человеку дозы TDF, FTC и RAL составляют 61,7 мг/кг/день, 40,7 мг/кг/день и 164 мг/кг/день, соответственно.
  3. Для введения в питьевой воде, раздавить таблетки наркотиков и добавить соответствующее количество в бутылку с водой, гарантируя, что каждая мышь в клетке приобретает свою суточную дозу. Так как порошок препарата может образовывать осадок в бутылке, периодически встряхивая бутылку воды для достижения однородной подвески.
  4. Каждую неделю меняйте бутылку с водой свежерастворимыми препаратами.
  5. Сбор крови через ретроорбитальные вены каждую неделю или каждые 2 недели после начала АРТ для оценки изменений в вирусной нагрузке и соотношении CD4:CD8.

9. Эвтаназия мыши, сбор вторичных лимфоидных органов и изоляция моноядерных клеток

  1. Эвтаназия выполняется в трех гуманизированных моделях мышей, периодически вдоль инфекционного времени, или в конце эксперимента.
  2. Выполните эвтаназию взрослых мышей с помощью CO2 асфиксии, а затем вывихшей шейки матки. Для удушья используйте незаряженную камеру, распределите CO2 из коммерческого цилиндра с регулятором фиксированного давления и в линию ограничителя, контролирующего поток газа в пределах 20%-30% от объема камеры/минуты в соответствии с руководящими принципами AVMA 2013 года.
  3. Поддержание потока CO2 для мониторинга остановки дыхания (который может занять до 5 минут), а затем вывих шейки матки для обеспечения эвтаназии.
  4. Эвтаназия новорожденных злт;7 дней назад физическим методом (т.е. с помощью острых ножниц).
  5. Визуализируйте подмышечные, медиалистические и мезентерические лимфатические узлы (которые обычно наблюдаются) и извлекайте их с помощью пинцета и острых ножниц. Также извлеките селезенку, расположенную в верхней левой стороне перитонеальной полости.
  6. Депозит лимфоидных тканей в 1,5 мл центрифуговых труб, содержащих стерильные RPMI 1640 среды.
  7. Немедленно обработайте лимфоидные ткани в 70-миллиметровом поро-размерном нейлоновом штамме, собирая клетки в трубке 50 мл. Не аспирируйте ткани.
  8. Вымойте клетки с 5 мл RPMI 1640 среды дополнили 1% FBS для облегчения фильтрации клеток.
  9. После дезагрегации тканей центрифугия клеток суспензия на 3500 х г в течение 10 мин в микроцентрифуге.
  10. Откажитесь от супернатанта и resuspend клетки с 500 Зл 1x PBS.
  11. Перенесите подвеску клеток в центрифужную трубку 1,5 мл, содержащую 500 л стерильной среды градиента плотности.
  12. Центрифуга при 3500 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге, без тормозов, чтобы предотвратить баффи пальто от смешивания с плотностью градиента среды
  13. Тщательно соберите фракцию моноядерных клеток (между градиентной средой и супернатантом плотности) и перенесите шубу в центрифугу мощностью 1,5 мл, содержащую 500 л 1x PBS. Центрифуга при 3000 х г в течение 3 мин.
  14. Удалите оставшиеся эритроциты, лизинируя 500 qL буфера ACK, инкубируя в течение 4 минут на RT.
  15. Центрифуга при 3000 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант и отбросьте в 1 мл 1x PBS или среднего.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как описано выше, в 14 недель после HSC инъекции (хроническая модель) или на 3 недели после PBMC инъекции (острые и реактивации моделей), мышей кровоточат для скрининга уровня человеческих клеток прививок потокцитометрии. Репрезентативная стратегия gating для оценки 1) человека CD45- реконституция клеток и 2) процент CD4и CD8- Т-клеток показана на рисунке 1A. Как правило, уровень прививки (в процентах от человеческих CD45и клеток) колеблется от 10%-80% после инъекции CD34и HSC и зависит от маршрута инъекций и мыши штамма, среди других ранее описанных факторов(Рисунок 1B). После инъекции PBMC уровень прививки (в процентах отклеток CD45 или CD3) колеблется от 5%-65%, также с различиями между штаммами мыши(рисунок 1B). Кроме того, некоторые различия между мышами, вводимыми pbMC, полученными от здорового и ВИЧ-инфицированного донора, можно наблюдать(рисунок 1D). Как правило, для ВИЧ-инфекции, уровни прививки выше 5%-10% достаточно для активной репликации вируса.

Важно отметить, что характерной чертой hu-PBL-NS-цепинулевой мыши модели является развитие ксеногенных GVHD в течение нескольких недель после клеточного прививок, в связи с человеческим Т-клеток признание мурин основных гистосовместимости комплекса (MHC) молекул23. Этот процесс очевиден, даже после 3 недель после инъекции PBMC, по таким признакам, как волосы и потеря веса(Рисунок 2A,B), а также увеличение экспрессии маркеров в Т-клетки, такие как HLA-DR и CD38 (Рисунок 2C, D). С другой стороны, GVHD более медленно развивается у мышей, вводимых с человеческим CD34и HSC и напрямую коррелирует с начальный уровень прививки.

После ВИЧ-инфекции, наблюдается быстрый рост плазменной вирусной нагрузки, как правило, обнаруживаются после 2-3 недель после инфекции, как в хронических и острых моделей(Рисунок 3A,B), с аналогичными кинетики в модели реактивации (Рисунок 3C). Увеличение вирусной нагрузки совпадает со снижением соотношения CD4:CD8(рисунок 3D,E,F). Эти изменения не наблюдаются в контроль мышей (без ВИЧ-инфекции, Рисунок 3). Следует отметить, что в модели нулевоймыши hu-PBL-NS-цепи можно наблюдать начальную инверсию соотношения CD4:CD8, которая была восстановлена по времени мониторинга(рисунок 3E,F). Наконец, если АРТ вводят ВИЧ-инфицированным мышам, ожидается подавление вирусной нагрузки, а также восстановление в соотношении CD4:CD8, достигающее уровней, аналогичных тем, которые находятся в неинфицированных средствах управления(рисунок 3A,C,D,F). Как правило, после 2-3 недель лечения, снижение вирусной нагрузки и увеличение соотношения CD4:CD8 наблюдается в хронических, острых и реактивационных моделей. Если этого не наблюдается, дозы препарата и маршрут введения нуждается в оценке.

Figure 1
Рисунок 1: Представительная стратегия gating для оценки уровней прививок человека CD45 и Т-клеток. (A) Стратегия Gating, используемая для скрининга процента человека CD45 (huCD45),CD3,CD4, иCD8 , и CD8 - Т-клетки в huNS-цепиnull мышей, на неделе 14 после инъекции с пуповинной крови CD34и HSCs. Цифры указывают процент каждого населения. (B) Представитель ные уровни прививки (в процентах от huCD45и клеток) в huNS q-цепиnull (n No 6) и аналогичный иммунодефицитный штамм с трансгенным выражением IL-3 и GM-CSF (huNOG-EXL, n No 6), как сообщалось ранее15. (C) Представитель ные уровни прививки (процент huCD3и клеток) в hu-PBL-NS-цепиnull и hu-PBL-SGM3 мышей (NS q-цепиnull мышей с трансгенной экспрессией SCF, GM-CSF, и IL-3), на неделе 3 после инъекции с PBMCs от здорового донора (острая модель, n 7 и n 8, соответственно). (D) Представитель ные уровни прививки (в процентах от huCD3и клеток) в hu-PBL-NSG-SGM3 мышей после инъекции с ПБМК от здорового или ВИЧ-инфицированного пациента, который был под АРТ (модель реактивации, no 10 и n 12, соответственно). В B-D строка указывает медиану, и отображается p-значение теста Манн-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Разработка GVHD в модели нулевой мыши hu-PBL-NS. (A) Выпадение волос у двух представительных мышей hu-PBL-NSG-SGM3, на 7 неделе после инъекции PBMC от здорового донора. (B) Потеря веса тела мыши на протяжении всего времени мониторинга нормализовалась до процента стартового веса у мышей hu-PBL-NSG-SGM3, вводили с помощью PBMC от здорового донора (n No 10) и ВИЧ-инфицированного пациента (n No 12). (C) Представитель выражение (на неделе 7 после трансплантации) HLA-DR и CD38 вCD4 и CD8- Т-клеток от hu-PBL-NSG-SGM3 мышей вводили с PBMCs от здорового донора. Цифры указывают процент каждого населения. (D) Представитель проценты CD4и CD8- Т-клеток, которые HLA-DRCD38 - в hu-PBL-NSG-SGM3 мышей вводят с PBMC от здорового донора. Примечательно, что в клетках до инъекций на мышей уровни HLA-DRи CD38cd38 и CD8и Т-клеток составили 2,0% и 5,7%, соответственно. В B и D отображается средний и межквартильный диапазон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные изменения вирусной нагрузки и соотношения CD4:CD8 у мышей huNS q-цепиnull после ВИЧ-инфекции и после введения АРТ. (A, D) Соотношение CD4:CD8 и плазменная вирусная нагрузка у хун-энд-цепинулевых мышей после заражения ВИЧ-балами (красные точки и линия, n No 3), которые были выполнены после недели 14 инъекций с пуповинной кровью CD34и HSCd. Неинфицированные элементы управления (PBS-впрыскиваемые) также были включены (зеленые точки и линии, n No 5). (B, E) Плазменная вирусная нагрузка и соотношение CD4:CD8 у мышей hu-PBL-NSG-SGM3 после заражения ВИЧ-балем (красные точки и линия, n No 4), которое было выполнено на неделе 3 после инъекции PBMC от здорового донора (острая модель). Неинфицированные элементы управления (PBS-впрыскиваемые) также были включены (зеленые точки и линии, n No 3). (C и F) Плазменная вирусная нагрузка и соотношение CD4:CD8 у мышей hu-PBL-NSG-SGM3, вводили ПБМК от ВИЧ-инфицированного донора (красные точки и линии,. 9) или здорового донора (зеленые точки и линии, n - 10) (модель реактивации). Во всех случаях отображается средний и межквартильный диапазон. В A-C пунктирной линии указывается предел обнаружения ассея (150 копий/мл). Для образцов с необнаруживаемой вирусной нагрузкой было назначено значение, равное половине предела обнаружения. В D-F пунктирная линия указывает на соотношение CD4:CD8 1. В A, C, D и F серая коробка указывает время с администрированием АРТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важные достижения были достигнуты в развитии иммунодефицитных штаммов мыши для гуманизации, с рядом различных вариантов, которые могут быть использованы в соответствии с интересом исследования1. Здесь приведен общий протокол для гуманизации н.с. цепинулевых мышей и генетически аналогичных штаммов, которые будут использоваться в трех различных моделей для изучения ВИЧ-инфекции. В первом экспериментальном подходе облученные новорожденные мыши вводят сяпованные с помощью cd34и HSCs человека, которые могут быть получены из пуповинной крови, печени плода, или мобилизованной периферической крови3,21. Соответствующее облучениенэнд-цепных нулевых мышей является критическим шагом, так как оно устраняет костный мозг мыши и другие клетки-прародители, позволяя эффективно восстановить популяции клеток человека. Тем не менее, некоторые доклады свидетельствуют о восстановлении человеческих клеток в различных штаммов мыши, без облучения27. В связи с этим, надлежащие дозы облучения должны быть предоставлены, так как NS q-цепинулевых мышей являются радиочувствительными, и высокий q-облучение может вызвать тимический лимфогенез21,28.

Другие критические шаги и факторы, которые могут повлиять на уровень прививки включают маршрут инъекции (внутрипеченевого, внутривенного, внутрисердечного), мышей возраста, процент чистоты CD34и HSCs, и оператор экспертизы29. Во втором и третьем подходах, основанных на моделях нулевоймыши hu-PBL-NS, некоторые критические факторы включают маршрут инъекций (интраперитонеальный, внутривенный, интраспелин), возраст мышей и количество инъекционных клеток человека, которые могут влиять на конечный уровень прививки. Что касается этого последнего фактора, несколько исследований использовали 5-10 х 106 PBMCs для прививки22,23,30, в то время как настоящий протокол предлагает использование 3,5 х 106 PBMCs. Следует отметить, что это количество клеток достаточно для восстановления Т-клеток и для репликации ВИЧ, как в острой и реактивации моделей, а также задерживает развитие GVHD23. Тем не менее, исследователи должны оптимизировать условия гуманизации в соответствии с целями исследования. Кроме того, важно проверить штамм ВИЧ, используемый для заражения хуня и цепинулевых мышей. Здесь используется штамм R5 tropic HIV-1 BaL, который дает высокий уровень репликации вируса у хун-цепныхнулевых мышей. Другие штаммы репортера, такие как те, которые содержат люциферазу или флуоресцентные белки, также подходят для одноклеточного анализа ВИЧ-инфицированных клеток31.

В целом, три основных ограничения проявляются в huNS-цепинулевой мыши моделей после прививки с CD34и HSC. Во-первых, из-за отсутствия тимической среды человека, Т-клетки образованы в контексте молекул Murine MHC, сдерживая последующую антиген-специфическую стимуляцию через свои Т-клеточные рецепторы. Этот вопрос ограничивает использование моделейнулевой мыши NS q-цепи для изучения реакции Т-клеток, специфичных для ВИЧ-специфических. Тем не менее, это ограничение может быть преодолено с помощью BLT мышей или NS цепинулевой мышей с трансгенной экспрессией молекул HLA16,17. Во-вторых, как правило, существует плохая реконституция популяций миелоидов в NS цепинулевой мыши моделей, ограничивая изучение этих подмножеств, которые имеют отношение в контексте антиген-презентации и патогенеза ВИЧ-инфекции14,15. В этом случае рекомендуется использовать штаммы мыши с трансгенным выражением гематопогетических факторов8,15,32.

В-третьих, есть 1) плохое развитие лимфоидных фолликулов структур во вторичных лимфоидных тканей и 2) отсутствие третичных лимфоидных тканей, что связано с низким уровнем врожденных иммунных клеток (т.е., дендритные клетки в huNS- цепьнулевых мышей), которые имеют решающее значение для развития фолликулов33. Этот вопрос связан с плохой юмористической реакции в huNS цепинулевой мыши модели34. Тем не менее, некоторые доклады свидетельствуют о развитии фолликула-подобных структур в huNS-цепи null мышей4, в то время как селезенка- и лимфатические узлы ограничены фолликулярных Т-клеток (выражение фолликул-находной хемоцин рецептор CXCR5) обнаружены в huNS цепинулевых мышей и связанных с ними штаммов 15). Опять же, использование 1) BLT мышей или 2) мыши штаммов с трансгенным выражением гематопогетических факторов и / или с выражением молекул HLA может улучшить восстановление популяций миелоидов, развитие организованных вторичных и третичных лимфоидных структур, а также эффективные Т-клеточные и B-клеточные ответы8,35,36.

Подобно ограничениям CD34- HSC-гуманизированных моделейнлигеш-цепи null мыши, есть отсутствие антиген-специфических Т-клеток и юмористических реакций, отсутствие миелоидных популяций, а также организованные лимфоидные структуры в hu-PBL-NS-цепнойнулевой мышей. Кроме того, важным ограничением модели нулевоймыши hu-PBL-NS (острые и реактивационные модели ВИЧ-инфекции) является коротким окном для мониторинга, так как у этих мышей развивается ксеногенный GVHD23. Развитие GVHD может также вызвать нежелательные фенотипические и функциональные изменения иммунных популяций, присущие патогенный процесс23,37. Тем не менее, эта модель имеет то преимущество, что проще и доступнее, особенно с учетом того, что человеческие ПБМС легче приобрести у здоровых или ВИЧ-инфицированных доноров38. Кроме того, инъекция первичных клеток непосредственно от пациентов полезна для изучения клеточных или патогенно-внутренних состояний донора, таких как вирусные мутации лекарственной устойчивости или донорские специфические иммунные изменения. Следует отметить, что для модели реактивации, in vitro анализы с агентами реактивации ВИЧ могут быть выполнены для подтверждения реакции ПБМК перед инъекцией в мышей39. Еще одним ограничением для некоторых учреждений является то, что эта работа требует BSL2 "объектов для обработки ВИЧ-инфицированных животных в соответствии с правилами.

Модели нулевоймыши huNS и цепи имеют некоторые преимущества по сравнению с другими моделями животных для изучения ВИЧ-инфекции, таких как нечеловеческие приматы, инфицированные вирусом иммунодефицита симиана. Например, мыши huNS q-цепиnull позволяют творение нокаута гена или трансгенных штаммов, которые позволяют оценить конкретные цели гена. Кроме того, использование первичных человеческих клеток в huNS q-цепинулевых мышей позволяет избежать возможных видов конкретных ограничений, таких как случай интерферона стимулировали гены у нечеловеческих приматов, которые могут влиять на противовирусную реакцию и ход инфекции40. Таким образом, кинетика инфекции очень согласована между мышами huNS q-цепьюnull. Наконец, модели нулевоймыши huNS и цепи являются менее дорогостоящими, не требуют сложных основных средств и более доступны.

Таким образом, модели cd34и HSC-humanized и hu-PBL-NS q-chainnull mouse предлагают различные возможности для изучения хронических, острых и реактивационных событий при ВИЧ-инфекции. С признанием и преодолением вышеупомянутых ограничений этих моделей, использование н.э.-цепинулевых мышей может быть мощным инструментом для вирусологических, иммунологических и лекарственных доклинических исследований, а также для редактирования генома и клеточной иммунотерапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана IHV клинического отдела внутренних средств в JC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 154,CD34 PBMC интрагепатические инъекции интраперитонеальные инъекции ретро-орбитальные кровотечения ВИЧ
Хроническая, острая и активированная ВИЧ-инфекция в гуманизированных иммунодефицитных моделях мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno,… More

Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter