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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

Published: December 3, 2019 doi: 10.3791/60315
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

Summary

Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.

Abstract

Los ratonesnulos de cadena NOD/SCID/IL-2 humanizados recapitulan algunas características de la inmunidad humana, que pueden ser explotadas en la investigación básica y preclínica sobre enfermedades infecciosas. Aquí se describen tres modelos de ratones inmunodeficientes humanizados para estudiar la dinámica de la infección por VIH. La primera se basa en la inyección intrahepática de CD34+ células madre hematopoyéticas en ratones recién nacidos, lo que permite la reconstitución de varias células confinadas de sangre y tejido linfoide, seguida de una infección con una cepa de VIH de referencia. Este modelo permite la monitorización de hasta 36 semanas después de la infección y por lo tanto se llama el modelo crónico. El segundo y el tercer modelo se conocen como modelos agudos y de reactivación, en los que las células mononucleares de sangre periférica se inyectan por vía intraperitoneal en ratones adultos. En el modelo agudo, las células de un donante sano se injertan a través de la vía intraperitoneal, seguida de una infección con una cepa de VIH de referencia. Por último, en el modelo de reactivación, las células de un donante infectado por el VIH bajo tratamiento antirretroviral se injertan por vía intraperitoneal. En este caso, un entorno libre de drogas en el ratón permite la reactivación de virus y un aumento de la carga viral. Los protocolos proporcionados aquí describen el enfoque experimental convencional para los modelos de ratón humanizados e inmunodeficientes de la infección por VIH.

Introduction

El modelo de ratón humanizado NOD/SCID/interleukin (IL)-2-chain-chain null (en adelante, huNS -cadenanula)ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la patogénesis de infecciones, autoinmunidad y cáncer, así como para estudios preclínicos de fármacos y terapias basadas en células humanas1,2. Estos ratones se basan en un fondo diabético no obeso (NOD), con la mutación scida y la mutación dirigida en el locus de cadena del receptor IL-2 (cadena común para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que inducen un deterioro grave en el desarrollo de células de ratón T-, B- y natural killer (NK)1. Por lo tanto, apoyan el injerto de tejido humano, humano CD34+ células madre hematopoyéticas (HSC), y células mononucleares de sangre periférica humana (PPBM)3,4,5. Además, la expresión transgénica de factores hematopoyéticos humanos, como el factor de células madre (SCF), el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrorófagos (GM-CSF), y la IL-3 promueve el injerto de las poblaciones mieloides humanas6,7,8.

Para los estudios sobre el VIH, se han descrito varios modelos de ratónnulo de cadena huNS, que difieren en la tensión del ratón, el tipo de células humanas utilizadas, el tipo de tejidos para el injerto y el origen de las células (es decir, sanos vs. Donante infectado por el VIH)9,10. La cepa original, sin embargo, es ampliamente utilizada debido a los altos niveles de injerto de células humanas y replicación viral después de la infección con una cepa de referencia del VIH11,12,13. Cepas similares de ratón inmunodeficientes con expresión transgénica de factores hematopoyéticos humanos (p. ej., NOG-EXL o NSG-SGM3) o con implantes de hígado humano y tejidos de timo (ratones de médula ósea-hígado-timo [BLT]) son útiles para evaluar el papel de las poblaciones mieloides en la respuesta inmune anti-VIH, los efectos del VIH en estos tejidos y su participación como reservorios virales14,15. Además, algunas cepas con expresión transgénica de moléculas de antígeno leucocito humano (HLA), así como ratones BLT, se pueden utilizar para estudiar la respuesta de las células T a la infección por VIH16,17.

En general, en estos ratones, la humanización depende del origen celular, la vía de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiaca) y la edad del ratón en el momento del injerto18,19,20. En cuanto al origen celular, se puede inyectar en ratones recién nacidos o jóvenes CD34+ HSC derivados de la sangre del cordón umbilical, el hígado fetal o la sangre periférica movilizada3,21. Además, los ratonesnulos de cadena adulta pueden ser humanizados por la inyección de PBMC (en este caso, conocido como ratonesnulos de cadena hu-PBL-NS), permitiendo la circulación temporal de estas células en la sangre, órganos linfoides secundarios y tejidos inflamados22,23,24.

Aquí se describe un protocolo detallado para el establecimiento de modelos de ratónnulo de cadena huNS para el estudio de la infección por VIH. El primero es el modelo crónico, en el que los CD34+ HSC humanos derivados de la sangre del cordón umbilical de un donante sano se inyectan en ratones recién nacidos, seguido de una infección con una cepa de VIH de referencia después de 14 semanas de reconstitución del sistema inmunitario humano. Este modelo permite la monitorización de ratones durante un máximo de 36 semanas después de la infección. El segundo modelo es un modelo agudo, en el que los PMAC derivados de un donante sano se inyectan en ratonesnulos adultos de cadena NS, seguidos de una infección con una cepa de VIH de referencia después de 3 semanas de expansión de células T humanas en el ratón. Por último, el tercer modelo es el modelo de reactivación, en el que se inyectan PAPI derivados de un donante infectado por el VIH bajo terapia antirretroviral supresiva (TAR) en ratonesnulos adultos de cadena NS. En este caso, un entorno libre de drogas permite la reactivación viral y el aumento de la carga viral. Los dos últimos modelos permiten la monitorización hasta 9 semanas después del injerto.

En general, estos tres modelos son útiles para estudios virológicos, estudios preclínicos de nuevos fármacos y la evaluación de los efectos de la infección por VIH en la respuesta inmunitaria global. También es importante considerar que el uso de ratones humanizados infectados por el VIH requiere la revisión y aprobación por parte del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC), así como por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) antes de cualquier experimento. Esto garantiza que el estudio siga todas las regulaciones institucionales internas y externas para el uso de material biológico peligroso y el manejo humano de animales experimentales.

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Protocol

En este trabajo, todos los cuidados y procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con los protocolos revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad de Maryland (números de protocolo 1018017, 1018018 y 0318009).

1. Enjerción humana de CD34+ HSC de ratones recién nacidos

  1. Utilice siempre equipos de protección personal desechables (EPP), incluidos exfoliantes estériles, guantes, zapatos dedicados, fundas de zapatos, máscaras, gafas, sombrero de cabello/barba y abrigos de laboratorio estériles.
  2. Vuelva a suspender 1 x 106 de CD34 congelado+ HSCs (ver Tabla de Materiales)en 10 mL de RPMI 1640 medios 10% FBS bajo un gabinete de bioseguridad certificado y mantener condiciones estériles.
  3. Utilice 10 l de la suspensión para contar (para asegurar la presencia del número esperado de células) y compruebe la viabilidad celular mediante la tinción de exclusión azul trypan en un hemocitómetro.
  4. Centrífuga a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y resuspenda en frío 1x PBS a la concentración requerida (1,4 x 105 de CD34+ HSCs en 50 l). Mantenga las células en hielo hasta la inyección.
  5. Coloque los cachorros (pupsnulos de cadena NS de ambos sexos de 1 a 4 días de edad) en un plato estéril de 100 mm2 Petri junto con una pequeña cantidad de material de cama de la jaula del criador. Además, frote la ropa de cama limpia entre las manos para enmascarar aún más los olores extraños en los cachorros receptores.
    NOTA: Esto minimiza los olores extraños que se impregnan en los cachorros, mejorando así las posibilidades de que las madres acepten a sus cachorros de nuevo en las jaulas después del procedimiento.
  6. Coloque el plato Petri en una jaula de transporte limpia y coloque la jaula en una jaula de microisolator de ratón limpia para proteger a los cachorros del medio ambiente. Cubra la jaula de transporte con una almohadilla de cubierta para evitar la exposición de los animales a la luz externa mientras está en tránsito a la sala de irradiación.
  7. Irradiar cachorros con irradiación de cuerpo entero (WBI) de 100 cGy por exposición a una fuente de 137 Cs. Limpie el interior del irradiador con solución desinfectante, coloque ratones en el irradiador y encienda el plato giratorio para que todos los cachorros sean irradiados de forma homogénea. Cierre el irradiador y pulse el interruptor de encendido para iniciar el proceso de irradiación. Espere hasta que se complete el tiempo de irradiación y retire inmediatamente los ratones.
    NOTA: Dado que la irradiación no genera estrés en los ratones, no se requiere anestesia previa.
  8. 2-4 h después del procedimiento de irradiación, coloque los cachorros en un gabinete de bioseguridad dentro de un plato de Petri estéril refrigerado cubierto con gasa estéril sobre hielo, hasta que se anesteta (5-10 min). Se logra anestesia suficiente cuando cesan los movimientos brutos.
  9. Cargue la jeringa con una aguja conectada (29 G, 0,5") con 50 ml de la suspensión celular y 1,4 x 105 de CD34+ HSCs bajo el gabinete de bioseguridad certificado.
  10. Para el injerto a través de la inyección hepática, sujeta los cachorros con el pulgar y los dedos índice. Para minimizar la sujeción del ratón (30–45 s), deje que un investigador sostenga el cachorro y administre la inyección, y pida al segundo investigador que cargue la jeringa con la suspensión HSC. Limpie el lugar de inyección con un 70% de alcohol y entregue 50 ml de células directamente en el hígado. Utilice un ángulo de aguja poco profundo al inyectar para evitar perforar completamente el hígado. Como control, inyectar ratones con 50 s de 1x PBS en el hígado.
  11. Coloque los cachorros en un plato de Petri estéril precalentado cubierto con gasa estéril durante 1-5 minutos para permitir la recuperación. Precalienta el plato usando una almohadilla de calentamiento infrarroja para roedores a 20oC para asegurar que los cachorros no estén sobrecalentados.
  12. Inmediatamente antes de devolver los cachorros a sus padres, aplique una pequeña cantidad de pomada a base de mentol y eucalipto, usando el pulgar y los dedos índice, al hocico de ambos padres para evitar el canibalismo o el rechazo de los cachorros.
  13. Revise las jaulas todos los días, buscando cualquier signo de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) en los cachorros, como piel seca, sin alimentación, erupción cutánea y alopecia. Eutanasia a los animales si se observa alguno de estos signos.
  14. Desteta los ratones a las 3 semanas de edad, agrupándolos por género. No ponga más de 5 animales por jaula. Verifique el injerto en la sangre periférica por citometría de flujo a las 14 semanas de edad.
    NOTA: La tasa de éxito del injerto está entre el 80% y el 100%.

2. Injerto de PBMC humano de ratones juveniles

  1. Para los modelos agudos y de reactivación, inyecte ratonesnulos de cadena NS de 6 a 8 semanas por vía intraperitoneal con PMAC humanos derivados de un donante sano o un paciente infectado por el VIH que estaba bajo ART, respectivamente. En ambos modelos, incluya ratones inyectados con PBB de un donante sano sin infección por VIH (sham) como controles.
  2. Capa 15 ml de sangre entera en 5 ml de medio gradiente de densidad estéril en un tubo cónico de 50 ml.
  3. Centrífuga a 400 x g durante 30 min en RT, sin frenos, para evitar que la capa buffy se mezcle con el medio de gradiente de densidad.
  4. Recoger cuidadosamente la fracción de las células mononucleares (entre el medio de gradiente de densidad y el sobrenadante) y transferir la capa de color buffy a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 10 ml de 1x PBS. Centrífuga a 300 x g durante 10 min a RT.
  5. Deseche el sobrenadante y retire los glóbulos rojos restantes lysing con 5 ml de tampón de confirmación añadido a las células peletadas. Incubar durante 4 min a RT.
  6. Centrífuga a 300 x g durante 10 min en RT. Deseche el sobrenadante y resuspenda en 10 ml de 1x pbS o RPMI 1640 medio.
  7. Utilice 10 l de la suspensión celular para contar las células y comprobar la viabilidad mediante la tinción de exclusión azul trypan en un hemocitómetro. Típicamente, 1–2 x 106 células se obtienen por cada 1 ml de sangre, con más del 95% de viabilidad.
  8. Centrífuga a 300 x g durante 10 minutos en RT. Deseche el sobrenadante y ajuste el número de celda a la concentración requerida (en este caso, 3,5 x 106 células en 200 éL de 1x PBS).
  9. Cargue la jeringa con una aguja conectada (28 G, 0,5") con 3,5 x 106 de PMAC en 200 oL de 1 pbS en un gabinete de bioseguridad certificado.
  10. Retire el ratón de la jaula y sosténgalo por la cola para que pueda agarrar la malla, aplicando una tracción suave hacia atrás. Luego, coloca el índice y los dedos del pulgar sobre los hombros del animal, agarrando la piel suelta del cuello y usando el dedo medio para estabilizar su espalda.
  11. Deslice la cabeza del ratón hacia atrás para que su espalda esté por encima de la cabeza. Esto permite que las vísceras de la cavidad abdominal se desplacen hacia atrás y reduce el riesgo de puntuar los órganos internos durante la inyección.
  12. Limpie el lugar de inyección con un 70% de alcohol.
  13. Penetra rinde la jeringa utilizada en el paso 2.9 a través de la pared abdominal y aspira antes de inyectar las células, si se aspira algún material, retira la jeringa y deséchala. De lo contrario, inyecte las células lentamente en la cavidad intraperitoneal, retire la jeringa y deséchela. Inyectar 1x PBS para controlar ratones.
  14. Devuelva al animal a su jaula.
  15. Verifique el injerto en sangre periférica por citometría de flujo a las 3 semanas después de la inyección.

3. Cuidado post-injerto

  1. Identifique a los ratones mediante el etiquetado de oídos.
  2. Observe los ratones utilizados en estos experimentos de cerca 2 veces al día después de cada procedimiento para los signos clínicos de angustia.
  3. Después del trasplante de células humanas, monitoree ratones para la EICH. Para monitorear los síntomas de la EICH en ratones recién nacidos, juveniles y adultos, evalúe a los animales para la aparición de la enfermedad de la piel (es decir, color, sequedad, erupción cutánea, alopecia), además de la medida de peso corporal. Evaluar a los animales que muestran estos signos por un veterinario para considerar la eutanasia temprana.

4. Procedimiento de infección por VIH y procedimiento de infección falsa

NOTA: Para los modelos crónicos y agudos, los ratones están infectados con la cepa de referencia del VIH BaL en la semana 14 y la semana 3 después del injerto, respectivamente. Las inyecciones con VIH se administran por vía intraperitoneal en los cuadrantes abdominales inferiores.

  1. Realice el proceso de carga del virus/PBS en jeringas, utilizando una aguja de 28 G 0,5", en gabinetes BSL2 siguiendo los procedimientos de ABSL2. La cantidad total de virus inyectados es de 15.000 dosis infecciosas de cultivo de tejido medio (TCID50) en 200 l de RPMI 1640 estéril.
  2. Retire el ratón de la jaula y sosténgalo por su cola para que pueda agarrar la malla, aplicando una tracción suave hacia atrás. Luego, coloca el dedo índice y el pulgar sobre los hombros del animal, agarrando la piel suelta del cuello y usando el dedo medio para estabilizar la espalda.
  3. Deslice la cabeza del ratón hacia atrás para que su espalda esté por encima de su cabeza. Esto permite que las vísceras de la cavidad abdominal se desplacen hacia atrás y reduce el riesgo de punción de órganos internos durante la inyección.
  4. Limpie los ratones con una almohadilla de alcohol previamente humedecido en el cuadrante inferior izquierdo/derecho del abdomen. Inyectar 15.000 TCID50 del virus del VIH BaL contenido en 200 l de RPMI 1640 estéril.
  5. Después de la inyección, devuelva el ratón a su jaula de origen.

5. Recolección de sangre por punción retroorbital

NOTA: El sangrado retroorbital permite la rápida acumulación de sangre, reduciendo así el tiempo total de recolección y aumentando la estabilidad de los marcadores de linfocitos humanos. Use tubos EDTA para recolectar sangre de ratones.

  1. En el modelo crónico, a las 14 semanas después de la inyección de HSC, recoger la sangre a través de la vena retroorbital. En los modelos agudos y de reactivación, realice este procedimiento a las 3 semanas de inyección post-PBMC.
  2. Anestetizar a los animales utilizando 250 l de inhalación de isoflurano antes de la recolección de sangre en una campana de bioseguridad clase B2 que se canaliza externamente.
  3. Dispensar el Isoflurano en almohadillas de algodón debajo de una malla de alambre en un frasco transparente de 1 L en un gabinete de bioseguridad ventilado fuera del edificio. El uso de la malla asegura que los animales no entren en contacto con la almohadilla empapada de isoflurano, que puede causar irritación de la piel y posible sobredosis ya que el isoflurano también se absorbe a través de la piel. Además, coloca una toalla de papel suave entre la malla y el animal para evitar lesiones en las extremidades.
  4. Una vez que el frasco está saturado con isoflurano (aproximadamente 1 min después de añadirlo), introducir el animal y observar la frecuencia respiratoria, que aumentará y luego disminuir. Compruebe la indicación clínica de un plano profundo de la anestesia, que incluye la falta de un reflejo de retorcimiento (al inclinar suavemente el frasco) y la falta de movimientos brutos. Inicie el procedimiento de sangrado tan pronto como el animal esté completamente relajado y carente del reflejo de pellizcar del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
    NOTA: Dado que el isoflurano se evapora, dispensar más medicamentos si no se observan signos de anestesia.
  5. Para el sangrado retroorbital, presione el caudal de la vena yugular externa del ratón a la mandíbula con el pulgar, y con la misma mano, levante suavemente el párpado superior con el dedo índice.
  6. Inserte un tubo de hematocrito en el canthus medial del ojo y dirijalo en dirección ventrolateral hasta que la sangre comience a funderse.
  7. Recoger al menos 100 l de sangre. Una vez obtenido el volumen deseado de sangre (un volumen no superior al 1% del peso corporal del animal), interrumpa la presión yugular externa y retire el tubo de hematocrito.
  8. Asegúrese de que la hemostásis está completa aplicando la presión directa sobre el ojo utilizando una gasa estéril durante un mínimo de 30 s.
  9. Aplique gotas de tetracaína en el ojo. Monitoree al animal hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia y colóquelo de nuevo en la jaula.
    NOTA: Los 100 l de sangre recogida se utilizan para la evaluación del nivel de injerto de CD45+ humano y otras poblaciones de células sanguíneas, así como para la evaluación de la carga viral plasmática.

6. Examen del nivel de injerto y análisis de citometría de flujo

  1. Siga un protocolo de tinción de citometría de flujo convencional para sangre entera, que incluye la incubación de anticuerpos antihumanos etiquetados con fluorocromo (para el panel de flujo sugerido, véase Tabla de materiales), seguido de la lisis de los glóbulos rojos y los pasos de lavado13,15.
    NOTA: Para el cribado del nivel de injerto, incluya un anticuerpo CD45 antihumano. Para la comparación, también se puede utilizar un anticuerpo CD45 antiratón. Incluya controles de compensación, así como una muestra de sangre humana manchada con la misma mezcla de anticuerpos, muestras de ratón y sangre humana no manchadas, y control no humanizado para probar la reactividad cruzada de los reactivos. Después de la tinción, siempre hay alguna señal de fondo; sin embargo, todas las señales positivas se distinguen claramente de los controles negativos y reactivos cruzados.
  2. En un citómetro de flujo apropiado, adquiera al menos 10.000 eventos en la puerta del linfocito (FSC-A vs. Para el análisis de citometría de flujo, después de la exclusión duplicada, determinar el porcentaje de CD45+ células humanas, así como otras poblaciones celulares de interés.

7. Evaluación de la carga viral plasmática

  1. Evaluar la carga viral en animales infectados por el VIH 1 veces por semana después de la infección.
  2. Después del sangrado retroorbital (aproximadamente 100 l), obtener plasma mediante la recolección del sobrenadante después de la centrifugación de la sangre anticoagulada a 3.500 x g durante 3 minutos en una microcentrífuga. El pellet se utiliza para el fenotipado de células sanguíneas.
  3. Utilice un kit comercial de extracción de ARN viral (ver Tabla de Materiales)para obtener ARN a partir de 40 ml de plasma.
  4. Convierta el ARN en CDNA utilizando la primera mezcla de síntesis de deformación unitaria (ver Tabla de Materiales)y imprimación de mordaza VIH SK431.
  5. Realizar PCR cuantitativo en tiempo real utilizando imprimaciones de medición de VIH SK38/SK39 y colorantes verdes fluorescentes (por ejemplo, SYBR green) como se describe en estudios anteriores13,25.

8. Administración de terapia antirretroviral

  1. Administrar ART oral al menos 3 semanas después de la infección, cuando se observa una alta carga viral, en los modelos crónicos, agudos y de reactivación.
  2. Calcular las dosis de tenofovir disoproxilo fumarato (TDF), emtricitabina (FTC) y raltegravir (RAL), según los valores de Km de 37 y 3 para humanos y ratones, respectivamente26. Típicamente, las dosis equivalentes humanas de TDF, FTC y RAL son 61,7 mg/kg/día, 40,7 mg/kg/día y 164 mg/kg/día, respectivamente.
  3. Para la administración en agua potable, triturar los comprimidos de drogas y añadir la cantidad respectiva en la botella de agua, asegurando que cada ratón en la jaula adquiere su dosis diaria. Dado que el medicamento en polvo puede formar sedimentos en la botella, agitar periódicamente la botella de agua para lograr una suspensión homogénea.
  4. Cambie la botella de agua cada semana con medicamentos recién disueltos.
  5. Recoger la sangre a través de la vena retroorbital cada semana o cada 2 semanas después de la iniciación del TAR para evaluar los cambios en la carga viral y la relación CD4:CD8.

9. Eutanasia de ratón, acumulación de órganos linfoides secundarios y aislamiento de células mononucleares

  1. La eutanasia se realiza en los tres modelos de ratón humanizados, periódicamente a lo largo del tiempo de infección, o al final del experimento.
  2. Realizar la eutanasia de ratones adultos mediante asfixia porCO2, seguida de la luxación cervical. Para la asfixia, utilice una cámara no precargada, dispensar CO2 de un cilindro comercial con regulador de presión fija y en línea restricdor controlando el flujo de gas dentro del 20%-30% del volumen de la cámara / minuto para cumplir con las directrices de 2013 AVMA.
  3. Mantener el flujo deCO2 para >60 s monitoreo de paro respiratorio (que puede tardar hasta 5 min), seguido de la luxación cervical para asegurar la eutanasia.
  4. Eutanasia sinneatos <7 días de edad por un método físico (es decir, usando tijeras afiladas).
  5. Visualice los ganglios linfáticos axilares, mediastinales y mesentéricos (que normalmente se observan) y extráigalos con pinzas y tijeras afiladas. También extraer el bazo, situado en la parte superior izquierda de la cavidad peritoneal.
  6. Depositar los tejidos linfoides en tubos centrífugos de 1,5 ml que contengan un medio estéril RPMI 1640.
  7. Procesa inmediatamente los tejidos linfoides en un colador de células de nylon del tamaño de un poro de 70 mm, recogiendo las células en un tubo de 50 ml. No aspirar los tejidos.
  8. Lavar las células con 5 ml de rpm 1640 medio complementado con 1% FBS para facilitar el filtrado de las células.
  9. Después de la desagregación del tejido, centrifugar la suspensión de las células a 3.500 x g durante 10 minutos en una microcentrífuga.
  10. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con 500 s de 1pbS.
  11. Transfiera la suspensión de las células a un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga 500 ml de medio de gradiente de densidad estéril.
  12. Centrífuga a 3.500 x g durante 3 min en una microcentrífuga, sin freno, para evitar que la capa buffy se mezcle con el medio de gradiente de densidad
  13. Recoger cuidadosamente la fracción de las células mononucleares (entre el medio de gradiente de densidad y el sobrenadante) y transferir la capa de buffy a un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contiene 500 l de 1 x PBS. Centrífuga a 3.000 x g durante 3 min.
  14. Retire los glóbulos rojos restantes lysing con 500 l de tampón de aCK, incubando durante 4 minutos a RT.
  15. Centrífuga a 3.000 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda en 1 ml de 1x PBS o medio.

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Representative Results

Como se describió anteriormente, a las 14 semanas después de la inyección de HSC (modelo crónico) o a las 3 semanas de inyección post-PBMC (modelos agudos y de reactivación), los ratones se desangran para detectar el nivel de injerto de células humanas por citometría de flujo. En la Figura 1Ase muestra una estrategia representativa de gating para la evaluación de 1) CD45humano + reconstitución de células y 2) porcentaje de células CD4+ y CD8+ T. Típicamente, el nivel de injerto (porcentaje de CD45+ células humanas) oscila entre 10% –80% después de la inyección de CD34+ HSC y depende de la ruta de la inyección y la tensión del ratón, entre otros factores descritos previamente(Figura 1B). Después de la inyección de PBMC, el nivel de injerto (porcentaje de CD45+ o CD3+ células humanas) oscila entre 5%-65%, también con diferencias entre las cepas del ratón(Figura 1B). Además, se pueden observar algunas diferencias entre los ratones inyectados con PBMC derivados de un donante sano frente a un donante infectado por el VIH(Figura 1D). Por lo general, para la infección por el VIH, los niveles de injerto por encima del 5%-10% son suficientes para la replicación viral activa.

Es importante destacar que una característica de los modelos de ratónnulo de cadena hu-PBL-NS es el desarrollo de la EICH xenogénica dentro de unas pocas semanas después del injerto celular, debido al reconocimiento humano de células T humanas de moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor murino (MHC)23. Este proceso es evidente, incluso después de 3 semanas de inyección post-PBMC, por signos como pérdida de cabello y peso(Figura 2A,B),así como por el aumento de la expresión de marcadores de activación en células T como HLA-DR y CD38(Figura 2C,D). Por otro lado, la EICH se desarrolla más lentamente en ratones inyectados con CD34+ HSC humano y está directamente correlacionado con el nivel inicial de injerto.

Después de la infección por VIH, hay un rápido aumento de la carga viral plasmática, que generalmente es detectable después de 2-3 semanas después de la infección, tanto en los modelos crónicos como agudos(Figura 3A,B),con cinética similar en el modelo de reactivación(Figura 3C). El aumento de la carga viral coincide con una disminución de la relación CD4:CD8(Figura 3D,E,F). Estos cambios no se observan en ratones de control (sin infección por VIH, Figura 3). Cabe destacar que en el modelo de ratónnulo de cadena hu-PBL-NS, se puede observar una inversión inicial de la relación CD4:CD8, que se reconstituye a lo largo del tiempo de supervisión(Figura 3E,F). Por último, si se administra TAR a ratones infectados por el VIH, se espera una supresión de la carga viral, así como la recuperación en la relación CD4:CD8, alcanzando niveles similares a los de los controles no infectados(Figura 3A, C,D,F). Por lo general, después de 2-3 semanas de tratamiento, se observa una disminución de la carga viral y un aumento en la relación CD4:CD8 en los modelos crónicos, agudos y de reactivación. Si esto no se observa, las dosis de drogas y la vía de administración necesita una evaluación.

Figure 1
Figura 1: Estrategia representativa de la evaluación de los niveles de injerto de las células CD45+ y T humanas. (A) Estrategia de gating utilizada para el cribado del porcentaje de CD45+ humano (huCD45), CD3+, CD4+y CD8+ células T en ratonesnulos de cadena huNS, en la semana 14 después de la inyección con sangre de cordón CD34+ HSCs. Los números indican el porcentaje de cada población. (B) Niveles representativos de injerto (porcentaje de huCD45+ células) en la cadena huNS -nula (n s 6) y una cepa inmunodeficiente similar con expresión transgénica de IL-3 y GM-CSF (huNOG-EXL, n a 6), como se informó anteriormente15. (C) Niveles representativos de injerto (porcentaje de huCD3+ células) en ratonesnull y hu-PBL-SGM3 de cadena hu-PBL-NS( (ratonesnulos de cadena NS con expresión transgénica de SCF, GM-CSF e IL-3), en la semana 3 después de la inyección con PMC de un donante sano (modelo agudo, n.o 7 y n a 8, respectivamente). (D) Niveles representativos de injerto (porcentaje de huCD3+ células) en ratones hu-PBL-NSG-SGM3 después de la inyección con PPC de un paciente sano o infectado por el VIH que estaba bajo ART (modelo de reactivación, n a 10 y n a 12, respectivamente). En B-D, la línea indica la mediana, y se muestra el valor p de la prueba Mann-Whitney. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Desarrollo de GVHD en el modelo de ratónnulo de cadena hu-PBL-NS. (A) Pérdida de cabello en dos ratones representativos hu-PBL-NSG-SGM3, en la semana 7 después de la inyección con PBMC de un donante sano. (B) Pérdida de peso corporal del ratón durante el tiempo de monitorización normalizada al porcentaje de peso inicial en ratones hu-PBL-NSG-SGM3 inyectados con PBMC de un donante sano (n.o 10) y paciente infectado por el VIH (n.o 12). (C) Expresión representativa (en la semana 7 post-injerto) de HLA-DR y CD38 en CD4+ y CD8+ células T de ratones hu-PBL-NSG-SGM3 inyectados con PMC de un donante sano. Los números indican el porcentaje de cada población. (D) Porcentajes representativos de CD4+ y CD8+ células T que son HLA-DR+ CD38+ en ratones hu-PBL-NSG-SGM3 inyectados con PBMC de un donante sano. Cabe destacar que en las células antes de la inyección en ratones, los niveles de Células HLA-DR+ CD38+ CD4+ y CD8+ T fueron 2,0% y 5,7%, respectivamente. En B y D, se muestra la mediana y el rango intercuartil. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Cambios representativos de la carga viral y la relación CD4:CD8 en ratonesnulos de cadena huNS después de la infección por VIH y después de la introducción del TAR. (A, D) Relación CD4:CD8 y carga viral plasmática en ratonesnulos de cadena huNS después de la infección por VIH BaL (puntos rojos y línea, n a 3), que se realizaron después de la semana 14 de la inyección con sangre de cordón CD34+ HSCd. También se incluyeron controles no infectados (inyección de PBS) (puntos verdes y línea, n .5). (B, E) Carga viral plasmática y relación CD4:CD8 en ratones hu-PBL-NSG-SGM3 después de la infección por VIH BaL (puntos rojos y línea, n.o 4), que se realizó en la semana 3 después de la inyección con PBMC de un donante sano (modelo agudo). También se incluyeron controles no infectados (inyectados por PBS) (puntos verdes y línea, n.o 3). (C y F) Carga viral plasmática y relación CD4:CD8 en ratones hu-PBL-NSG-SGM3 inyectados con PbMCs de un donante infectado por el VIH (puntos rojos y línea, n.o 9) o donante sano (puntos verdes y línea, n a 10) (modelo de reactivación). En todos los casos, se muestra la mediana y el rango intercuartil. En A–C, la línea discontinua indica el límite de detección del ensayo (150 copias/ml). Para muestras con carga viral indetectable, se asignó un valor igual a la mitad del límite de detección. En D–F, la línea discontinua indica una relación CD4:CD8 de 1. En A, C, D y F, el cuadro gris indica la hora con la administración de ART. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se han logrado importantes avances en el desarrollo de cepas de ratón inmunodeficientes para la humanización, con una serie de opciones diferentes que se pueden utilizar según el interés de la investigación1. Aquí se proporciona un protocolo general para la humanización de ratonesnulos de cadena NS y cepas genéticamente similares que se emplearán en tres modelos diferentes para el estudio de la infección por VIH. En el primer enfoque experimental, los ratones recién nacidos irradiados se inyectan con CD34+ HSC shumana, que pueden derivarse de sangre de cordón umbilical, hígado fetal o sangre periférica movilizada3,21. La irradiación adecuada de ratonesnulos de cadena NS es un paso crítico, ya que elimina la médula ósea del ratón y otras células progenitoras, lo que permite una reconstitución eficiente de las poblaciones de células humanas. Sin embargo, algunos informes han evidenciado la reconstitución de células humanas en diferentes cepas de ratón, sin irradiación27. A este respecto, deben proporcionarse dosis adecuadas de irradiación, ya que los ratonesnulos de cadena NS son radiosensibles, y la alta irradiación podría inducir la linfomagénesis timmica21,28.

Otros pasos críticos y factores que podrían afectar el nivel de injerto incluyen la vía de inyección (intrahepática, intravenosa, intracardiaca), la edad de los ratones, el porcentaje de pureza de CD34+ HSCs, y la experiencia del operador29. En los enfoques segundo y tercero basados en modelos de ratónnulo de cadena hu-PBL-NS, algunos factores críticos incluyen la vía de inyección (intraperitoneal, intravenosa, intraesplénica), la edad de los ratones y el número de células humanas inyectadas, lo que puede influir en el nivel final de injerto. Con respecto a este último factor, varios estudios han utilizado 5-10 x 106 PPM para el injerto22,23,30, mientras que el presente protocolo sugiere el uso de 3.5 x 106 PPM. Cabe destacar que este número de células es suficiente para la reconstitución de las células T y para la replicación del VIH, tanto en los modelos agudos como de reactivación, y también retrasa el desarrollo de la EICH23. No obstante, los investigadores deben optimizar las condiciones de humanización de acuerdo con los objetivos de investigación. Por otra parte, es importante validar la cepa del VIH utilizada para la infección de ratonesnulos de cadena huNS. Aquí, se utiliza la cepa R5 tropic HIV-1 BaL, que produce altos niveles de replicación viral en ratonesnulos de cadena huNS. Otras cepas de reporteros, como las que contienen luciferasa o proteínas fluorescentes, también son adecuadas para el análisis de células monocelulares de células infectadas por el VIH31.

En general, se evidencian tres limitaciones importantes en los modelos de ratónnulo de cadena huNS después del injerto con CD34+ HSC. En primer lugar, debido a la ausencia de un entorno timémico humano, las células T se educan en el contexto de las moléculas de MHC murina, lo que restringe la estimulación específica del antígeno posterior a través de sus receptores de células T. Este problema limita el uso de modelos de ratónnulo de cadena NS para estudiar la respuesta de células T específicas del VIH. No obstante, esta limitación puede ser superada por el uso de ratones BLT o ratonesnulos de cadena NS con expresión transgénica de moléculas de HLA16,17. En segundo lugar, por lo general hay una reconstitución deficiente de las poblaciones mieloides en los modelos de ratónnulo de cadena NS, limitando el estudio de estos subconjuntos que tienen relevancia en el contexto de la presentación de antígenos y la patogénesis de la infección por VIH14,15. En este caso, se recomienda el uso de cepas de ratón con expresión transgénica de factores hematopoyéticos8,15,32.

En tercer lugar, hay un desarrollo 1) deficiente de estructuras del folículo linfoide en los tejidos linfoides secundarios y 2) falta de tejidos linfoides terciarios, que está relacionado con los bajos niveles de células inmunitarias innatas (es decir, células dendríticas en ratonesnulos de cadena huNS) que son críticos para el desarrollo de folículos33. Este problema está asociado con una respuesta humoral deficiente en los modelos de ratónnulo de cadenahuNS 34. No obstante, algunos informes han evidenciado el desarrollo de estructuras similares a los del folículo en ratonesnulos de cadena huNS4, mientras que las células T foliculares confinadas en bazo y ganglios linfáticos (que expresan el receptor de quimioquina cxCR5) que se oman en ratonesnulos de cadena de huNS y cepas relacionadas15). Una vez más, el uso de 1) ratones BLT o 2) cepas de ratón con expresión transgénica de factores hematopoyéticos y/o con expresión de moléculas de HLA puede mejorarla reconstitución de las poblaciones mieloides, el desarrollo de estructuras linfoides secundarias y terciarias organizadas, y respuestas eficaces de células T y células B8,35,36.

De manera similar a las limitaciones de los modelos de ratónnulo de cadena NS CD34+ HSC humanizados, hay una falta de respuestas humorales y de células T específicas para antígenos, ausencia de poblaciones mieloides y estructuras linfoides organizadas en ratonesnulos de cadena hu-PBL-NS. Además, una limitación importante del modelo de ratónnulo de cadena hu-PBL-NS (modelos agudos y de reactivación de la infección por VIH) es el corto plazo para la monitorización, ya que estos ratones desarrollan xenógenos GVHD23. El desarrollo de la EICH también podría inducir cambios fenotípicos y funcionales no deseados de las poblaciones inmunitarias, inherentes al proceso patógeno23,37. No obstante, este modelo tiene la ventaja de ser más simple y accesible, sobre todo teniendo en cuenta que los PBL humanos se adquieren más fácilmente de donantes sanos o infectados por el VIH38. Además, la inyección de células primarias directamente de los pacientes es útil para el estudio de las condiciones intrínditas de las células o patógenos del donante, como las mutaciones virales de resistencia a los medicamentos o las alteraciones inmunitarias específicas del donante. Cabe destacar que para el modelo de reactivación, se pueden realizar ensayos in vitro con agentes de reactivación del VIH para corroborar la respuesta de los PMC antes de la inyección en ratones39. Otra limitación para algunas instituciones es que este trabajo requiere bSL2+ instalaciones para manejar animales infectados por el VIH debido a las regulaciones.

Los modelos de ratónnulo de cadena huNS tienen algunas ventajas en comparación con otros modelos animales para estudiar la infección por VIH, como los primates no humanos infectados con el virus de la inmunodeficiencia simio. Por ejemplo, los ratonesnulos de cadena huNS permiten la creación de cepas transgénicas o de nocaut genéticos, que permiten la evaluación de objetivos genéticos específicos. Además, el uso de células humanas primarias en ratonesnulos de cadena huNS evita posibles restricciones específicas de la especie, como el caso de genes estimulados por interferón en primates no humanos, lo que puede influir en la respuesta antiviral y el curso de la infección40. Por lo tanto, la cinética de la infección es muy consistente entre los ratonesnulos de cadena huNS. Por último, los modelos de ratónnulo de cadena huNS son menos costosos, no requieren instalaciones centrales complejas y son más accesibles.

En resumen, los modelos de ratónnulo CD34+ HSC humanizados y hu-PBL-NS-chain ofrecen una variedad de posibilidades para el estudio de eventos crónicos, agudos y de reactivación en la infección por VIH. Con el reconocimiento y la superación de las limitaciones antes mencionadas de estos modelos, el uso de ratonesnulos de cadena NS puede ser una herramienta poderosa para estudios preclínicos virológicos, inmunológicos y farmacológicos, así como para la edición del genoma y las inmunoterapias basadas en células.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los fondos internos de la división clínica del IHV a JCZ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

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Inmunología e infección Número 154 CD34+ PBMC inyecciones intrahepáticas inyecciones intraperitoneales sangrado retroorbital VIH
Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados
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Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

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