Summary
Dette arbeidet forhåndsinnpeker en avansert protokoll for å nøyaktig vurdere tumorlasting ved påvisning av grønt fluorescerende protein og bioluminescenssignaler samt integrering av kvantitativ molekylær deteksjonsteknikk.
Abstract
Trippel-negativ brystkreft (TNBC) er en aggressiv brystkreft subtype med begrensede terapeutiske alternativer. Sammenlignet med pasienter med mindre aggressive brystsvulster, er 5-års overlevelse hos TNBC-pasienter 77% på grunn av deres karakteristiske legemiddelresistente fenotype og metastatisk byrde. Mot dette formål har murinemodeller blitt etablert for å identifisere nye terapeutiske strategier som begrenser TNBC tumorvekst og metastatisk spredning. Dette arbeidet beskriver en praktisk guide for TNBC ortopisk modell der MDA-MB-231 brystkreftceller suspendert i en kjeller membran matrise er implantert i fjerde pattedyr fett pad, som nøye etterligner kreftcelle atferd hos mennesker. Måling av svulster av caliper, lungemetastasevurdering via in vivo og ex vivo imaging, og molekylær deteksjon diskuteres. Denne modellen gir en utmerket plattform for å studere terapeutisk effekt og er spesielt egnet for studiet av samspillet mellom den primære svulsten og distale metastatiske steder.
Introduction
Omtrent en av åtte kvinner i USA vil utvikle invasiv brystkreft i løpet av hennes levetid, og 10% −20% av disse kvinnene vil bli diagnostisert med den aggressive trippel negative brystkreft (TNBC) undertypen. Mens primære lesjoner kan fjernes kirurgisk i de fleste tilfeller, gjør den subkliniske mikrometastasen og kjemoresistens en uopprettelig sykdom. Viktigere, de fleste pasienter med metastatisk TNBC til slutt tilbakefall, selv om de gjennomgikk behandling i tidlig stadium1. Dermed er kreftheterogenitet, mikrometastase og terapeutisk resistens tre store utfordringer som begrenser det vellykkede kliniske utfallet av TNBC-pasienter. Derfor er det et presserende behov for å bedre forstå den polymorfe molekylære bakgrunnen til TNBC og utvikle effektive terapeutiske midler som begrenser metastatisk sykdom.
Tumormetastase er en flertrinnsprosess hvor tumorcellekontrollene og utnytter mikromiljøet for å fremme sin egen formidling via membrannedbrytning og tumorcelleflukt fra den primære lesjonen, via inntreden i (dvs. intravasation) og utgang fra (dvs. ekstravasasjon) vaskulaturen, og til slutt tilpasning og kolonisering i distal vevssenger2. Dyremodeller er utviklet for å studere brystkreftmetastase, hvor to metoder ofte implementeres: direkte blodsirkulasjonsinjeksjon og ortopisk implantasjon. Vanligvis brukte metoder for direkte blodsirkulasjonsinjeksjon inkluderer haleveneinjeksjon, mens andre tilnærminger, inkludert direkte hjerteinjeksjon3,direkte hjerneinjeksjon4og direkte leverinjeksjon5, også er ansatt. Den direkte blodsirkulasjonsinjeksjonen kalles ofte en kunstig metastasemodell, som er rask og enkel, men mindre fysiologisk nøyaktig fordi den omgår tumorflukt fra den primære lesjonen og intravasation6,7,8. Sammenlignet med direkte injeksjonsmodeller tar den ortotopiske brystkreftmodellen lengre tid for forekomsten av påvisbare metastatiske lesjoner i eksterne organer som lungene, men det er mer fysiologisk relevant fordi den nøye etterligner multistep metastatisk prosess som det skjer hos mennesker. Viktigere, en 2013 studie9 sammenlignet halen vene injeksjon og ortotop modeller og fant at brystkreftcellene injisert i halen venen og de isolert fra lunge metastatiske lesjoner etter hale vene injeksjon utstilt lignende globale genuttrykk profiler. I motsetning var den globale genuttrykksprofilen til ortotopisk injiserte brystkreftceller dramatisk annerledes enn for lungemetastatiske lesjoner som følge av ortotopisk injiserte celler9. Disse observasjonene tyder på at ortopisk modellen er mer fysiologisk relevant, fordi de metastatiske lesjonene gjennomgår en utvelgelsesprosess som ligner multistepprosessen av metastase som det forekommer hos mennesker.
Dette arbeidet beskriver en ortotopisk brystkreft (MDA-MB-231-Luc/GFP) modell i nakne mus som ble optimalisert i vårt laboratorium for bildedeteksjonsteknikker, samt identifisering av nye biomarkører og utvikling av målrettede kjemoterapeutiske midler.
Protocol
Analyse av tumorvekst ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av komiteen for etikk for dyreforsøk fra National Cancer Institute og fulgte anbefalingene fra United States National Research Council's "Guide for care and use of Laboratoriedyr", USAs offentlige helsetjeneste "Guide for care and use of Laboratory Animals", og "Policy on Human Care and Use of Laboratory Animals".
1. Tilberedning av celler for implantasjon
MERK: MDA-MB-231 humane brystadenokarsinomceller (kommersielt anskaffet) ble stabilt transfected med luciferase genet III og forbedret grønn fluorescerende protein (GFP) markør ved lentivirus og vokst i nærvær av utvalgantibiotika (puromycin) .
- Start cellekulturen med 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP-celler og legg til 15 ml førvarmet (37 °C) RPMI 1640 medium med 10% føtal storfeserum (FBS) i en T75 kulturkolbe. Hold cellene vokser i en temperaturkontrollert cellekulturinkubator ved 37 °C med 5 % CO2. Skift ut hele mediet minst 2x i uken.
MERK: Ikke forstyrr celleveksten og fortsett å sjekke cellevekstforholdene daglig. Cellene må subkulturere når de når 85%−90% samløpet for å opprettholde spredningsfasen. - En uke før celleimplantasjonstrinnet, fjern puromycinfra cellekulturkolben ved først å fjerne alt mediet i kulturkolben, og skyll deretter 2x med 10 ml 1x fosfat bufret saltvann (PBS), og til slutt erstatte mediet med komplett medium uten puromycin. Under de middels-legge og svåne trinnene, ikke forstyrr cellene. Husk å ikke bruke hele mediet med utvalg antibiotika fra nå av for alle middels etterfylling trinn.
- På dagen for å forberede cellene for implantasjon, fjern alt komplett medium før trypsinisering for å unngå å deaktivere trypsin. Legg til 5 ml trypsin i kolben for å trypsinere cellene. Overvåk cellene og kontroller at de løsner fra kulturkolben.
- Når flertallet av cellene løsner, legg til 10 ml komplett medium for å nøytralisere trypsinaktiviteten. Deretter overfører du cellesuspensjonen til et 50 ml sentrifugerør og sentrifuge ved ~150 x g for å pellet cellene. Fjern supernatanten etter sentrifugeringen og tilsett deretter 10 ml 1x PBS for å resuspendere cellene og forberede celletelling.
- Tell cellene med en celleteller og juster cellekonsentrasjonen til 20 x 106 celler/ml i kald 1x PBS som inneholder 25% kjellermembranmatrise. Injiser 2 x 106 celler i 0,1 ml 1x PBS med 25% kjellermembranmatrise i den fjerde brystfettputen til hver mus. Ta med ekstra nåler og sprøyter til celleimplantasjonen og hold celle-kjeller-membran-matriseblandingen på is før implantasjon.
MERK: Det er dødt rom i sprøyten og nålen. Avhengig av valg av nål og sprøytelengde, type og størrelse, kan en tuberculin sprøyte med en 0,5 i 26 G nål ha opptil 70 μL død plass10. Forbered 40% −50 % mer celleimplantasjonsblanding for å kompensere for det døde rommet og eventuelle andre tilfeldige tap.
2. Ortopisk brystkreft modell og tumor størrelse måling
- Tillat 6 uker gamle kvinnelige athymiske nakenmus å akklimatisere seg til boliganlegget i minst 1 uke før celleimplantasjonen.
MERK: Bruk av samme alder sto det ved å redusere datavariasjonen. - For hver runde, bedøve fem mus med isofluran ved 4% med filtrert (0,2 μm) luft med en strømningshastighet på 1 l / min i 3-4 min. Vær oppmerksom på musens respirasjonshastighet og mønsterendring, og bruk en tåklype for å sikre at musene er under riktig anestesi. Når de ikke lenger beveger seg, fjern en mus og plasser en nesekjegle over nesen og munnen med samme anestesi.
- Vattpinne venstre 4th brystkjertel med alkohol. Ved hjelp av fine rottetanntang, løft 4th brystkjertelen litt for å sette inn 25 G nålen. Pass på at nålen er skrått og trekk stempelet litt for å sikre at nålen ikke treffer noen blodkar. Hvis det ikke kommer blod inn i sprøyten, fortsetter du å injisere 100 μL av celle-kjellermembran-matriseblandingen i brystfettputen.
MERK: Et rundt, hevet område vises under huden. - Vent 10-15 s til kjellermembranmatrisen å herde, og fjern deretter nålen. Gjenta prosessen med de gjenværende musene i induksjonskammeret. Legg alle brukte nåler og sprøyter i en skarp boks.
- Bruk samme injeksjonssted for brystkjertelen for alle mus. Hold øye med injeksjonsstedet og noter deg en celleimplantasjonsblanding som lekker ut fra injeksjonsstedet.
MERK: Innen få minutter vil musen begynne å gjenvinne bevisstheten. - La xenograft vokse fritt uten avbrudd i 7-10 dager før noen tumorstørrelsesmåling.
- Undersøk alle mus for xenograft-størrelsen. Mål tumorstørrelsen med en caliper. Bestem tumorvolumet (mm3) med følgende ligning:
hvor L er den lengste dimensjonen og W er den korteste dimensjonen vinkelrett på L. - Identifiser og fjern outliers som overskrider ett standardavvik av gjennomsnittet. Bruk bare mus med sammenlignbare tumorstørrelser for eksperimenter. Del musene tilfeldig inn i forskjellige behandlingsgrupper og begynn behandlinger.
- Mål tumorstørrelsen ved å kalipper 2x i uken. Legg merke til alle de fysiske endringene i xenografts (dvs. nekrose, kutting).
3. In vivo bioluminescence og ex vivo fluorescens avbildning
MERK: I denne studien utføres både todimensjonal bioluminescens og fluorescensavbildning ved endepunktet av eksperimentet. Bioluminescence imaging (BLI) ble utført ved hjelp av en kommersiell preklinisk optisk skanner utstyrt med et 16-bits avkjølt CCD-kamera og oppvarmet bildebehandlingsstadium.
- Før bildebehandling, bedøve opptil fem tumorbærende mus i induksjonskammeret ved å sette isofluran ved 3% med filtrert (0,2 μm) luft med en strømningshastighet på 1 l / min i 3-4 min. Bestelegg anestesi med en tåklemme. Sørg for at induksjonskammeret holdes inne i en ventilert hette for å minimere eksponering for
- Administrer D-luciferin (150 mg/kg) til de bedøvede musene ved hjelp av en intraperitoneal rute ved hjelp av en 27 G nål, og overfør en bedøvet mus til bildekammeret. Ved skannerbildekammeret opprettholder du isofluranen med 2%−2,5 % med O2 som bærer med en strømningshastighet på 1 l/min.
MERK: Hold musetemperaturen på ~37 °C under prosedyren ved å holde en oppvarmet pute under anestesiinduksjonskammeret, bildetabellen (hvis scenen ikke varmes opp), og etterbehandlingsinnkrevingsburet. - Før du avbildning av studiemusene, få luciferin kinetikk ved å bilde tre ekstra tumorbærende mus (dyr som ikke er tildelt noen studiegrupper) ved 2 min intervaller i totalt 40 min ved hjelp av følgende parametere: eksitasjonfilterblokkert, utslippsfilter-åpen, f / stopp 1, FOV-D, middels binning (8 x 8), og automatisk eksponering. Bruk peak bioluminescence signal målt for å definere det optimale bildeinnhentingstidsvinduet for alle påfølgende tidspunkter.
- Mens du utfører metastaseavbildning, beskytter du det høye BLI-signalet fra den primære svulsten ved å dekke det med en hylse kuttet ut fra en svart hanske. Skaff bildet ved hjelp av de samme parametrene som er beskrevet i trinn 3.3 med ventralsiden av musen vendt mot kameraet for lungemetastaseavbildning og dorsalsiden av musen vendt mot kameraet for hjernemetastaseavbildningen.
MERK: Det er viktig å teste noen forskjellige merker av svarte hansker for å velge den med minimal auto luminescence. - Ved hjelp av en skanner- og dataanalyseprogramvare tegner du en standard formregion av interesse (ROI) over thoraxhulen eller hjernen, slik at hele interesseorganet er dekket for å evaluere den metastatiske byrden. Kvantifiser bioluminescensen (BL) som total fluks (fotoner/sekund).
- Umiddelbart etter BLI, euthanize musen via CO2 kvelning (i henhold til ACUC retningslinjer og institusjon-godkjente dyreprotokoller) og trekke ut lungene og hjernen med dissekere saks og tang for ex vivo imaging.
MERK: Lungeekstraktet for ex vivo-avbildning og for lungemetastaseknutetelling kan ikke utføres på samme mus på grunn av uforenlige prosedyrer. - Skyll raskt alle organer med 1x PBS for å fjerne overfladiske blodflekker og plassere organer på en lavautofluorescens, svart plastplate. Transportorganer til en multispektral fluorescensskanner utstyrt med spektral unmixing evne (solid-state flytende krystall bølgelengde tuning) med en 12-bits CCD kamera for GFP deteksjon.
- Få multispektrale GFP-bilder (eksitasjonsfilter = 457 ± 23 nm; utslippsfilter = 490 nm lang pass) av de ekstraherte organene og ikke-tumorbærende kontrollmusene ved å skanne gjennom 500-720 nm med en trinnstørrelse på 10 nm. Bruk utskårne organer fra ikke-tumorlagerkontrollmus for å korrigere for autofluorescens.
- Etter multispektral GFP-avbildning bestemmer du de optimale bildeinnstillingene. Utfør bildeinnhenting av alle målorganer og gjennomfør bildeanalyse (dvs. generere et spektralbibliotek for autofluorescens og GFP for spektral unmixing prosedyre) i henhold til produsentens protokoll.
4. Molekylær påvisning av metastatiske brystkreftceller
- Etter ex vivo-avbildningen fryser du hele hjernen i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C i en fryser til den er klar for DNA-ekstraksjonen.
- For DNA-ekstraksjon, legg hele hjernen i et 5 ml homogeniserende rør med 2 ml DNA-lysisbuffer. Bruk en homogenisator med effektinnstillingen på 50 for å homogenisere det snap-frosne hele hjernevevet. Når hjernevevet er helt homogenisert, overføre 1 ml suspensjon (lysate) til en DNase-fri og RNase-fri 2 ml mikrocentrifuge rør og fortsette å isolere DNA i henhold til produsentens protokoll.
MERK: For å minimere overførbar DNA-kontaminering, rengjør homogenisatoren grundig etter hver prøve ved først å skylle den med 75 % etanol i DNase-fritt og RNase-fritt vann, og skyll deretter med 1 M NaOH-løsning, etterfulgt av en skyll med 75 % etanol i DNase-fritt og RNase-fritt vann for å effektivt redusere og ødelegge eventuelle DNA-rester. - Tilsett 0,5 ml 100% etanol av DNA-lysisbuffer til lysatet. Bland prøven ved inversjon og oppbevar ved romtemperatur i 3 min.
MERK: Ikke vend for mange ganger eller for kraftig. DNA vil være synlig som en ull-lignende utfelling. - Bruk en pipettespiss til å overføre DNA-et til et friskt DNase-fritt og RNase-fritt 2 ml mikrosentrifugerør. La prøveluften tørke i 1 min. Tilsett 1 ml 75 % etanol og inverter mikrosentrifugerøret 3–6x for å vaske DNA-prøven. Kast etanoletter hver vask ved pipettering. Gjenta vasketrinn 2x.
- Lufttørk DNA-prøven i 10 s. Tilsett deretter 52 μL 8 mM NaOH for å oppløse DNA-prøven. Rør 2 μL av DNA-prøven for DNA-kvantitasjon, og bruk de resterende 50 μL for en sanntids PCR-analyse etter konsentrasjonsjustering.
MERK: NaOH bidrar til å løse DNA-prøven fullt ut. - Kvantat 2 μL av hver DNA-prøve med spektrotometer og bruk et absorbansforhold mellom A260/280 som en kvalitetskontrollreferanse. Beregn DNA-konsentrasjonen med denne formelen:
- Juster DNA-konsentrasjonen til 50 ng/μL. For hver DNA-prøve, bruk 50 ng av DNA som startmal for en pcr-analyse i sanntid. Bruk 8 mM NaOH-oppløsning eller DNase-fritt og RNase-fritt vann for å fortynne DNA-prøven.
- Design primerparet som er spesifikt for den eksogene grønne fluorescensproteinsekvensen (GFP) internt ved hjelp av en åpen kildekode primer design webportal for sanntid PCR deteksjon av GFP-koden i metastatiske celler som invaderte og koloniserte distale nettsteder.
MERK: Denne studien brukte F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'. - Bruk en rask PCR-reagens i sanntid og en PCR-maskin i sanntid som støtter en rask PCR-protokoll i sanntid. I tillegg til de vanlige 30 syklusforsterkningstrinnene, legger du til et dissosiasjonskurvetrinn på slutten av løpet for påvisning av ikke-spesifikk forsterkning.
MERK: Følgende forhold ble brukt til molekylær deteksjon: 95 °C 2 min varm start, 40 sykluser på 95 °C 5 s, 60 °C 15 s, og til slutt en smeltekurveanalyse. GFP-ampliconen er 135 bp i størrelse. - Bruk en naiv mus hjerne DNA (ikke en MDA-MB-231 celle implantat) som en negativ kontroll. Bruk DNA hentet fra MDA-MB-231-GFP/Luc-cellene som en positiv kontroll. Legg til alle PCR-reagenser uten DNA-mal som en ingen malkontroll (NTC).
MERK: En PCR-kontroll er nødvendig for hver PCR-analyse.
5. Symptompåvisning av metastatisk brystkreftcelle i lungene
- For mus undergruppen valgt for metastatisk lunge knute telling, bedøve mus med isoflurane (som i trinn 2.2) umiddelbart etter ex vivo imaging, utføre en hjertepunktering for blodinnsamling, og deretter euthanize ved cervical dislokasjon.
- Åpne brysthulen med dissekere saks og kutt forbi hjertet og thymus for å utsette luftrøret.
- Sett en 10 ml sprøyte med en 22 G kanyle som inneholder Bouins oppløsning inn i luftrøret. Skyv sprøytestempelet til de kollapsede lungene er hovne med ~ 2 ml av Bouins oppløsning. Fjern sprøyten og nålen når lungene er oppblåst.
- Legg hele lungen i et 15 ml rør som inneholder Bouins oppløsning, vend forsiktig røret noen ganger, og la det suge i 24 timer ved romtemperatur.
- Etter 24 timer, fjern Bouins løsning fra røret, skyll lungen med vann, og legg den deretter tilbake i røret med 70% etanol. Telle metastase (hvite flekker eller knuter) på overflatene av lungene ved hjelp av et dissekerende mikroskop.
6. Datainnsamling og analyse
- Registrere tumorvolumdata, samt in vivo og ex vivo imaging data, på et elektronisk regneark for enkel dataregistrering, innsamling og administrasjon.
- På slutten av eksperimentet overfører du alle data til det elektroniske regnearket og statistisk programvare for dataplotting og statistiske analyser.
Representative Results
Tumorvolummåling av kaliper er en veletablert metode for å vurdere behandlingseffekt (figur 1). Antall celler implantert, bruk av kjellermembranmatrise, mikrobiome, anleggsrenslighet og injeksjonssted er de viktigste faktorene som påvirker tumorveksten.
I motsetning til GFP-bildebehandling krevde BLI administrering av luciferase-substrat minst 15–20 min før BLI-bildebehandling. Videre påvirker musestammen, cellelinjen, behandlingene og luciferase-reporteren alle bioluminescenssignalnivåene. For å oppnå sammenlignbare signaler mellom studiegruppene må derfor en pre-imaging BLI kinetisk studie utføres for å bestemme den beste bildetidsrammen (figur 2).
På grunn av det overlegne signal-til-bakgrunn-forholdet26,27var hele kroppen in vivo bioluminescence bildebehandling ganske følsom ti for å oppdage lavt nivå metastasesignal sammenlignet med GFP-tilnærmingen (figur 3). Videre ga bioluminescenssignalet dypere penetrasjon enn GFP med noen få millimeter. Bioluminescence signalproduksjon krever imidlertid ATP, som er en begrensende faktor i evalueringen av ex vivo vevsprøver. Hvis dyrene behandles raskt, kan BLI være en levedyktig tilnærming for å oppnå kvantitative resultater på metastase. En måte å oppnå dette på er ved å behandle ett dyr om gangen. Denne tilnærmingen var imidlertid ikke mulig for denne studien fordi en stor kohort av mus ble brukt. BLI-signalble ikke oppdaget da organene ble avbildet rundt 45 min post luciferin injeksjon. Bruken av en dual reporter cellelinje er nyttig i denne situasjonen. På grunn av den stabile naturen til GFP-molekylet, ville forskerne ha tilstrekkelig tid til å behandle før de fanger GFP-signalene fra målorganer (figur 4).
Figur 5 gir et ekte eksempel på hvordan caliper tumorstørrelsesmålinger kan forvrenge datatolkningen, fordi xenograft mistet det meste av det levedyktige tumorcelleinnholdet, men fortsatt opprettholdt sin store masse og form. Histopatologisk undersøkelse av disse xenografts indikerte nekrose inne i massen (Figur 5B).
For forskere som utfordrer bilderesultatene angående hjernemetastase i ortotopisk brystkreftmodell, kan molekylær deteksjon av sanntids PCR gi overbevisende bevis (Figur 6). I dette tilfellet var den eksogene GFP DNA-sekvensen den beste måten å løse dette problemet på, fordi den transinfiserte GFP DNA-sekvensen ikke naturlig eksisterer hos mennesker eller gnagere.
Figur 1: Måling av tumorvolum. Tumorvolum/lastingsmåling med en caliper startet på dag 10 etter xenograftimplantasjon og ble deretter målt 2x i uken til slutten av eksperimentet. Feilfelt beregnes av SEM-verdien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fastsettelse av optimalbildeanskaffelsesvindu. Venstre: En mus med en stor xenograft og en mus med en liten xenograft ble valgt for optimal luciferin kinetisk rekkevidde bestemmelse. Høyre: Luciferin kinetisk kurve oppnådd ved å anskaffe bildene hver 2 min for 40 min. Et platå ble observert mellom 15-22 min, som ble brukt som en optimal bildeoppkjøpstid for alle påfølgende bildebehandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hele kroppen BLI bildebehandling. L: Hele kroppen BLI bildebehandling. M: Ventral visning med underkroppen dekket med en hylse av en svart hanske. R: Ryggvisning med underkroppen dekket med en hylse av en svart hanske. En aksillær lymfeknutemetastase oppdages i ventralvisning ved BLI-avbildning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ex vivo BLI/GFP-signaldeteksjon. GFP-signaler ble oppdaget i hjernen og lungene fra samme mus 20 min etter at musen ble ofret. BLI-signalble ikke oppdaget 45 min post luciferin injeksjon. Ingen GFP-signal ble oppdaget i naiv mushjerne og lunge. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fordeler med optiske bildeteknikker over kalipermålinger. (A) Representativt bilde som viser in vivo GFP-signaldeteksjon i en primær svulst. Bare en mindre del av xenograft viste GFP-signal, noe som tyder på at en betydelig del av massen var stroma. Dette kan ikke bestemmes av tradisjonelle caliper målinger og kan føre til en unøyaktig konklusjon. Dette eksemplet understreker viktigheten av optisk avbildning for dyremodellstudien. (B) Histopathology delen av samme mus som viser at nekrotisk region (dvs. indre region) også bidro til tumorstørrelseberegning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Smeltekurveanalyse. Smeltekurveplottet som viser spesifisiteten til GFP-amplicons. DNA fra hjernen hentet fra MDA-MB-231-Luc/ GFP-implanterte mus og DNA isolert fra MDA-MB-231-Luc / GFP celler dyrket i kultur (positiv kontroll) ble analyset. Sanntids PCR-analysen ble utført for å vurdere GFP-innholdet i hjernevevet. - Jeg har ikkenoe å si. Smeltekurvene til den positive kontrollen og DNA-et ekstrahert fra henholdsvis musehjernen. (C) De overlappende kurvene på panela A og B, noe som indikerer toppsignalene fra musehjernen DNAer er spesifikke for den eksogene GFP-sekvensen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
For studiet av TNBC hos dyr er to murinemodeller utviklet: MDA-MB-231 humane brystadenokarsinomceller hos immunkompromitterte mus (dvs. athymiske nakne mus, NSG-mus) og 4T1 i immunkompetente BALB/c-mus. Begge modellene har sine fordeler. Valget av dyremodellen for en studie avhenger av forskningsmålene. For eksempel er MDA-MB-231-modellen en menneskelig TNBC-cellelinje dyrket i immunkompromitterte mus som etterligner immunsuppresserte pasienter med brystkreft hos mennesker. På den annen side etterligner den invasive fenotypen av ortotopisk 4T1 trippelnegative murine brystkreftceller i BALB/c-mus nøye den metastatiske prosessen som det oppstår i stadium IV human brystkreftpasienter. I motsetning til intravenøs celle injeksjon tilnærming, humane MDA-MB-231 brystkreftceller ble tilsvarende injisert i bryst fett pad11,12 i ortotop brystkreft modell11,13. Jo lengre tumorvekst og ervervet metastatisk evne er mer fysiologisk relevant, og dermed er det ikke en kunstig metastatisk kreftmodell4,14. En slik spontan metastasemodell etterligner nøye menneskelig brystkreftutvikling bortsett fra initieringsstadiet. Dette er en avgjørende modell for in vivo narkotika screening og terapeutisk effektvurdering i metastatisk brystkreft.
Tumorimplantasjonsstedet i musen spiller en avgjørende rolle i å gi et mikromiljø som opprettholder tumorvekst og valg av metastatisk fenotype som ligner på det som forekommer hos mennesker. Den proksimale lymfeknuten og tilstedeværelsen av fettvev er de viktigste faktorene som påvirker sykdomsprogresjonen av brystkreft15,16. Hos en menneskelig pasient er lymfeknuten og fettvevet begge viktige interagefaktorer som påvirker maligniteten og forekomsten av brystkreft17,18,19. Dermed kan valget av riktig anatomisk plassering for injeksjonsstedet sterkt påvirke relevansen av tumormodellen sammenlignet med den menneskelige sykdommen. Denne studien brukte den fjerde brystkjertelen som implantasjonsstedet hovedsakelig på grunn av de nevnte kravene, og at det er anatomisk mer tilgjengelig og lettere å manipulere.
Ulike beregningsmetoder for tumorvolum er tilgjengelige, og en forsker kan velge hvilken som helst de passer. Algoritmen valgt for denne studien er basert på funnene av Faustino-Rocha et al., som sammenlignet forskjellige tumorvolumberegningsformler og konkluderte med at formelen nedenfor er den mest nøyaktige20.
Kjellermembranmatrise er en viktig ekstracellulær matrise som brukes i ulike in vitro21 og in vivo22,23 analyser. Det er motstridende rapporter22,24,25 om påvirkning av kjelleren membran matrise på xenograft malignitet. Det synes å bare påvirke den første etableringen av xenograft og har ingen ytterligere effekt på xenograft vekst25. For xenograft implantasjonen som er beskrevet, ble kjellermembranmatrisen blandet med kreftcellene for å øke celle/gelblandingsoppløsningenføring før implantasjon. Tilstedeværelsen av kjellermembranmatrisen reduserer tap av blandeoppløsning fra injeksjonsstedet og holder blandeløsningen på implantasjonsstedet, og øker dermed ensartetheten til det implanterte xenograftvolumet.
MDA-MB-231 cellelinjen er en ondartet udødeliggjort humanbryst adenokarsinom celle linje og er et populært verktøy i brystkreft forskning på grunn av sin trippel-negativ status. Bruken av dual reporters (luciferase og GFP) cellelinje gir mer fleksibilitet i håndteringen av in vivo og ex vivo imaging. Det er godt fastslått at bioluminescenssignalet har større følsomhet, dybdepåektelighet og overlegen kontrast (signal-til-støy-forhold) enn GFP-signaler. På grunn av dette er det en mye brukt bildemodalitet for hele kroppsavbildning. Dessverre er bioluminescensdeteksjon begrenset av et smalt tidsvindu (~15−20 min post luciferin injeksjon) der signaldeteksjonen er lineær. BLI-signalet avtar raskt når dyrene er euthanized. Dette blir et eksperimentelt designproblem hvis mange mus må euthanized og høste flere vev eller organer er nødvendig. I disse studiene ble blod høstet av direkte hjertepunktering, hjernen, primær svulst, lunge og berørt lymfeknute ble undersøkt hos 40 mus. Da organene ble høstet og klare for ex vivo-avbildning, var bioluminescenssignalet umulig å oppdage. Derfor er GFP-deteksjon mer egnet i disse situasjonene. Utslippet av GFP-signalet er i det synlige området, og ved disse bølgelengdene er signalabsorpsjon på grunn av blod (dvs. hemoglobin) betydelig høyere. Autofluorescens i det synlige området på grunn av NADH, lipo-pigmenter og flavins resulterer i en betydelig bakgrunn som gjør det vanskelig å skille mellom et lavt nivå GFP-signal og autofluorescensbakgrunn. Ved hjelp av en multispektral fluorescensavbildningstilnærming i stedet for tradisjonell filterparavbildning og bruk av spektrale unmixing-algoritmer bidrar til å identifisere ekte GFP-signal i interesseorganet. Derfor, ved å kombinere styrkene til bioluminescensavbildning i hele kroppen in vivo deteksjon og multispektral GFP-avbildning i ex vivo organ / vev evalueringer, kan kvantifiserbare data maksimeres i en stor kohort av mus.
Uansett hvilken tilnærming som er valgt for en dyrestudie, er det sterkt anbefalt å trekke ut alt blod før organ/vevsgjenfinning, spesielt for studier rettet mot den metastatiske byrden. Denne protokollen oppdager GFP-signaler fra hele blodprøver hentet fra musene (data som ikke er vist) i ortotop brystkreftmodellen av PCR-analyser i sanntid. Minimere blodvolumet i organer / vev vil redusere det falske positive signalet i målorganene.
Til slutt er ortotopbrystkreftmodellen som bruker MDA-MB-231-Luc/GFP-cellene en svært relevant dyremodell som ligner den menneskelige TNBC-pasienttilstanden nøye. Denne modellen er avgjørende for å studere, overvåke og vurdere terapeutisk effekt i et tumormikromiljø som ligner på mennesker. Bruken av dual reporter cellelinjer ytterligere forbedrer praktisk av denne ortotopiske brystkreft modellen.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Intramural Research Program av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Cancer and Inflammation Program, og Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
| D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
| DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
| IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
| Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
| MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
| MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
| Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
| Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
| Primer3 | MIT | Primer Design | |
| Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
| RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
| SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
| StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |
References
- Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy. Cancer. 121, 8-16 (2015).
- Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
- Saha, D., et al. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (56), e3175 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), e54903 (2016).
- Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), e2775 (2011).
- Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
- Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy. Journal of Visualized Experiments. (141), e57849 (2018).
- Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model? Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).
- Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle. Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).
- Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad. Journal of Visualized Experiments. (143), e58604 (2019).
- Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland. Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).
- Paschall, A. V., Liu, K. An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Kocaturk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Fletcher, S. J., et al. Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).
- Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability? Ecancermedicalscience. 9, 552 (2015).
- Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. Influence of tumor location on breast cancer prognosis. International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).
- Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study. PLoS One. 9, e94815 (2014).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42, 217-224 (2013).
- Mullen, P. The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).
- Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice. Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).
- Mullen, P., Langdon, S. P. The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts. Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).
- Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts. BMC Medical Imaging. 16, 5 (2016).
- Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines. International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).
- Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models. Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).
