Summary
Denna artikel beskriver en metod för att montera bräckliga zebrafiskar embryon för utökad tid-lapse konfokal mikroskopi. Denna lågkostnads metod är lätt att utföra med hjälp av vanliga glasbotten mikroskopi rätter för avbildning på någon inverterad Mikroskop. Monteringen utförs i lager av aganat vid olika koncentrationer.
Abstract
Dynamiken i utvecklingen kan följas av konfokaltidsförlopp mikroskopi av levande transgena zebrafiskar embryon uttrycker fluorescens i specifika vävnader eller celler. En svårighet med avbildning hela embryots utveckling är att zebrafiskar embryon växer avsevärt i längd. När den monteras som regelbundet görs i 0,3-1% låg smält aguppstod, aguppstod innebär tillväxt begränsning, vilket leder till snedvridningar i den mjuka embryot kroppen. Ändå, för att utföra konfokaltid-lapse mikroskopi, måste embryot immobiliseras. Denna artikel beskriver en skiktad monteringsmetod för zebrafiskar embryon som begränsar motilitet av embryon samtidigt som det möjliggör obegränsad tillväxt. Monteringen utförs i lager av aganat vid olika koncentrationer. För att demonstrera användbarheten av denna metod, hela embryo vaskulär, neuronala och muskelutveckling var avbildas i transgena fisk för 55 timmar i följd. Denna monteringsmetod kan användas för enkel, låg kostnad avbildning av hela zebrafiskar embryon med inverterade Mikroskop utan krav på formar eller särskild utrustning.
Introduction
Sebrafisken har länge varit en modellorganism för utvecklingsbiologi, och mikroskopi är den viktigaste metoden för att visualisera embryonal utveckling. Fördelarna med att använda zebrafiskar embryon för utvecklingsstudier inkluderar liten storlek, optisk klarhet, snabb utveckling, och hög Fecundity av den vuxna fisken. Generering av transgena zebrafiskar linjer uttrycker fluorescens i vissa vävnader eller celler har tillåtit en direkt visualisering av vävnads utveckling på ett sätt som inte är möjligt med större ryggradsdjur. I kombination med tidsfördröjd mikroskopi kan detaljer och dynamik i vävnads utvecklingen lätt studeras.
En svårighet med Imaging zebrafiskar utveckling är att embryona växer avsevärt i längd; embryot förlänger sin längd fyra gånger inom de första 3 dagarna i livet1. Också, kroppen av det tidiga embryot är mjuk, och lätt blir förvrängd om tillväxten är begränsad. Men för att utföra konfokalmikroskopi måste embryot immobiliseras. För att hålla embryon i en fast position för konfokaltid-lapse Imaging, de är regelbundet sövda och monteras i 0,3-1% låg smälta Agreste. Detta har fördelen av att tillåta viss tillväxt under bildtagning under en viss tidsperiod, samtidigt som man begränsar embryots rörelser. Delar av embryot kan effektivt avbildas så här. Vid användning av denna metod för avbildning av hela embryot under längre tidsperioder observeras dock snedvridningar på grund av den begränsade tillväxt som orsakats av aganden. Därför krävs andra monteringsmetoder. Kaufmann och kollegor har beskrivit en alternativ montering av zebrafiskar embryon för ljusplåt mikroskopi, såsom selektiv plan belysning mikroskopi (spim), genom att montera embryon i fluorerade etylenpropylen (FEP) rör som innehåller låga koncentrationer av aguppstod eller metylcellulosa2. Denna teknik ger en superb visualisering av embryogenes över tid. Schmid et al. beskriva montering av upp till sex embryon i aguppstod i FEB rör för ljus-Sheet mikroskopi3 tillhandahålla visualisering av flera embryon i en avbildning session. Formar har använts för att skapa embryomatriser för effektiv montering av ett större antal embryon4. Masselkink et al. har konstruerat 3D tryckt plast formar som kan användas för att göra kisel kastar att zebrafiskar embryon i olika stadier kan placeras i, vilket möjliggör montering i en konstant position för avbildning, inklusive konfokalmikroskopi Imaging5. 3D-utskrifter har också använts för att göra formar för konsekvent positionering av zebrafiskar embryon i 96-väl format6. Vissa formar är anpassade för vissa stadier och kan inte tillåta obegränsad tillväxt under långa tidsperioder, medan andra formar är mer flexibla. Nyligen publicerade weijts et al. design och tillverkning av en fyra-väl skålen för levande avbildning av zebrafiskar embryon7. I denna maträtt, är svansen och stammen av sövda fisk embryon placeras manuellt under en klar silikon tak bifogas strax ovanför ett täckglas för att bilda en ficka. Embryot är sedan fast i detta läge genom tillsats av 0,4% Agreste. Denna montering möjliggör avbildning av den ca 2 mm långa bakre delen (bål och svans) av embryot, och upp till 12 embryon kan monteras per brunn, metoden möjliggör avbildning av flera prover. Likaså presenterade Hirsinger och Steventon nyligen en metod där huvudet av fisken är monterad i aguppstod, medan svansen kan fritt växa, och denna metod också effektivt underlättar avbildning av stammen och svans regionen av embryot8.
Denna artikel beskriver en skiktad monteringsmetod för zebrafiskar embryon som begränsar förflyttningar av embryon samtidigt som den möjliggör obegränsad tillväxt. Fördelarna med denna monteringsmetod är att det är en låg kostnad, snabb och enkel metod för att montera embryon i olika stadier för avbildning med hjälp av inverterade Mikroskop. Monteringen tillåter långsiktig avbildning av hela kroppen (huvud, bål och svans) under embryots utveckling. För att Visa användbarheten av denna metod, hela embryo vaskulär, neuronala och muskelutveckling var avbildas i transgena fisk. Två embryon per session, vid två våglängder i 3D var avbildas av Time-lapse mikroskopi för 55 timmar i sträck för att återge filmer av vävnad utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det djur arbete som presenteras här godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittéer (IACUCs) vid University of Houston och Indiana University.
1. fisk hållning
Anm.: arbete med ryggradsdjur kräver ett IACUC-godkänt protokoll. Den bör genomföras i enlighet med relevanta nationella och internationella riktlinjer.
- Underhåll vuxna zebrafiskar enligt beskrivningen i tidigare publicerad litteratur9.
- På eftermiddagen, placera Adult zebrafiskar i avel tankar. Föda upp hanar till honor vid ett förhållande av 1:2.
2. beredning av lösningar
- Gör en stamlösning av 1% låg smält aguppstod i embryomedia (E3:5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4, justerad till pH 7,0). Alikvot stamlösningen i 1,5 mL rör och förvara dem vid 4 ° c.
- Gör en stamlösning på 4% (w/v) Tricaine (MS-222) i destillerat vatten. Förvaras vid 4 ° c i en mörk flaska.
FÖRSIKTIGHET: Tricaine är giftigt och bör vägas och lösas i en dragfläkt. - Gör en stamlösning av 20 mM N-fenyltiourea (PTU) i destillerat vatten. Förvaras vid-20 ° c.
3. beredning av embryon
- Efter parning, skörda embryon i E3 i en petriskål och inkubera dem vid 26,5 ° c i ca 28 h före montering.
Anmärkning: detta bromsar utvecklingen av embryon så att embryona är ungefär vid 30 somite skede i början av avbildning. - Anesthetize embryon i 0.016-0.020% Tricaine i E3. För att hämma pigmentering, tillsätt PTU till en koncentration av 200 μM.
- Dekorionate embryona med hjälp av pinps under en dissekera Mikroskop. Med hjälp av två tång, grepp och försiktigt dra chorion isär för att frigöra embryot.
4. montering i aguppstod
Obs: den utvecklade monteringsmetoden kräver två olika koncentrationer av låg smält aguppstod i E3 med 0,02% Tricaine och PTU efter behov. Den första aganlösningen innehåller en optimal koncentration av aguppstod vid vilken distorsion och motilitet är minst. Optimeringen beskrivs i steg 5 nedan.
- Värm aganlösningarna för de två lagren (koncentrationen definierad i steg 5 nedan och 1%) till 65 ° c. Låt aguppstod svalna till ca 30 ° c strax före monteringen så att embryot inte skadas av värmen. För montering, Använd 35 mm glasbotten rätter med en nr 0 täckglas botten. Täckglaset fäst på botten av skålen skapar en 10 mm grunt (ca. 1,2 mm djup) väl, där embryot ska placeras.
Anmärkning: i detta fall, koncentrationen med minsta motilitet och snedvridningar var mellan 0,025 till 0,040% Agreste. - Placera försiktigt ett dekorionerat embryo med en av dess laterala sidor mot botten av skålen med hjälp av en glaspipett eller mikropipett. Om du använder en micropipett, skär den yttre delen av spetsen för att öka storleken på öppningen för att passa embryot (figur 1a). Ta försiktigt bort kvarvarande E3 med en micropipett.
- Lägg den första aguppstod lösningen på den lilla brunnen som skapats av omslags glaset fäst på botten av skålen för att täcka embryot (Layer 1) (figur 1B). Se till att aguppstod täcker den lilla brunnen men kommer inte overflow det.
- Täck den lilla brunnen med ett täckglas (22 mm x 22 mm) (figur 1C) för att skapa ett smalt aguppstod fyllt utrymme med embryot mellan de två täckglasögonen.
- Placera ett lager av 1% aguppstod lösning ovanpå locket glaset över botten av skålen (Layer 2) (figur 1D). Eftersom detta skikt stelnar, håller det täckglaset på plats.
- Fyll den resterande delen av skålen med E3 som innehåller 0,02% Trikain för att hålla systemet hydrerad (Layer 3) (figur 1E).
Anmärkning: i denna inställning, locket glaset och 1% aguppstod skydda bottenskiktet från att bli utspädd.
5. optimering av aguppstod lösning för Layer 1
- För att identifiera den optimala koncentrationen av aguppstod för Layer 1, Använd en flerskalig rutnät sökmetod. Montera embryon i ökande koncentrationer av aguppstod från 0,01% till 1% följt av tidsförlopp avbildning av embryonal tillväxt begränsning och motilitet inom synfältet. Identifiera koncentrationerna där både distorsionen och motiliteten är minst.
- För att optimera koncentrationen av aguppkommit ytterligare, montera embryona med ett finare intervall av koncentrationer av aguppstod (t. ex. mellan 0,025 och 0,040% Agreste) beroende på den koncentration som befunnits vara bäst i steg 5,1 (t. ex. 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
Anmärkning: i vårt laboratorium var den optimala aguppkom koncentrationen runt 0,03%.
6. fotografering med tidsfördröjning
Obs: denna monteringsmetod fungerar för alla inverterade Mikroskop med Time-lapse funktionalitet för fluorescens och ljus fält avbildning.
- Utför fotografering med tidsförlopp för hela embryot eller delar av det i upp till 55 timmar. För avbildning av flera embryon, Använd en scenadapter som rymmer flera rätter med ett embryo monterat per maträtt. Rotera rätterna en efter en så att embryona är ungefär horisontellt placerade som bestäms av ögat. För optimal embryonal tillväxt och utveckling, Använd ett Mikroskop skede med en inkubator inställd på 28,5 ° c.
- Välj ett mål med låg förstoringsgrad i Mikroskop programvaran. Under ögat pjäs, lokalisera och fint anpassa embryona horisontellt genom att rotera rätterna med hjälp av ljus fält belysning och registrera sina platser i programvaran. Skapa ett filnamn för automatisk sparande av data.
Anmärkning: i detta experiment, en plan APO λ 4x 0,2 NA mål och XY fliken inom nd förvärv fönstret användes för att registrera platser av embryon. Data sparades i. nd2-format. Målet valdes genom att klicka på dess ikoner i ti pad fliken. - Ställ in hålstorlek, skanningshastighet, bildstorlek och zoom. Välj sedan ett högre förstorings mål för att avbilda bilderna.
Anmärkning: i detta experiment, en plan-APO 10X 0,45 NA mål användes för avbildning av hela embryon, och en super-fluor 20x 0,75 NA mål användes för den högre förstoringen avbildning av delar av embryot. Den hål var satt till 1,2 au (19,2 μm för 10X objektivet), var skanningshastigheten inställd för en pixel Dwell tid på 2,4 μs och bildens storlek var inställd på 1024 x 1024 pixlar med en scan zoom av en, vilket ger en pixelstorlek på 1,24 μm för 10X objektivet och 0,62 μm för 20x-linsen. - Välj kanalerna för fluorescensen som ska avbildas. Justera inställningarna för bildfångst en kanal i taget. För varje fluorescens kanal justera lasereffekt och detektor hög spänning, se till att samla in det bästa dynamiska omfånget möjligt samtidigt undvika mättnad och begränsa photoblekning.
Anmärkning: i detta experiment var GFP avbildas med 488 grön kanal, (488 nm Laser och emission mellan 500 och 550 Nm), och RFP med 561 röd kanal (561 nm Laser och emission mellan 570 och 600 Nm), och överföringen bilden samlades in med hjälp av 561 nm Laser och den överförda Ljusdetektorn (TD - kanal). - Att avbilda hela embryot med 10X mål, bild flera fält med överlappning och sy ihop dem med hjälp av Mikroskop programvaran.
Obs: eftersom embryona kommer att växa kraftigt i storlek under bildtagning, se till att det finns utrymme i synfält anterior och posteriort om embryot. Använd fliken Skanna stor bild i fönstret nd-förvärv och välj ett 4 x 1-mönster med 10% överlappning för att fånga in fyra intilliggande fält. - Konfigurera inställningarna för att fånga Z-stackarna med hjälp av Mikroskop programvaran.
Obs: eftersom embryot är monterad nära botten av glas skålen, dess centrum kommer att flytta bort från botten när den växer. Använd fliken Z i fönstret nd-anskaffning och välj det asymmetriska relativa intervallet. Med denna metod används det aktuella fokus planet som referensplan och resten av planen är asymmetriskt fördelade över och under för att inkludera hela embryot i Z-stacken volym, med tillräckligt utrymme för att redogöra för preparatet tillväxt. I alla experiment var intervallet inställt på 11 μm och det totala intervallet till cirka 45 plan. - För att bibehålla fokus för flera embryon under långtids fotografering med tidsfördröjning, Använd ett automatiserat fokus. Om du avbildar flera embryon ska du justera de individuella förskjutnings nivåerna för varje embryo för att fokusera på referensplanet.
Notera: i detta experiment användes ett laserbaserat fokus stabiliseringssystem. - Ställ in tids fördröjnings parametrar i Mikroskop programvaran och bilden under en löptid på 55 h vid cirka 1 h intervall. I varje cykel, fånga två embryo datauppsättningar sekventiellt och spara data automatiskt efter varje cykel.
- Bearbeta bilder med hjälp av en on-line eller off-line version av Mikroskop programvaran. Om mer än ett embryo avbildas, skapa oberoende filer för varje embryo genom att dela upp datauppsättningen baserat på platsen för avbildning. Använd maximal intensitet prognoser eller ett liknande verktyg för att konvertera 3D-tid datauppsättningar i 2D tid datauppsättningar. Skapa filmfiler med hjälp av menyalternativet Spara som , markera. avi som filformat. Välj alternativet Ingen komprimering med 200 MS-intervall för en uppspelningshastighet på 5 bildrutor/s.
Anmärkning: den ursprungliga datauppsättningen av två embryon i detta experiment delades med hjälp av funktionen dela platser i programvaran (fil | Import/export | Dela Multipoints). 3D-tidsdatauppsättningar konverterades till 2D-tidsuppsättningar med hjälp av funktionen för maximal intensitetsprojektion (bild | Nd bearbetning | Skapa maximal Intensitetsprojektionsbild i Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utveckling av monteringsmetoden
Det huvudsakliga syftet med detta arbete var att utveckla en låg kostnad Monteringsteknik för tidsförlopp avbildning av zebrafiskar utveckling under längre tidsperioder. Den lagrade monteringsmetoden utvecklades för att möjliggöra full tillväxt av den bräckliga zebrafiskar embryo kroppen, samtidigt begränsa dess rörelser. Om aganhalten i lager 1 är för hög blir embryona förvrängda och böjda (figur 2). Embryon som odlas på 0,1% och 0,5% Agreste har förkortade svansar, förvrängda fenor och böjda huvuden. Tvärtom, om aganhalten koncentrationen är för låg, kommer embryona flytta ut ur synfältet under tid-lapse mikroskopi, även om de är sövda, som den växande svansen svänger ut från embryot kroppen och orsakar den att flytta. I våra händer varierade den optimala aguppkom koncentrationen mellan 0,028% och 0,034% aguppstod mellan olika partier av Agreste. Montering under 0,025% Agreste inte ger tillräckligt motstånd för embryot att stanna inom synfältet.
Förlängd tidsfördröjning avbildning av vaskulär, neuronala och muskelutveckling
Efter optimering av monteringsmetoden som beskrivs ovan, tid förfaller konfokala mikroskopi bilder fångades över en spännvidd på 55 h. Vi avbildade levande transgena zebrafiskar uttrycker GFP eller RFP i olika vävnader. En fördel med att använda transgena fiskar med endogena fluorescens för tidsfördröjning Imaging är att fluorescensmolekyler, såsom GFP och RFP, produceras kontinuerligt i levande embryo, och därmed är det inte lätt Foto blekmedel. För det första var embryon av ett kors av TG (kdr1: EGFP) mitfab692/B69210 och ubi-zebrabow 11 avbildade . I dessa embryon uttrycks RFP i alla celler av embryot, vilket möjliggör visualisering av den allmänna embryots struktur. GFP uttrycks i den endotelceller av kärl. Dubbla transgena embryon var avbildade för 55 timmar från cirka 30 somite skede att visualisera vaskulär utveckling i huvudet och kroppen (figur 3 och kompletterande film S1) med en 10X mål med 0,45 na. Två embryon/session avbildades med z-stackar och Time-lapse i en slinga så att efter avbildning det första embryot vid två olika våglängder, den andra var därefter avbildas och sedan den första igen. Figur 3 visar intersegmentär kärl (ISV) Sprouting, utveckling av subintestinal fartyg och huvud vaskulatur, och caudal Vein plexus kondensation tillsammans med trunk förlängning. Avbildning av hela embryot med kärlsystemet visar att ISV-spirande börjar mellan somiter och växer dorsalt upp till den punkt i neurala röret, där ISVs tar en annan väg och groddar i en riktning över till nästa främre somite gränsen.
Nästa, embryon av ett kors av TG (MNX: GFP) mitfab692/B629 och ubi-zebrabow var avbildas för 55 timmar ungefär från 30 somite skede att visualisera motorneuron utveckling (figur 4 och kompletterande film S2). TG (MNX: GFP) hade först korsats till mitfab692/B692 (både från Zebrafish International Resource Center vid University of Oregon, eller) för att producera TG(MNX: GFP) mitfab692/b629. Den motorneuron axoner spira från ventrala neurala röret över somiterna mot den ventrala sidan av embryot. Till skillnad från de intersegmentär fartyg som gro i mellan somiterna, den axoner GRO över mitten över Chevron-formade somites. Den groning börjar mot den främre änden av neuralröret, i en rät vinkel från neuralröret, och sprider posteriort. Genom det somite/äggula gränssnittet, groning ändrar riktning till främre och bakre groning. Notera innervation av det utvecklande hjärtat av främre neuriter.
Också, embryon av ett kors av TG (KDR: enl. memRFP) mitfab692/b692 (Cross av TG (KDR: enl. memrfp och Mitfab692/B692) och TG (MNX: GFP) mitfab692/b692 avbildades. I de tidigare embryona, den röda vaskulär fluorescens var inte synlig förrän 36 timmar efter befruktning (HPF), och därför började vi Imaging vid en senare tidpunkt vid 2 DPF. Vi avbildade en del av stammen, dorsalt till äggulan SAC förlängning, med högre förstoring (20x mål). Denna film visar att embryona låg fortfarande tillräckligt för bra bildkvalitet vid högre förstoring. Den Co-utveckling av dorsala groning av motorneuron axoner i förhållande till placeringen av intersegmentär fartyg följdes (figur 5 och kompletterande film S3). I dessa filmer, de finare detaljerna i ventrala Axon groning är synliga, liksom dorsala Axon groning från neurala röret till en punkt där neuronala axoner och intersegmentär fartyg sammigrera. Den kaudala venen plexus kondensation är också tydligt visad. Observera att som en neurit spira saknas mot den bakre änden av svansen (i positionen av den 12: e påverkar från höger sida), den närmaste bakre neuron sträcker sig mot den främre delen av embryot för att täcka området mellan neuriter 11 och 13.
Slutligen var ett kors av HGn39b12,13 och ubi-zebrabow avbildas. HGn39b är en ztrap linje med GFP infoga i aktivator av värme chock protein ATPase homolog 1 (AHA1) gen (http://Kawakami.Lab.Nig.AC.jp/) och det uttrycker GFP i musklerna i Somiterna (figur 6 och kompletterande film S4). Somite numrerar förhöjning, somitesna fördjupa också i längd och bredd. Denna film också fint visar hjärtat utveckling i röd fluorescens från ubi-zebrabow Fish line.
Figur 1: Beskrivning av monteringsmetod. Atillsätt zebrafiskembryot till den lilla brunnen som skapas av glas bottnen i 35 mm-skålen. (B) tillsätt Agros Layer 1 till den lilla brunnen för att täcka embryot. (C) Placera försiktigt ett täckglas över den lilla brunnen. (D) tillsätt Agros Layer 2 på hela botten av 35 mm skålen. (E) Lägg till E3 till skålen. FSchematisk ritning av en tvärsektion av monterings uppsättningen. (G) Mikroskop bild (5x mål) av zebrafiskar embryot i den slutliga montage. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: begränsning av embryonal tillväxt och utvecklingsförsening i olika koncentrationer av Agros. Embryona monterades i olika aganskoncentrationer och deras storlek och utveckling avbildades vid 48 HPF. Bilder tagna med ett Mikroskop utrustat med en Digital Mikroskop färgkamera (2.5 x mål) och medföljande Mikroskop programvara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: visualisering av utvecklingen av vaskulatur. Korsa av TG (kdr1: egfp) mitfab692/b692 och ubi-zebrabow avbildat från omkring 30 somite arrangerar för 55 h på ett konfokalmikroskopi Mikroskop. Vasculature i grönt och alla andra celler i rött. Skalbar 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: visualisering av utvecklingen av nervceller och neurit Sprouting. Cross av TG (MNX: GFP) mitfab692/B629 och ubi-zebrabow avbildas från ca 30 somite skede för 55 h på ett konfokala Mikroskop. Motorneuroner i grönt, alla andra celler i rött. Skalbar 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: visualisering av co-utveckling av nervceller och kärl. Cross av TG (KDR: enl. memRFP) mitfab692/b692 och TG (MNX: GFP) mitfab692/b692 avbildas för 55 timmar från ca 2 DPF på en konfokal Mikroskop. Vasculature i rött, motorneuroner i grönt. Skalbar 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: visualisering av MUSKELGFP-uttryck i somiter. Cross of HGn39b och ubi-zebrabow avbildades på ett konfokal Mikroskop för 55 h från ca 30 somite skede. Muskler i grönt, alla andra celler i rött. Scale bar 500 μm vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film S1: film av ett embryo till ett kors av TG (KDR1: egfp) mitfab692/B692 och ubi-zebrabow avbildas från ca 30 somite skede för 55 h på ett konfokal Mikroskop med en 10X mål. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande film S2: film av ett embryo till ett kors av TG (MNX: GFP) mitfab692/B629 och ubi-zebrabow avbildas från ca 30 somite skede för 55 h på ett konfokala Mikroskop med en 10X mål. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande film S3: film av ett embryo till ett kors av TG (KDR: enl. memRFP) mitfab692/b692 och TG (MNX: GFP) mitfab692/b692 avbildas från ca 2 DPF för 55 h på ett konfokal Mikroskop med en 20x mål. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande film S4: film av ett embryo till ett kors av HGn39b och ubi-zebrabow avbildas från ca 30 somite skede för 55 h på ett konfokala Mikroskop med en 10X mål. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs en monteringsmetod för utökad tidsfördröjning konfokalmikroskopi av hela zebrafiskar embryon. Det mest kritiska steget för monteringsmetoden är att identifiera den optimala koncentrationen av aguppstod som kommer att möjliggöra obegränsad zebrafiskar embryotillväxt, och samtidigt hålla embryona i en helt fast position för konfokal avbildning. Eftersom den optimala koncentrationen av aguppstod är mycket smal, är detta värde mycket känsligt för fel i mätningen av vikten av Agreste och volymen E3 under beredning av lösningen. Den optimala koncentrationen kan också bero på temperaturen och stadiet av embryot. Således måste den optimala koncentrationen omdefinieras för varje ny sats av aguppstod lösning genom upprepning av tester av olika koncentrationer.
Ett annat kritiskt steg är i monteringsmetoden är tillägget av det andra lagret av aguppstod. Det andra skiktet håller omslags glaset på plats. Det måste läggas noga till skålen lite i taget så att den inte orsakar täckglaset att flytta. Det andra skiktet fungerar också som en permeabel barriär för E3. Utan E3 kommer embryona att torka ut under bilden. Utan det andra lagret av aguppstod, kommer täckglaset och embryot att börja flyta.
En begränsning av den föreslagna monteringsmetoden är att även om det fungerar bra för inverterade Mikroskop, fungerar det inte för upprätt Mikroskop. Flera försök gjordes att utföra tidsfördröjning avbildning med hjälp av ett upprätt Mikroskop, genom att fylla glaset botten skålen med E3, tätning den med parafilm, och vrida den upp och ner. Men ofta detta resulterade i att monteringen kollapsade halvvägs genom Imaging. Detta kan ha orsakats av ökad värme i provet efter den långa exponeringen för laserljus, vilket gör att det stelnade aguppstod skiktet att smälta.
I slutet av tid-lapse mikroskopi började embryona att Visa perikardiell ödem. Varierande mellan olika experiment, ödem observerades mellan 35 och 50 timmar av avbildning. Om detta orsakades av embryoimmobilisering, eller en effekt av anestetika, är för närvarande inte känd. Tricaine är känt för att undertrycka sammandragning av skelett-och hjärtmuskulaturen. Följaktligen, Trikain påverkar hjärtfrekvensen hos vuxna fiskar14 och embryon15. Andra studier har också rapporterat att trikain behandling orsakar perikardiell ödem i zebrafiskar embryon2,16. I denna artikel ska en koncentration av Trikain (0.016-0.020%) används som ofta används i zebrafiskar forskning; ändå inträffade perikardiell ödem i slutet av vår avbildnings period. Perikardiell ödem utgjorde en huvudsaklig begränsning för att möjliggöra avbildning av embryona för ännu längre tidsperioder. Potentiella sätt att minska denna hjärttoxicitet är att kombinera två olika anestetika, såsom Tricaine med eugenol, eller använda α-bungarotoxin mRNA injektion för anestetika16; gynnsamma effekter av kombinatoriska eller alternativa anesthetizing föreningar måste undersökas ytterligare för förlängd tidsförlopp avbildning av zebrafiskar utveckling.
Sammanfattningsvis är den beskrivna monteringsmetoden snabb, enkel, kostnadseffektiv och fungerar på alla inverterade Mikroskop. Regelbundna glasbotten rätter och låg smältning aguppstod kan användas, och inga speciella formar, utrustning eller instrumentering krävs. Den lagrade monteringsmetoden möjliggör embryonal tillväxt och samtidigt hålla embryona i en fast position. Genom att använda förlängd tidsfördröjning avbildning av hela organismen ny kunskap om vävnads utveckling kan erhållas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Albert Pan och Arndt Sieakmann för gåvor av transgena fiskar. Vi tackar Koichi Kawakami vid National Institute of Genetics, det nationella Bioresource projektet från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan för gåvan av den transgena zebrafiskar HGn39b. Vi tackar också Fatima Merchant och Kathleen Gajewski för hjälp med konfokalmikroskopi, och Tracey Theriault för fotografier.
Detta arbete stöddes av bidrag från nationella institutet för miljö hälsovetenskaper vid National Institutes of Health (bidrags nummer P30ES023512 och kontraktsnummer HHSN273201500010C). SU stöddes av ett stipendium från Keck Computational cancer biologi program (Gulf Coast konsortia CPRIT Grant RP140113) och av Hugh Roy och Lillie donationsfond. J-Å G stöddes av Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
