Summary
本研究描述了在定义的流动条件下，在剪切应力下在分化人类原发内皮细胞表面产生的对冯·威勒布兰德因子字符串的肺炎球菌依从的微观监测。通过应用微分免疫染色程序，此协议可扩展到特定细胞结构的详细可视化和细菌定量。
Abstract
肺炎链球菌与内皮细胞表面的相互作用通过对美能敏感蛋白（如冯·威勒布兰德因子（VWF）在血液流动中介导。这种糖蛋白改变其分子构象，以响应剪切应力，从而暴露结合位点，用于广泛的宿主-配体相互作用。一般来说，在定义的剪切流下培养原发内皮细胞可以促进特定的细胞分化，并形成一个稳定且紧密相连的内皮层，类似于血管内壁的生理。.因此，对细菌病原体与涉及对肌敏感的蛋白质的宿主血管之间的相互作用的功能分析需要建立泵系统，以模拟已知影响表面的生理流动力。血管细胞。
本研究中使用的微流体装置使具有定义流速的流体能够连续和无脉冲再循环。计算机控制的气压泵系统通过生成连续、单向和控制的介质流，在内皮细胞表面应用定义的剪切应力。通过使用专为微观可视化而设计的特殊通道幻灯片，可以在流中微观监控和量化细胞和细菌附着物的形态变化。与静态细胞培养感染（一般要求在免疫标记和微观分析之前进行样品固定）不同，微流体滑道可实现基于荧光的蛋白质、细菌和细胞成分的检测样品固定后;系列免疫荧光染色;和直接荧光检测。结合荧光细菌和特定的荧光标记抗体，这种感染程序为与血管过程相关的大量科学应用提供了一个高效的多组分可视化系统。
Introduction
肺炎球菌感染的发病机制的特点是与细胞外基质化合物和人类血变成分的多样性相互作用，如质原和VWF1，2， 3，4，5，6，7，8 。多域糖蛋白VWF作为平衡血变的关键调节器，通过调解血栓细胞招募和纤维蛋白结合在血管血栓形成位9。功能，活跃的VWF对出血控制和伤口愈合的重要性证明了冯·威尔布兰德的疾病，一种常见的遗传性出血紊乱10。
球状VWF在人体血液系统中循环，浓度高达14.0微克/mL11，10。为了应对血管损伤，内皮韦贝尔帕拉德体（WBP）局部释放的VWF明显增加11，12。以前的研究表明，肺炎球菌粘附于人类内皮细胞及其产生的孔隙毒素肺炎溶血蛋白显著刺激发光VWF分泌13。血流的流体动力诱导机械反应VWF域的结构开放。在10dyn/cm2的流速下，VWF多变到长度高达几百微米的长蛋白串，仍然附着在子内皮10，12。
为了理解在剪切应力下产生的多面化VWF字符串在肺炎球菌与内皮表面相互作用中的功能，建立了基于微流体的细胞培养感染方法。使用一种微流体装置，采用软件控制的气压泵系统。这使得细胞培养基的连续、单向再循环具有定义的流速。因此，系统在内皮细胞表面应用了定义的剪切应力，内皮细胞仍附着在专用通道滑道内。这种方法能够模拟人类血管系统血流中的剪切力，在定义的恒定流动条件下，VWF字符串在分化的内皮细胞上生成。为此，内皮细胞在特定的通道幻灯片中培养（见材料表），这些细胞适用于流中的微小分析。微流体泵系统提供了在可融合的内皮细胞层上形成扩展 VWF 字符串所需的高度定义和控制的剪切应力情况。通过组胺补充刺激人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）的VWF分泌后，通过施加10 dyn/cm2的剪切应力（*）诱导弦形成。剪切应力定义为作用于细胞层的力。它是大约根据康尼什等人计算的。al.14与方程 1：
其中 = = 在 dyn/cm2中剪切应力 ，= 在 （dyn_s）/cm2中的粘度，h = 通道高度的一半，w = 通道宽度的一半，而 = = 流量（以 mL/min 表示）。
公式 1 的结果取决于所使用的不同幻灯片的不同高度和宽度（参见材料表）。在本研究中，使用了 0.4 μm 的 Luer 通道滑动，导致室滑动系数为 131.6（参见公式 2）。
37°C时介质的粘度为0.0072 dyn_s/cm2，剪切应力为10 dyn/cm2。这导致流量为 10.5 mL/min（参见公式 3）。
本文详细介绍了使用单向层流系统对宿主血管中细菌感染机制进行调查和可视化的微流体细胞培养过程的适应和进展。内皮层上的VWF字符串的生成也可以通过使用其他泵系统，能够应用连续和稳定的剪切应力15刺激。
在原发内皮细胞培养到流动汇合和刺激VWF弦形成后，在恒定的微观控制下，将表达红荧光蛋白（RFP）16的肺炎球菌添加到内皮细胞层中。使用VWF特异性荧光标记抗体，对内皮细胞表面的细菌附着在VWF串上进行微观可视化和实时监测长达三个小时。用这种方法，VWF作为促进细菌附着到血管内皮的粘附辅助因子的作用被确定8。
除了蛋白质分泌和构象变化的微观可视化外，该方法还可用于实时监测细菌感染过程的单步骤，并量化不同时间点的附着细菌数量。感染。特定的软件控制的泵系统还提供在定义的恒定流动条件下培养内皮细胞长达数天的可能性，并实现定义的脉冲介质流孵育。此外，该方法可以使用不同的单元格类型应用。调整染色方案还能够检测和可视化内化为真核细胞的细菌。
本手稿描述了这种高级实验协议，可用作一种定义、可靠和可重复的方法，用于对病理生理学过程进行高效和通用的表征。
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Protocol
微流体细胞培养用商业性原发性人类脐带静脉内皮细胞（HUVEC）进行。公司在未经捐赠者知情同意后对细胞进行隔离。这项研究得到了联邦巴登-符腾堡州医生委员会伦理委员会的批准，参考号为219-04。
注：有关协议供应，请参阅材料表。
1. 原内皮细胞的预培养
- 在37°C下从三个不同的捐赠者轻轻解冻含有1 x 105初级HUVEC的冷冻甘油小瓶，并在25cm2细胞瓶中将细胞播种在7 mL的预热内皮细胞生长培养基（ECGM，准备与补充剂一起使用）。
注：主内皮细胞在超过5个增殖周期后失去分化能力。因此，如果需要高等级的细胞分化，只能使用通道少于5个通道的细胞。 - 在5%CO2大气中在37°C下培养细胞60分钟，使表面附着并交换ECGM细胞培养基，以去除冷冻保存的残留物。
- 在5%CO2大气中在37°C下继续培养细胞，直到它们形成亚康体细胞层。
注：HUVEC 不能生长到汇层，因为紧密的细胞-细胞接触会阻止在流动后期形成稳定的细胞层。
2.肺炎链球菌的预培养
注意：肺炎链球菌是生物安全2级制剂，只允许在生物安全2级实验室进行培养。对于所有细菌处理，使用安全等级为 2 的清洁工作台，严格避免气溶胶形成，并使用带有气溶胶保护的离心机进行细菌沉淀。
- 接种哥伦比亚血琼脂蛋白板与肺炎链球菌临床分离ATCC11733衍生自甘油库存不断储存在-80°C，并培养琼月琼度在37°C和5%CO2。
- 准备40 mL的托德·休伊特液体汤，辅以1%酵母提取物（THY）和15 mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4，用于细菌培养和洗涤步骤。
- 使用无菌管进行细菌培养，用细菌质量接种液体培养汤。以非接种液体汤为参考，在 600 nm 处通过光度测量测量 1 mL 等分，控制接种量。将细菌质量填充液体汤中，直到达到 0.15 的 600 nm （OD600）的光学密度。
- 在37°C和5%CO2下孵育接种液汤，不摇晃，并使用塑料比胶测量1 mL等分，每30分钟测定OD600。
- 一旦细菌培养达到OD600 0.4，对应于指数生长阶段，在室温（RT）下在1000 x g下将细菌培养悬浮液离心10分钟。
注：不要让肺炎球菌培养达到 OD600超过 1.0，因为高肺炎球菌培养密度已知会触发细菌自测，这可能会影响整体细菌健康。 - 用10 mL PBS 轻轻悬浮细菌沉积物，在 RT 处 1，000 x g处再次将沉淀物再悬浮 10 分钟。
- 将洗涤的细菌沉积物轻轻悬浮在 1 mL PBS 中，并使用 1 mL 的 PBS 作为参考，确定细菌悬浮液的 OD600 10 μL。
- 将 PBS 中的细菌量调整到 OD600的 2.0。根据先前确定的细菌计数，2.0 的 OD600对应于 2 x 109菌落形成单元 （CFU）。立即进行感染程序，以防止细菌自传染。
3. 微流体条件下HUVEC的内皮细胞培养
- 通过受控蛋白解分离，从细胞培养瓶中分离原内皮细胞。使用干净的工作台在无菌环境中执行以下步骤。为洗涤步骤准备 15 mL 无菌 PBS 的体积。
- 从亚康康生长的HUVEC层中取出ECGM，并使用血清学移液器用10mL PBS清洗细胞层，以去除细胞培养基。
- 在37°C下用3mL37°C预热细胞分离溶液孵育洗涤的HUVEC，用于细胞分离5分钟。通过每分钟的微观监测来观察蛋白解细胞分离。
- 将分离的细胞悬浮液移入含有7 mL的ECGM的管中，并辅以2%的胎儿小牛血清（FCS），用于阻止蛋白解解和在RT处220 x g下沉淀细胞3分钟。
- 去除上清液，并在250 μL的ECGM中重新悬浮HUVEC，辅以5%FCS和1 mM MgSO4。使用 Neubauer 细胞计数室使用 10 μL 的细胞悬浮液进行细胞计数，并将细胞计数调整为 4 x 106细胞/mL ECGM，辅以 5% FCS 和 1 mM MgSO4。
注：对于每个流量实验 30 mL 的 ECGM 介质辅以 5% FCS 和 1 mM MgSO4将是必需的。从这里这个介质组成被称为ECGMS-媒体。培养基中的FCS浓度从2%增加到5%支持在通道幻灯片中播种的HUVEC细胞附着和细胞活力。介质补充FCS和MgSO4在剪切应激条件下可显著稳定HUVEC的细胞附件。
- 在通道幻灯片中播种和培养 HUVEC。使用干净的长凳在无菌环境中工作。细胞将在剪切压力下培养2天，然后感染细菌和显微监测再持续2小时。
- 将通道滑动、直径 1.6 mm 和长度为 50 厘米的灌注集、ECGMS 介质的等分和高度为 0.4 μm 的 Luer 通道滑动平衡，在 37°C 下具有 5% CO2大气的培养箱中 24 小时，以减少气泡的数量。
注：建议采用此程序对塑料设备进行脱气，并预加热介质、灌注管和储液罐。如果材料或液体储存在RT或冰箱中，在实验期间在培养箱中加热时，溶解在塑料中的气体和液体将被释放。然后会出现气泡。在实验前对所有塑料部件进行脱气将消除这种影响。每次系统从培养箱中取出时，气体吸收过程又开始了。因此，在 RT 上快速工作，切勿将液体单元留在培养箱外更长时间。 - 使用移液器将 PBS 溶液中 2% 无菌过滤的猪明胶溶液注入温度平衡通道滑道的储液罐之一。在 37°C 下孵育明胶溶液 1 小时，在无菌条件下使用 1 mL Luer 注射器用 1 mL PBS 冲洗滑道。
- 将明胶涂层通道滑块放在薄聚苯乙烯或发泡胶板上，以防止滑动温度下降。将 4 x 106/mL HUVEC 悬架的 100 μL 加入幻灯片，并带有 1 mL Luer 注射器。
注：将通道滑块放在清洁工作台的冷金属表面可能会降低滑底温度，从而对内皮细胞产生冷应力。在细胞移液过程中，将幻灯片保持一点向上，让气泡从滑道内部上升和消失。 - 在 37°C 和 5% CO2下用 HUVEC 孵育通道滑道 60 分钟，并填充通道滑道两端的介质储层，每个通道的 ECGMS 介质为 60 μL ECGMS 介质。在37°C和5%CO2下孵育1小时。
- 将通道滑动、直径 1.6 mm 和长度为 50 厘米的灌注集、ECGMS 介质的等分和高度为 0.4 μm 的 Luer 通道滑动平衡，在 37°C 下具有 5% CO2大气的培养箱中 24 小时，以减少气泡的数量。
- 调整微流体泵和软件设置。
- 将平衡灌注组连接到泵单元，加注 13.6 mL 的 ECGMS 介质，然后启动泵控制软件。使用设置的流体单元菜单中的向下滚动窗口选择足够的灌注集和造型室幻灯片类型。在软件中选择 0.007 （dyn_s/cm2） 以进行中等粘度。（请参阅补充图 1中标有红色箭头的压力泵软件设置）。
- 在培养箱外，将装有干燥硅珠的玻璃瓶连接到气压管（参见图1，内注3）。压力泵的空气在灌注储液罐和泵之间循环，在重新进入泵装置之前必须干燥。在软件菜单中选择流量参数，将压力设置为 40 mbar，并通过启动连续介质流将泵管与液体介质冲洗。（这些设置也由补充图 1中的红色箭头指示。
- 规划所需的流量培养剪切应力循环。从 5 dyn/cm2开始，控制平衡储液罐泵，并确保泵系统中没有气泡循环。
注：通道滑动中的壁剪切应力取决于灌注介质的流速和粘度。如果使用另一个泵系统，请参阅简介中描述的方程，以设置产生所需剪切应力级别的流速。所述设置对应于 5.42 mL/min 的流速（在补充图 2中显示压力泵软件中适当流量参数设置的模范屏幕截图）。 - 通过夹紧 Luer 连接附近的管，停止泵控制软件中的流量循环，并将中流保持在灌注管中。连接通道滑块，从而避免气泡，并将带连接通道滑动的流体单元置于 CO2培养箱中，温度为 37°C 和 CO25%。在 5 dyn/cm2处启动剪切应力 30 分钟，使细胞在加速剪切应力水平之前平稳地适应剪切应力产生的力（参见补充图 3）。
注：小心，在连接到管系统后，管系统或滑轨中没有气泡，因为气流中的气泡运动可能导致细胞分离。 - 将剪切应力加速至 10 dyn/cm2（在此流量设置中对应于 10.86 mL/min），并在 37°C 和 5% CO 2 的小型 CO2培养箱中孵育通道滑动，在 37°C 和 5% CO2中孵育通道滑动 48 小时，以允许细胞分化 （在补充图 4中，相应的软件设置以红色箭头表示。
注：如果流量培养直接开始于10 dyn/cm 2，HUVEC细胞往往会从通道表面分离。如果流量培养开始时使用 5 dyn/cm2进行至少 30 分钟的剪切应力，然后缓慢地将剪切应力增加到所需的 10 dyn/cm2，则细胞仍附着在腔室表面。10 dyn/cm2的剪切应力是 VWF 字符串形成所需的此灌注设置中的最低值。 - 微流体细胞培养24小时后，当两个介质储层达到平衡介质水平时，用泵控制软件停止中流。将液体单元放在干净的工作台上，并使用 10 mL 血清移液器去除灌注储液罐循环培养培养基的 10 mL。将10mL的ECGMS-培养基加入储液罐以更新介质，将流体单元放回37°C和5%CO2的CO2培养箱中，并使用泵控制软件重启流体培养。
注：压力泵的功能可能突然被实验室机器（如大型离心机）破坏，从而产生强烈的磁场扰动。这种突然的中断可能导致细胞分离。在实验过程中，请注意此类机器在压力泵附近没有活动。 - 在显微可视化之前，开始将覆盖荧光显微镜阶段的温度孵化室预热至 37°C，以进行 24 小时的温度平衡。显微镜预热后，启动显微镜软件控制，通过选择适当的过滤器设置（540 nm/590 nm）来检测 RFP 表达细菌和荧光显微监测的主要设置。470 nm/515 nm，用于检测 FITC 结合的 VWF 特异性抗体的荧光素发射。预热一个额外的加热室，用于在37°C下孵育流体单元。
注：在感染分析和微观监测过程中，通道滑动和循环介质的温度不应大幅下降，因为这会对细胞产生冷应力。一般来说，覆盖显微镜阶段的温度室的大小不足以覆盖整个流体单元。因此，建议使用预热至 37°C 的额外加热室。 - 对于微观可视化，将流体单元放入 37°C 预热加热室，并将通道滑动放在 37°C 预热显微镜的舞台上。
注：对于微观可视化，由于灌注管长度有限，需要从 CO2培养箱中取出流体单元和通道滑块。如果在 5% CO2大气外需要超过 180 分钟的感染时间和显微监测，则应使用 pH 缓冲介质进行微流体培养。 - 在将组胺和细菌注入流循环的整个流动实验期间，以及使用显微镜的明亮场模式完成流动实验后，控制HUVEC层的细胞形态和完整性。
4. VWF释放的诱导和多面化VWF字符串的可视化
- 保持流量设置，因为需要 10 dyn/cm2的剪切应力来触发 VWF 到高达 200 MDa 的长串的多动化。将100 mM组胺溶液的136 μL注射到使用注射口在灌注管中循环的ECGMS-培养基中，诱导VWF从内皮WPB中释放。流动介质中组胺的最终浓度为1 mM。如果没有可用的注油口，可以通过移液到泵储液罐的介质中交替添加组胺。
- 对于多美化 VWF 字符串的免疫荧光检测，当储液罐中达到平衡的中位水平时停止流动，并将 20 μg 的 VWF 特异性 FITC 结合抗体注入 200 μL PBS （pH 7.4） 的循环 13.6 mL 中。使用喷射端口的 ECGMS 介质。如果没有可用的注射口，可以通过移液到泵储液罐的介质中交替添加抗体。这导致最终抗体浓度为1.3μg/mL。
- 对于在短时间内对多个视场进行微观扫描，请使用显微镜的荧光单元，使用具有 30% 功率的 Xenon 荧光装置和显微荧光相机。使用明亮场模式监视 HUVEC 图层的形状和形态，以选择适合 VWF 字符串可视化的代表性单元格。
- 要可视化绿色荧光 VWF 字符串，请在显微镜软件 （LasX） 的荧光单元菜单中选择 63x/1.40 油目标和 470 nm 检测过滤器。创建至少 50 个代表性字段视图的 Z 堆栈快照，每个视图包含大约 10 个形态完整的 HUVEC。为了在不同时间点定量绿色荧光VWF字符串，扫描多个视场。
5. 实时流中VWF字符串细菌附着的微观评价
-
通过免疫荧光检测，量化对HUVEC细胞表面产生的VWF字符串的肺炎球菌附件。
- 保持流量，并使用注射口将1.35 x 108 CFU/mL RFP表达肺炎球菌的最大体积为1 mL注入ECGMS介质。或者，将细菌移入泵储液罐中的介质中。以 10 dyn/cm2的速度重新启动剪切应力，让细菌在泵系统内循环。
- 选择 63x 油浸物，用于显微镜放大，并将显微镜软件中的荧光滤光片设置调整到 RFP 通道（540 nm 检测过滤器），以检测 RFP 表达性肺炎球菌。
- 为了量化对 VWF 字符串的细菌附件，停止流并创建至少 30 个代表性场视图的 Z 堆栈快照，每个视图包含大约 10 个形态完整的 HUVEC，并计算肺球菌的数量。
- 使用 ANOVA 单因子统计算法来评估数据，然后进行后两尾未配对的样本测试，以便进行详细的统计比较。<0.05 的 P 值被认为具有统计显著性。
6. 样品固定后对VWF字符串的细菌附着的微观评估
- 在免疫荧光染色前取样固定。
- 停止流量，从泵储液罐中取出 10 mL 的 ECGMS 介质，并添加 10 mL 的 PBS，并辅以 5% 的甲醛 （PFA）。让PFA溶液在10 dyn/cm2的剪切应力下循环10分钟。
- 断开通道滑块与泵单元的连接。
- 阻断细胞表面的未特异性结合位点，对VWF字符串和附着细菌进行免疫检测。
- 准备 4 mL 的洗涤溶液，含有 100 mM Na2CO3 （pH 9.2），并辅以 4% 蔗糖，用于所有洗涤步骤。制备含有100mM Na2CO3（pH 9.2）的阻断溶液1 mL，辅以4%蔗糖和2%牛血清白蛋白（BSA），用于阻断非特异性结合位点。
- 使用 1 mL Luer 注射器清洗 PFA 孵育通道滑道滑道 3x，注射 200 μL 的洗涤溶液，并在 RT 下用 200 μL 阻滞溶液孵育滑道 120 分钟。
- 准备4 mL的另一个阻断溶液含有100 mM Na2CO3，（pH 9.2）补充4%蔗糖和0.5%BSA，用于稀释抗体。使用这种阻断溶液的200μL稀释肺炎球菌特异性兔子抗血清1：100。使用这种阻断溶液的200μL稀释VWF特异性小鼠抗体1：50，使VWF特异性抗体浓度为4μg/mL。从2mg/mL库存溶液中稀释AlexaFluor488-偶联二级抗体，在200 μL的PBS（pH 7.4）中1：100，最终产生20微克/mL的最终浓度。
注：在所述的免疫荧光设置中，当抗体在上述碱性碳酸盐缓冲液中稀释时，抗体检测可产生最佳结果。根据先前的结果，推荐的阻断溶液和抗体量适用于许多应用。然而，不同的实验可能需要单独优化抗体组合、抗体浓度、孵育时间和阻断缓冲液的组成。作为替代方案，具有中性pH范围的磷酸盐缓冲系统可能适合甚至优先作为孵化缓冲液。在荧光信号较弱的情况下，应增加二级抗体的浓度。如果检测到过多的非特异性荧光背景噪声，应增加阻滞物质的量。 - 对于 VWF 免疫荧光染色，使用 1 mL Luer 注射器注射 200 μL 的洗涤溶液 3x，用 1：50 稀释的 VWF 特异性抗体孵育滑道 30 分钟。洗涤溶液的μL，用1：100稀释的AlexaFluor488-结合小鼠特异性抗体在RT孵育幻灯片30分钟。最后，用200 μL的洗涤溶液再次清洗通道滑块3倍。
注：AlexaFluor-荧光团对漂白很敏感。因此，在与荧光结合抗体的孵育步骤中，应将其保持在暗室中，从而保护幻灯片。 - 为了免疫检测肺炎球菌，在RT用1：100稀释肺炎球菌特异性兔子抗体孵育幻灯片30分钟。 之后，用200μL的洗涤溶液清洗通道幻灯片3x，用1：100稀释的幻灯片孵育幻灯片AlexaFluor568-结合兔特异性抗体在RT.用200 μL的洗涤溶液再次清洗通道滑动3倍。
- 要用荧光噬菌体染色细胞细胞骨架，在RT处用120μL的Triton X-100孵育5分钟，用120μL稀释1：1，000的滑道清洗通道幻灯片3x，孵育120μL的1：1，000张。亚历克萨弗洛350-结合的噬菌体。这个孵育步骤将可视化聚合行为素细胞骨架，并允许监测细胞形状和可能的应力引起的形态变化。
- 用 200 μL 的洗涤溶液清洗通道滑块 3x。最后，用200μL ddH2O清洗幻灯片4x，并使用荧光显微镜上适当的滤光片设置，可视化绿色荧光VWF字符串、红色荧光细菌和蓝色荧光行为素细胞骨架。
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Representative Results
在恒定的单向流动中培养初级HUVEC，形成一个融合和紧密包装的细胞层，促进细胞WPB的生成，填充了对美氯介素VWF13，14。该协议描述了使用基于气压泵的无脉冲再循环系统的感染分析，需要模拟人类血流中的剪切应力情况。
该系统支持定义的软件控制流量条件设置。图1中的流方案说明了主要工作流程，从主内皮细胞的预培养（图1，内动1）和肺球菌的预培养（图1，内动2）开始。应用的微流体系统（图1，内注3）由一个特殊的通道滑道组成，该滑道通过Luer适配器连接到具有两个中等储液罐的灌注管。灌注管组放置在作为支架的流体单元上，并采用灌注管作为阀门系统。对于流量培养，具有中充灌注集和连接通道滑块的流体单元被放置在CO2培养箱中（图1，内注 3）。流体单元通过空气管连接到气压泵。管道中的空气必须通过含有硅珠的干燥瓶，以去除灌注储液罐中的水分，然后才能将空气重新泵送入泵系统（图1，内注3）。气压泵由计算机软件 （PumpControl v1.5.0） 控制，根据通道滑道的直径、灌注管组的长度和直径以及使用介质（图 1，内集 3）。WPB的外泄性VWF分泌物由组胺刺激8通过注射口在灌注管中的介质循环中诱导（图1，内注4）。在10 dyn/cm2的最小剪切应力下，释放的VWF蛋白多变并形成长度超过100μm的长蛋白串（图1，内集4，5，6和图2A）。这些蛋白质串在将氟素异体素 （FITC） 结合的 VWF 特异性抗体注射到介质中后，在微观上检测和可视化。循环抗体使细胞表面结合的VWF字符串的免疫荧光检测能够实时（图1，内录5）8。
使用原发内皮细胞的既定微流体细胞培养感染方法模拟了细菌性病菌（如链球菌）渗透血液循环时局部发炎的血管状况肺炎。显示了使用微流体内皮细胞培养在剪切应力下细菌与分化血管细胞相互作用的可视化和定量分析示例（图1，Inset5，6）。RFP表达的肺炎球菌被注入流中，在循环30分钟后，在微缩地检测到组胺刺激HUVEC的VWF字符串的细菌附着的最初迹象（图1，Inset5，6和图2A，B白色箭头）8。因此，使用RFP表达肺球菌使细菌附着在内皮细胞上的VWF字符串的定量，无需细菌抗体检测。
使用 Leica（即 LasX）提供的评估软件生成荧光强度的直方图叠加图，以可视化 RFP 表达肺球菌与用绿色荧光抗体检测的 VWF 字符串的共定位。这使得荧光图像中特定感兴趣区域 （ROI） 的共定位概率进行了定量分析。使用细菌信号的直方图叠加与 VWF 的荧光信号相结合，可以可视化两者的重叠荧光峰，从而确认肺炎球菌附着在 VWF 字符串上。细菌附件可抵抗连续施加的剪切应力至少25分钟（图2B）8。
总之，初级HUVEC的连续流动培养使VWF分泌和产生长VWF蛋白串，作为循环细菌8的粘附位。
图1：使用微流体内皮细胞培养分析VWF字符串细菌附着的工作流程。主要实验步骤的工作流程从原发内皮细胞的预培养开始，到细胞培养瓶中的亚冷凝。在细胞培养流之前，细胞被播种到明胶涂层通道幻灯片（内分1）。细菌生长在琼脂板上，随后在复杂的液体介质到中原木阶段（内注2）中种植。对于微流体细胞培养，带内皮细胞的通道滑块连接到泵系统流体单元的灌注管，并承受细胞分化的恒定流动（内注3）。VWF串（绿色箭头）的产生是由组胺注射在10 dyn/cm2的剪切应力诱导，并通过免疫荧光检测使用FITC标签VWF特异性抗体（内注4）进行显微监测。将RFP表达的细菌注射到循环介质后，通过450nm（内注5）的荧光发射，将肺炎球菌附着物（红色箭头）实时可视化到VWF字符串上。使用PFA固定细胞后，微分免疫荧光染色提供特定感染时间点（内联6）细菌附着的可视化效果。包括步骤 1、3 中描述的泵系统和 HUVEC 单元层的图像以及喷射端口（示波4）的图像。Inset 4和5中显示的免疫荧光图像已经修改，并经Jagau等人8许可使用。刻度条的长度在右下角指示。
图2：肺炎球菌与VWF字符串结合的代表性免疫荧光图像，在组胺刺激的HUVEC表面连续流动产生。（A） VWF字符串的生成在将生长的HUVEC暴露在10 dyn/cm2微流体泵系统剪切应力中后进行了微观量化。FITC 结合的 VWF 特异性抗体检测到 VWF 字符串。白色箭头指向 RFP 表达的肺炎球菌，红色荧光附着在长 VWF 字符串上。（B） 在恒流（白色箭头）中，细菌附着在绿色荧光VWF字符串上被微观观察长达2小时，并通过基于软件的确定ROI的荧光强度评估得到确认。使用共聚焦激光扫描显微镜（SP8，Leica）的荧光设备拍摄实时图像。刻度条 = 10 μm。这个数字已经修改，并经Jagau等人8的许可使用。
补充图1。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图2。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图3。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
模拟细菌与对美能敏感宿主蛋白（如 VWF）的相互作用，需要一个可渗透的细胞培养系统，该系统能够生成定义、单向和连续流动的液体，从而产生可靠的剪切应力.已经描述了几个微流体泵系统。Bergmann等人的综合综述总结了不同二维和三维细胞培养模型的关键方面17。
微流体技术是一种非常年轻的技术，始于20世纪90年代初，在微米甚至纳米尺度18的微环境中发展可控、可重复和可渗透的微环境。提出的微流体方法也可以应用于研究广泛的细菌粘附机制和涉及的蛋白质。它最适合任何涉及美能反应性粘附成分（如 VWF）的相互作用，使用标准细胞培养技术通常无法接近。例如，众所周知，几个细胞外基质蛋白的构象因位置而异。在血液系统中，糖蛋白如纤维蛋白在球状构象中循环，而在细胞外基质中，蛋白质表现为多连通的二和多位脚手架19，20。此外，微流体设备的多个分销商提供标准化通道幻灯片，预涂有不同类型的胶原蛋白（例如，下皮胶原蛋白或其他血浆衍生蛋白质）。这些通道幻灯片适用于不同流动情况下细菌粘附到特定细胞外基质蛋白的可视化和定量分析。
不同的微流体系统可以根据用于微设备生产的不同材料进行分类。在这方面，玻璃/硅基平台不同于聚合物和纸基平台21。基于聚合物的通道滑道采用弹性支撑表面 （ESS） 生成，在流动实验期间通常需要用于细胞附着的表面涂层。作为具有粘附支持成分（如胶原蛋白）的涂层的替代方案，一些市售通道滑道的表面经过物理改性，从而形成适合大多数细胞类型的亲水和粘合剂表面。此外，一些通道幻灯片是使用基质，如聚二甲基硅氧烷（PDMS），这是可吸氧的，也使血管细胞在流体泵系统微通道的内表面培养22，23.
这些研究中使用的微流体系统是一个高效可靠的系统，用于分析金黄色葡萄球菌在流动中培养出人类内皮细胞后与多种水化VWF纤维的相互作用。24，25.这种微流体系统是一个封闭的圆形灌注系统，能够分析生物安全2条件下的致病菌感染。此外，通道幻灯片适用于流中的微小监测，并提供各种预涂层（例如明胶、聚L-赖因或胶原蛋白-IV），确保细胞附着力和高度的实验可重复性。该协议使用微流体系统（见材料表）为肺炎建立一个可渗透的感染模型，从而模拟人类血管系统内的流动情况8。
此微流体系统中所述的细菌细胞附着的一般程序也可以与其他类型的泵系统一起进行，在无菌环境中生成定义和连续的流量。对于微流体目的，主要使用四种类型的流量控制系统：i） 蠕动泵和再循环泵（用于此协议），ii） 注射器泵，iii） 压力控制器，和 iv） 带流量开关矩阵的压力控制器。根据特定的微流体应用和实时进行微观可视化的能力，各种流量控制系统都有优缺点。在大多数需要连续循环样品的应用中，再循环泵与基于软件的压力控制器相结合，以确保定义的流量情况。这里演示的泵系统中也进行了优化。基于注射器的泵系统可细分为产生流动振荡的"经典"注射器泵和"无脉冲"微流体注射器泵。这些基于注射器泵的系统通常易于使用，但使用注射器泵在死路通道中的流量控制具有挑战性。此外，芯片内的流量变化可能需要一些时间，并且需要流量计来确定流速。由于注射器泵的分步电机，即使是无脉冲注射器泵也可能对流速产生周期性脉动。另外两个注射器泵装置能够产生基于"注入和退出"的流体运动，在细胞表面应用定义的剪切力，适用于微透析应用，即使采用与 PC 无关的方式。该系统必须与连接室或通道幻灯片的微管相结合，用于细胞培养，然后进行微观分析。
上述压力控制器是流动控制系统，对含有样品的储罐加压，该样品被平稳地注入微流体室或芯片上。压力控制器可以建立无脉冲流量，还可以与流量计结合提供流量。压力控制器与流量开关矩阵的组合可实现快速流量开关，无回流。这里介绍的循环系统使人类血管系统通常报告的剪切应力值的生成26。体内血管壁剪切应力是从非侵入性记录的速度曲线和动脉中大动脉全血粘度和血浆粘度26的壁剪率估计的。雷内曼和Hoeks使用专门设计的超声波系统记录大动脉的速度曲线，并使用荧光流速示踪器26的光学技术记录大动脉的速度曲线。胡萝卜动脉的平均剪切应力为 11-13 dyn/cm2，而胸动脉仅为 4-5 dyn/cm2。已监测胡萝卜动脉的峰值高达 25-70 dyn/cm2。小静脉和中脉的剪切应力值范围在0.1和0.5 dyn/cm2之间。在本文描述的微流体系统中，适用的剪切应力值取决于所选灌注管直径、通道滑动的高度以及所使用的流体介质的粘度。选定的流体设置由高度为 0.4 厘米（体积为 100 μl）的幻灯片与长度为 50 厘米、直径为 1.6 mm 的灌注组合组成，中等粘度为 0.0072 [dyn_s]/cm2。此设置适用于 3.5 到 31.2 dyn/cm2之间的剪切应力范围，流速为 3.8~33.9 mL/min。此外，压力泵软件控制可以应用脉冲介质流，可以模拟脉冲动脉血流。
这种联合微流体感染方法的成功、可靠和可重复的使用需要一些预防措施，必须牢记。在微流体条件下的感染过程中，细胞层可能暴露于细胞毒性或细胞分解细菌化合物，如肺炎溶素，这会影响真核细胞的生存能力，并削弱细胞对滑动表面的依从性。因此，在整个实验过程中都需要保持恒定的流动，并且必须经常监测细胞形态的完整性。此外，流动培养培养基应向内皮细胞提供所有必需的营养，以确保在整个感染实验中细胞表面附着紧密。然而，必须指出，介质补充剂含有可能干扰或抑制细菌和特定宿主蛋白之间的相互作用的物质。例如，在肺炎球菌-VWF相互作用的研究中，肝素必须从细胞培养基中耗尽，因为它抑制了肺炎球菌与VWF8的结合。
内皮细胞流动培养的另一个关键步骤是维持紧细胞附着力，这取决于细胞的整体活力和分化水平。只有当细胞在暴露于剪切应力之前严格保持亚顺流时，才达到原内皮细胞的抗剪切细胞粘附。另一方面，WPB的生产直接取决于内皮细胞层的汇合，促进紧细胞-细胞接触13。主内皮细胞微流体细胞培养的益处包括强诱导细胞增殖，在流动条件下迅速形成汇合细胞层。细胞彼此紧密地连接，共同定向于流动方向，并代表产生分泌WPB所需的高度分化表型。这些WPB作为储存囊泡VWF，血管化活化剂，和细胞因子，当蛋白爆发时组胺刺激或肺炎溶酶活性27，13。因此，在低增殖通道中生成高粘性、汇合细胞层的分化原发内皮细胞是有效释放 VWF 和在细胞表面和分析流速条件下的细菌-VWF相互作用。因此，必须指出，内皮细胞的分化至少需要48小时的流量培养，需要恒定的剪切流，泵压力没有任何变化。任何变化都可能导致突然的中度爆炸，从而将细胞从幻灯片中冲出。此外，在微观可视化期间，泵系统的微流体滑动和介质储液罐需要保持在37°C的温度，因为这代表了人体细胞的温度最佳。
不朽的人类细胞系适用于许多科学实验，并常用于细胞培养感染研究。这些细胞系具有一些一般技术优势，如低或中度培养要求和无限增殖，这使得传传几百次，而形态或受体特征没有显著变化。然而，这些细胞系代表一种孤独的单一培养，并受到人工二维生长条件的影响。28生理源组织环境缺失导致功能和形态细胞表型发生实质性变化，每一段培养29。在其他细菌粘附实验之前，确定了不同细胞培养通道上表面暴露细胞型特异性标记蛋白和人体原发性肺内皮细胞受体的轮廓。流式细胞学分析表明，在八轮细胞传递中，特定表面蛋白（如血小板内皮细胞粘附分子1（PECAM1）的表达明显减少。此外，在较高的细胞通道中，表达的integrin受体轮廓发生了显著变化，有利于细胞类型非特异性的一元化受体模式和减少的细胞类型特异性一元化受体模式（Bergmann等人，未发表的数据）。这些结果与感染生物学研究中的病原体-宿主相互作用的分析特别相关。为了在细菌感染时微流体细胞培养期间维持型型细胞特性和高水平的功能分化，在这种情况下，从多个捐赠者中选取了来自多个捐赠者的初级内皮细胞，并仅使用最多五个通道，以保持尽可能具体的型特征8。
在流动过程中，细菌和特定细胞表面结构的组合可视化需要优化的荧光染色方案。使用直接标记的蛋白质、荧光蛋白表达细菌和荧光结合抗体的不同组合，免疫荧光染色程序可以特别适应可视化目标。这些程序使一个定义和明确的显微可视化，也分化和量化细菌粘附和内化3，13，30，31。基于免疫荧光的内化细菌检测需要细胞渗透步骤，如短Triton X-100孵育，这可能导致细胞分离。因此，使用PFA交联样品在流动孵育后，应可视化流培养中发生的细菌内化过程。为了实时可视化流动中的细菌，使用表达荧光蛋白的转基因细菌能够快速和有针对性地进行显微检测。利用Kjos和Veening16、8设计的高效基因结构产生的RFP表达肺炎球菌菌株，用于本实验研究。为了检测流动中的VWF串，测试了不同VWF特异性荧光体标记的抗体，并可以使用。为了在最小化未特异性背景下获得最佳信号响应，每个应用的抗体都一致地对适当的抗体浓度进行定度。
对于显微活细胞成像，流体单元和通道滑块从 CO2培养箱中取出，并放置在显微镜预热至 37°C 的腔室中。此腔室无法调整为 5% CO2。如果没有碳酸盐缓冲气氛，HUVEC形态和细菌适应性保持长达180分钟不变，这足以分析VWF介导的细菌依从性。如果需要更长的感染时间和CO2培养箱外的微观监测，则应使用缓冲细胞培养基，以补偿 CO2浓度不足造成的 pH 转移。或者，整个系统可以放在CO2孵化器之间一个时间序列的微观可视化的步骤。
除了实时的荧光检测外，通道滑道内的内皮细菌感染可以通过与甲醛（PFA）作为固定物质的介质交换来停止和保存。在流中固定后，通道幻灯片内细胞表面的优化和逐步免疫荧光染色可实现宝贵的微观快照可视化，并提供多功能的组合结构检测细菌和宿主细胞之间相互作用的特定细胞化合物。该组合方法的科学好处是，PFA处理的通道滑道可以存储并用于感兴趣的结构的后流免疫荧光染色。PFA治疗使细菌失去活性，从而抑制RFP蛋白的表达。因此，在兔子体内生成了肺炎球菌特异性抗血清进行细菌免疫检测，并使用兔子特异性AlexaFluor568-结合二级抗体8进行可视化。如前所述，使用不同的抗体组合需要抗体量和阻断缓冲液成分的精确优化。否则，不特定的背景信号和交叉检测效果可能会导致人为染色结果。优化的免疫荧光染色程序可以很容易地用于检测许多不同的细胞靶点，如行为因细胞骨架或内皮标记13，31。
此过程可以适应创建更复杂的组织环境，从组织学、生理学和功能的角度模拟生理学。所提供的感染分析可以使用多个通道幻灯片到一个灌注集的线路连接，有效地同时回答几个科学问题。这种扩展设置将有助于分析不同细胞类型、细胞汇合和同一流环境中不同滑动涂层，并可直接比较不同细胞类型的细菌感染。此外，串联序列和多个通道幻灯片的组合分析也提供了时间序列实验的可能性，可用于基因表达分析（例如，分析感染时间依赖性毒性因子）基因表达）。
感染分析也可以扩展到持续数天甚至数周的恒定层流状况，以分析模拟长期慢性感染阶段的细胞反应。除了提出的单细胞类型培养外，微流体细胞培养装置中的异质细胞培养的一些例子已经报道到32，33。这允许高通量药理学研究，并可能最终导致使用微流体细胞培养系统再生的目的，以及34。
总之，微流体系统与免疫染色程序相结合，在模拟血管系统内状况的环境中，为分析细菌和宿主细胞之间的病理机制提供了宝贵的模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由DFG（BE 4570/4-1）向S.B.提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
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