Summary
Este estudo descreve o monitoramento microscópico da adesão pneumococcus às cordas do fator von Willebrand produzidas na superfície de células endotélias primárias humanas diferenciadas estresse de cisalhamento em condições de fluxo definidas. Este protocolo pode ser estendido à visualização detalhada de estruturas celulares específicas e quantificação de bactérias aplicando procedimentos diferenciais de imunocoloração.
Abstract
A interação de Streptococcus pneumoniae com a superfície das células endotélias é mediada no fluxo sanguíneo através de proteínas mecanosensíveis, como o Fator Von Willebrand (VWF). Esta glicoproteína muda sua conformação molecular em resposta ao estresse de cisalhamento, expondo assim locais de ligação para um amplo espectro de interações hospedeiro-ligand. Em geral, o cultivo de células endotélias primárias um fluxo de cisalhamento definido é conhecido por promover a diferenciação celular específica e a formação de uma camada endotelial estável e rigidamente ligada que se assemelha à fisiologia do revestimento interno de um vaso sanguíneo . Assim, a análise funcional das interações entre patógenos bacterianos e a vasculatura hospedeira envolvendo proteínas mecanosensíveis requer o estabelecimento de sistemas de bomba que possam simular as forças fisiológicas de fluxo conhecidas por afetar a superfície de células vasculares.
O dispositivo microfluídico usado neste estudo permite uma recirculação contínua e sem pulso de fluidos com uma taxa de fluxo definida. O sistema controlado por computador bomba de pressão do ar aplica um estresse tesoura definida em superfícies de células endoteliis, gerando um fluxo contínuo, unidirecional e controlado médio. As mudanças morfológicas das células e o acessório bacteriano podem ser monitoradas microscópicas e quantificadas no fluxo usando slides especiais de canal projetados para visualização microscópica. Em contraste com a infecção da cultura celular estática, que em geral requer uma fixação da amostra antes da rotulagem imunológica e análises microscópicas, as lâminas microfluídicas permitem a detecção baseada em fluorescência de proteínas, bactérias e componentes celulares após a fixação da amostra; coloração de imunofluorescência em série; e detecção direta baseada em fluorescência em tempo real. Em combinação com bactérias fluorescentes e anticorpos específicos rotulados por fluorescência, este procedimento de infecção fornece um sistema de visualização de componentes múltiplos eficiente para um enorme espectro de aplicações científicas relacionadas a processos vasculares.
Introduction
A patogênese das infecções pneumocócicas é caracterizada por uma interação multifacetada com uma diversidade de compostos de matriz extracelular e componentes da hemostase humana, como plasminogênio e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. O multidomínio glicoproteína VWF serve como regulador-chave de uma hemostasis equilibrada, mediando recrutamento trombocito e incorporação de fibrina no local da formação de trombosvascular9. A importância do VWF funcional e ativo para o controle hemorrágico e cicatrização de feridas é demonstrada pela doença de von Willebrand, um distúrbio hemorrágico herdado comum10.
Globular VWF circula no sistema sanguíneo humano a uma concentração de até 14,0 μg/mL11,10. Em resposta a lesão vascular, a liberação local do VWF por endotelial Weibel Palade Bodies (WBP) é marcadamente aumentada11,12. Estudos anteriores mostram que a adesão pneumoccus às células endotélias humanas e sua produção da pneumolysin a toxina formadora porosa estimula significativamente a secreção luminal da VWF13. As forças hidrodinâmicas do fluxo sanguíneo induzem uma abertura estrutural dos domínios mechanoresponsive vwf. A taxas de fluxo de 10 dyn/cm2, o VWF multimeriza para longas cadeias proteicas de até várias centenas de micrômetros de comprimento que permanecem ligados ao subendotelio10,12.
Para compreender a função das cordas multimerizadas de VWF geradas o esforço da tesoura na interação do pneumococcus com a superfície endotelial, uma aproximação microfluidic-baseada da infecção da cultura da pilha foi estabelecida. Um dispositivo microfluídico com um sistema de bomba de pressão de ar controlado por software foi usado. Isto permitiu uma recirculação contínua, unidirecional do meio da cultura da pilha com uma taxa de fluxo definida. Assim, o sistema aplicou um esforço definido da tesoura na superfície das pilhas endothelial, que remanesceram unidas dentro das corrediças especializadas da canaleta. Essa abordagem possibilitou a simulação da força de cisalhamento dentro da corrente sanguínea do sistema vascular humano, na qual as cordas da VWF são geradas em células endotélias diferenciadas condições de fluxo constantedefinidas. Para isso, as células endotélias foram cultivadas em toboáguas específicos (ver Tabela de Materiais),que foram adaptados para análises microscópicas durante o fluxo. O sistema microfluídico da bomba forneceu a situação altamente definida e controlada do esforço da tesoura exigida para a formação de cordas prolongadas de VWF na camada endotelial confluent da pilha. Após a estimulação da secreção VWF-seção de células endotélias da veia umbilical humana cultivada sifluente (HUVEC) por suplementação de histamina, a formação de cordas foi induzida pela aplicação de um estresse de cisalhamento () de 10 dyn/cm2. O estresse da cisalhamento é definido como a força agindo na camada celular. É calculado aproximadamente de acordo com Cornish et. al.14 com equação 1:
Onde = estresse de cisalhamento em dyn/cm2, η = viscosidade em (dyn' s)/cm2, h =metade da altura do canal, w = metade da largura do canal, e Φ = flowrate em mL/min.
O resultado da equação 1 depende das diferentes alturas e larguras dos diferentes slides usados (ver Tabela de Materiais). Neste estudo foi utilizado um slide de canal Luer de 0,4 μm, resultando em um fator de deslizamento de câmara de 131,6 (ver fórmula 2).
Viscosidade do meio em 37 °C é 0.0072 dyn' s/cm² e um esforço da tesoura de 10 dyn/cm² foi usado. Isso resultou em uma taxa de fluxo de 10,5 mL/min (ver fórmula 3).
Aqui, a adaptação e o avanço de um procedimento microfluídico do culturing da pilha usando um sistema de fluxo laminar unidirecional para a investigação e a visualização de mecanismos bacterianos da infecção na vasculatura do anfitrião são descritos em detalhe. A geração de cordas VWF em camadas endotelias também pode ser estimulada usando outros sistemas de bomba que são capazes de aplicar um estresse de cisalhamento contínuo e constante15.
Após o cultivo de células endotélias primárias à confluência no fluxo e estimulação da formação de cordas VWF, pneumococci expressando proteína fluorescência vermelha (RFP)16 foram adicionados à camada de células endotelial controle microscópico constante. O apego de bactérias às cordas VWF na superfície das células endotélias foi microscópico visualizado e monitorado por até três horas em tempo real usando anticorpos específicos da VWF com rótulo fluorescente. Com essa abordagem, o papel da VWF como cofator de adesão promovendo o apego bacteriano ao endotelio vascular foi determinado8.
Além da visualização microscópica da secreção de proteínas e alterações conformais, este método poderia ser usado para monitorar etapas únicas dos processos de infecção bacteriana em tempo real e quantificar a quantidade de bactérias associadas em diferentes pontos de Infecção. O sistema de bomba controlado por software específico também fornece a possibilidade de cultura das células endotélias em condições de fluxo constante definido por até vários dias e permite uma incubação de fluxo médio pulsado definido. Além disso, este método pode ser aplicado usando diferentes tipos de células. A adaptação do protocolo de coloração também permite a detecção e visualização de bactérias internalizadas em células eucarióticas.
Este manuscrito descreve este protocolo experimental avançado que pode ser usado como uma abordagem definida, confiável e reproduzível para uma caracterização eficiente e versátil de processos fisiopatológicos.
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Protocol
O cultivo microfluídico de células foi realizado com células endotélias humanas primárias comerciais (HUVEC). A empresa isolou as células com o consentimento informado do doador. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Câmara de Médicos do Estado Federal Baden-Wuerttemberg com o número de referência 219-04.
Nota: Veja a Tabela de Materiais para suprimentos de protocolo.
1. Pré-cultivo de células endotélias primárias
- Descongele um frasco congelado de glicerol contendo 1 x 105 HUVEC primário de três doadores diferentes suavemente a 37 °C e semeie as células em 7 mL de meio de crescimento de células endoteliis pré-aquecido (ECGM, pronto para uso com suplementos) em um frasco de25 cm 2 células.
Nota: As células endotélias primárias perdem capacidade de diferenciação após mais de 5 ciclos de proliferação. Portanto, apenas células com menos de 5 passagens podem ser usadas se altos teores de diferenciação celular forem necessários. - Cultivar as células a 37 °C em 5% de CO2 atmosfera por 60 min para permitir a fixação da superfície e trocar o meio de cultura celular ECGM para se livrar dos resíduos de crioconservação.
- Continue a cultivar as células a 37 °C em 5% de CO2 até formarem uma camada de células subconfluentestidas.
Nota: O HUVEC não deve crescer a uma camada do confluent desde que os contatos apertados da pilha-pilha impedem a formação de uma camada de pilha estável mais tarde no fluxo.
2. Pré-cultivo de Streptococcus pneumoniae
CUIDADO: Streptococcus pneumoniae é um agente de nível 2 de biossegurança e só é permitido ser cultivado em laboratórios de biossegurança nível 2. Use um banco limpo classificado para o nível de segurança 2 para todos os tratamentos bacterianos, evite estritamente a formação do aerossol, e use uma centrífuga com proteção do aerossol para sedimentação das bactérias.
- Inocular uma placa de ágar de sangue Columbia com Streptococcus pneumoniae clínica isolar ATCC11733 derivado de um estoque de glicerol constantemente armazenados a -80 °C e cultivar a placa de ágar durante a noite em 37 °C e 5% CO2.
- Prepare 40 mL de caldo líquido Todd Hewitt complementado com extrato de levedura de 1% (THY) e 15 mL de soline estéril tampão de fosfato (PBS) pH 7.4, para o cultivo bacteriano e passos de lavagem.
- Use um tubo estéril para o cultivo bacteriano e inocular o caldo de cultura líquida com massa bacteriana. Controle a quantidade de inoculação por medição fotométrica de 1 mL alíquotas a 600 nm contra caldo líquido não inoculado como referência. Preencha a massa bacteriana no caldo líquido até atingir uma densidade óptica de 600 nm (OD600)de 0,15.
- Incubar o caldo líquido inoculado sem tremer a 37 °C e 5% CO2 e determinar o OD600 a cada 30 min medindo 1 mL aliquots usando cuvettes de plástico.
- Assim que a cultura bacteriana atingiu um OD600 de 0,4, o que corresponde à fase de crescimento exponencial, centrífuga a suspensão da cultura bacteriana por 10 min a 1.000 x g à temperatura ambiente (RT).
Nota: Não permita que uma cultura pneumococo atinja um OD600 de mais de 1,0, porque uma alta densidade de cultura pneumocórcana é conhecida por desencadear a auto-falese bacteriana, o que pode afetar a aptidão bacteriana geral. - Resuspende o sedimento bacteriano suavemente com 10 mL PBS e sedimentos novamente por 10 min a 1.000 x g em RT.
- Resuspende o sedimento bacteriano lavado delicadamente em 1 mL PBS e determine o OD600 de 10 μL da suspensão bacteriana usando 1 mL de PBS como uma referência.
- Ajuste a quantidade de bactérias em PBS a um OD600 de 2.0. De acordo com a contagem bacteriana anteriormente determinada, um OD600 de 2.0 corresponde a 2 x 109 unidades de formação da colônia (CFU). Proceder imediatamente com o procedimento de infecção para evitar a auto-hídsite bacteriana.
3. Cultivo de células endotéliticas de HUVEC condições microfluídicas
- Desaque as células endotélias primárias do frasco de cultura celular por proteólise controlada. Executar os seguintes passos em um ambiente estéril usando um banco limpo. Prepare um volume de 15 mL de PBS estéril para as etapas de lavagem.
- Retire o ECGM de uma camada HUVEC cultivada em subconfluently e lave a camada celular com 10 mL PBS usando uma pipeta sorológica para se livrar do meio de cultura celular.
- Incubar o HUVEC lavado com 3 mL de 37 °C solução de dissociação de células pré-aquecidas para desprendimento celular para 5 min a 37 °C. Observe o desprendimento das células proteolíticas por monitoramento microscópico a cada minuto.
- Pipeta a suspensão celular destacada em um tubo contendo 7 mL de ECGM complementado com 2% de soro de bezerro fetal (FCS) para parar a proteólea e sedimentar as células por 3 min a 220 x g em RT.
- Retire o supernatant e resuspender o HUVEC em 250 μL de ECGM complementado com 5% FCS e 1 mM MgSO4. Use 10 μL da suspensão celular para contagem celular usando uma câmara de contagem de células Neubauer e ajuste a contagem celular para 4 x 106 células/mL ECGM complementada com 5% FCS e 1 mM MgSO4.
Nota: Para cada experimento de fluxo 30 mL de ecgm médio complementado com 5% FCS e com 1 mM MgSO4 será necessário. A partir daqui, esta composição média é chamada ECGMS-medium. O aumento da concentração de Fcs no meio da cultura de 2% para 5% suporta o acessório celular e a viabilidade celular do HUVEC semeado no slide do canal. O meio suplementos FCS e MgSO4 estabilizar substancialmente o acessório celular do HUVEC condições de estresse de cisalhamento.
- Semente e cultive o HUVEC em um slide de canal. Trabalhe em um ambiente estéril usando um banco limpo. As células serão cultivadas estresse de cisalhamento por 2 dias seguidos de infecção por bactérias e monitoramento microscópico por mais 2 h.
- Equilibre um slide de canal, um conjunto de perfusão de 1,6 mm de diâmetro e 50 cm de comprimento, um adianto do ECGMS-médio e um canal Luer deslizam 0,4 μm de altura, por 24 h em uma incubadora com 5% de CO2 atmosfera a 37 °C para reduzir o número de bolhas de ar.
Nota: Este procedimento é recomendado para degas o equipamento plástico e para preaquecer o meio, os tubos de perfusão, e os reservatórios. Se materiais ou líquidos tiverem sido armazenados na RT ou na geladeira, gases dissolvidos no plástico e líquidos serão liberados quando aquecidos na incubadora durante o experimento. Bolhas de gás aparecerão. Degassing todos os componentes plásticos antes do experimento irá eliminar este efeito. Cada vez que o sistema é retirado da incubadora, o processo de absorção de gás começa novamente. Portanto, trabalhar rapidamente na RT e nunca deixar a unidade fluida fora da incubadora por períodos de tempo mais longos. - Use uma pipeta para injetar 100 μL de uma solução de gelatina suína filtrada porerena de 2% estéril na solução PBS em um dos reservatórios de um slide de canal com equilíbrio de temperatura. Incubar a solução de gelatina para 1 h a 37 °C e enxaguar o canal do slide com 1 mL PBS em condições estéreis usando uma seringa 1 mL Luer.
- Coloque o canal revestido de gelatina deslizar sobre uma fina placa de poliestireno ou isopor para evitar uma queda na temperatura do slide. Adicione 100 μL da suspensão 4 x 106/mL HUVEC com uma seringa Luer de 1 mL no slide.
Nota: Colocar o slide do canal na superfície do metal frio do banco limpo pode diminuir a temperatura do fundo da lâmina, gerando assim o estresse frio para as células endotélias. Durante a tubulação celular segurar o slide um pouco para cima para deixar as bolhas de ar subir e desaparecer de dentro do slide. - Incubar o slide do canal com o HUVEC por 60 min a 37 °C e 5% CO2 e encher os reservatórios médios em ambas as extremidades do slide do canal com 60 μL ECGMS-médio cada. Incubar por 1 h a 37 °C e 5% CO2.
- Equilibre um slide de canal, um conjunto de perfusão de 1,6 mm de diâmetro e 50 cm de comprimento, um adianto do ECGMS-médio e um canal Luer deslizam 0,4 μm de altura, por 24 h em uma incubadora com 5% de CO2 atmosfera a 37 °C para reduzir o número de bolhas de ar.
- Ajuste a bomba microfluídica e as configurações do software.
- Conecte o conjunto de perfusão equilibrado à unidade de bomba, preencha com 13,6 mL de ECGMS-médio e inicie o software de controle da bomba. Selecione o conjunto de perfusão adequado e o tipo de deslizamento de câmara usando o rolagem para baixo das janelas no menu da unidade fluida configurada. Escolha 0.007 (dyn- s/cm2)no software para a viscosidade média. (Consulte as configurações de software da bomba de pressão marcadas com setas vermelhas na Figura Suplementar 1).
- Fora da incubadora, conecte uma garrafa de vidro cheia de contas de sílica de secagem à tubulação de pressão do ar (consulte a Figura 1, Inset 3). O ar da bomba de pressão circula entre os reservatórios de perfusão e a bomba e deve estar seco antes de reentrar no dispositivo da bomba. Selecione parâmetros de fluxo no menu de software, definir a pressão para 40 mbar, e lavar os tubos de bomba com o meio líquido, iniciando o fluxo médio contínuo. (Essas configurações também são indicadas por setas vermelhas na Figura Suplementar 1).
- Programe os ciclos desejados do esforço da tesoura do cultivo do fluxo. Comece com 5 dyn/cm2,controle o pumpinng equilibrado do reservatório e assegure-se de que nenhuma bolha de ar está circulando no sistema da bomba.
Nota: O estresse da cisalhamento da parede em um slide de canal depende da taxa de fluxo e da viscosidade do meio de perfusão. Se usar outro sistema de bomba, consulte as equações descritas na introdução para definir uma taxa de fluxo que gera o nível de estresse desejado cisalhamento. As configurações descritas correspondem a uma taxa de fluxo de 5,42 mL/min. (Uma captura de tela exemplar mostrando as configurações adequadas do parâmetro de fluxo no software da bomba de pressão é mostrada na Figura Suplementar 2). - Pare a circulação de fluxo no software de controle da bomba e mantenha o fluxo médio na tubulação de perfusão apertando os tubos perto das conexões Luer. Conecte o slide do canal, evitando assim bolhas de ar, e coloque a unidade fluida com o slide do canal conectado em uma incubadora de CO2 a 37 °C e 5% DECO 2. Comece o estresse de cisalhamento em 5 dyn/cm2 por 30 min para adaptar suavemente as células às forças geradas pelo estresse da cisalhamento antes de acelerar o nível de estresse da cisalhamento (ver Figura Suplementar 3).
Nota: Tome cuidado para que nenhuma bolha de ar permaneça no sistema de tubo ou no slide após a conexão com o sistema de tubo, porque o movimento das bolhas de ar no fluxo pode levar ao desprendimento celular. - Acelere o estresse da cisalhamento para 10 dyn/cm2 (que correspondem a 10,86 mL/min nessa configuração de fluxo) e incubar o slide do canal em estresse contínuo de cisalhamento por 48 h em uma pequena incubadora de CO2 a 37 °C e 5% de CO2 para permitir a diferenciação celular ( os respectivos settinngs software são indicados com setas vermelhas na Figura Suplementar 4).
Nota: As células HUVEC tendem a se separar da superfície do canal se o cultivo de fluxo for iniciado diretamente em 10 dyn/cm2. As células permanecem ligadas à superfície da câmara se o cultivo de fluxo for iniciado com menos estresse cisalhamento usando 5 dyn/cm2 por um mínimo de 30 min seguido supérfluo lentamente até o desejado 10 dyn/cm2. Um estresse de cisalhamento de 10 dyn/cm2 é o valor mínimo nesta configuração de perfusão necessária para a formação de cordas VWF. - Após 24 h de cultivo de células microfluídicas, pare o fluxo médio com o software de controle da bomba exatamente quando um nível médio equilibrado é alcançado em ambos os reservatórios médios. Coloque a unidade fluida em um banco limpo e retire 10 mL do meio de cultivo circulado dos reservatórios de perfusão usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 10 mL de ECGMS-médio para os reservatórios para renovar o meio, coloque a unidade fluida de volta para a incubadora de CO2 em 37 °C e 5% CO2, e reiniciar o cultivo fluido usando o software de controle da bomba.
Nota: A função da bomba de pressão pode de repente ser interrompida por máquinas de laboratório, como grandes centrífugas, o que pode criar uma forte perturbação do campo magnético. Esta súbita perturbação pode levar ao desprendimento celular. Tome cuidado para que essas máquinas não estão ativos perto da bomba de pressão durante o experimento. - Comece o pré-aquecimento da câmara de incubação de temperatura que cobre o estágio do microscópio de fluorescência a 37 °C para o equilíbrio de temperatura 24 h antes da visualização microscópica. Depois que o microscópio é pré-aquecido, iniciar o controle de software microscópio e ajustar as configurações principais para o monitoramento microscópico fluorescência, selecionando as configurações de filtro apropriado (540 nm/590 nm para detecção das bactérias que expressam RFP e 470 nm/515 nm para detecção de emissão de fluoresceina dos anticorpos específicos da VWF conjugados fitc). Prewarm uma câmara de aquecimento adicional para a incubação da unidade fluidic em 37 °C.
Nota: Durante as análises de infecção e monitoramento microscópico a temperatura do slide do canal e do meio circulante não deve diminuir substancialmente, porque isso geraria estresse frio nas células. Em geral, o tamanho das câmaras de temperatura que cobrem o estágio do microscópio não é suficiente para cobrir toda a unidade fluida. Portanto, recomenda-se o uso de uma câmara de aquecimento adicional pré-aquecida a 37 °C. - Para visualização microscópica, coloque a unidade fluida na câmara de aquecimento pré-aquecida de 37 °C e coloque o slide do canal em um palco do microscópio pré-aquecido de 37 °C.
Nota: Para visualização microscópica, a unidade fluida e o slide do canal precisavam ser removidos da incubadora de CO2 devido ao comprimento limitado da tubulação de perfusão. Se os tempos de infecção e o monitoramento microscópico de mais de 180 min forem necessários fora da atmosfera de 5% de CO2 para tampão de pH, um meio amortecimento de pH deve ser usado para cultivo microfluídico. - Controle a morfologia celular e a integridade da camada HUVEC antes da injeção de histamina e bactérias para a circulação de fluxo ao longo do tempo do experimento de fluxo e depois de terminar o experimento de fluxo usando o modo de campo brilhante do microscópio.
4. Indução de lançamento e visualização de VWF de cordas vwf multimerizadas
- Manter a configuração de fluxo, porque um estresse de cisalhamento de 10 dyn/cm2 é necessário para desencadear a multimerização do VWF para longas cadeias de até 200 MDa. Induza a liberação de VWF do WPB endotelial injetando 136 μL de uma solução do estoque da histamina de 100 mM no ECGMS-médio que circula na tubulação da perfusão usando uma porta da injeção. A concentração final de histamina no meio de fluxo será de 1 mM. Se nenhuma porta de injeção estiver disponível, a histamina pode ser adicionada alternativamente por tubulação no meio dos reservatórios da bomba.
- Para a detecção de imunofluorescência de cadeias vwf multimerizadas, parar o fluxo quando um nível médio equilibrado nos reservatórios é atingido, e injetar 20 μg de um vwf específico fitc-conjugado anticorpo em um volume de 200 μL PBS (pH 7,4) para a circulação de 13,6 mL de ECGMS-médio usando uma porta de injeção. Se nenhuma porta de injeção estiver disponível, o anticorpo pode ser adicionado alternativamente por tubulação no meio dos reservatórios da bomba. Isso resulta em uma concentração final de anticorpos de 1,3 μg/mL.
- Para a varredura microscópica de diversos campos de vista em um curto espaço de tempo, use a unidade da fluorescência do microscópio com um dispositivo da fluorescência de Xenon no poder de 30% e em uma câmera da epifluorescência. Monitore a forma e a morfologia da camada HUVEC com o modo de campo brilhante para selecionar células representativas adequadas para a visualização de cordas VWF.
- Para visualização de cordas VWF fluorescentes verdes, selecione um objetivo de óleo 63x/1.40 e um filtro de detecção de 470 nm no menu da unidade de fluorescência do software de microscópio (LasX). Crie instantâneos de z-pilhas de pelo menos 50 vistas representativas do campo, cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intactos. Para quantificação das cordas verdes fluorescentes vwf em diferentes pontos de tempo, digitalizar vários campos de visão.
5. Avaliação microscópica do acessório bacteriano às VWF-cordas no fluxo no tempo real
-
Quantificar o acessório pneumocócico às vwf-cordas geradas em superfícies celulares HUVEC através da detecção de imunofluorescência.
- Segure o fluxo e injete 1,35 x 108 CFU/mL RFP-expressando pneumocci em um volume máximo de 1 mL no ECGMS-médio usando a porta de injeção. Alternativamente, pipeta as bactérias no meio no reservatório da bomba. Reiniciar o estresse cisalhamento em 10 dyn /cm2 para deixar as bactérias circulam dentro do sistema de bomba.
- Selecione um objetivo de imersão de óleo de 63x para ampliação do microscópio e ajuste as configurações de filtro de fluorescência no software de microscópio para o canal RFP (filtro de detecção de 540 nm) para detecção de pneumococci expressorde RFP.
- Para quantificação de apego bacteriano às cordas VWF, pare o fluxo e crie instantâneos de z-pilhas de pelo menos 30 vistas representativas do campo, cada uma contendo aproximadamente 10 HUVEC morfologicamente intacto, e conte a quantidade de pneumococci.
- Use o algoritmo de estatísticas de um fatorial ANOVA para avaliar os dados, seguido por um teste de amostra não emparelhado pós-hoc de duas caudas para comparação estatística detalhada. Os valores p de <0.05 foram considerados estatisticamente significativos.
6. Avaliação microscópica do acessório bacteriano às VWF-cordas após a fixação da amostra
- Experimente a fixação antes da coloração de imunofluorescência.
- Pare o fluxo, retire 10 mL de ECGMS-médio dos reservatórios da bomba, e adicione 10 mL de PBS complementado com 5% de paraformaldeído (PFA). Deixe a solução PFA circular por 10 min em um estresse de cisalhamento de 10 dyn/cm2.
- Desligue o slide do canal da unidade da bomba.
- Bloqueie locais de ligação inespecíficos na superfície celular e realize imunodetecção de cordas VWF e bactérias anexadas.
- Prepare 4 mL de uma solução de lavagem contendo 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) complementada com 4% de sacarose para todas as etapas de lavagem. Prepare 1 mL de uma solução de bloqueio contendo 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) complementada com sacarose de 4% e 2% de albumina de soro bovina (BSA) para bloqueio de sites de ligação inespecíficos.
- Lave o canal pfa-incubado slide 3x usando uma seringa 1 mL Luer para injetar 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide para 120 min em RT com 200 μL solução de bloqueio.
- Prepare 4 mL de outra solução de bloqueio contendo 100 mM Na2CO3, (pH 9,2) complementada com sacarose de 4% e 0,5% BSA para a diluição dos anticorpos. Use 200 μL desta solução de bloqueio para diluir o anti-sero de coelho específico do pneumoctilo 1:100. Use 200 μL desta solução de bloqueio para diluir o anticorpo de camundongo específico da VWF 1:50 para fazer uma concentração de anticorpos específica da VWF de 4 μg/mL. Diluir o anticorpo secundário alexafluor488-conjugado a partir de uma solução de estoque de 2 mg/mL 1:100 em 200 μL de PBS (pH 7.4) para gerar uma concentração final de 20 μg/mL.
Nota: Nas configurações de imunofluorescência descritas, a detecção de anticorpos apresentou resultados ideais quando os anticorpos foram diluídos no tampão de carbonato alcalino acima mencionado. Com base em resultados anteriores, as soluções de bloqueio recomendadas e a quantidade de anticorpos são adequadas para muitas aplicações. No entanto, diferentes experimentos podem exigir otimização individual da combinação de anticorpos, concentração de anticorpos, tempo de incubação e constituição do buffer de bloqueio. Como alternativa, um sistema tampão de fosfato com uma faixa neutra de pH pode ser adequado ou até mesmo preferido como um amortecedor de incubação. Em caso de sinais fracos de fluorescência, a concentração de anticorpos secundários deve ser aumentada. Se for detectado demasiado ruído de fundo de fluorescência inespecífico, a quantidade de substâncias de bloqueio deve ser aumentada. - Para a coloração vwf-imunofluorescência, lave o slide do canal usando uma seringa 1 mL Luer injetando 200 μL da solução de lavagem 3x e incubar o slide com o 1:50 diluído VWF-anticorpo específico para 30 min em RT. Depois, lavar o slide do canal novamente 3x com 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide com o 1:100 diluído AlexaFluor488-conjugado mouse-specific anticorpo para 30 min em RT. Finalmente, lave o slide do canal novamente 3x com 200 μL da solução de lavagem.
Nota: Os húrforos AlexaFluor são sensíveis ao branqueamento. Portanto, o slide deve ser protegido, mantendo-o em uma câmara escura durante os passos de incubação com os anticorpos conjugados de fluorofoforre. - Para a imunodetecção do pneumococci, incubar o slide com um 1:100 diluído pneumococo específico anticorpo coelho para 30 min em RT. Depois, lave o slide do canal 3x com 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide com 1:100 diluído AlexaFluor568-conjugado coelho específico anticorpo para 30 min em RT. Lave o slide do canal novamente 3x com 200 μL da solução de lavagem.
- Para manchar o citoesqueleto de actina celular com faloide fluorescente, permeabilize o HUVEC por incubação com 120 μL de 0,1% Triton X-100 por 5 min na RT. Lave o canal slide 3x com 200 μL da solução de lavagem e incubar o slide com 120 μL de 1:1.000 diluído AlexaFluor350-conjugado faloide. Esta etapa de incubação visualizará o citoesqueleto polimerado de actina e permitirá o monitoramento da forma celular e possíveis alterações morfológicas induzidas pelo estresse.
- Lave o canal slide 3x com 200 μL da solução de lavagem. Finalmente, lave o slide 4x com 200 μL ddH2O e visualize as cordas verdes fluorescentes vwf, as bactérias fluorescentes vermelhas e o citoesqueleto fluorescente azul de actina usando as configurações de filtro apropriadas no microscópio de fluorescência.
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Representative Results
Culturing HUVEC primário em um fluxo unidirecional constante resulta na formação de um confluente e camada de células bem embaladoque promove a geração de WPBs celulares preenchidos com o mecanosensível VWF13,14. Este protocolo descreve o uso de uma bomba de pressão de ar baseada, sistema de recirculação sem pulso para análise de infecção que requer imitar a situação de estresse cisalhamento no fluxo sanguíneo humano.
Este sistema permite uma configuração definida e controlada por software das condições de fluxo. O esquema de fluxo na Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho principal, começando com o pré-cultivo das células endotélias primárias (Figura 1,Inserção 1) e o pré-cultivo de pneumococci (Figura 1,Inset 2). O sistema microfluídico aplicado (Figura 1,Inset 3) é composto por um slide de canal especial que é conectado através de um adaptador Luer à tubulação de perfusão com dois reservatórios médios. O conjunto de tubos de perfusão é colocado em uma unidade fluida que serve como suporte e emprega os tubos de perfusão como um sistema de válvula. Para o cultivo de fluxo, a unidade fluida com o conjunto de perfusão de médio enchida e o slide do canal conectado são colocados em uma incubadora de CO2 (Figura 1,Inset 3). A unidade fluidic é conectada a uma bomba de pressão de ar através da tubulação de ar. O ar na tubulação deve passar por uma garrafa de secagem contendo contas de sílica para a remoção de umidade dos reservatórios de perfusão antes que o ar seja rebombeado para o sistema de bomba (Figura 1, Inset 3). A bomba de pressão do ar é controlada por software de computador (PumpControl v1.5.0) que permite a configuração de uma taxa de fluxo contínua e definida, dependendo do diâmetro do slide do canal, o comprimento e o diâmetro do conjunto de tubos de perfusão e a viscosidade do médio utilizado (Figura 1,Inset 3). A secreção do VWF pela exocitose WPB do HUVEC cultivado simicamente é induzida pela estimulação de histamina8 aplicada na circulação média na tubulação de perfusão usando uma porta de injeção (Figura 1, Inset 4). Em um estresse mínimo de cisalhamento de 10 dyn/cm2,as proteínas VWF liberadas multimernizam e formam longas cadeias de proteínas atingindo comprimentos de mais de 100 μm (Figura 1, Inset 4,5,6 e Figura 2A). Estas cadeias proteicas são microscópicamente detectadas e visualizadas após a injeção de anticorpos específicos vwf conjugados de fluoresceina (FITC) no meio. Os anticorpos circulantes permitem a detecção de imunofluorescência das cordas VWF ligadas à superfície celular em tempo real (Figura 1,Inset 5)8.
A abordagem estabelecida de infecção por culturas celulares microfluídicas usando células endotélias primárias imita a situação de uma vasculatura inflamada localmente após a infiltração da circulação sanguínea por pathobiontes bacterianos, como Streptococcus pneumoniae. Exemplos da visualização e análise quantitativa da interação bacteriana com células vasculares diferenciadas estresse de cisalhamento usando o cultivo microfluídico de células endotélias são mostrados (Figura 1,Inserções 5,6). Pneumococci-expressor de RFP foram injetados no fluxo e após 30 min da circulação, os primeiros sinais do acessório bacteriano às cordas de VWF de HUVEC histamine-estimulado foram detectados microscopicamente (Figura 1,Insets 5,6 e Figura 2A, B setas brancas)8. Assim, o uso de pneumocci-expresso rfp permitiu a quantificação do apego bacteriano às cordas VWF nas células endoteliis sem a exigência de detecção de anticorpos bacterianos.
Parcelas de sobreposição de histogramas das intensidades de fluorescência foram geradas usando o software de avaliação fornecido pela Leica (ou seja, LasX) para visualizar a colocalização de pneumocci expressorde RFP com as cordas VWF detectadas com anticorpos fluorescentes verdes. Isso possibilitou uma análise quantitativa da probabilidade de colocalização em regiões específicas de interesse (ROI) dentro da imagem de fluorescência. Usando sobremissões de histograma de sinais bacterianos em combinação com os sinais de fluorescência do VWF, picos de fluorescência sobrepostos para ambos poderiam ser visualizados e, assim, confirmou o apego pneumococo às cordas VWF. O acessório bacteriano resiste ao estresse de cisalhamento continuamente aplicado por um mínimo de 25 min (Figura 2B)8.
Em suma, o cultivo contínuo de fluxo de HUVEC primário permitiu a secreção vwf e a geração de longas cadeias de proteína VWF que servem como locais de adesão para circulando bactérias8.
Figura 1: Fluxo de trabalho para análises de apego bacteriano às cordas vwf usando o cultivo microfluídico de células endotélias. Fluxo de trabalho dos principais passos experimentais começando com o pré-cultivo de células endotélias primárias à subconfluência em frascos de cultura celular. Antes do cultivo celular no fluxo, as células são semeadas em um slide de canal revestido de gelatina(Inset 1). As bactérias são cultivadas em placas de ágar, seguidas pelo cultivo em uma fase líquida complexa de médio a meio de log(Inset 2). Para a cultura microfluídica de células, um slide de canal com células endotélias está conectado aos tubos de perfusão de uma unidade fluida do sistema de bomba e submetido a fluxo constante para diferenciação celular (Inset 3). A geração das cordas VWF (seta verde) foi induzida pela injeção de histamina em um estresse de cisalhamento de 10 dinamicamente/cm2 e microscópica monitorada pela detecção de imunofluorescência usando anticorpos específicos VWF(Inset 4). Após a injeção de bactérias que expressam RFP para o meio circulante, o acessório pneumococo (seta vermelha) às cordas VWF foi microscópicamente visualizado em tempo real por emissão de fluorescência a 450 nm (Inset 5). Após a fixação das células usando PFA, a coloração diferencial de imunofluorescência fornece a visualização do acessório bacteriano em pontos de tempo específicos de infecção(Inset 6). As imagens do sistema de bomba e da camada celular HUVEC descritas nos passos 1, 3 e a imagem da porta de injeção(Inset 4)estão incluídas. As imagens de imunofluorescência mostradas nas Inções 4 e 5 foram modificadas e usadas com permissão de Jagau et al.8. Os comprimentos das barras de escala são indicados no direito inferior.
Figura 2: Imagens representativas de imunofluorescência de pneumococo sonoro que liga maçomococcus às cordas vwf geradas em fluxo contínuo na superfície do HUVEC estimulado por histamina. (A) A geração das cordas VWF foi microscópicamente quantificada depois de expor huvec cultivado saquigraficamente ao estresse de cisalhamento usando um sistema de bomba microfluídica em 10 dyn/cm2. Os anticorpos específicos da VWF conjugados fitc detectaram as cordas vwf. As setas brancas apontam para pneumococci expressando rfp com fluorescência vermelha ligada a longas cordas VWF. (B) O apego bacteriano às cordas verdes fluorescentes da VWF foi observado microscópico por até 2 h em fluxo constante (setas brancas) e foi confirmado por avaliação baseada em software de intensidades de fluorescência de um ROI definido. Imagens em tempo real foram tiradas com o equipamento de fluorescência de um microscópio de varredura a laser confocal (SP8, Leica). Barras de escala = 10 μm. Esta figura foi modificada e usada com permissão de Jagau et al.8.
Figura suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura suplementar 2. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura suplementar 3. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
A simulação da interação bacteriana com proteínas hospedeiras mecanosensíveis, como a VWF, requer um sistema de cultura celular perfusível que permita a geração de um fluxo definido, unidirecional e contínuo de líquidos, gerando assim um estresse de cisalhamento confiável . Vários sistemas de bombas microfluídicas já foram descritos. Uma revisão abrangente de Bergmann et al. resume os aspectos-chave dos diferentes modelos de cultura celular bie tridimensional17.
A tecnologia microfluídica é uma técnica muito jovem iniciada no início da década de 1990 com o desenvolvimento de microambientes controláveis, reprodutíveis e perfusíveis em um micrômetro e até mesmo em uma escala de nanômetro18. A abordagem microfluídica apresentada também pode ser aplicada para estudar a ampla gama de mecanismos de adesão bacteriana e proteínas envolvidas. É melhor adequado para qualquer interação que envolva componentes de adesão mecanoresponsive, como vwf, que em geral não são acessíveis usando técnicas de cultura celular padrão. Por exemplo, sabe-se que a conformação de várias proteínas mmatrix extracelulares difere dependendo de sua localização. Dentro do sistema sanguíneo, glicoproteínas como fibronectina circulam em uma conformação globular, enquanto na matriz extracelular as proteínas aparecem como andaimes multiconectados di- e multimerized19,20. Além disso, vários distribuidores de equipamentos microfluídicos oferecem lâminas de canal padronizadas pré-revestidas com diferentes tipos de colágeno (por exemplo, collagens subendotélias ou outras proteínas derivadas de plasma). Esses slides de canais são adequados para visualização e análises quantitativas de adesão bacteriana a proteínas específicas da matriz extracelular em diferentes situações de fluxo.
Diferentes sistemas microfluídicos podem ser categorizados com base nos diferentes materiais usados para a produção de microdispositivos. A este respeito, as plataformas baseadas em vidro/silicone diferem das plataformas baseadas em polímero e em papel21. As lâminas de canal baseadas em polímero são produzidas com uma superfície elástica suportada (ESS), geralmente exigem um revestimento de superfície para o acessório celular durante experimentos de fluxo. Como alternativa a um revestimento com componentes suportadores de adesão, como colágeno, a superfície de alguns slides de canal comercialmente disponíveis é fisicamente modificada, o que cria uma superfície hidrofílica e adesiva adequada para a maioria dos tipos de células. Além disso, alguns slides de canais são gerados usando substratos como polidimiosiloxano (PDMS), que é permeável em oxigênio e também permite a cultura das células dos vasos sanguíneos na superfície interna dos microcanais em sistemas de bomba fluídica22, 23.
O sistema microfluídico utilizado nesses estudos serviu como um sistema eficiente e confiável que foi aplicado para a análise da interação de Staphylococcus aureus com fibras VWF multimerizadas após a cultura das células endotélias humanas em fluxo 24,25. Este sistema microfluídico foi um sistema de perfusão circular fechado que permitiu a análise da infecção por bactérias patogênicas condições de biossegurança 2. Além disso, os slides do canal eram adequados para monitoramento microscópico durante o fluxo e estão disponíveis com diferentes pré-revestimentos (por exemplo, gelatina, poli-l-lisina ou colágeno-IV) que garantem a adesão celular e um alto grau de reprodutibilidade experimental. Este protocolo utiliza um sistema microfluídico (ver Tabela de Materiais)para o estabelecimento de um modelo de infecção perfusível para S. pneumoniae, imitando assim a situação do fluxo dentro do sistema vascular humano8.
O procedimento geral descrito do acessório bacteriano da pilha neste sistema microfluidic pode igualmente ser conduzido com outros tipos de sistemas da bomba que geram um fluxo definido e contínuo em um ambiente estéril. Para fins microfluídicos, principalmente quatro tipos de sistemas de controle de fluxo são usados: i) bombas peristálticas e bombas de recirculação, que são usadas neste protocolo, ii) bombas de seringa, iii) controladores de pressão e controladores de pressão iv) com matrizes de interruptor de fluxo. Cada tipo de sistema de controle de fluxo tem vantagens e desvantagens, dependendo da aplicação microfluídica específica e da capacidade de realizar visualização microscópica em tempo real. Na maioria dos aplicativos que exigem uma circulação contínua das amostras, as bombas de recirculação são combinadas com controladores de pressão baseados em software para garantir uma situação de fluxo definida. Isso também é otimizado no sistema de bomba demonstrado aqui. Os sistemas de bomba à base de seringa podem ser subdivididos em bombas de seringa "clássicas", que geram oscilação de fluxo, e bombas de seringa microfluídica "sem pulso". Estes sistemas baseados em bombas de seringa são geralmente fáceis de usar, mas o controle de fluxo em canais sem saída é um desafio usando bombas de seringa. Além disso, as mudanças de fluxo dentro do chip podem levar algum tempo, e um medidor de fluxo é necessário para determinar a taxa de fluxo. Mesmo as bombas de seringa sem pulso podem gerar pulsação periódica na taxa de fluxo devido ao motor passo a passo da bomba de seringa. Outro dispositivo de bomba de duas seringas é capaz de gerar um movimento fluídico baseado em "infundir e retirar" que aplica forças de cisalhamento definidas em superfícies celulares e é adequado para aplicações de microdiálise, mesmo de forma independente do PC. Este sistema deve ser combinado com microtubing para a conexão das câmaras ou das corrediças da canaleta para o cultivo da pilha seguido por análises microscópicas.
Os controladores de pressão acima mencionados são sistemas de controle de fluxo que pressurizam o tanque contendo a amostra, que é injetada sem problemas em uma câmara microfluídica ou em um chip. Os controladores de pressão podem estabelecer um fluxo sem pulso e também fornecer taxas de fluxo em combinação com medidores de fluxo. Uma combinação de controladores de pressão com matrizes de interruptor de fluxo permite um interruptor de fluxo rápido sem fluxos traseiros. O sistema de recirculação apresentado aqui permitiu a geração de valores de estresse de cisalhamento tipicamente relatados para o sistema vascular humano26. O estresse da cisalhamento vascular da parede in vivo foi estimado a partir de taxas de cisalhamento da parede como derivados de perfis de velocidade não invasivamente registrados, e viscosidade de sangue inteiro em grandes artérias e viscosidade plasmática nas arterioles26. Reneman e Hoeks registraram perfis de velocidade em grandes artérias usando um sistema de ultra-som especialmente projetado e em artérias através de técnicas ópticas usando traçadores de velocidade de fluxo fluorescente26. Um estresse médio de cisalhamento de 11-13 dyn/cm2 é alcançado na artéria carótida, em oposição a apenas 4-5 dyn/cm2 na artéria braquial. Os valores máximos de até 25-70 dyn/cm2 foram monitorados para a artéria carótida. Os valores de estresse de cisalhamento das veias pequenas e médias variam entre 0,1 e 0,5 dyn/cm2. No sistema microfluídico descrito aqui, o valor de estresse de cisalhamento aplicável depende do diâmetro da tubulação de perfusão selecionado, da altura do deslizamento do canal e da viscosidade do meio fluídico utilizado. A configuração fluida selecionada foi composta por um slide com 0,4 cm de altura (volume de 100 μl) em combinação com um conjunto de perfusão de 50 cm de comprimento e 1,6 mm de diâmetro e a viscosidade média foi de 0,0072 [dyn·s]/cm2. Esta configuração é apropriada para uma faixa de estresse de cisalhamento entre 3,5 e 31,2 dyn/cm2 a taxas de fluxo de 3,8-33,9 mL/min. Além disso, o controle de software da bomba de pressão pode aplicar um fluxo médio pulsado que poderia imitar um fluxo sanguíneo arterial pulsado.
O uso bem-sucedido, confiável e reprodutível deste método combinado de infecção microfluídica requer algumas precauções que devem ser mantidas em mente. Durante o processo de infecção em condições microfluídicas, a camada celular pode ser exposta a compostos bacterianos citotóxicos ou citolíticos, como pneumolíse, que afetam a viabilidade das células eucarióticas e enfraquecem a adesão celular à superfície de deslizamento. Portanto, manter um fluxo constante é necessário durante todo o curso do experimento e a integridade da morfologia celular deve ser monitorada com frequência. Além disso, o meio da cultura do fluxo deve fornecer todos os nutrientes essenciais às pilhas endothelial para assegurar um acessório de superfície apertado das pilhas durante todo a experiência da infecção. No entanto, deve-se notar que os suplementos médios contêm substâncias que podem interferir ou inibir a interação entre as bactérias e proteínas hospedeiras específicas. Em estudos de interação pneumococcus-VWF, por exemplo, a heparina deve ser esgotada do meio de cultura celular, pois inibe a ligação de pneumococci para VWF8.
Outro passo crítico na cultura de fluxo de células endotélias é a manutenção da adesão celular apertada, que depende da vitalidade celular global e do nível de diferenciação. A adesão celular resistente ao fluxo de cisalhamento das células endotélias primárias só foi alcançada quando as células eram estritamente mantidas em subconfluência antes da exposição ao estresse de cisalhamento. Por outro lado, a produção de WPB depende diretamente da confluência da camada de células endoteliis promovendo apertado célula-célula-contatos13. O benefício da cultura microfluídica das células endotélias primárias abrange a proliferação celular fortemente induzida que rapidamente leva à formação de uma camada de células de confluentes condições de fluxo. As células estão firmemente ligadas entre si, são coletivamente orientadas na direção do fluxo e representam um fenótipo altamente diferenciado que é necessário para produzir o WPB secreto. Estes WPB servem como vesículas de armazenamento para VWF, ativadores de vasodilatação e citocinas que são exocitosas à medida que a proteína explode sobre a estimulação de histamina ou a atividade de pneumolysina27,13. Portanto, a geração de uma camada de células altamente adesivae confluente de células endotélias primárias diferenciadas em passagens de baixa proliferação é um pré-requisito indispensável para a liberação eficiente do VWF e a formação de cadeias VWF na superfície celular e análises de bactérias-VWF-interação em condições de fluxo. Assim, tem que ser notado que a diferenciação das células endotélias levou 48 h de cultivo de fluxo no mínimo e exigiu um fluxo de cisalhamento constante, sem quaisquer variações na pressão da bomba. Quaisquer variações podem levar a uma súbita explosão média, o que liberaria as células para fora do escorregador. Além disso, durante a visualização microscópica, a lâmina microfluídica e os reservatórios médios do sistema de bomba precisavam ser mantidos a uma temperatura de 37 °C, pois isso representa a temperatura ideal das células humanas.
Linhas celulares humanas imortalizadas são adequadas para muitos experimentos científicos e muitas vezes são empregadas em estudos de infecção por cultura celular. Essas linhas celulares compartilham algumas vantagens técnicas gerais, como requisitos de cultura baixa ou moderada e proliferação ilimitada, o que permite a passagem várias centenas de vezes sem mudanças significativas nos perfis de morfologia ou receptores. No entanto, essas linhas celulares representam uma monocultura solitária e são submetidas a condições de crescimento bidimensional artificial. 28 O ambiente fisiológico faltando do tecido da fonte conduz às mudanças substanciais do fenótipo funcional e morfológico da pilha com cada passagem da cultura29. Antes de outros experimentos de adesão bacteriana, o perfil de proteínas de marcadores específicos do tipo célula expostas à superfície e receptores de células endotélias pulmonares primárias humanas em diferentes passagens da cultura celular foi determinado. A análise da citometria do fluxo revelou uma expressão fortemente reduzida de proteínas de superfície específicas tais como a molécula endotelial da adesão 1 da plaqueta (PECAM1) dentro de oito círculos da passagem da pilha. Além disso, o perfil expresso do receptor integrino foi significativamente alterado em passagens celulares mais altas em favor de um padrão de receptor integrina específico do tipo celular e um padrão de receptor integrinespecífico específico do tipo celular reduzido (Bergmann et al., dados inéditos). Esses resultados são particularmente relevantes para análises de interações patógenos-hospedeiros em estudos de biologia de infecções. Com o objetivo de sustentar as características das células phenotípicas e um alto nível de diferenciação funcional durante a cultura microfluídica das células no momento da infecção bacteriana, as células endotélias primárias de múltiplos doadores foram escolhidas neste caso e usadas apenas até cinco passagens no máximo, a fim de manter as características phenotípicas tão específicas quanto possível8.
A visualização combinada de bactérias e estruturas de superfície celular específicas durante o fluxo requer um protocolo otimizado de coloração de fluorescência. Usando diferentes combinações de proteínas diretamente rotuladas, bactérias que expressam proteínas fluorescência e anticorpos conjugados de fluorescência, procedimentos de coloração de imunofluorescência podem ser especificamente adaptados aos alvos de visualização. Esses procedimentos possibilitam uma visualização microscópica definida e clara e também uma diferenciação e quantificação da adesão bacteriana e internalização3,13,30,31. A detecção de bactérias internalizadas baseada em imunofluorescência requer um passo de permeabilização celular, como uma curta incubação Triton X-100, o que pode levar ao desprendimento celular. Portanto, a detecção de processos de internalização bacteriana que ocorrem em uma cultura de fluxo deve ser visualizada após a incubação de fluxo usando amostras interligadas por PFA. Para visualização em tempo real de bactérias em fluxo, o uso de bactérias geneticamente modificadas expressando proteínas de fluorescência permite uma detecção microscópica rápida e direcionada. Cepas de pneumococos que expressam rfp que foram geradas por meio de uma construção genética eficiente projetada por Kjos e Veening16,8 foram utilizadas neste estudo experimental. Para a detecção de cordas VWF no fluxo, diferentes anticorpos rotulados por fluoresceina específicos da VWF foram testados e poderiam ser usados. Para obter uma resposta de sinal ideal em um fundo inespecífico minimizado, a concentração adequada do anticorpo foi titrated consistentemente para cada anticorpo aplicado.
Para imagens microscópicas de células vivas, a unidade fluida e o slide do canal são removidos da incubadora de CO2 e colocados em uma câmara pré-aquecida a 37 °C no microscópio. Esta câmara não pôde ser ajustada para 5% de CO2. Sem uma atmosfera tamponada por carbonato, a morfologia HUVEC e a aptidão bacteriana permaneceram intactas por até 180 min, o que é suficiente para análise da adesão bacteriana mediada pela VWF. Se forem necessários tempos de infecção mais longos e monitorização microscópica fora de uma incubadora de CO2, deve ser utilizado um meio de cultura de células amortecidas para compensar as mudanças de pH devido à concentração inadequada de CO2. Alternativamente, todo o sistema poderia ser colocado de volta na incubadora de CO2 entre os passos de uma série de visualização microscópica.
Além da detecção de fluorescência em tempo real, a infecção bacteriana do endotelio dentro do slide do canal pode ser interrompida e preservada por troca média com paraformaldeído (PFA) como substância de fixação. Após a fixação no fluxo, a coloração otimizada e stepwise da imunofluorescência da superfície celular dentro do slide do canal permite a geração de visualizações microscópicas valiosas e fornece uma detecção de estrutura combinada versátil de compostos celulares específicos envolvidos na interação entre bactérias e células hospedeiras. O benefício científico deste método combinado é que o slide do canal tratado pela PFA pode ser armazenado e usado para uma mancha de imunofluorescência pós-fluxo das estruturas de interesse. O tratamento pfa inativa as bactérias e, assim, prende a expressão de RFP-proteína. Portanto, um antisero pneumo-específico de pneumococo foi gerado em coelho para detecção e visualização imunológica bacteriana foi realizado usando um anticorpo secundário de AlexaFluor568- conjugado com coelho8. Como já mencionado, o uso de diferentes combinações de anticorpos requer uma otimização exata de quantidades de anticorpos e a composição tampão de bloqueio. Caso contrário, sinais de fundo inespecíficos e efeitos de detecção cruzada podem levar a resultados de coloração artificial. Um procedimento otimizado de coloração de imunofluorescência pode ser facilmente usado para a detecção de muitos alvos celulares diferentes, como o citoesqueleto actina ou marcadores endosômicos13,31.
Este procedimento pode ser adaptado para criar um ambiente de tecido mais complexo que imita a fisiologia de um ponto de vista histológico, fisiológico e funcional. As análises apresentadas da infecção podem eficientemente ser usadas para responder a diversas perguntas científicas ao mesmo tempo usando uma na linha-conexão de diversas corrediças da canaleta a um jogo da perfusão. Esta configuração estendida facilitaria as análises de diferentes tipos de células, confluências celulares e diferentes revestimentos de slides dentro do mesmo ambiente de fluxo em paralelo e permitiria uma comparação direta de infecções bacterianas de diferentes tipos de células. Além disso, a conexão em série em linha e análises combinadas de vários slides de canal também fornecem a possibilidade de experimentos de séries de tempo, que podem ser aplicados para o perfil de expressão gênica (por exemplo, a análise do fator de virulência dependente do tempo de infecção expressão gênica).
As análises da infecção podem igualmente ser estendidas a uma condição constante do fluxo laminar que dura diversos dias ou mesmo semanas a fim analisar a resposta celular nas circunstâncias que imitam uma fase a longo prazo da infecção crônica. Além da cultura do tipo unicelular apresentada, alguns exemplos de cultura heterotípica de células em dispositivos de cultura de células microfluídicas já foram relatados32,33. Isso permite estudos farmacológicos de alta rendimento e pode resultar no uso de sistemas de cultura de células microfluídicas para fins regenerativos, bem como34.
Em resumo, o sistema microfluídico em combinação com procedimentos de coloração imunológica serviu como um modelo valioso para a análise de mecanismos de pathomecanismos entre bactérias e células hospedeiras em um ambiente que simula as condições dentro do sistema vascular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
O projeto foi financiado pelo DFG (BE 4570/4-1) para a SB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
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