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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60323
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Summary

Este estudio describe el monitoreo microscópico de la adherencia del neumococo a las cadenas del factor von Willebrand producidas en la superficie de células endoteliales primarias humanas diferenciadas bajo tensión de cizallamiento en condiciones de flujo definidas. Este protocolo se puede extender a la visualización detallada de estructuras celulares específicas y cuantificación de bacterias mediante la aplicación de procedimientos de inmunoinso diferencial.

Abstract

La interacción de Streptococcus pneumoniae con la superficie de las células endoteliales se media en el flujo sanguíneo a través de proteínas sensibles al mecanosensible como el Factor Von Willebrand (VWF). Esta glicoproteína cambia su conformación molecular en respuesta al estrés de cizallamiento, exponiendo así sitios de unión para un amplio espectro de interacciones huésped-ligand. En general, el cultivo de células endoteliales primarias bajo un flujo de cizallamiento definido es conocido por promover la diferenciación celular específica y la formación de una capa endotelial estable y estrechamente vinculada que se asemeja a la fisiología del revestimiento interno de un vaso sanguíneo . Por lo tanto, el análisis funcional de las interacciones entre patógenos bacterianos y la vasculatura huésped que involucra proteínas mecanósensitiveas requiere el establecimiento de sistemas de bombeo que puedan simular las fuerzas de flujo fisiológico que se sabe que afectan a la superficie de células vasculares.

El dispositivo microfluídico utilizado en este estudio permite una recirculación continua y sin pulsos de fluidos con un caudal definido. El sistema de bomba de presión de aire controlado por ordenador aplica una tensión de cizallamiento definida en las superficies de células endoteliales mediante la generación de un flujo medio continuo, unidireccional y controlado. Los cambios morfológicos de las células y la unión bacteriana se pueden monitorear y cuantificar microscópicamente en el flujo mediante el uso de diapositivas de canal especiales que están diseñadas para la visualización microscópica. A diferencia de la infección por cultivo celular estático, que en general requiere una fijación de muestraantes antes del etiquetado inmune y los análisis microscópicos, las diapositivas microfluídicas permiten tanto la detección basada en fluorescencia de proteínas, bacterias y componentes celulares después de la fijación de la muestra; inmunofluorescencia en serie; y detección directa basada en fluorescencia en tiempo real. En combinación con bacterias fluorescentes y anticuerpos específicos etiquetados con fluorescencia, este procedimiento de infección proporciona un sistema de visualización de múltiples componentes eficiente para un gran espectro de aplicaciones científicas relacionadas con los procesos vasculares.

Introduction

La patogénesis de las infecciones por neumococo se caracteriza por una interacción multifacética con una diversidad de compuestos de matriz extracelular y componentes de la hemostasia humana, como el plasminógeno y el VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. El VWF multidominio de glicoproteína sirve como regulador clave de una hemostasis equilibrada mediante la mediación del reclutamiento de trombocitos y la incorporación de fibrina en el sitio de formación de trombos vasculares9. La importancia del VWF funcional y activo para el control del sangrado y la cicatrización de heridas se demuestra en la enfermedad de von Willebrand, un trastorno hemorrágico hereditario común10.

Globular VWF circula en el sistema sanguíneo humano a una concentración de hasta 14,0 g/ml11,10. En respuesta a la lesión vascular, la liberación local de FVW por parte de los cuerpos endoteliales de palademán de Weibel (WBP) se incrementa notablemente11,12. Estudios anteriores muestran que la adherencia del neumococo a las células endoteliales humanas y su producción de la toxina formacional de poros neumolisina estimula significativamente la secreción luminal de VWF13. Las fuerzas hidrodinámicas del flujo sanguíneo inducen una apertura estructural de los dominios de VWF mecanoresponsive. A caudales de 10 dyn/cm2 el VWF multimerizes a cadenas de proteínas largas de hasta varios cientos de micrómetros de longitud que permanecen unidos al subendotelio10,12.

Para comprender la función de las cadenas multimerizadas de VWF generadas bajo tensión cortante en la interacción del neumococo con la superficie endotelial, se estableció un enfoque de infección del cultivo celular basado en microfluidos. Se utilizó un dispositivo microfluídico con un sistema de bomba de presión de aire controlado por software. Esto permitió una recirculación continua y unidireccional del medio de cultivo celular con un caudal definido. De este tipo, el sistema aplicó una tensión cortante definida en la superficie de las células endoteliales, que permanecía unida dentro de diapositivas de canal especializadas. Este enfoque permitió la simulación de la fuerza cortante dentro del torrente sanguíneo del sistema vascular humano, en el que las cadenas VWF se generan en células endoteliales diferenciadas en condiciones de flujo constante definidas. Para ello, las células endoteliales se cultivaron en diapositivas de canal específicas (ver Tabla de Materiales),que fueron adaptadas para análisis microscópicos durante el flujo. El sistema de bomba microfluídica proporcionó la situación de tensión de cizallamiento altamente definida y controlada necesaria para la formación de cadenas VWF extendidas en la capa de células endoteliales confluentes. Después de la estimulación de la secreción de VWF de las células endoteliales de venas umbilicales humanas cultivadas confluentes (HUVEC) por la suplementación con histamina, la formación de cuerdas fue inducida mediante la aplicación de una tensión de cizallamiento (o) de 10 dyn/cm2. La tensión de cizallamiento se define como la fuerza que actúa sobre la capa de celda. Se calcula aproximadamente de acuerdo con Cornish et. al.14 con la ecuación 1:
Equation 1

En el caso de la tensión de cizallamiento en dyn/cm2, á viscosidad en (dyn)/cm2, h a la mitad de la altura del canal, a la mitad de la anchura del canal y a la velocidad de flujo en ml/min.

El resultado de la ecuación 1 depende de las diferentes alturas y anchuras de las diferentes diapositivas utilizadas (ver Tabla de Materiales). En este estudio se utilizó una diapositiva de canal Luer de 0,4 m que dio como resultado un factor de deslizamiento de cámara de 131,6 (ver fórmula 2).
Equation 2

La viscosidad del medio a 37oC es de 0,0072 dyns/cm2 y se utilizó una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2. Esto dio lugar a un caudal de 10,5 ml/min (véase la fórmula 3).
Equation 3

Aquí, la adaptación y el avance de un procedimiento de cultivo celular microfluídico utilizando un sistema de flujo laminar unidireccional para la investigación y visualización de los mecanismos de infección bacteriana en la vasculatura del huésped se describe en detalle. La generación de cadenas VWF en capas endoteliales también se puede estimular mediante el uso de otros sistemas de bomba que son capaces de aplicar una tensión de cizallamiento continua y constante15.

Después del cultivo de células endoteliales primarias para confluencia en el flujo y la estimulación de la formación de cuerdas DeVWF, se añadieron neumococos que expresan proteína de fluorescencia roja (RFP)16 a la capa de células endoteliales bajo control microscópico constante. La unión de bacterias a las cuerdas del VWF en la superficie de las células endoteliales se visualizó y monitorizó microscópicamente durante hasta tres horas en tiempo real mediante el uso de anticuerpos con etiquetas fluorescentes específicas de VWF. Con este enfoque, se determinó el papel del VWF como cofactor de adhesión que promueve el apego bacteriano al endotelio vascular8.

Además de la visualización microscópica de la secreción de proteínas y los cambios de conformación, este método podría utilizarse para monitorear pasos individuales de los procesos de infección bacteriana en tiempo real y para cuantificar la cantidad de bacterias adheridas en diferentes puntos de tiempo de Infección. El sistema específico de bomba controlada por software también ofrece la posibilidad de cultivar las células endoteliales en condiciones de flujo constante definidas durante un máximo de varios días y permite una incubación de flujo medio pulsada definida. Además, este método se puede aplicar utilizando diferentes tipos de celda. La adaptación del protocolo de tinción también permite la detección y visualización de bacterias internalizadas en células eucariotas.

Este manuscrito describe este protocolo experimental avanzado que se puede utilizar como un enfoque definido, confiable y reproducible para una caracterización eficiente y versátil de los procesos fisiopatológicos.

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Protocol

El cultivo de células microfluidas se realizó con células endoteliales comerciales de venosas umbilicales humanas primarias (HUVEC). La compañía aisló las células con el consentimiento informado del donante. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Cámara de Médicos del Estado Federal de Baden-Wuerttemberg con el número de referencia 219-04.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener suministros de protocolo.

1. Precultivo de Células Endoteliales Primarias

  1. Descongelar un vial de glicerol congelado que contiene 1 x 105 HUVEC primario de tres donantes diferentes suavemente a 37 oC y sembrar las células en 7 ml de medio de crecimiento de células endoteliales precalentados (ECGM, listo para usar con suplementos) en un matraz de25 cm 2 células.
    NOTA: Las células endoteliales primarias pierden capacidad de diferenciación después de más de 5 ciclos de proliferación. Por lo tanto, sólo se pueden utilizar celdas con menos de 5 pasajes si se requieren altos grados de diferenciación celular.
  2. Cultivar las células a 37 oC en una atmósfera de CO2 al 5% durante 60 minutos para permitir la fijación de la superficie e intercambiar el medio de cultivo celular ECGM para deshacerse de los residuos de la crioconservación.
  3. Continúe el cultivo de las células a 37 oC en una atmósfera de CO2 del 5% hasta que formen una capa celular de subconfluente.
    NOTA: El HUVEC no debe crecer a una capa de confluente ya que los contactos estrechos de las celdas celulares impiden la formación de una capa celular estable más adelante en el flujo.

2. Precultivo de Streptococcus pneumoniae

ADVERTENCIA: Streptococcus pneumoniae es un agente de nivel 2 de bioseguridad y solo se permite el cultivo en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad. Utilice un banco limpio clasificado para el nivel de seguridad 2 para todos los tratamientos bacterianos, evite estrictamente la formación de aerosoles y utilice una centrífuga con protección contra aerosoles para la sedimentación de bacterias.

  1. Inocular una placa de agar en sangre de Columbia con aislado clínico de Streptococcus pneumoniae ATCC11733 derivado de un stock de glicerol almacenado constantemente a -80 oC y cultivar la placa de agar durante la noche a 37 oC y 5% de CO2.
  2. Preparar 40 ml de caldo líquido Todd Hewitt complementado con 1% de extracto de levadura (THY) y 15 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) pH 7.4, para pasos de cultivo y lavado bacterianos.
  3. Utilice un tubo estéril para el cultivo bacteriano e inocular el caldo de cultivo líquido con masa bacteriana. Controlar la cantidad de inoculación mediante medición fotométrica de alícuotas de 1 ml a 600 nm contra caldo líquido no inoculado como referencia. Rellene la masa bacteriana en el caldo líquido hasta que alcance una densidad óptica a 600 nm (OD600)de 0,15.
  4. Incubar el caldo líquido inoculado sin agitar a 37 oC y 5% de CO2 y determinar laDoS 600 cada 30 min midiendo alícuotas de 1 ml utilizando cubetas de plástico.
  5. Tan pronto como el cultivo bacteriano ha alcanzado una DoP600 de 0.4, que corresponde a la fase de crecimiento exponencial, centrifugar la suspensión del cultivo bacteriano durante 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: No permita que un cultivo de neumococo alcance una OD600 de más de 1,0, porque se sabe que una alta densidad de cultivo de neumococo desencadena la autolisis bacteriana, que podría afectar la aptitud bacteriana general.
  6. Resuspenda el sedimento bacteriano suavemente con 10 ml de PBS y vuelva a sedimentar durante 10 min a 1.000 x g a RT.
  7. Resuspenda el sedimento bacteriano lavado suavemente en 1 ml de PBS y determine el OD600 de 10 l de la suspensión bacteriana utilizando 1 ml de PBS como referencia.
  8. Ajuste la cantidad de bacterias en PBS a una DoP600 de 2.0. Según el conteo bacteriano previamente determinado, una OD600 de 2.0 corresponde a 2 x 109 unidades formadoras de colonias (CFU). Proceder inmediatamente con el procedimiento de infección para prevenir la autolisis bacteriana.

3. Cultivo celular endotelial de HUVEC bajo condiciones microfluídicas

  1. Separe las células endoteliales primarias del matraz del cultivo celular por proteólisis controlada. Realice los siguientes pasos en un entorno estéril utilizando un banco limpio. Preparar un volumen de 15 ml de PBS estéril para los pasos de lavado.
    1. Retire el ECGM de una capa HUVEC de subconfluente y lave la capa celular con PBS de 10 ml utilizando una pipeta serológica para deshacerse del medio de cultivo celular.
    2. Incubar el HUVEC lavado con 3 ml de solución de disociación celular precalentada de 37oC para desprendimiento celular durante 5 min a 37oC. Observe el desprendimiento de células proteolíticas mediante la monitorización microscópica cada minuto.
    3. Pipetear la suspensión de celda separada en un tubo que contenga 7 ml de ECGM complementado con 2% de suero de ternero fetal (FCS) para detener la proteólisis y sedimentar las células durante 3 min a 220 x g en RT.
    4. Retire el sobrenadante y resuspenda el HUVEC en 250 l de ECGM complementado con 5% de FCS y 1 mM MgSO4. Utilice 10 l de la suspensión celular para el recuento celular utilizando una cámara de recuento de células Neubauer y ajuste el recuento de células a 4 x 106 células/ml ECGM complementado con 5% de FCS y 1 mM MgSO4.
      NOTA: Para cada experimento de flujo se requerirán 30 mL de medio ECGM complementado con 5% FCS y con 1 mM MgSO4. A partir de aquí, esta composición media se denomina ECGMS-medium. El aumento de la concentración de FCS en el medio de cultivo de 2% a 5% apoya la fijación celular y la viabilidad celular de HUVEC sembrada en la diapositiva del canal. El medio complementa FCS y MgSO4 estabiliza sustancialmente la unión celular de HUVEC en condiciones de tensión cortante.
  2. Semilla y cultiva el HUVEC en una diapositiva de canal. Trabaje en un ambiente estéril utilizando un banco limpio. Las células se cultivarán bajo estrés de cizallamiento durante 2 días seguido de infección con bacterias y monitoreo microscópico para otras 2 h.
    1. Equilibrar una diapositiva de canal, un conjunto de perfusión de 1,6 mm de diámetro y 50 cm de longitud, una alícuota del medio ECGMS y una diapositiva de canal Luer de 0,4 m de altura, durante 24 horas en una incubadora con una atmósfera deCO2 del 5% a 37 oC para reducir el número de burbujas de aire.
      NOTA: Este procedimiento se recomienda para desgasificar el equipo plástico y precalentar el medio, los tubos de perfusión y los depósitos. Si se han almacenado materiales o líquidos en RT o en el refrigerador, los gases disueltos en el plástico y los líquidos se liberarán cuando se calientan en la incubadora durante el experimento. A continuación, aparecerán burbujas de gas. Desgasificar todos los componentes plásticos antes del experimento eliminará este efecto. Cada vez que el sistema es sacado de la incubadora, el proceso de absorción de gas comienza de nuevo. Por lo tanto, trabaje rápidamente en RT y nunca deje la unidad fluida fuera de la incubadora durante períodos de tiempo más largos.
    2. Utilice una pipeta para inyectar 100 ml de una solución de gelatina porcina filtrada estéril al 2% en una solución de PBS en uno de los depósitos de una diapositiva de canal equilibrado a temperatura. Incubar la gelatina-solución durante 1 h a 37 oC y enjuagar el canal de la corredera con 1 ml de PBS en condiciones estériles utilizando una jeringa Luer de 1 ml.
    3. Coloque el portaobjetos recubierto de gelatina sobre una fina placa de poliestireno o espuma de poliestireno para evitar una caída en la temperatura del deslizamiento. Añadir 100 l de la suspensión HUVEC de 4 x 106ml con una jeringa Luer de 1 ml en la corredera.
      NOTA: Colocar la corredera de canal en la superficie de metal frío del banco limpio podría disminuir la temperatura del fondo de la diapositiva, generando así tensión fría a las células endoteliales. Durante el pipeteo celular mantenga la diapositiva un poco hacia arriba para dejar que las burbujas de aire se eleven y desaparezcan del interior de la diapositiva.
    4. Incubar la diapositiva del canal con el HUVEC durante 60 min a 37 oC y 5% co2 y llenar los depósitos medios en ambos extremos de la diapositiva del canal con un medio ECGMS de 60 ol cada uno. Incubar durante 1 h a 37oC y 5% CO2.
  3. Ajuste la bomba microfluídica y los ajustes del software.
    1. Conecte el conjunto de perfusión equilibrada a la unidad de bomba, llene con 13,6 ml de ECGMS-medio e inicie el software de control de la bomba. Seleccione el conjunto de perfusión adecuado y el tipo de diapositiva de cámara utilizando las ventanas de desplazamiento hacia abajo en el menú de la unidad fluida configurada. Elija 0.007 (dyns/cm2) en el software para la viscosidad media. (Consulte los ajustes del software de la bomba de presión marcados con flechas rojas en la Figura suplementaria 1).
    2. Fuera de la incubadora, conecte una botella de vidrio llena de perlas de sílice de secado al tubo de presión de aire (consulte la Figura 1, Inset 3). El aire de la bomba de presión circula entre los depósitos de perfusión y la bomba y debe estar seco antes de volver a entrar en el dispositivo de la bomba. Seleccione Parámetros de flujo en el menú de software, ajuste la presión a 40 mbar y enjuague los tubos de la bomba con el medio líquido iniciando el flujo medio continuo. (Estos ajustes también se indican mediante flechas rojas en la Figura Suplementaria 1).
    3. Programe los ciclos de tensión de cizallamiento deseados del cultivo de flujo. Comience con 5 dyn/cm2, controle el bombeo de depósito equilibrado y asegúrese de que no haya burbujas de aire circulando en el sistema de la bomba.
      NOTA: La tensión de cizallamiento de pared en una diapositiva de canal depende del caudal y la viscosidad del medio de perfusión. Si utiliza otro sistema de bomba, consulte las ecuaciones descritas en la introducción para establecer un caudal que genere el nivel de tensión de cizallamiento deseado. Los ajustes descritos corresponden a un caudal de 5,42 ml/min. (Una captura de pantalla ejemplar que muestra los ajustes de parámetros de flujo adecuados en el software de la bomba de presión se muestra en la Figura suplementaria 2).
    4. Detenga la circulación del flujo en el software de control de la bomba y mantenga el flujo medio en el tubo de perfusión sujetando los tubos cerca de las conexiones Luer. Conecte la diapositiva del canal, evitando así las burbujas de aire, y coloque la unidad fluida con la diapositiva del canal conectado en una incubadora de CO2 a 37 oC y 5% de CO2. Inicie la tensión de cizallamiento a 5 dyn/cm2 durante 30 minutos para adaptar suavemente las células a las fuerzas generadas por la tensión de cizallamiento antes de acelerar el nivel de tensión de cizallamiento (consulte la Figura suplementaria 3).
      NOTA: Tenga cuidado de que no queden burbujas de aire en el sistema de tubos o en el portaobjetos después de conectarlo al sistema de tubos porque el movimiento de las burbujas de aire en el flujo podría conducir al desprendimiento de la célula.
    5. Acelere la tensión de cizallamiento a 10 dyn/cm2 (que corresponden a 10,86 ml/min en este ajuste de flujo) e incubar la corredera de canal en tensión de cizallamiento continua durante 48 h en una pequeña incubadora de CO2 a 37 oC y 5% de CO2 para permitir la diferenciación celular ( los settinngs de software respectivos se indican con flechas rojas en la Figura Suplementaria 4).
      NOTA: Las células HUVEC tienden a desprenderse de la superficie del canal si el cultivo del flujo se inicia directamente a 10 dyn/cm2. Las células permanecen unidas a la superficie de la cámara si el cultivo de flujo se inicia con menos tensión de cizallamiento utilizando 5 din/cm2 durante un mínimo de 30 minutos seguido de aumentar la tensión de cizallamiento lentamente hasta los 10 diques/cm2deseados. Una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2 es el valor mínimo en este ajuste de perfusión requerido para la formación de cuerdas VWF.
    6. Después de 24 h de cultivo de células microfluídicas, detenga el flujo medio con el software de control de la bomba exactamente cuando se alcanza un nivel medio equilibrado en ambos depósitos medios. Colocar la unidad fluida en un banco limpio y retirar 10 ml del medio de cultivo circulado de los depósitos de perfusión utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Añadir 10 ml de ECGMS-medio a los depósitos para renovar el medio, volver a colocar la unidad fluida en la incubadora de CO2 a 37oC y 5% deCO2,y reiniciar el cultivo fluido utilizando el software de control de la bomba.
      NOTA: La función de la bomba de presión puede ser interrumpida repentinamente por máquinas de laboratorio como grandes centrífugas, lo que podría crear una fuerte perturbación del campo magnético. Esta interrupción repentina podría conducir al desprendimiento celular. Tenga cuidado de que estas máquinas no estén activas cerca de la bomba de presión durante el experimento.
    7. Iniciar el precalentamiento de la cámara de incubación de temperatura que cubre la etapa del microscopio de fluorescencia a 37 oC para el equilibrio de temperatura 24 h antes de la visualización microscópica. Después de precalentar el microscopio, inicie el control del software del microscopio y ajuste los ajustes principales para la monitorización microscópica de fluorescencia seleccionando los ajustes de filtro adecuados (540 nm/590 nm para la detección de las bacterias y bacterias que expresan RFP y 470 nm/515 nm para la detección de la emisión de fluoresceína de los anticuerpos específicos para FVW conjugados por el FITC). Precalentar una cámara de calentamiento adicional para la incubación de la unidad fluida a 37 oC.
      NOTA: Durante los análisis de infección y la monitorización microscópica la temperatura de la diapositiva del canal y el medio circulante no deben disminuir sustancialmente, ya que esto generaría estrés frío en las células. En general, el tamaño de las cámaras de temperatura que cubren la etapa del microscopio no es suficiente para cubrir toda la unidad fluida. Por lo tanto, se recomienda el uso de una cámara de calentamiento adicional precalentada a 37 oC.
    8. Para la visualización microscópica, coloque la unidad fluida en la cámara de calentamiento precalentada de 37 oC y coloque la diapositiva del canal en una etapa del microscopio precalentado de 37 oC.
      NOTA: Para la visualización microscópica, la unidad fluida y la corredera de canal debían retirarse de la incubadora de CO2 debido a la longitud limitada del tubo de perfusión. Si se requieren tiempos de infección y monitorización microscópica superior a 180 min fuera de la atmósfera del 5% deCO2 para el amortiguamiento del pH, se debe utilizar un medio con pH amortiguado para el cultivo microfluídico.
    9. Controlar la morfología celular y la integridad de la capa HUVEC antes de la inyección de histamina y bacterias a la circulación de flujo durante todo el momento del experimento de flujo y después de terminar el experimento de flujo utilizando el modo de campo brillante del microscopio.

4. Inducción de la liberación de VWF y visualización de cadenas DeV Multimerizadas

  1. Mantenga el ajuste de flujo, ya que se requiere una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2 para desencadenar la multimerización de VWF a cadenas largas de hasta 200 MDa. Induzca la liberación de VWF de WPB endotelial inyectando 136 ml de una solución de hetamina de 100 mM en el medio ECGMS que circula en el tubo de perfusión utilizando un puerto de inyección. La concentración final de histamina en el medio de flujo será de 1 mM. Si no hay puerto de inyección disponible, la histamina se puede añadir alternativamente mediante pipeteo en el medio de los depósitos de la bomba.
  2. Para la detección de inmunofluorescencia de cuerdas VWF multimerizadas, detenga el flujo cuando se alcance un nivel medio equilibrado en los depósitos e inyecte 20 g de un anticuerpo conjugado FITC específico para VWF en un volumen de 200 ml de PBS (pH 7.4) en la circulación de 13,6 ml de ECGMS-medio utilizando un puerto de inyección. Si no hay puerto de inyección disponible, el anticuerpo se puede añadir alternativamente pipeteando en el medio de los depósitos de la bomba. Esto da como resultado una concentración final de anticuerpos de 1,3 g/ml.
  3. Para el escaneo microscópico de varios campos de visión en poco tiempo, utilice la unidad de fluorescencia del microscopio con un dispositivo de fluorescencia de xenón a una potencia del 30% y una cámara de epifluorescencia. Supervise la forma y la morfología de la capa HUVEC con el modo de campo brillante para seleccionar celdas representativas adecuadas para la visualización de cadenas VWF.
  4. Para la visualización de cadenas VWF fluorescentes verdes, seleccione un objetivo de aceite de 63x/1.40 y un filtro de detección de 470 nm en el menú de la unidad de fluorescencia del software del microscopio (LasX). Cree instantáneas de pilas Z de al menos 50 vistas de campo representativas, cada una de las cuales contiene aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactos. Para la cuantificación de las cadenas VWF fluorescentes verdes en diferentes puntos de tiempo, escanee varios campos de visión.

5. Evaluación microscópica del apego bacteriano a las cuerdas VWF en el flujo en tiempo real

  1. Cuantifique la unión neumocócica a las cadenas VWF generadas en superficies celulares HUVEC mediante la detección de inmunofluorescencia.
    1. Sostenga el flujo e inyecte 1,35 x 108 CFU/mL RFP-expressing neumococci en un volumen máximo de 1 ml en el medio ECGMS utilizando el puerto de inyección. Alternativamente, pipetear las bacterias en el medio en el depósito de la bomba. Reinicie la tensión de cizallamiento a 10 dyn/cm2 para dejar que las bacterias circulen dentro del sistema de la bomba.
    2. Seleccione un objetivo de inmersión en aceite de 63x para el aumento del microscopio y ajuste los ajustes del filtro de fluorescencia en el software del microscopio al canal RFP (filtro de detección de 540 nm) para la detección de neumococos que expresan RFP.
    3. Para la cuantificación de la fijación bacteriana a las cadenas VWF, detenga el flujo y cree instantáneas de pilas Z de al menos 30 vistas de campo representativas, cada una con aproximadamente 10 HUVEC morfológicamente intactas, y cuente la cantidad de neumococos.
    4. Utilice el algoritmo de estadísticas unifactoriales de ANOVA para evaluar los datos, seguido de una prueba de muestra no emparejada de dos colas post hoc para una comparación estadística detallada. Los valores P de <0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

6. Evaluación microscópica del apego bacteriano a las cuerdas VWF después de la fijación de la muestra

  1. Muestree la fijación antes de la tinción de inmunofluorescencia.
    1. Detenga el flujo, retire 10 ml de ECGMS-medio de los depósitos de la bomba, y agregue 10 mL de PBS complementado con 5% de paraformaldehído (PFA). Deje que la solución pfA circule durante 10 minutos a una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2.
    2. Desconecte la diapositiva del canal de la unidad de bomba.
  2. Bloquear sitios de unión inespecíficos en la superficie celular y realizar la inmunodetección de las cuerdas del VWF y las bacterias unidas.
    1. Preparar 4 ml de una solución de lavado que contenga 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) suplementada con 4% de sacarosa para todos los pasos de lavado. Preparar 1 ml de una solución de bloqueo que contenga 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) complementada con 4% de sacarosa y 2% de albúmina sérica bovina (BSA) para el bloqueo de sitios de unión inespecíficos.
    2. Lave la corredera de canal incubada por PFA 3x utilizando una jeringa Luer de 1 ml para inyectar 200 ml de la solución de lavado e incubar la corredera durante 120 minutos a RT con una solución de bloqueo de 200 ml.
    3. Preparar 4 ml de otra solución de bloqueo que contenga 100 mM Na2CO3, (pH 9.2) complementado con 4% de sacarosa y 0,5% de BSA para la dilución de los anticuerpos. Utilice 200 l de esta solución de bloqueo para diluir el antisuero de conejo específico del neumococo 1:100. Utilice 200 ml de esta solución de bloqueo para diluir el anticuerpo de ratón específico de VWF 1:50 para realizar una concentración de anticuerpos específica de VWF de 4 g/ml. Diluir el anticuerpo secundario conjugado AlexaFluor488 a partir de una solución de 2 mg/ml 1:100 en 200 ml de PBS (pH 7.4) para generar una concentración final de 20 g/ml.
      NOTA: En los ajustes de inmunofluorescencia descritos, la detección de anticuerpos proporcionó resultados óptimos cuando los anticuerpos se diluyeron en el tampón de carbonato alcalino antes mencionado. Según los resultados anteriores, las soluciones de bloqueo recomendadas y la cantidad de anticuerpos son adecuadas para muchas aplicaciones. Sin embargo, diferentes experimentos pueden requerir la optimización individual de la combinación de anticuerpos, la concentración de anticuerpos, el tiempo de incubación y la constitución del búfer de bloqueo. Como alternativa, un sistema con búfer de fosfato con un rango de pH neutro podría ser adecuado o incluso preferir como tampón de incubación. En caso de señales de fluorescencia débiles, se debe aumentar la concentración de anticuerpos secundarios. Si se detecta demasiado ruido de fondo de fluorescencia inespecífico, se debe aumentar la cantidad de sustancias de bloqueo.
    4. Para la tinción de VWF-inmunofluorescencia, lave el portaobjetos con una jeringa Luer de 1 ml inyectando 200 ml de la solución de lavado 3x e incubar el portaobjetos con el anticuerpo específico para VWF diluido de 1:50 durante 30 minutos a RT. L de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con el anticuerpo específico del ratón conjugado AlexaFluor488 diluido de 1:100 durante 30 min a RT. Por último, lave la corredera de nuevo 3x con 200 sl de la solución de lavado.
      NOTA: Los fluoróforos AlexaFluor son sensibles al blanqueo. Por lo tanto, la diapositiva debe protegerse manteniéndola en una cámara oscura durante los pasos de incubación con los anticuerpos conjugados con fluoróforo.
    5. Para la inmunodetección de los neumococos, incubar el portaobjetos con un anticuerpo de conejo específico para neumococo diluido de 1:100 durante 30 min a RT. Después, lave el portaobjetos 3x con 200 ml de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con 1:100 diluido AlexaFluor568 conjugado anticuerpo específico de conejo durante 30 minutos en RT. Lavar la diapositiva del canal de nuevo 3x con 200 l de la solución de lavado.
    6. Para manchar el citoesqueleto de actina celular con faloidina fluorescente, permeabilizar el HUVEC por incubación con 120 ol de 0,1% Triton X-100 durante 5 min en RT. Lavar la diapositiva del canal 3x con 200 ol de la solución de lavado e incubar el portaobjetos con 120 ol de 1:1.000 diluido AlexaFluor350-faloidin conjugado. Este paso de incubación visualizará el citoesqueleto de actina polimerizada y permitirá el monitoreo de la forma celular y posibles cambios morfológicos inducidos por el estrés.
    7. Lavar la corredera de canal 3x con 200 sL de la solución de lavado. Por último, lave la corredera 4x con 200 l ddH2O y visualice las cuerdas fluorescentes verdes VWF, las bacterias fluorescentes rojas y el citoesqueleto de actina fluorescente azul utilizando los ajustes de filtro adecuados en el microscopio de fluorescencia.

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Representative Results

El cultivo de HUVEC primario en un flujo unidireccional constante da como resultado la formación de una capa celular confluente y estrechamente embalada que promueve la generación de WPB celulares llenos del VWF13mecanosensible,14. Este protocolo describe el uso de un sistema de recirculación sin pulso basado en bomba de presión de aire para el análisis de infecciones que requiere imitar la situación de tensión de cizallamiento en el flujo sanguíneo humano.

Este sistema permite una configuración definida y controlada por software de las condiciones de flujo. El esquema de flujo de la Figura 1 ilustra el flujo de trabajo principal, comenzando con el precultivo de células endoteliales primarias(Figura 1, Inset 1) y el precultivo de neumococos(Figura 1, Inset 2). El sistema microfluídico aplicado(Figura 1,Inset 3) se compone de una diapositiva de canal especial que se conecta a través de un adaptador Luer a tubos de perfusión con dos depósitos medios. El juego de tubos de perfusión se coloca en una unidad fluida que sirve como soporte y emplea los tubos de perfusión como un sistema de válvulas. Para el cultivo de flujo, la unidad fluida con el conjunto de perfusión de llenado medio y la corredera de canal conectado se colocan en una incubadora de CO2 (Figura 1,Inserción 3). La unidad fluida está conectada a una bomba de presión de aire a través de tubos de aire. El aire en el tubo debe pasar a través de una botella de secado que contiene perlas de sílice para la eliminación de la humedad de los depósitos de perfusión antes de que el aire se vuelva a bombear en el sistema de la bomba(Figura 1, Inserción 3). La bomba de presión de aire está controlada por un software informático (PumpControl v1.5.0) que permite ajustar un caudal continuo y definido dependiendo del diámetro de la corredera del canal, la longitud y el diámetro del conjunto de tubos de perfusión, y la viscosidad de la medio utilizado(Figura 1, Inserción 3). La secreción de VWF por exócitosis WPB de HUVEC cultivado confluente es inducida por la histamina-estimulación8 aplicada en la circulación media en el tubo de perfusión utilizando un puerto de inyección(Figura 1,Inset 4). Con una tensión de cizallamiento mínima de 10 dyn/cm2, las proteínas VWF liberadas multimerizan y forman largas cadenas proteicas que alcanzan longitudes de más de 100 m(Figura 1, Inserción 4,5,6 y Figura 2A). Estas cadenas proteicas se detectan y visualizan microscópicamente después de la inyección de anticuerpos conjugados con FVW confitados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) en el medio. Los anticuerpos circulantes permiten la detección de inmunofluorescencia de las cadenas de VWF enlazadas a la superficie celular en tiempo real(Figura 1, Inset 5)8.

El enfoque establecido de infección del cultivo celular basado en microfluidos utilizando células endoteliales primarias imita la situación de una vasculatura inflamada localmente tras la infiltración de la circulación sanguínea por patono bacterianos como Streptococcus pneumoniae. Se muestran ejemplos de visualización y análisis cuantitativo de la interacción bacteriana con células vasculares diferenciadas bajo tensión cortante mediante el cultivo microfluídico de células endoteliales(Figura 1,Insets 5,6). Se inyectaron neumococos expresos por RFP en el flujo y después de 30 minutos de circulación, se detectaron microscópicamente los primeros signos de unión bacteriana a las cadenas VWF de HUVEC estimulada por histamina(Figura 1, Sets 5,6 y Figura 2A, B flechas blancas)8. Por lo tanto, el uso de neumococos expresos de RFP permitió la cuantificación de la unión bacteriana a las cuerdas VWF en las células endoteliales sin el requisito de detección de anticuerpos bacterianos.

Las gráficas de superposición de histogramas de las intensidades de fluorescencia se generaron utilizando el software de evaluación proporcionado por Leica (es decir, LasX) para visualizar la colocalización de neumococos que expresan RFP con las cadenas VWF detectadas con anticuerpos fluorescentes verdes. Esto permitió un análisis cuantitativo de la probabilidad de colocación en regiones específicas de interés (ROI) dentro de la imagen de fluorescencia. Utilizando superposiciones de histograma de señales bacterianas en combinación con las señales de fluorescencia del VWF, se pudieron visualizar picos de fluorescencia superpuestos para ambos y, por lo tanto, se confirmó la unión del neumococo a las cuerdas del VWF. El accesorio bacteriano resiste la tensión de cizallamiento aplicada continuamente durante un mínimo de 25 min(Figura 2B)8.

En resumen, el cultivo continuo de flujo primario HUVEC permitió la secreción de VWF y la generación de largas cadenas de proteína VWF que sirven como sitios de adhesión para la circulación de bacterias8.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo para análisis de la unión bacteriana a las cadenas VWF mediante el cultivo microfluídico de células endoteliales. Flujo de trabajo de los principales pasos experimentales que comienzan con el precultivo de células endoteliales primarias a la subconfluencia en matraces de cultivo celular. Antes del cultivo celular en el flujo, las células se sembran en una diapositiva de canal recubierto de gelatina (Inset 1). Las bacterias se cultivan en placas de agar seguidas de cultivo en una compleja fase de medio líquido a medio registro (Inset 2). Para el cultivo celular microfluido, una diapositiva de canal con células endoteliales está conectada a los tubos de perfusión de una unidad fluida del sistema de la bomba y sometida a un flujo constante para la diferenciación celular (Inset 3). La generación de las cuerdas VWF (flecha verde) fue inducida por inyección de histamina a una tensión de cizallamiento de 10 dyn/cm2 y monitoreada microscópicamente mediante la detección de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para VWF con etiqueta FITC (Inset 4). Después de la inyección de bacterias que expresan RFP en el medio circulante, la unión de neumococo (flecha roja) a las cuerdas VWF se visualizó microscópicamente en tiempo real mediante la emisión de fluorescencia a 450 nm(Inset 5). Después de la fijación de las células utilizando PFA, la tinción diferencial de inmunofluorescencia proporciona la visualización de la unión bacteriana en puntos de tiempo de infección específicos (Inset 6). Se incluyen las imágenes del sistema de bomba y la capa de células HUVEC descritaen en los pasos 1, 3 y la imagen del puerto de inyección (Inset 4). Las imágenes de inmunofluorescencia mostradas en los insertos 4 y 5 han sido modificadas y utilizadas con el permiso de Jagau et al.8. Las longitudes de las barras de escala se indican en la parte inferior derecha.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas de inmunofluorescencia de la unión del neumococo a las cuerdas del VWF generadas en flujo continuo sobre la superficie del HUVEC estimulado por la histamina. (A) La generación de las cuerdas VWF se cuantificó microscópicamente después de exponer HUVEC cultivado con fluentemente a tensión de cizallamiento utilizando un sistema de bomba microfluídica a 10 dyn/cm2. Los anticuerpos específicos de VWF conjugados por FITC detectaron las cadenas de VWF. Las flechas blancas apuntan a neumococos que expresan RFP con fluorescencia roja unida a cuerdas Largas de VWF. (B) La fijación bacteriana a las cuerdas VWF fluorescentes verdes se observó microscópicamente durante un máximo de 2 h en flujo constante (flechas blancas) y se confirmó mediante una evaluación basada en software de las intensidades de fluorescencia de un ROI definido. Se tomaron imágenes en tiempo real con el equipo de fluorescencia de un microscopio de escaneo láser confocal (SP8, Leica). Barras de escala a 10 m. Esta figura ha sido modificada y utilizada con permiso de Jagau et al.8.

Figura suplementaria 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La simulación de la interacción bacteriana con proteínas huésped sensibles al mecanosensible como el VWF requiere un sistema de cultivo celular perfundible que permita la generación de un flujo definido, unidireccional y continuo de líquidos, generando así un flujo confiable de tensión de cizallamiento . Ya se han descrito varios sistemas de bombas microfluídicas. Una revisión exhaustiva de Bergmann et al. resume los aspectos clave de los diferentes modelos de cultivo celular bidimensional y tridimensional17.

La tecnología microfluídica es una técnica muy joven iniciada a principios de la década de 1990 con el desarrollo de microambientes controlables, reproducibles y perfundibles en un micrómetro e incluso en una escala de nanómetros18. El enfoque microfluídico presentado también se puede aplicar para estudiar la amplia gama de mecanismos de adhesión bacteriana y proteínas implicadas. Es más adecuado para cualquier interacción que implique componentes de adhesión mecanoresponsive como VWF, que en general no son accesibles utilizando técnicas de cultivo celular estándar. Por ejemplo, se sabe que la conformación de varias proteínas de matriz extracelular difiere dependiendo de su ubicación. Dentro del sistema sanguíneo, las glicoproteínas como la fibronectina circulan en una conformación globular, mientras que en la matriz extracelular las proteínas aparecen como andamios multiconectados di y multimerizados19,20. Además, varios distribuidores de equipos microfluídicos ofrecen diapositivas de canal estandarizadas precubiertas con diferentes tipos de colágeno (por ejemplo, colágenos subendoteliales u otras proteínas derivadas del plasma). Estas diapositivas de canal son adecuadas para la visualización y análisis cuantitativos de la adhesión bacteriana a proteínas de matriz extracelular específicas en diferentes situaciones de flujo.

Diferentes sistemas microfluídicos se pueden clasificar en función de los diferentes materiales utilizados para la producción de microdispositivoes. En este sentido, las plataformas basadas en vidrio/silicona difieren de las plataformas basadas en polímeros y en papel21. Las diapositivas de canal basadas en polímeros se producen con una superficie con soporte elástico (ESS), generalmente requieren un recubrimiento superficial para la fijación de células durante los experimentos de flujo. Como alternativa a un recubrimiento con componentes de soporte de adherencia como el colágeno, la superficie de algunas guías de canal disponibles comercialmente se modifica físicamente, lo que crea una superficie hidrófila y adhesiva adecuada para la mayoría de los tipos de células. Además, algunas diapositivas de canal se generan utilizando sustratos como el polidimetilsiloxano (PDMS), que es permeable al oxígeno y también permite el cultivo de células de los vasos sanguíneos en la superficie interna de los microcanales en sistemas de bombas fluidas22, 23.

El sistema microfluídico que se utilizó en estos estudios sirvió como un sistema eficiente y confiable que se aplicó para el análisis de la interacción de Staphylococcus aureus con fibras Multimerizadas VWF después del cultivo de células endoteliales humanas en flujo 24,25. Este sistema microfluídico era un sistema de perfusión circular cerrada que permitía el análisis de la infección por bacterias patógenas en condiciones de bioseguridad 2. Además, las guías de canal eran adecuadas para la monitorización microscópica durante el flujo y están disponibles con diferentes prerecubrimientos (por ejemplo, gelatina, poli-L-lisina o colágeno-IV) que aseguran la adhesión celular y un alto grado de reproducibilidad experimental. Este protocolo utiliza un sistema microfluídico (ver Tabla de Materiales)para el establecimiento de un modelo de infección perfundible para S. pneumoniae, imitando así la situación de flujo dentro del sistema vascular humano8.

El procedimiento general descrito de unión celular bacteriana en este sistema microfluídico también se puede llevar a cabo con otros tipos de sistemas de bomba que generan un flujo definido y continuo en un entorno estéril. Para fines microfluídicos, se utilizan principalmente cuatro tipos de sistemas de control de flujo: i) bombas peristálticas y bombas de recirculación, que se utilizan en este protocolo, ii) bombas de jeringa, iii) controladores de presión, y iv) controladores de presión con matrices de interruptores de flujo. Cada tipo de sistema de control de flujo tiene ventajas e inconvenientes dependiendo de la aplicación microfluídica específica y la capacidad de realizar visualización microscópica en tiempo real. En la mayoría de las aplicaciones que requieren una circulación continua de las muestras, las bombas de recirculación se combinan con controladores de presión basados en software para garantizar una situación de flujo definida. Esto también está optimizado en el sistema de bomba demostrado aquí. Los sistemas de bomba basados en jeringas se pueden subdividir en bombas de jeringa "clásicas", que generan oscilación de flujo, y bombas de jeringa microfluídicas "sin pulso". Estos sistemas basados en bombas de jeringa son generalmente fáciles de usar, pero el control de flujo en canales sin salida es un desafío para usar bombas de jeringa. Además, los cambios de flujo dentro del chip pueden tardar algún tiempo, y se requiere un medidor de flujo para determinar el caudal. Incluso las bombas de jeringa sin pulso pueden generar pulsaciones periódicas en el caudal debido al motor paso a paso de la bomba de jeringa. Otro dispositivo de bomba de dos jeringas es capaz de generar un movimiento fluido basado en "infundir y retirar" que aplica fuerzas de cizallamiento definidas en superficies celulares y es adecuado para aplicaciones de microdiálisis incluso de una manera independiente del PC. Este sistema debe combinarse con microtubos para la conexión de cámaras o portaobjetos para el cultivo celular seguido de análisis microscópicos.

Los controladores de presión antes mencionados son sistemas de control de flujo que presurizan el tanque que contiene la muestra, que se inyecta suavemente en una cámara microfluídica o en un chip. Los controladores de presión pueden establecer un flujo sin pulso y también proporcionar caudales en combinación con medidores de flujo. Una combinación de controladores de presión con matrices de interruptores de flujo permite un interruptor de flujo rápido sin flujos posteriores. El sistema de recirculación presentado aquí permitió la generación de valores de tensión cortante típicamente reportados para el sistema vascular humano26. El estrés por cizallamiento de la pared vascular in vivo se ha estimado a partir de las tasas de cizallamiento de la pared derivadas de perfiles de velocidad no registrados de forma no invasiva, y de la viscosidad de la sangre entera en grandes arterias y la viscosidad plasmática en las arterias26. Reneman y Hoeks registraron perfiles de velocidad en grandes arterias mediante el uso de un sistema de ultrasonido especialmente diseñado y en arterioles a través de técnicas ópticas utilizando trazadores de velocidad de flujo fluorescente26. Se alcanza una tensión de cizallamiento promedio de 11-13 dyn/cm2 en la arteria carótida, en comparación con sólo 4-5 dyn/cm2 en la arteria braquial. Se han monitoreado valores máximos de hasta 25-70 dyn/cm2 para la arteria carótida. Los valores de tensión de cizallamiento de las venas pequeñas y medias oscilan entre 0,1 y 0,5 dyn/cm2. En el sistema microfluídico descrito aquí, el valor de tensión de cizallamiento aplicable depende del diámetro de tubería de perfusión seleccionado, la altura de la diapositiva del canal y la viscosidad del medio fluido utilizado. El ajuste fluido seleccionado se componía de un portaobjetos de 0,4 cm de altura (volumen de 100 ol) en combinación con un conjunto de perfusión de 50 cm de longitud y 1,6 mm de diámetro y la viscosidad media era de 0,0072 [dyns]/cm2. Este ajuste es adecuado para un rango de tensión de cizallamiento entre 3,5 y 31,2 dyn/cm2 a caudales de 3,8 a 33,9 ml/min. Además, el control del software de la bomba de presión puede aplicar un flujo medio pulsado que podría imitar un flujo sanguíneo arterial pulsado.

El uso exitoso, fiable y reproducible de este método combinado de infección microfluídica requiere algunas precauciones que deben tenerse en cuenta. Durante el proceso de infección en condiciones microfluídicas, la capa celular podría estar expuesta a compuestos bacterianos citotóxicos o citolíticos como la neumolisina, que afectan la viabilidad de las células eucariotas y debilitan la adherencia celular a la superficie del portaobjetos. Por lo tanto, se requiere mantener un flujo constante durante todo el curso del experimento y la integridad de la morfología celular debe ser monitoreada con frecuencia. Además, el medio de cultivo de flujo debe proporcionar todos los nutrientes esenciales a las células endoteliales para asegurar una estrecha unión superficial de las células a lo largo del experimento de infección. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los suplementos medios contienen sustancias que podrían interferir o inhibir la interacción entre las bacterias y proteínas huésped específicas. En estudios de interacción neumococo-VWF, por ejemplo, la heparina debe agotarse del medio de cultivo celular, ya que inhibe la unión de neumococos a VWF8.

Otro paso crítico en el cultivo de flujo de células endoteliales es el mantenimiento de la adhesión celular apretada, que depende de la vitalidad celular general y del nivel de diferenciación. La adhesión celular resistente al flujo de cizallamiento de las células endoteliales primarias sólo se logró cuando las células se mantuvieron estrictamente en subconfluencia antes de la exposición a la tensión de cizallamiento. Por otro lado, la producción de WPB depende directamente de la confluencia de la capa celular endotelial promoviendo contactos celulares apretados13. El beneficio del cultivo celular microfluido de las células endoteliales primarias cubre la proliferación celular fuertemente inducida que conduce rápidamente a la formación de una capa celular confluente en condiciones de flujo. Las células están estrechamente unidas entre sí, están orientadas colectivamente en la dirección del flujo y representan un fenotipo altamente diferenciado que se requiere para producir WPB secreto. Estos WPB sirven como vesículas de almacenamiento para VWF, activadores de vasodilatación y citoquinas que se exatitosed como ráfagas de proteína según la estimulación de la histamina o actividad de neumolisina27,13. Por lo tanto, la generación de una capa celular altamente adhesiva y confluente de células endoteliales primarias diferenciadas en pasajes de baja proliferación es un requisito indispensable para la liberación eficiente de VWF y la formación de cadenas VWF en la superficie celular y el análisis de bacterias-Interacción de VWF en condiciones de flujo. Por lo tanto, hay que señalar que la diferenciación de las células endoteliales tomó 48 h de cultivo de flujo como mínimo y requirió un flujo de cizallamiento constante sin variaciones en la presión de la bomba. Cualquier variación podría conducir a una explosión media repentina, que saque las células de la diapositiva. Por otra parte, durante la visualización microscópica, el deslizamiento microfluídico y los depósitos medios del sistema de bomba debían mantenerse a una temperatura de 37oC, ya que esto representa la temperatura óptima de las células humanas.

Las líneas celulares humanas inmortalizadas son adecuadas para muchos experimentos científicos y a menudo se emplean en estudios de infección del cultivo celular. Estas líneas celulares comparten algunas ventajas técnicas generales, como requisitos de cultivo bajos o moderados y proliferación ilimitada, lo que permite el paso de varios cientos de veces sin cambios significativos en morfología o perfiles de receptores. Sin embargo, estas líneas celulares representan un monocultivo solitario y están sujetas a condiciones artificiales de crecimiento bidimensional. 28 El entorno de tejido fuente fisiológica faltante da lugar a cambios sustanciales del fenotipo celular funcional y morfológico con cada paso del cultivo29. Antes de otros experimentos de adhesión bacteriana, se determinó el perfil de proteínas marcadoras específicas de tipo celular expuestas a la superficie y receptores de células endoteliales pulmonares primarias humanas en diferentes pasajes del cultivo celular. El análisis de citometría de flujo reveló una expresión fuertemente reducida de proteínas superficiales específicas como la molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias 1 (PECAM1) dentro de ocho rondas de paso celular. Además, el perfil del receptor de integrina expresado se modificó significativamente en pasajes celulares más altos en favor de un patrón de receptor de integrina inespecífico de tipo de célula y un patrón de receptor de integrina específico del tipo de célula reducido (Bergmann et al., datos no publicados). Estos resultados son particularmente relevantes para los análisis de interacciones patógeno-huésped en estudios de biología de infecciones. Con el objetivo de mantener las características de las células fenotípicas y un alto nivel de diferenciación funcional durante el cultivo celular microfluídico en el momento de la infección bacteriana, las células endoteliales primarias de múltiples donantes se eligieron en este caso y se utilizaron sólo hasta cinco pasajes como máximo para mantener las características fenotípicas lo más específicas posible8.

La visualización combinada de bacterias y estructuras de superficie celular específicas durante el flujo requiere un protocolo optimizado de tinción de fluorescencia. Utilizando diferentes combinaciones de proteínas etiquetadas directamente, bacterias que expresan proteínas de fluorescencia y anticuerpos conjugados con fluorescencia, los procedimientos de tinción de inmunofluorescencia se pueden adaptar específicamente a los objetivos de visualización. Estos procedimientos permiten una visualización microscópica definida y claray también una diferenciación y cuantificación de la adherencia e internalización bacteriana3,13,30,31. La detección basada en inmunofluorescencia de bacterias internalizadas requiere un paso de permeabilización celular como una incubación corta de Tritón X-100, que podría conducir a la desprendimiento celular. Por lo tanto, la detección de procesos de internalización bacteriana que se producen en un cultivo de flujo debe visualizarse después de la incubación de flujo utilizando muestras reticuladas pfA. Para la visualización en tiempo real de bacterias en flujo, el uso de bacterias modificadas genéticamente que expresan proteínas de fluorescencia permite una detección microscópica rápida y dirigida. En este estudio experimental se utilizaron cepas de neumococo que expresan rFP que se generaron utilizando una construcción genética eficiente diseñada por Kjos y Veening16,8. Para la detección de cadenas de VWF en el flujo, se probaron diferentes anticuerpos etiquetados con fluoresceína específicos de VWF y se podrían utilizar. Para obtener una respuesta óptima de la señal en un fondo inespecífico minimizado, la concentración adecuada de anticuerpos se valoró constantemente para cada anticuerpo aplicado.

Para las imágenes microscópicas de células vivas, la unidad fluida y la diapositiva del canal se retiran de la incubadora de CO2 y se colocan en una cámara precalentada a 37 oC en el microscopio. Esta cámara no se ha podido ajustar al 5% CO2. Sin una atmósfera amortiguada de carbonato, la morfología huVEC y la aptitud bacteriana permanecieron intactas hasta 180 min, lo que es suficiente para el análisis de la adherencia bacteriana mediada por VWF. Si se requieren tiempos de infección más largos y un control microscópico fuera de una incubadora deCO2, se debe utilizar un medio de cultivo celular amortiguado para compensar los cambios de pH debido a una concentración inadecuada deCO2. Alternativamente, todo el sistema podría ser colocado de nuevo en la incubadora de CO2 entre los pasos de una serie temporal de visualización microscópica.

Además de la detección de fluorescencia en tiempo real, la infección bacteriana del endotelio dentro de la diapositiva del canal se puede detener y preservar mediante intercambio medio con paraformaldehído (PFA) como sustancia de fijación. Después de la fijación en el flujo, la tinción de inmunofluorescencia optimizada y escalonada de la superficie celular dentro de la diapositiva del canal permite la generación de valiosas visualizaciones microscópicas de instantáneas y proporciona una detección de estructura combinada versátil de compuestos celulares específicos involucrados en la interacción entre las bacterias y las células huésped. El beneficio científico de este método combinado es que la diapositiva de canal tratada con PFA se puede almacenar y utilizar para una tinción de inmunofluorescencia post-flujo de las estructuras de interés. El tratamiento con PFA inactiva las bacterias y, por lo tanto, detiene la expresión de proteína RFP. Por lo tanto, se generó un antisuero específico para neumococo en conejo para la detección y visualización inmune bacteriana utilizando un anticuerpo secundario conjugado por AlexaFluor568 conjugado por el conejo8. Como ya se ha mencionado, el uso de diferentes combinaciones de anticuerpos requiere una optimización exacta de las cantidades de anticuerpos y la composición del búfer de bloqueo. De lo contrario, las señales de fondo inespecíficos y los efectos de detección cruzada podrían conducir a resultados de tinción artificial. Un procedimiento optimizado de tinción de inmunofluorescencia se puede utilizar fácilmente para la detección de muchas dianas celulares diferentes, como el citoesqueleto de actina o marcadores endosomales13,31.

Este procedimiento se puede adaptar para crear un entorno de tejido más complejo que imita la fisiología desde un punto de vista histológico, fisiológico y funcional. Los análisis de infección presentados se pueden utilizar eficientemente para responder a varias preguntas científicas al mismo tiempo mediante el uso de una conexión en línea de varias diapositivas de canal a un conjunto de perfusión. Esta configuración extendida facilitaría los análisis de diferentes tipos de células, confluencias celulares y diferentes revestimientos deslizantes dentro del mismo ajuste de flujo en paralelo y permitiría una comparación directa de infecciones bacterianas de diferentes tipos de células. Además, la conexión serie en línea y los análisis combinados de varias diapositivas de canal también ofrecen la posibilidad de experimentos de series temporales, que se pueden aplicar para la elaboración de perfiles de expresión génica (por ejemplo, el análisis del factor de virulencia dependiente del tiempo de infección expresión genética).

Los análisis de infección también se pueden extender a una condición de flujo laminar constante que dura varios días o incluso semanas con el fin de analizar la respuesta celular en condiciones que imitan una fase de infección crónica a largo plazo. Además del cultivo de tipo de una sola célula presentado, ya se han notificado algunos ejemplos de cultivo celular heterotípico en dispositivos de cultivo celular microfluídico32,33. Esto permite estudios farmacológicos de alto rendimiento y, en última instancia, podría dar lugar al uso de sistemas de cultivo celular microfluídico para fines regenerativos, asícomo 34.

En resumen, el sistema microfluídico en combinación con procedimientos de tinción inmune sirvió como un modelo valioso para el análisis de patologías entre bacterias y células huésped en un entorno que simula las condiciones dentro del sistema vascular.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El proyecto fue financiado por el DFG (BE 4570/4-1) a S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-syringe Fisher Scientific 10303002 with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe Sarstedt 9077136 For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase eBioscience now thermo fisher 00-4555-56 protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin Abcam ab176751 no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody Thermo Fisher Sientific A11001 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody Thermo Fisher Scientific A-11011 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth Becton Dickinson GmbH BD 249210 complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-25G solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter TPP 90026 subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R Beckman Coulter Life Sciences 392304 spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30 Beckman Coulter Life Sciences B06314 spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK Hermle 305.00 V05 - Z 216 M spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3886.2 used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing ibidi 10821 for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator Fisher Scientific MIDI 40 incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator Sanyo MCO-18 AIC for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates Becton Dickinson GmbH PA-254005.06 agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer Dell Latitude 3440 Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Leica DMi8 An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3904.1 used for PBS buffer
Drying material Merck 101969 orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix Promocell C-39215 supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS Promocell C-22010 ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) Promocell C-22010 culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS) biochrome now Merck S 0415 supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody Abcam ab8822 stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit ibidi 10903 fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G-1890-100g for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride Sigma Aldrich H-7250-10MG for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Promocell C-12203 Lot-Nr. 396Z042 primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) Santa Cruz sc73268 stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port ibidi 10820 for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope Zeiss Axiovert 35M inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) ibidi 80176 physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) Sigma Aldrich M7506-500G For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump ibidi 10905 air pressure pump
Neubauer cell counting chamber Karl Hecht GmbH&Co KG 40442002 microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710-S for cross linking of samples
Perfusion Set ibidi 10964 Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS) the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes Sarstedt 67,741 (2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum Pineda raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6781.1 used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) ibidi v1.5.4 Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL Sarstedt 72.706/ 72.695.500 required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume Sarstedt 6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci National Collection of Type Cultures, Public Health England 10,319 Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL Sarstedt 86.1253.025/ 86.1254.025 for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) Sigma Aldrich 451614-25G for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe P030.2 used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22 Biochrom 80-2115-20 measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G for preparation of blocking buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-500ML Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract oxoid LP0021 bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

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References

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Inmunología e infección número 152 Streptococcus pneumoniae microfluídico células endoteliales microscopía fluorescencia tensión de cizallamiento adherencia
Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante
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Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, M., Bergmann, S. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (152), e60323, doi:10.3791/60323 (2019).

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