Summary
Denna studie beskriver den mikroskopiska övervakningen av pneumokocker anslutning till von Willebrands faktor strängar som produceras på ytan av differentierade mänskliga primära endotelceller under skjuvning stress i definierade flödesförhållanden. Detta protokoll kan utökas till detaljerad visualisering av specifika cellstrukturer och kvantifiering av bakterier genom att tillämpa differentiell immunofärgning procedurer.
Abstract
Interaktion av Streptococcus pneumoniae med ytan av endotelceller förmedlas i blodflödet via mechanosensitive proteiner såsom von Willebrands faktorn (VWF). Detta glykoprotein förändrar dess molekylära konformation som svar på skjuvning stress, därigenom exponera bindningsställen för ett brett spektrum av värd-ligand interaktioner. I allmänhet är odling av primära endotelceller under ett definierat skjuvflöde känt för att främja den specifika cellulära differentieringen och bildandet av ett stabilt och tätt sammanlänkat endotelskikt som liknar fysiologin hos det inre fodret i ett blodkärl . Således kräver funktionell analys av interaktioner mellan bakteriella patogener och värd kärl med mechanosensitive proteiner inrättandet av pumpsystem som kan simulera de fysiologiska flödes krafterna som är kända för att påverka ytan av vaskulära celler.
Den mikroflödessystem enhet som används i denna studie möjliggör en kontinuerlig och diskuterar återcirkulation av vätskor med en definierad flödeshastighet. Det datorstyrda luft trycks pumpsystemet tillämpar en definierad skjuvbelastning på endotelcellytor genom att generera ett kontinuerligt, enkelriktat och kontrollerat medium flöde. Morfologiska förändringar av cellerna och bakteriell kvarstad kan mikroskopiskt övervakas och kvantifieras i flödet med hjälp av speciella kanalbilder som är utformade för mikroskopisk visualisering. I motsats till statisk cellkultur infektion, som i allmänhet kräver ett prov fixering före immun märkning och mikroskopiska analyser, den mikroflödessystem slides möjliggöra både fluorescens-baserad detektion av proteiner, bakterier, och cellulära komponenter efter prov upptagning; seriell immunofluorescenscfärgning; och direkt fluorescensbaserad detektion i realtid. I kombination med fluorescerande bakterier och specifika fluorescensmärkta antikroppar, denna infektion förfarande ger en effektiv multipel komponent visualisering system för ett stort spektrum av vetenskapliga tillämpningar relaterade till vaskulära processer.
Introduction
Patogenesen av pneumokocker infektioner kännetecknas av en mångfacetterad interaktion med en mångfald av extracellulära matrix föreningar och komponenter i människans hemostas, såsom plasminogen ochVWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Den flera domäner glykoprotein VWF fungerar som nyckel regulator av en balanserad hemostas genom att förmedla trombocyter rekrytering och fibrin inkorporering vid platsen för vaskulär tromb formation9. Betydelsen av funktionell, aktiv VWF för blödningskontroll och sårläkning framgår av von Willebrands sjukdom, en vanlig ärftlig blödningssjukdom10.
Globulära VWF cirkulerar i det humana blodsystemet med en koncentration på upp till 14,0 μg/ml11,10. Som svar på vaskulär skada, den lokala utgåvan av VWF av endotelceller Weibel Palade organ (WBP) är markant ökade11,12. Tidigare studier visar att pneumokocker anslutning till humana endotelceller och dess produktion av Porbildande toxin pneumolysin stimulerar signifikant luminala VWF sekretion13. Blodflödets hydrodynamiska krafter inducerar en strukturell öppning av de mechanoresponsive VWF-domänerna. Vid flödeshastigheter på 10 dyn/cm2 den VWF multimerizes till långa protein strängar på upp till flera hundra mikrometer i längd som förblir knutna till subendotelet10,12.
För att förstå funktionen av multimerized VWF strängar som genereras under skjuvning stress i samspelet mellan pneumokocker med endoteliala ytan, en microfluidic-baserade cellkultur infektion strategi fastställdes. En mikrofluidisk enhet med ett programvarustyrt luft trycks pumpsystem användes. Detta möjliggjorde en kontinuerlig, enkelriktad återcirkulation av cellodlingsmedium med en definierad flödeshastighet. Därmed applicerade systemet en definierad skjuvning spänning på ytbehandla av endotelceller celler, som återstod fäst insida specialiserade kanaliserar glidbanor. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde simuleringen av skjuvning kraft inom blodströmmen av det mänskliga vaskulära systemet, där VWF strängar genereras på differentierade endotelceller under definierade konstanta flödesförhållanden. I detta syfte odlades endotelcellerna i specifika kanalbilder (se tabell över material), som anpassades för mikroskopiska analyser underflödet. Mikroflödessystem pumpsystem som den mycket definierade och kontrollerade skjuvning stress situation som krävs för bildandet av utökade VWF strängar på konfluenta endotelceller cell skiktet. Efter stimulering av VWF-utsöndring av samverkande odlas mänskliga navel ven endotelceller (HUVEC) av histamin tillskott, var strängen bildandet induceras genom att tillämpa en skjuvning stress (ԏ) av 10 dyn/cm2. Skjuvspänningen definieras som den kraft som verkar på cell skiktet. Den beräknas ungefär enligt Cornish et. Al.14 med ekvation 1:
Där ԏ = skjuvning stress i dyn/cm2, η = viskositet i (dyn ∙ s)/cm2, h = halva kanalens höjd, w = hälften av kanalbredden, och Φ = flöde i ml/min.
Resultatet av ekvation 1 beror på de olika höjderna och bredderna för de olika bilderna som används (se tabell över material). I denna studie användes en Luerkanalslide på 0,4 μm, vilket resulterade i en kammar bild faktor på 131,6 (se formel 2).
Viskositeten hos mediet vid 37 ° c är 0,0072 dyn ∙ s/cm ² och en skjuvning stress på 10 dyn/cm ² användes. Detta resulterade i en flödeshastighet på 10,5 mL/min (se formel 3).
Här beskrivs anpassning och avancemang av en mikroflödessystem cell odlings procedur med hjälp av ett enkelriktat laminärt flödessystem för utredning och visualisering av bakteriella infektions mekanismer i värd kärlsystemet i detalj. Generering av VWF strängar på endotelskikt kan också stimuleras genom att använda andra pumpsystem som kan tillämpa en kontinuerlig och stadig skjuvning stress15.
Efter odling av primära endotelceller till sammanflödet i flödet och stimulering av VWF sträng formation, pneumokocker uttrycker rött fluorescens protein (RFP)16 lades till endotelcellskiktet under konstant mikroskopisk kontroll. Fastsättning av bakterier till VWF strängar på ytan av endotelceller var mikroskopiskt visualiseras och övervakas för upp till tre timmar i realtid med hjälp av VWF-specifika fluorescerande-märkta antikroppar. Med detta tillvägagångssätt, var den roll som VWF som en vidhäftning kofaktor främja bakteriell kvarstad på vaskulära endotelet bestämdes8.
Förutom den mikroskopiska visualiseringen av proteinsekretion och kon Formations förändringar, kan denna metod användas för att övervaka enstaka steg av bakteriella infektions processer i realtid och för att kvantifiera mängden bifogade bakterier vid olika tidpunkter i Infektion. Det specifika programvarustyrda pumpsystemet ger också möjlighet att odla endotelcellerna under definierade konstanta flödesförhållanden i upp till flera dagar och möjliggör en definierad inkubation mellan pulsade medel. Dessutom kan denna metod tillämpas med hjälp av olika celltyper. Anpassning av infärgnings protokollet möjliggör också detektion och visualisering av bakterier internaliseras i eukaryotiska celler.
Detta manuskript beskriver detta avancerade experimentella protokoll som kan användas som en definierad, tillförlitlig och reproducerbar metod för en effektiv och mångsidig karakterisering av patofysiologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den mikroflödessystem cellodling utfördes med kommersiella primära mänskliga navel venen endotelceller (huvec). Företaget isolerade cellerna med informerat samtycke av givaren. Denna studie var godkänd vid etikkommittén av manipulerar kammaren av det federalt påstår Baden-Wuerttemberg med hänvisa till numrerar 219-04.
Anmärkning: Se tabell över material för protokoll leveranser.
1. precultivation av primära endotelceller
- Tina en fryst glycerol injektionsflaska innehållande 1 x 105 primär huvec från tre olika givare försiktigt vid 37 ° c och utsäde cellerna i 7 ml föruppvärmd endotelceller tillväxtmedium (ecgm, klar att använda med kosttillskott) i en 25 cm2 cells kolv.
Anmärkning: De primära endotelcellerna förlorar differentierings kapacitet efter mer än 5 proliferation cykler. Därför kan endast celler med mindre än 5 passager användas om höga halter av celldifferentiering krävs. - Odla cellerna vid 37 ° c i 5% CO2 atmosfär för 60 min att tillåta ytan kvarstad och utbyta ecgm cellkulturmedium för att bli av med rester från kryoconservation.
- Fortsätt att kultera cellerna vid 37 ° c i 5% CO2 atmosfär tills de bildar ett subconfluent cellskikt.
Anmärkning: HUVEC får inte växa till ett konflytande skikt eftersom de snäva cell cells kontakterna förhindrar bildandet av ett stabilt cellskikt senare i flödet.
2. precultivation av Streptococcus pneumoniae
Varning: Streptococcus pneumoniae är en biosäkerhetsnivå 2-agent och får endast odlas i laboratorier för biosäkerhetsnivå 2. Använd en ren bänk klassificerad för säkerhetsnivå 2 för alla bakteriella behandlingar, strikt undvika aerosolbildning, och använda en centrifug med aerosol skydd för sedimentering av bakterier.
- Inokulera en Columbia blodgagar-platta med Streptococcus pneumoniae kliniskt isolat ATCC11733 härledd från ett glycerollager som ständigt lagras vid-80 ° c och odla agarplattan över natten vid 37 ° c och 5% Co2.
- Förbered 40 mL av Todd Hewitt flytande buljong kompletterad med 1% jästextrakt (THY) och 15 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,4, för bakteriell odling och tvättsteg.
- Använd ett sterilt rör för bakterieodling och Inokulera flytande odlings buljong med bakterie massa. Kontrollera mängden inokulering genom fotometrisk mätning av 1 mL alikvoter vid 600 Nm mot icke-inokulerade flytande buljong som referens. Fyll i bakterie massan i vätske buljongen tills den når en optisk densitet vid 600 Nm (OD600) av 0,15.
- Inkubera den inokulerade vätskan buljong utan att skaka vid 37 ° c och 5% CO2 och bestäm OD600 var 30 min genom att mäta 1 ml alikvoter med plast cuvettes.
- Så snart den bakteriella kulturen har nått en OD600 av 0,4, vilket motsvarar den exponentiella tillväxtfasen, Centrifugera bakteriekulturen suspensionen för 10 min vid 1 000 x g vid rumstemperatur (RT).
Anmärkning: Låt inte en pneumokocker kultur att nå en OD600 av mer än 1,0, eftersom en hög pneumokocker kultur densitet är känt för att utlösa bakteriell autolys, som kan påverka övergripande bakteriell kondition. - Omsuspendera bakterie sediment försiktigt med 10 mL PBS och sediment igen i 10 min vid 1 000 x g vid RT.
- Omsuspendera det tvättade bakterie sedimentet försiktigt i 1 mL PBS och bestäm OD600 på 10 μl av bakteriesuspensionen med 1 ml PBS som referens.
- Justera mängden bakterier i PBS till en OD600 av 2,0. Enligt tidigare bestämd bakterieräkning, motsvarar en OD600 av 2,0 till 2 x 109 kolonin som bildar enheter (CFU). Omedelbart fortsätta med infektionen förfarande för att förhindra bakteriell autolys.
3. endotelcellodling av HUVEC under Mikrofluidiska förhållanden
- Lossa de primära endotelcellerna från cell odlings flaskan genom kontrollerad proteolys. Utför följande steg i en steril miljö med en ren bänk. Bered en volym på 15 mL steril PBS för tvätt stegen.
- Ta bort ECGM från ett subconfluently-odlat HUVEC-skikt och tvätta cell skiktet med 10 mL PBS med hjälp av en serologisk pipett för att bli av med cell odlingsmediet.
- Inkubera den tvättade HUVEC med 3 mL 37 ° c förvärmda cell dissociation lösning för cell avlossning för 5 min vid 37 ° c. Observera den proteolytiska cell avlossning genom mikroskopisk övervakning varje minut.
- Pipettera den lossna cellsuspensionen i ett rör innehållande 7 mL ECGM kompletterat med 2% fetalt kalv serum (FCS) för att stoppa proteolys och sediment cellerna i 3 min vid 220 x g vid RT.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera HUVEC i 250 μL ECGM kompletterat med 5% FCS och 1 mM MgSO4. Använd 10 μL cellsuspension för cellräkning med en Neubauer cell räknings kammare och justera cell räkningen till 4 x 106 celler/ml ecgm kompletterat med 5% FCS och 1 mm MgSO4.
Anmärkning: För varje flödes experiment krävs 30 mL ECGM-medium kompletterat med 5% FCS och 1 mM MgSO4 . Härifrån på denna medelsammansättning namnges ECGMS-medlet. Ökningen av FCS-koncentrationen i odlingsmediet från 2% till 5% stöder cell infästning och cellviabilitet hos HUVEC seedade i kanalbilden. Mediet kompletterar FCS och MgSO4 avsevärt stabilisera cell fastsättning av huvec under skjuvning stress villkor.
- Frö och odla HUVEC i en kanalbild. Arbeta i en steril miljö med en ren bänk. Cellerna kommer att odlas under skjuvning stress för 2 dagar följt av infektion med bakterier och mikroskopisk övervakning för en annan 2 h.
- Equilibrate en kanalbild, en perfusion set 1,6 mm i diameter och 50 cm i längd, en alikvot av ECGMS-medium, och en Luer kanal glida 0,4 μm i höjd, för 24 h i en inkubator med 5% CO2 atmosfär vid 37 ° c för att minska antalet luftbubblor.
Anmärkning: Detta förfarande rekommenderas att Degas plast utrustning och att förvärmma mediet, perfusion rören, och reservoarerna. Om material eller vätskor har lagrats på RT eller i kylskåpet kommer gaser som löses i plast och vätskor att frisläppas när de värms upp i inkubatorn under experimentet. Gas bubblor kommer då att visas. Avgasning alla plastkomponenter innan experimentet kommer att eliminera denna effekt. Varje gång systemet tas ut ur inkubatorn börjar processen med gasabsorption igen. Därför, arbeta snabbt på RT och aldrig lämna fluidic enheten utanför inkubatorn för längre tidsperioder. - Använd en pipett för att injicera 100 μl av en 2% steril-filtrerad svin-gelatinlösning i PBS-lösning till en av behållarna i en temperaturjämkade kanalbild. Inkubera gelatinlösningen i 1 h vid 37 ° c och skölj kanalens kanal med 1 mL PBS under sterila förhållanden med en 1 mL Luerspruta.
- Placera den gelatin-belagda kanalen glida på en tunn polystyren eller frigolit plattan för att förhindra en droppe i bilden temperatur. Tillsätt 100 μL av 4 x 106/ml huvec-suspensionen med en 1 ml luerspruta i glaset.
Anmärkning: Placera kanalbilden på den kalla metallytan av den rena bänken kan minska temperaturen på glid botten, vilket genererar kall stress till endotelcellerna. Under cellpipettering håller du bilden lite uppåt för att låta luftbubblorna stiga och försvinna från insidan av bilden. - Inkubera kanalbilden med HUVEC för 60 min vid 37 ° c och 5% CO2 och fyll upp de medelstora behållarna i båda ändarna av kanalbilden med 60 μl ecgms-medium vardera. Inkubera i 1 h vid 37 ° c och 5% CO2.
- Equilibrate en kanalbild, en perfusion set 1,6 mm i diameter och 50 cm i längd, en alikvot av ECGMS-medium, och en Luer kanal glida 0,4 μm i höjd, för 24 h i en inkubator med 5% CO2 atmosfär vid 37 ° c för att minska antalet luftbubblor.
- Justera mikroflödessystem pumpen och programvaruinställningarna.
- Anslut den skakad perfusion inställd på pumpenheten, fyll med 13,6 ml av ecgms-medium, och starta pumpen kontrollprogramvara. Välj lämplig perfusion set och typ av kammar bild med hjälp av rulla ned fönster i menyn för fluidic enheten inrättas. Välj 0,007 (dyn ∙ s/cm2) i programvaran för medelhög viskositet. (Se de inställningar för tryck pumpens programvara som är markerade med röda pilar i kompletterande figur 1).
- Utanför inkubatorn, Anslut en glas flaska fylld med torkning kiseldioxid pärlor till lufttryck slangen (se figur 1, infälld 3). Lufttrycket pumpen cirkulerar mellan perfusion reservoarer och pumpen och måste vara torr innan du går in i pumpen enheten. Välj flödes parametrar i programmenyn, Ställ in trycket på 40 mbar, och spola pump rören med det flytande mediet genom att starta det kontinuerliga mediet flödet. (Dessa inställningar indikeras också med röda pilar i kompletterande figur 1).
- Program mera de önskade skjuvspänningscyklerna för flödes odling. Börja med 5 dyn/cm2, kontrollera balanserad reservoar pumpinng och försäkra att inga luftbubblor cirkulerar i pumpsystemet.
Anmärkning: Väggskjuvspänningen i en kanalbild beror på flödeshastigheten och viskositeten hos per fusions mediet. Om du använder ett annat pumpsystem, se de ekvationer som beskrivs i inledningen för att ställa in en flödeshastighet som genererar önskad skjuvning stressnivå. De beskrivna inställningarna motsvarar en flödeshastighet på 5,42 mL/min. (en exemplarisk skärmbild som visar lämpliga flödes parameterinställningar i tryck pumpens programvara visas i kompletterande figur 2). - Stoppa flödes cirkulationen i pump styrningsprogram varan och håll det medelstora flödet i per fusions slangen genom att spänna fast rören nära Lueranslutningarna. Anslut kanalbilden och Undvik därmed luftbubblor och placera fluidic-enheten med den anslutna kanalbilden i en CO2 -inkubator vid 37 ° c och 5% Co2. Starta skjuvspänningen vid 5 dyn/cm2 i 30 minuter för att smidigt anpassa cellerna till krafterna som genereras av skjuvspänningen innan skjuvspänningen accelererar (se kompletterande figur 3).
Anmärkning: Se till att inga luftbubblor finns kvar i rörsystemet eller i bilden efter connectinng till rörsystemet, eftersom förflyttning av luftbubblor i flödet kan leda till cell avlossning. - Accelerera skjuvspänningen till 10 dyn/cm2 (som motsvarar 10,86 ml/min i detta flödesläge) och inkubera kanalbilden i kontinuerlig skjuvning stress för 48 h i en liten Co2 inkubator vid 37 ° c och 5% Co2 för att möjliggöra celldifferentiering ( respektive programvara settinngs indikeras med röda pilar i kompletterande figur 4).
Anmärkning: HUVEC-celler tenderar att lossna från kanalens yta om flödes odling startas direkt vid 10 dyn/cm2. Cellerna förblir fästa vid kammar ytan om flödes odling påbörjas med mindre skjuvspänning med 5 dyn/cm2 under minst 30 min följt av en ökning av skjuvspänningen långsamt upp till önskad 10 dyn/cm2. En skjuvning stress på 10 dyn/cm2 är det minsta värdet i denna perfusion inställning som krävs för VWF sträng formation. - Efter 24 h av mikrofluidisk cellodling, stoppa mediet flöde med pumpen styr programvara exakt när en balanserad medium nivå uppnås i båda medelstora reservoarer. Placera fluidic-enheten i en ren bänk och ta bort 10 mL av det cirkulerade odlingsmediet för per fusions reservoarer med hjälp av en serologiska pipett på 10 mL. Tillsätt 10 mL ECGMS-medium i reservoarerna för att förnya mediet, placera fluidic enheten tillbaka i CO2 inkubator vid 37 ° c och 5% Co2, och starta om fluidic odling med hjälp av pumpen kontrollprogramvara.
Anmärkning: Tryck pumpens funktion kan plötsligt störas av laboratorie maskiner såsom stora centrifuger, vilket kan skapa en stark magnet fälts störning. Detta plötsliga avbrott kan leda till cell avlossning. Var försiktig så att sådana maskiner inte är aktiva nära tryck pumpen under experimentet. - Starta förvärrande av temperaturinkubations kammaren som täcker stadiet av fluorescensmikroskopet till 37 ° c för temperaturequilibration 24 h före den mikroskopiska visualiseringen. När mikroskopet är förvärmt, starta mikroskopet programvara kontroll och justera de viktigaste inställningarna för fluorescens mikroskopisk övervakning genom att välja lämpliga filterinställningar (540 nm/590 Nm för detektion av RFP-uttrycker bakterier och 470 nm/515 Nm för detektion av fluoresceinutsläpp av de FITC-konjugerade VWF-specifika antikropparna). Värm en extra värme kammare för inkubering av fluidic-enheten vid 37 ° c.
Anmärkning: Under infektion analyser och mikroskopisk övervakning av temperaturen i kanalbilden och det cirkulerande mediet bör inte minska avsevärt, eftersom detta skulle generera kall stress på cellerna. I allmänhet är storleken på temperatur kammare som täcker Mikroskop skede inte tillräckligt för att täcka hela fluidic enheten. Därför rekommenderas användning av ytterligare en värme kammare till 37 ° c. - För mikroskopisk visualisering, placera fluidic enheten i 37 ° c förvärmda värme kammaren och placera kanalen glida på en etapp av 37 ° c förvärmda Mikroskop.
Anmärkning: För mikroskopisk visualisering behövde fluidic-enheten och kanalbilden avlägsnas från CO2 -inkubatorn på grund av den begränsade längden av per fusions slangen. Om infektions tider och mikroskopisk övervakning längre än 180 min krävs utanför 5% CO2 atmosfär för pH-buffring, ett pH-buffrat medium bör användas för mikrofluidic odling. - Kontrollera cellens morfologi och integriteten av HUVEC skiktet före injektion av histamin och bakterier till flödet cirkulationen under hela tiden av flödet experiment och efter avslutad flödet experimentet med hjälp av ljusa fältet läge i mikroskopet.
4. induktion av VWF-release och visualisering av Multimerized VWF strängar
- Underhåll flödesinställningen eftersom en skjuvbelastning på 10 dyn/cm2 krävs för att utlösa multimerization av VWF till långa strängar på upp till 200 MDa. Inducera frisättning av VWF från endotelial WPB genom injektion av 136 μL av en 100 mM histaminbeståndets lösning i det ECGMS-medium som cirkulerar i per fusions slangen med hjälp av en injektions port. Den slutliga koncentrationen av histamin i flödet mediet kommer att vara 1 mM. Om ingen injektions port är tillgänglig, kan histamin läggas alternativt genom pipettering i mediet av pumpen reservoarer.
- För immunofluorescensdetektion av multimeriserade VWF-strängar, stoppa flödet när en balanserad medelnivå i reservoarerna uppnås och injicera 20 μg av en VWF-specifik FITC-konjugerad antikropp i en volym på 200 μL PBS (pH 7,4) i den cirkulerande 13,6 mL av ECGMS-medium med hjälp av en injektions port. Om ingen injektions port finns tillgänglig kan antikroppen tillsättas alternativt genom pipettering till mediet av pumpens reservoarer. Detta resulterar i en slutlig antikroppskoncentration på 1,3 μg/mL.
- För mikroskopisk skanning av flera fält på kort tid, Använd fluorescensenheten i mikroskopet med en Xenon-fluorescensapparat med 30% effekt och en epifluorescens-kamera. Övervaka HUVEC-lagrets form och morfologi med det ljusa fält läget för att välja representativa celler som lämpar sig för visualisering av VWF-strängar.
- För visualisering av gröna fluorescerande VWF strängar, Välj ett 63x/1.40 olje mål och ett 470 nm detektions filter i fluorescensenhets menyn i Mikroskop programvaran (LasX). Skapa ögonblicksbilder av Z-stackar av minst 50 representativa fältvyer, vardera innehållande cirka 10 morfologiskt intakt HUVEC. För kvantifiering av den gröna fluorescerande VWF strängar vid olika tidpunkter, skanna flera fält av vyn.
5. mikroskopisk utvärdering av bakteriell fastsättning till VWF-strängar i flöde i real tid
-
Kvantifiera pneumokockkoppling till de VWF-strängar som genereras på HUVEC-cellytor via immunofluorescensdetektion.
- Håll i flödet och injicera 1,35 x 108 CFU/ml RFP-uttrycker pneumokocker i en maximal volym av 1 ml i ecgms-mediet med hjälp av injektionsporten. Alternativt Pipettera bakterierna i mediet i pump behållaren. Starta om skjuvspänningen vid 10 dyn/cm2 för att låta bakterierna cirkulera i pumpsystemet.
- Välj ett 63x oljesänknings mål för Mikroskop förstoring och justera fluorescensfilterinställningarna i Mikroskop programvaran till RFP-kanalen (540 nm Detection filter) för detektion av RFP-uttryckande pneumokocker.
- För kvantifiering av bakteriell koppling till VWF-strängarna, stoppa flödet och skapa ögonblicksbilder av Z-stackar av minst 30 representativa fältvyer, var och en som innehåller cirka 10 morfologiskt intakt HUVEC, och räkna mängden av pneumokocker.
- Använd ANOVA-faktoriell statistik algoritm för att utvärdera data, följt av ett post hoc tvåsidiga unparade prov test för detaljerad statistisk jämförelse. P-värden på < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.
6. mikroskopisk utvärdering av bakteriell fastsättning till VWF-strängar efter prov fixering
- Ta prov på fixering före färgning av immunofluorescensteknik.
- Stoppa flödet, ta bort 10 mL ECGMS-medium från pump behållarna och tillsätt 10 mL PBS kompletterad med 5% PARAFORMALDEHYD (PFA). Låt PFA-lösningen cirkulera i 10 minuter vid en skjuvspänning på 10 dyn/cm2.
- Koppla bort kanalbilden från pumpenheten.
- Blockera ospecifika bindningsställen på cellytan och utför immunodetection av VWF-strängar och bifogade bakterier.
- Bered 4 mL av en tvättlösning som innehåller 100 mM na2Co3 (pH 9,2) kompletterad med 4% sackaros för alla tvättsteg. Bered 1 mL av en blockerande lösning som innehåller 100 mM na2Co3 (pH 9,2) kompletterad med 4% sackaros och 2% bovint serumalbumin (BSA) för blockering av ospecifika bindningsställen.
- Tvätta PFA-inkuberad kanalbild 3x med hjälp av en 1 mL Luer-spruta för att injicera 200 μL av tvättlösningen och inkubera bilden för 120 min vid RT med 200 μL blockerande lösning.
- Bered 4 mL av en annan blockerande lösning som innehåller 100 mM na2Co3, (pH 9,2) kompletterad med 4% SACKAROS och 0,5% BSA för spädning av antikropparna. Använd 200 μL av denna blockerande lösning för att späda ut det pneumococcus-specifika kanin-antiserum 1:100. Använd 200 μL av denna blockerande lösning för att späda ut den VWF-specifika mus antikroppen 1:50 för att göra en VWF-specifik antikroppskoncentration på 4 μg/mL. Späd den AlexaFluor488-konjugerade sekundära antikroppen från en 2 mg/mL stamlösning 1:100 i 200 μL PBS (pH 7,4) för att generera en slutlig koncentration på 20 μg/mL.
Anmärkning: I de beskrivna immunofluorescenskoncentrationer levererade antikropps detekteringen optimala resultat när antikropparna späddes i den ovan nämnda alkaliska karbonatbufferten. Baserat på tidigare resultat är de rekommenderade blockeringslösningar och mängden antikroppar lämpliga för många tillämpningar. Olika experiment kan dock kräva individuell optimering av antikropps kombinationen, antikroppskoncentrationen, inkuberingstiden och konstitutionen av blockeringsbufferten. Som ett alternativ kan ett fosfatbuffrat system med ett neutralt pH-intervall vara lämpligt eller till och med föredra som en inkubations buffert. Vid svaga fluorescenssignaler bör koncentrationen av sekundär antikropp ökas. Om för mycket ospecifik fluorescens bakgrundsbrus upptäcks, bör mängden blockerande ämnen ökas. - För VWF-färgning med immunofluorescensteknik, tvätta kanal glaset med en 1 mL Luerspruta genom att injicera 200 μL av tvättlösningen 3x och inkubera bilden med 1:50 utspädd VWF-specifik antikropp i 30 min vid RT. efteråt, tvätta kanal glaset igen 3x med 200 μL av tvättlösningen och inkubera bilden med 1:100 utspädd AlexaFluor488-konjugerad mus-specifik antikropp under 30 min vid RT. Tvätta slutligen kanal glaset igen 3x med 200 μL av tvättlösningen.
Anmärkning: Den AlexaFluor-fluorophores är känsliga för blekning. Därför bör bilden skyddas genom att hålla den i en mörk kammare under inkubationsstegen med de fluorophore-konjugerade antikropparna. - För immunodetektion av pneumokocker, inkubera bilden med en 1:100 utspädd pneumococcus-specifik kanin-antikropp i 30 min vid RT. efteråt, tvätta kanal glaset 3x med 200 μL av tvättlösningen och inkubera bilden med 1:100 utspädda AlexaFluor568-konjugerad kanin-specifik antikropp i 30 min vid RT. Tvätta kanal glaset igen 3x med 200 μL av tvättlösningen.
- För att färga cellulära aktin cytoskelettet med fluorescerande phalloidin, permeabilize den huvec genom inkubation med 120 μl av 0,1% Triton X-100 för 5 min vid RT. Tvätta kanal glaset 3x med 200 μl av tvättlösningen och inkubera bilden med 120 μl 1:1000 utspädd AlexaFluor350-konjugerat phalloidin. Detta inkubering steg kommer att visualisera polymeriserade aktin cytoskelettet och möjliggöra övervakning av cellens form och eventuella stressinducerade morfologiska förändringar.
- Tvätta kanal glaset 3x med 200 μL av tvättlösningen. Slutligen, tvätta bilden 4x med 200 μl DDH2O och visualisera de gröna fluorescerande VWF strängar, de röda fluorescerande bakterier, och den blå fluorescerande aktin cytoskelettet med lämpliga filterinställningar på fluorescensmikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Odling primär huvec i ett konstant enkelriktat flöde resulterar i bildandet av ett konflytande och tätt packade cellskikt som främjar generering av cellulära wpbs fylld med den mechanosensitive VWF13,14. Detta protokoll beskriver användningen av en luft trycks pump-baserade, diskuterar cirkulationssystem för infektions analys som kräver imitera skjuvning stress situationen i människans blodflöde.
Detta system möjliggör en definierad, programvarustyrd inställning av flödesförhållanden. Flödesschema i figur 1 illustrerar det huvudsakliga arbetsflödet, med början i precultivation av primära endotelceller (figur 1, Inset 1) och precultivation av pneumokocker (figur 1, Inset 2). Det tillämpade mikroflödessystem-systemet (figur 1, Inset 3) består av en speciell kanalbild som ansluts via en lueradapter till per fusions slang med två medelstora reservoarer. Den perfusion slang som är placerad på en fluidic enhet som fungerar som en monter och sysselsätter perfusion rören som ett ventilsystem. För flödes odling placeras fluidic-enheten med det medelfyllda per fusions Setet och den anslutna kanalbilden i en CO2 -inkubator (figur 1, infälld 3). Fluidic-enheten ansluts till en luft trycks pump via luftslangen. Luften i slangen måste passera genom en tork flaska som innehåller kiseldioxid pärlor för avlägsnande av fukt från perfusion reservoarer innan luften repumpas in i pumpsystemet (figur 1, infälld 3). Luft trycks pumpen styrs av datorprogramvara (PumpControl v 1.5.0) som möjliggör inställning av en kontinuerlig, definierad flödeshastighet beroende på kanalens diameter, längden och diametern på den per fusions slang som är inställd, och viskositeten hos medel som används (figur 1, infällbara 3). Utsöndringen av VWF av WPB exocytos av sammanflödet odlas HUVEC induceras av histamin-stimulering8 appliceras på medelstora cirkulationen i perfusion slangen med hjälp av en injektion port (figur 1, infällt 4). Vid en minsta skjuvning stress på 10 dyn/cm2, den utgivna VWF proteiner multimerize och bildar långa protein strängar nå längder av mer än 100 μm (figur 1, infällt 4, 5, 6 och figur 2A). Dessa protein strängar upptäcks mikroskopiskt och visualiseras efter injektion av fluorescein isotiocyanat (FITC)-konjugerade VWF-specifika antikroppar i mediet. De cirkulerande antikropparna möjliggör immunofluorescensdetektion av cellytan-bundna VWF-strängar i realtid (figur 1, Inset 5)8.
Den etablerade microfluidic-baserade cellkultur infektions metoden med hjälp av primära endotelceller härmar situationen för en lokalt inflammerad vasulatur vid infiltration av blodcirkulationen av bakteriell pathobionts som Streptococcus pneumoniae. Exempel på visualisering och kvantitativ analys av bakteriell interaktion med differentierade vaskulära celler under skjuvning stress med hjälp av mikrofluidic endotelcell odling visas (figur 1, insets 5, 6). RFP-uttrycker pneumokocker injicerades i flödet och efter 30 min cirkulation, de första tecknen på bakteriell fastsättning till VWF strängar av histaminstimulerad HUVEC upptäcktes mikroskopiskt (figur 1, indrag 5, 6 och figur 2A, B vita pilar)8. Således möjliggjorde användningen av RFP-uttryck av pneumokocker kvantifieringen av bakteriell koppling till VWF-strängarna på endotelcellerna utan krav på bakteriell antikropps detektering.
Histogram överlägg tomter av fluorescensintensiteter genererades med hjälp av utvärderingsprogramvara som tillhandahålls av Leica (dvs LasX) för att visualisera colocalization av RFP-uttrycker pneumokocker med VWF strängar detekteras med gröna fluorescerande antikroppar. Detta möjliggjorde en kvantitativ analys av sannolikheten för colocalization vid specifika intresse regioner (ROI) inom fluorescensbilden. Använda histogram överlagringar av bakteriella signaler i kombination med fluorescens signalerna i VWF, överlappande fluorescens toppar för båda kunde visualiseras och därmed bekräftat pneumokocker kvarstad på VWF strängar. Bakterie tillbehöret motstår den kontinuerligt tillämpade skjuvspänningen i minst 25 min (figur 2b)8.
Sammanfattningsvis, den kontinuerliga flödet odling av primära HUVEC aktiverat VWF sekretion och generering av långa VWF protein strängar som fungerar som vidhäftning platser för cirkulerande bakterier8.
Figur 1: arbetsflöde för analyser av bakterie infästning i VWF-strängar med hjälp av mikrofluidic endotelcellodling. Arbetsflödet av de viktigaste experimentella steg som börjar med precultivation av primära endotelceller till subconfluency i cellodling kolvar. Före cellodling i flödet, celler är seedade i en gelatin-belagd kanalbild (infälld 1). Bakterier odlas på agarplattor följt av odling i ett komplext flytande medium till Mid-log fas (Inset 2). För mikrofluidisk cellkultur, är en kanalbild med endotelceller ansluten till perfusion rören av en fluidic enhet av pumpsystemet och utsätts för konstant flöde för celldifferentiering (Inset 3). Generationen av de VWF-strängar (grön pil) inducerades av histamininjektion vid en skjuvning stress av 10 dyn/cm2 och mikroskopiskt övervakas av immunofluorescensdetektion med FITC-märkta VWF-specifika antikroppar (Inset 4). Efter injektion av RFP-uttrycker bakterier till cirkulerande medium, pneumokocker kvarstad (röd pil) till VWF-strängar var mikroskopiskt visualiseras i realtid genom fluorescensutsläpp vid 450 nm (infälld 5). Efter fixering av cellerna med hjälp av PFA ger differentiell immunofluorescensfärgning visualiseringen av bakteriell infästning vid specifika infektions tidpunkter (Inset 6). Bilderna av pumpsystemet och HUVEC-cellskiktet som beskrivs i steg 1, 3 och bilden av injektionsporten (Inset 4) ingår. De immunofluorescensbilder som visas i insets 4 och 5 har modifierats och använts med tillstånd från jagau et al.8. Längderna på skalnings staplarna visas längst nere till höger.
Figur 2: representativa immunofluorescensbilder av pneumokocker-bindning till de VWF-strängar som genereras i kontinuerligt flöde på ytan av histaminstimulerad huvec. (A) generationen av VWF-strängarna kvantifierades mikroskopiskt efter att ha exponerat den sammanväxlade huvec till skjuvspänningen med hjälp av ett mikroflödessystem pumpsystem på 10 dyn/cm2. FITC-konjugerade VWF-specifika antikroppar upptäckte VWF-strängarna. Vita pilar pekar på RFP-uttrycker pneumokocker med röd fluorescens bifogas långa VWF strängar. (B) bakteriell fastsättning till den gröna fluorescerande VWF strängar observerades mikroskopiskt för upp till 2 h i konstant flöde (vita pilar) och bekräftades av programvarubaserad utvärdering av fluorescens intensiteter av en definierad ROI. Real tidsbilder togs med fluorescensutrustning av en konfokal laser scanning Mikroskop (SP8, Leica). Skalstreck = 10 μm. Denna siffra har modifierats och använts med tillstånd från jagau et al.8.
Kompletterande figur 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Simuleringen av bakteriell interaktion med mechanosensitive Host proteiner såsom VWF kräver ett parfymera cellkultursystem som möjliggör generering av ett definierat, enkelriktat och kontinuerligt flöde av vätskor, vilket skapar tillförlitlig skjuvbelastning . Flera mikrofluidiska pumpsystem har redan beskrivits. En omfattande översyn från Bergmann et al. sammanfattar de viktigaste aspekterna av olika två-och tredimensionell cellkultur modeller17.
Den mikroflödessystem tekniken är en mycket ung teknik som inleddes i början av 1990-talet med utvecklingen av kontrollerbara, reproducerbara och perfusable mikromiljöer i en mikrometer och även i en nanometer skala18. Den presenterade mikroflödessystem tillvägagångssätt kan också tillämpas för att studera den breda spektrum av mekanismer för bakteriell vidhäftning och involverade proteiner. Det är bäst lämpad för alla interaktioner som involverar mechanoresponsive vidhäftning komponenter såsom VWF, som i allmänhet inte är lättillgänglig med hjälp av standard cellkultur tekniker. Till exempel, det är känt att konformation av flera extracellulära matrix proteiner skiljer sig beroende på deras plats. Inom blodsystemet, glykoproteiner som Fibronektin cirkulera i en globulära konformation, medan i den extracellulära matrisen proteinerna visas som multikopplade di-och multimerized byggnadsställning19,20. Dessutom erbjuder flera distributörer av mikroflödessystem utrustning standardiserade kanalbilder förbelagts med olika typer av kollagen (t. ex., subendoteliala kollagener eller andra plasma-derived proteiner). Dessa kanal diabilder lämpar sig för visualisering och kvantitativa analyser av bakteriell vidhäftning till specifika extracellulära matrix proteiner i olika flödes situationer.
Olika mikroflödessystem system kan kategoriseras baserat på de olika material som används för microdevice produktion. I detta avseende skiljer sig de glas/silikonbaserade plattformarna från de polymerbaserade och pappersbaserade plattformarna21. Polymerbaserade kanalbilder produceras med en elastiskt stödd yta (ESS), kräver i allmänhet en ytbeläggning för cell infästning under flödes experiment. Som ett alternativ till en beläggning med vidhäftning-stödjande komponenter såsom kollagen, ytan av vissa kommersiellt tillgängliga kanal diabilder är fysiskt modifierad, vilket skapar en hydrofila och adhesiv yta som lämpar sig för de flesta celltyper. Dessutom, vissa kanaler diabilder genereras med hjälp av substrat som Polydimetylsiloxan (PDMS), som är syre-permeable och möjliggör också kulturen i blodkärl celler på insidan av mikrokanaler i fluidic pumpsystem22, 23.
Den mikroflödessystem system som användes i dessa studier fungerade som ett effektivt och tillförlitligt system som tillämpades för analysen samspelet mellan Staphylococcus aureus med multimerized VWF fibrer efter kultur av humana endotelceller i flödet 24,25. Detta mikroflödessystem system var en sluten cirkulär perfusion system som möjliggjorde analys av infektion av patogena bakterier under biosäkerhet 2 villkor. Dessutom, kanal bilderna var lämpliga för mikroskopisk övervakning underflöde och finns med olika precoatings (t. ex., gelatin, Poly-L-lysin, eller kollagen-IV) som säkerställer cellernas vidhäftning och en hög grad av experimentell reproducerbarhet. Detta protokoll använder ett mikroflödessystem-system (se tabell över material) för att upprätta en parfym bar infektions modell för S. pneumoniae, vilket imitera flödes läget inom human vaskulär systemet8.
Den beskrivna allmänna förfarandet för bakteriell cell Attachment i detta mikroflödessystem system kan också utföras med andra typer av pumpsystem som genererar ett definierat och kontinuerligt flöde i en steril miljö. För mikroflödessystem ändamål, främst fyra typer av flödeskontroll system används: i) Peristaltiska pumpar och cirkulationspumpar, som används i detta protokoll, II) sprutpumpar, III) tryckregulatorer, och IV) tryckregulatorer med flödesbrytare matriser. Varje typ av flödeskontroll system har fördelar och nackdelar beroende på den specifika mikroflödessystem ansökan och förmågan att utföra mikroskopisk visualisering i realtid. I de flesta applikationer som kräver en kontinuerlig cirkulation av proverna, är cirkulationspumpar kombineras med programvarubaserade Tryckregulatorer för att säkerställa en definierad flödes situation. Detta är också optimerad i pumpsystemet demonstreras här. De sprutbaserade pump systemen kan delas in i "klassiska" sprutpumpar, som genererar flödessvängning och "pulseless" mikrofluidiska sprutpumpar. Dessa spruta pump-baserade system är i allmänhet lätt att använda, men flödeskontroll i återvändsgränd kanaler är utmanande med hjälp av sprutpumpar. Dessutom kan flödes förändringar inne i chip ta lite tid, och en flödesmätare krävs för att bestämma flödet. Även diskuterar spruta pumpar kan generera periodiska pulsering på flödet på grund av steg-för-steg-motorn i sprutpumpen. En annan två spruta pumpenhet kan generera en "ingjuta och dra"-baserade fluidic rörelse som gäller definierade skjuvning styrkor på cellytor och är lämplig för mikrodialys applikationer även i en PC-oberoende sätt. Detta system måste kombineras med mikroslangar för anslutning av kamrarna eller kanal glasen för cellodling följt av mikroskopiska analyser.
De ovan nämnda tryck regulatorerna är flödeskontroll system som pressar tanken som innehåller provet, som smidigt injiceras i en mikrofluidisk kammare eller på ett chip. Tryck regulatorerna kan etablera ett pulslöst flöde och även ge flödeshastigheter i kombination med flödesmätare. En kombination av tryckregulatorer med Flow switch matriser möjliggör en snabb flödesbrytare utan tillbaka flöden. Det cirkulationssystem som presenteras här möjliggjorde generering av skjuvspännings värden som vanligtvis rapporteras för Human vaskulär systemet26. In vivo vaskulär vägg skjuvning stress har uppskattats från vägg skjuvning priser som härrör från icke-invasivt inspelade hastighetsprofiler, och helblod viskositet i stora artärer och plasmaviskositet i arterioler26. Reneman och hoeks inspelade hastighetsprofiler i stora artärer med hjälp av en speciellt utformad ultraljud och i arterioler via optiska tekniker med hjälp av fluorescerande flöde hastighets spår26. En genomsnittlig skjuvning stress 11-13 dyn/cm2 nås i halspulsådern, i motsats till endast 4-5 dyn/cm2 i brachialis artär. Topp värden på upp till 25-70 dyn/cm2 har övervakats för halspulsådern. Skjuvspänningen värden för små och mellersta vener varierar mellan 0,1 och 0,5 dyn/cm2. I det mikroflödessystem system som beskrivs här beror det tillämpliga skjuvspännings värdet på den valda per fusions rördiametern, höjden på kanalbilden och viskositeten hos det fluidiska mediet som används. Den valda fluidic inställningen bestod av en bild med 0,4 cm i höjd (volym 100 μl) i kombination med en perfusion uppsättning av 50 cm i längd och 1,6 mm i diameter och medelviskositet var 0,0072 [dyn · s]/cm2. Denna inställning är lämplig för ett skjuvspänningsområde mellan 3,5 och 31,2 dyn/cm2 vid flödeshastigheter på 3,8 − 33,9 ml/min. Dessutom kan tryck pumpens programvarukontroll tillämpa ett pulserat medium flöde som kan efterlikna ett pulserat arteriellt blodflöde.
Den framgångsrika, pålitliga och reproducerbara användningen av denna kombinerade mikrofluidiska infektions metod kräver vissa försiktighetsåtgärder som måste hållas i åtanke. Under infektionsprocessen under mikrofluidiska förhållanden kan cell skiktet exponeras för cytotoxiska eller cytolytiska bakterie föreningar såsom pneumolysin, som påverkar eukaryota cellernas lönsamhet och försvagar cellens följsamhet till glid ytan. Därför, att hålla ett konstant flöde krävs under hela loppet av experimentet och integriteten av cellens morfologi måste övervakas ofta. Dessutom bör flödet odlingssubstrat ge alla viktiga näringsämnen till endotelcellerna för att säkerställa en stram yta fastsättning av cellerna under hela infektions försöket. Ändå, det måste noteras att medelstora kosttillskott innehåller ämnen som kan störa eller hämma samspelet mellan bakterierna och specifika värden proteiner. I studier av pneumococcus-VWF interaktion till exempel, heparin måste töms från cell odlingsmediet, eftersom det hämmar bindningen av pneumokocker till VWF8.
Ett annat kritiskt steg i flödes kulturen av endotelceller är upprätthållandet av snäva celler vidhäftning, som beror på den totala cell vitalitet och på nivån av differentiering. Skjuvning flödes beständig cell adhesion av primära endotelceller uppnåddes endast när celler var strikt hålls i subconfluency innan exponering för skjuvning stress. Å andra sidan, produktionen av WPB direkt beror på sammanväxningen av endotelceller skiktet främja snäva cell-cell-kontakter13. Fördelen med den mikrofluidiska cellkulturen i primära endotelceller täcker den starkt inducerade cellproliferation som snabbt leder till bildandet av ett konflytande cellskikt under flödesförhållanden. Cellerna är tätt knutna till varandra, är kollektivt orienterade i riktning mot flödet, och utgör en mycket differentierad fenotyp som krävs för att producera sekretoriska WPB. Dessa WPB fungera som lagring blåsor för VWF, vasodilatation aktivatorer, och cytokiner som exocytosed som protein skurar vid histamin stimulering eller pneumolysin aktivitet27,13. Därför är generationen av ett mycket lim, konflytande cellskikt av differentierade primära endotelceller i låg spridning passager en oumbärlig förutsättning för effektiv VWF release och bildandet av VWF strängar på cellytan och analyser av bakterier-VWF-interaktion i flödesförhållanden. Således måste det noteras att differentieringen av endotelcellerna tog 48 h av flödes odling på ett minimum och krävde ett konstant skjuvflöde utan några variationer i pumptrycket. Eventuella variationer kan leda till en plötslig medium blast, som skulle spola cellerna ur bilden. Dessutom, under mikroskopisk visualisering den mikroflödessystem Slide och medelstora reservoarer av pumpsystemet behövde hållas vid en temperatur av 37 ° c eftersom detta representerar temperaturen optimalt av de mänskliga cellerna.
Förevigade mänskliga cellinjer är lämpliga för många vetenskapliga experiment och är ofta anställda i cellkulturer infektions studier. Dessa cellinjer dela några generella tekniska fördelar, såsom låg eller måttlig kultur krav och obegränsad spridning, vilket möjliggör passaging flera hundra gånger utan betydande förändringar i morfologi eller receptor profiler. Men dessa cellinjer representerar en ensam monokultur och utsätts för konstgjorda tvådimensionella tillväxtförhållanden. 28 den saknade fysiologiska käll vävnaden miljö resulterar i betydande förändringar av funktionell och morfologisk cell fenotyp med varje passage av kulturen29. Före andra bakteriella vidhäftnings experiment fastställdes profilen för ytexponerade celltyp-specifika markör proteiner och receptorer för humana primära lungendotelceller vid olika cellkultur passager. Flödescytometrianalysen avslöjade ett starkt reducerat uttryck av specifika ytproteiner som trombocyt Aggregations molekylen 1 (PECAM1) inom åtta omgångar av cell passaging. Dessutom, den uttryckta integrin receptor profilen ändrades signifikant i högre cellpassager till förmån för en celltyp-unspecific integrin receptor mönster och en reducerad celltyp-specifika integrin receptor mönster (Bergmann et al., opublicerade data). Dessa resultat är särskilt relevanta för analyser av patogen-värdinteraktioner i infektionsbiologi studier. I syfte att upprätthålla fenotypiska Cellegenskaper och en hög grad av funktionell differentiering under den mikrofluidiska cellkulturen vid tidpunkten för bakteriell infektion valdes primära endotelceller från multipla donatorer i detta fall och användes endast upp till fem passager maximalt för att hålla de fenotypiska egenskaperna så specifika som möjligt8.
Den kombinerade visualiseringen av bakterier och specifika cellytstrukturer underflödet kräver ett optimerat fluorescensfärgningsprotokoll. Med hjälp av olika kombinationer av direkt märkta proteiner, fluorescens protein-uttryckande bakterier, och fluorescenskonjugerade antikroppar, kan immunofluorescensfärgning procedurer anpassas specifikt till visualiserings mål. Dessa förfaranden möjliggör en definierad och tydlig mikroskopisk visualisering och även en differentiering och kvantifiering av bakteriell följsamhet och internalisering3,13,30,31. Den immunofluorescensbaserade detektion av internaliserade bakterier kräver en cell depolarisering steg som en kort Triton X-100 inkubation, vilket kan leda till cell avlossning. Därför bör upptäckten av bakteriella internalisering processer som förekommer i en flödes kultur visualiseras efter flödesinkubering med hjälp av PFA-tvärbunden prover. För visualisering i realtid av bakterier i Flow möjliggör användningen av genetiskt modifierade bakterier som uttrycker fluorescensproteiner en snabb och riktad mikroskopisk detektion. RFP-uttrycker pneumokocker stammar som genererades med hjälp av en effektiv genetisk konstruktion designad av Kjos och veening16,8 användes i denna experimentella studie. För detektion av VWF strängar i Flow, olika VWF-specifika fluorescein-märkta antikroppar testades och kunde användas. För att få ett optimalt signal svar vid en minimerad ospecifik bakgrund titrerades den adekvata antikroppskoncentrationen genomgående för varje tillämpad antikropp.
För mikroskopisk levande cell avbildning tas fluidic-enheten och kanalbilden bort från CO2 -inkubatorn och placeras i en kammare som förvärms till 37 ° c i mikroskopet. Denna kammare kunde inte justeras till 5% CO2. Utan en karbonat-buffrad atmosfär, HUVEC morfologi och bakteriell Fitness förblev intakt för upp till 180 min, vilket är tillräckligt för analys av VWF-medierad bakteriell följsamhet. Om längre infektions tider och mikroskopisk övervakning utanför en CO2 -inkubator krävs, bör ett buffrat cellodlingsmedium användas för att kompensera för pH-skiftningar på grund av otillräcklig koncentration av co2 . Alternativt kan hela systemet placeras tillbaka i CO2 inkubator i mellan stegen i en tidsserie av mikroskopisk visualisering.
Förutom fluorescensdetekteringen i realtid kan bakterie infektionen i endotelet i kanal glaset stoppas och bevaras genom mellanutbyte med PARAFORMALDEHYD (PFA) som fixeringssubstans. Efter fixering i flödet, den optimerade och stegvis immunofluorescensfärgning av cellytan i kanalbilden möjliggör generering av värdefulla mikroskopiska ögonblicksbilder visualiseringar och ger en mångsidig kombinerad struktur detektering av specifika cellulära föreningar inblandade i samspelet mellan bakterier och värdceller. Den vetenskapliga nyttan av denna kombinerade metod är att den PFA-behandlade kanalbilden kan lagras och användas för en postflödesimmunofluorescensinfärgning av de olika strukturerna. PFA-behandlingen inaktiverar bakterierna och arresteras därmed uttrycket av RFP-protein. Därför, ett pneumococcus-specifikt antiserum genererades i kanin för bakteriell immun upptäckt och visualisering utfördes med hjälp av en kanin-specifik AlexaFluor568-konjugerad sekundär antikropp8. Som redan nämnts, användning av olika antikropps kombinationer kräver en exakt optimering av antikropp mängder och blockerande buffert sammansättning. I annat fall kan ospecifika bakgrunds signaler och kors detekterings effekter leda till artificiella infärgningsresultat. En optimerad immunofluorescensteknik kan lätt användas för detektion av många olika cellulära mål såsom aktin cytoskelettet eller endosomala markörer13,31.
Denna procedur kan anpassas för att skapa en mer komplex vävnads miljö som härmar fysiologi från en histologisk, fysiologisk och funktionell synvinkel. De presenterade infektions analyserna kan användas effektivt för att besvara flera vetenskapliga frågor samtidigt genom att använda en in-line-anslutning av flera kanaliserar glidbanor till en perfusion uppsättning. Denna utökade uppsättning skulle underlätta analyser av olika celltyper, cell sammanflöden och olika dia bilds beläggningar inom samma flödesinställning parallellt och möjliggöra en direkt jämförelse av bakteriella infektioner av olika celltyper. Dessutom ger seriell linje anslutning och kombinerade analyser av flera kanalbilder också möjlighet till tidsserie experiment, som kan användas för profilering av genuttryck (t. ex. analysen av infektions tidsberoende virulensfaktor genuttryck).
Infektionen analyser kan också utvidgas till en konstant laminärt flöde skick varar flera dagar eller veckor för att analysera cellulära svar i förhållanden imitera en långsiktig kronisk infektion fas. Förutom den presenterade Single-celltyp kulturen, några exempel på heterotypic cellkultur i mikroflödessystem cellkultur enheter har redan rapporterats32,33. Detta möjliggör hög genomströmning farmakologiska studier och kan i slutändan resultera i att använda mikroflödessystem cellkultursystem för regenerativa ändamål samt34.
Sammanfattnings, den mikroflödessystem systemet i kombination med immun färgning förfaranden fungerat som en värdefull modell för analys av patomekanismer mellan bakterier och värdceller i en miljö som simulerar förhållandena inom det vaskulära systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Projektet finansierades av DFG (BE 4570/4-1) till S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-syringe | Fisher Scientific | 10303002 | with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides |
| 2 mL Luer-syringe | Sarstedt | 9077136 | For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides |
| Accutase | eBioscience now thermo fisher | 00-4555-56 | protease mix used for gentle detachment of endothelial cells |
| AlexaFluor350-conjugated Phalloidin | Abcam | ab176751 | no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings) |
| AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody | Thermo Fisher Sientific | A11001 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence |
| AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence |
| Bacto Todd-Hewitt-Broth | Becton Dickinson GmbH | BD 249210 | complex bacterial culture medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-25G | solubilized, for preparation of blocking buffer |
| Cell culture flasks with filter | TPP | 90026 | subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface |
| Centrifuge Allegra X-12R | Beckman Coulter Life Sciences | 392304 | spinning down of bacteria (volumes of >2mL) |
| Centrifuge Allegra X-30 | Beckman Coulter Life Sciences | B06314 | spinning down of eukaryotic cells |
| Centrifuge Z 216 MK | Hermle | 305.00 V05 - Z 216 M | spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL) |
| Chloramphenicol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3886.2 | used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette |
| Clamp for perfusion tubing | ibidi | 10821 | for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system |
| CO2-Incubator | Fisher Scientific | MIDI 40 | incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2 |
| CO2-Incubator | Sanyo | MCO-18 AIC | for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C |
| Colombia blood agar plates | Becton Dickinson GmbH | PA-254005.06 | agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood |
| Computer | Dell | Latitude 3440 | Comuter with pressure pump software |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Leica | DMi8 | An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel) |
| Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 3904.1 | used for PBS buffer |
| Drying material | Merck | 101969 | orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor |
| ECGM supplement Mix | Promocell | C-39215 | supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone |
| ECGMS | Promocell | C-22010 | ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion |
| Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) | Promocell | C-22010 | culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix |
| Fetal Calf Serum (FCS) | biochrome now Merck | S 0415 | supplement for cell culture, used for infection analyses |
| FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody | Abcam | ab8822 | stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow |
| Fluidic Unit | ibidi | 10903 | fluidic unit for flow cultivation |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G-1890-100g | for precoating of microslide channel surface |
| Histamine dihydrochloride | Sigma Aldrich | H-7250-10MG | for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) | Promocell | C-12203 Lot-Nr. 396Z042 | primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen |
| Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) | Santa Cruz | sc73268 | stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation |
| Injection Port | ibidi | 10820 | for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation |
| Light microscope | Zeiss | Axiovert 35M | inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification |
| Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) | ibidi | 80176 | physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface. |
| Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) | Sigma Aldrich | M7506-500G | For preparation of ECGMS medium |
| Microfluidic Pump | ibidi | 10905 | air pressure pump |
| Neubauer cell counting chamber | Karl Hecht GmbH&Co KG | 40442002 | microscopic counting chamber for HUVECs |
| Paraformaldehyde 16% (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | for cross linking of samples |
| Perfusion Set | ibidi | 10964 | Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4 | ||
| Plastic cuvettes | Sarstedt | 67,741 | (2 x optic) for OD measurement at 600 nm |
| Pneumococcus-specific antiserum | Pineda | raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column. | |
| Polystyrene or Styrofoam plate | this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2. | ||
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | 6781.1 | used for PBS buffer |
| Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) | ibidi | v1.5.4 | Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow |
| Reaction tubes 1.5/2.0 mL | Sarstedt | 72.706/ 72.695.500 | required for antibody dilutions |
| Reaction tubes with 50 mL volume | Sarstedt | 6,25,48,004 | |
| RFP-expressing pneumococci | National Collection of Type Cultures, Public Health England | 10,319 | Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome |
| Serological pipets 5, 10 mL | Sarstedt | 86.1253.025/ 86.1254.025 | for pipeting larger volumes |
| Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) | Sigma Aldrich | 451614-25G | for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | P030.2 | used for PBS buffer |
| Spectral Photometer Libra S22 | Biochrom | 80-2115-20 | measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | for preparation of blocking buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284-500ML | Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation |
| Yeast extract | oxoid | LP0021 | bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY |
References
- Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
- Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
- Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
- Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
- Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
- Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
- Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
- Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
- Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
- Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
- Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
- Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
- Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
- Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
- Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
- Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
- Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
- Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
- Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
- Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
- Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
- Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
- Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
- Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
- Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
- Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
- Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
- Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
- Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).
