Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Published: October 31, 2019 doi: 10.3791/60323
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,4, 1
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Summary

Bu çalışmada, tanımlanmış akış koşullarında kesme stresi altında farklılaştırılmış insan primer endotel hücrelerinin yüzeyinde üretilen pnömokok komponent dizelerine bağlıpnozyağının mikroskobik takibi açıklanmaktadır. Bu protokol, diferansiyel immünboyama prosedürleri uygulanarak belirli hücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesi ve bakterilerin sayısallaştırılması için genişletilebilir.

Abstract

Streptococcus pneumoniae'nin endotel hücrelerinin yüzeyi ile etkileşimi Von Willebrand Factor (VWF) gibi mekanosiz proteinler aracılığıyla kan akışında aracılık edilir. Bu glikoprotein, kesme stresine yanıt olarak moleküler konformasyonunu değiştirir ve böylece geniş bir konak-ligand etkileşimi spektrumu için bağlayıcı bölgeleri açığa çıkarır. Genel olarak, tanımlanmış bir kesme akışı altında primer endotel hücrelerinin kültürlenme belirli hücresel farklılaşma ve bir kan damarının iç astar fizyolojisi andıran istikrarlı ve sıkıca bağlı endotel tabakasıoluşumunu teşvik bilinmektedir . Bu nedenle, bakteriyel patojenler ve mekanosensit proteinleri içeren konak vaskülatür arasındaki etkileşimlerin fonksiyonel analizi, yüzeyini etkilediği bilinen fizyolojik akış kuvvetlerini simüle eden pompa sistemlerinin kurulmasını gerektirir. vasküler hücreler.

Bu çalışmada kullanılan mikroakışkan cihaz, tanımlanmış akış hızına sahip sıvıların sürekli ve darbesiz dolaşımını sağlar. Bilgisayar kontrollü hava basıncı pompa sistemi sürekli, tek yönlü ve kontrollü bir ortam akışı oluşturarak endotel hücre yüzeylerine tanımlanmış bir kesme gerilimi uygular. Hücrelerin morfolojik değişimleri ve bakteriyel eki mikroskobik olarak izlenebilir ve mikroskobik görüntüleme için tasarlanmış özel kanal slaytları kullanılarak akışta ölçülebilir. Genel olarak bağışıklık etiketleme ve mikroskobik analizlerden önce örnek fiksasyon gerektiren statik hücre kültürü enfeksiyonunun aksine, mikroakışkan slaytlar hem proteinlerin, bakterilerin hem de hücresel bileşenlerin floresan tabanlı saptanmasını sağlar. örnek fiksasyondan sonra; seri immünofloresan boyama; ve gerçek zamanlı olarak doğrudan floresan tabanlı algılama. Floresan bakteriler ve spesifik floresan etiketli antikorlar ile birlikte, bu enfeksiyon prosedürü vasküler süreçler ile ilgili bilimsel uygulamaların büyük bir spektrum için verimli bir çoklu bileşenli görselleştirme sistemi sağlar.

Introduction

Pnömokok enfeksiyonlarının patogenezi, plazminojen ve VWF1gibi ekstrasellüler matriks bileşikleri ve insan hemostaz bileşenlerinin çeşitliliği ile çok yönlü bir etkileşim ile karakterizedir,2, 3,4,5,6,7,8. Multidomain glikoprotein VWF vasküler trombüs oluşumu yerinde trombosit işe ve fibrin incorporation aracılık ederek dengeli bir hemostaz anahtar düzenleyici olarak hizmet vermektedir9. Kanama kontrolü ve yara iyileşmesi için fonksiyonel, aktif VWF'nin önemi von Willebrand hastalığı ile gösterilmiştir, yaygın bir kalıtsal kanama bozukluğu10.

Globüler VWF kadar bir konsantrasyonda insan kan sisteminde dolaşır 14.0 μg/mL11,10. Vasküler yaralanmaya yanıt olarak, endotel Weibel Palade Organları (WBP) tarafından VWF lokal sürümü belirgin artmıştır11,12. Önceki çalışmalar, pnömokok insan endotel hücrelerine bağlılık ve gözenek oluşturan toksin pnömolysin üretimi önemli ölçüde luminal VWF salgılanmasını uyarır göstermektedir13. Kan akışının hidrodinamik kuvvetleri mechanoresponsive VWF etki alanlarının yapısal bir açılış neden. 10 dyn/cm2 akış hızlarında VWF, subendothelium10,12'yebağlı kalan birkaç yüz mikrometreye kadar uzun protein dizelerine multimerize eder.

Pnömokokların endotel yüzeyi ile etkileşiminde kesme stresi altında oluşturulan çok merize VWF dizelerin işlevini anlamak için mikroakışkan tabanlı hücre kültürü enfeksiyonu yaklaşımı oluşturulmuştur. Yazılım kontrollü hava basıncı pompa sistemine sahip mikroakışkan bir cihaz kullanıldı. Bu, hücre kültürü ortamının tanımlı akış hızına sahip sürekli, tek yönlü bir sirkülasyonunu sağladı. Bu nedenle, sistem endotel hücrelerinin yüzeyinde tanımlanmış bir kesme stresi uyguladı, hangi özel kanal slaytlar içinde bağlı kaldı. Bu yaklaşım, VWF dizelerinin tanımlanmış sabit akış koşullarında farklılaştırılmış endotel hücrelerinde üretildiği insan vasküler sisteminin kan dolaşımı içindeki kesme kuvvetinin simülasyonuna olanak sağladı. Bu amaçla, endotel hücreleri akış sırasında mikroskobik analizler için uyarlanmış belirli kanal slaytlarında (bkz. Malzemeler Tablosu)yetiştirilmiştir. Mikroakışkan pompa sistemi, yoğun endotel hücre tabakasıüzerinde genişletilmiş VWF dizeleri oluşumu için gerekli olan yüksek tanımlı ve kontrollü kesme gerilimi durumunu sağlamıştır. Konfluently yetiştirilen insan göbek ven endotel hücrelerinin VWF-salgılanması uyarılmasından sonra (HUVEC) histamin takviyesi tarafından, dize oluşumu bir kesme stresi uygulanarak indüklendi () 10 dyn / cm2. Kesme gerilimi hücre tabakasıüzerinde hareket eden kuvvet olarak tanımlanır. Yaklaşık cornish et göre hesaplanır. 1. denklem 1 ile al.14:
Equation 1

Dyn/cm2'dekikesme gerilimi , η = viskozite (dyn)/cm2, h =kanal yüksekliğinin yarısı, w = kanal genişliğinin yarısı ve Φ = mL/dk'da akış hızı.

Denklem 1'in sonucu, kullanılan farklı slaytların farklı yükseklik ve genişliklerine bağlıdır (bkz. Malzemeler Tablosu). Bu çalışmada 0.4 μm'lik bir Luer kanal slaytı kullanılmıştır ve bu slayt 131.6'dır (bkz. formül 2).
Equation 2

37 °C'de ortamın viskozitesi 0.0072 dyn/cm² olup, 10 dyn/cm² kesme gerilimi kullanılmıştır. Bu da 10,5 mL/dk akış hızıile sonuçlandı (bkz. formül 3).
Equation 3

Burada, konak vaskülatürde bakteriyel enfeksiyon mekanizmalarının araştırılması ve görüntülenmesi için tek yönlü laminar akış sistemi kullanılarak mikroakışkan hücre culturing prosedürünün uyarlanma ve ilerlemesi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Endotel tabakalarında VWF dizeleri üretimi de sürekli ve sürekli kesme stresi uygulamak mümkün diğer pompa sistemleri kullanılarak uyarılabilir15.

VWF dize oluşumunun akışı ve uyarılmasında biraraya gelmek için birincil endotel hücrelerinin ekiminden sonra, kırmızı floresan proteini (RFP)16'yı sürekli mikroskobik kontrol altında endotel hücre tabakasına eklenmiştir. Endotel hücrelerinin yüzeyindeVWF dizeleri bakteri eki mikroskobik görselleştirilmiş ve VWF özgü floresan etiketli antikorlar kullanılarak gerçek zamanlı olarak üç saate kadar izlendi. Bu yaklaşımla VWF'nin vasküler endotel'e bakteriyel bağlanmasını teşvik eden bir yapışma kofaktör olarak rolü8olarak belirlenmiştir.

Protein salgısı nın mikroskobik görselizasyonu na ve konformasyonel değişikliklere ek olarak, bu yöntem bakteriyel enfeksiyon süreçlerinin tek adımlarını gerçek zamanlı olarak izlemek ve farklı zaman noktalarındaki bağlı bakteri miktarını ölçmek için kullanılabilir. Enfeksiyon. Özel yazılım kontrollü pompa sistemi de birkaç gün için tanımlanmış sabit akış koşullarında endotel hücreleri kültür imkanı sağlar ve tanımlanmış darbeli orta akış kuluçka sağlar. Ayrıca, bu yöntem farklı hücre türleri kullanılarak uygulanabilir. Boyama protokolünün uyarlanması aynı zamanda ökaryotik hücrelere dahil edilen bakterilerin algılanmasını ve görüntülenmesini sağlar.

Bu makale, patofizyolojik süreçlerin verimli ve çok yönlü bir karakterizasyonu için tanımlanmış, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak kullanılabilecek bu gelişmiş deneysel protokolü açıklamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mikroakışkan hücre ekimi ticari birincil insan göbek ven endotel hücreleri (HUVEC) ile yapıldı. Şirket, donörün bilgilendirilmiş onayı ile hücreleri izole etti. Bu çalışma, Federal Eyalet Baden-Wuerttemberg Doktorlar Odası Etik Komitesi tarafından referans numarası 219-04 ile onaylanmıştır.

NOT: Protokol malzemeleri için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Primer Endotel Hücrelerinin Preresitresi

  1. 37 °C'de üç farklı donörden 1 x 105 primer HUVEC içeren dondurulmuş gliserol şişesini 37 °C'de eritin ve hücreleri önceden ısıtılmış endotel hücre büyüme ortamının 7 mL'lik (ECGM, takviyelerle kullanıma hazır) 25 cm2 hücreli bir şişede tohumlayın.
    NOT: Primer endotel hücreleri 5'ten fazla proliferasyon döngüsünden sonra ayırımkapasitelerini kaybederler. Bu nedenle, hücre farklılaşmasının yüksek derecelerde olması gerektiğinde sadece 5 pasajdan az olan hücreler kullanılabilir.
  2. 37 °C'de hücreleri %5 CO2 atmosferde 60 dk boyunca geliştirin ve eGM hücre kültür ortamının kriyokorumadan kalıntılardan kurtulması için değiştirin.
  3. Hücreleri %5 CO2 atmosferinde 37 °C'de bir alt hücre tabakası oluşturana kadar karıştırmaya devam edin.
    NOT: HUVEC, sıkı hücre-hücre kontatları daha sonra akışta kararlı bir hücre tabakasının oluşumunu önlediği için bir konfluent tabakaya büyümemelidir.

2. Streptococcus pneumoniae precultivation

DİkKAT: Streptococcus pneumoniae bir biyogüvenlik düzeyi 2 ajandır ve sadece biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuarlarında kültürlenebilir. Tüm bakteriyel tedaviler için güvenlik seviyesi 2 için sınıflandırılmış temiz bir tezgah kullanın, kesinlikle aerosol oluşumunu önlemek, ve bakterilerin sedimantasyon için aerosol korumalı bir santrifüj kullanın.

  1. Streptococcus pneumoniae klinik izole ATCC11733 sürekli -80 °C'de depolanan bir gliserol stok elde ile bir Columbia kan agar plaka aşılamak ve 37 °C ve% 5 CO2gecede agar plaka yetiştirmek .
  2. Hazırlamak 40 Todd Hewitt sıvı suyu% 1 maya ekstresi ile takviye (THY) ve steril fosfat tamponlu salin 15 mL (PBS) pH 7.4, bakteri yetiştiriciliği ve yıkama adımları için.
  3. Bakteriyel ekimi için steril bir tüp kullanın ve bakteri kitlesi ile sıvı kültür suyu aşılamak. Referans olarak aşısız sıvı suyu karşı 600 nm'de 1 mL aliquots fotometrik ölçüm ile aşılama miktarını kontrol edin. 0,15 600 nm (OD600)optik yoğunluğa ulaşana kadar sıvı suyu içine bakteri kütlesi doldurun.
  4. Aşılanmış sıvı suyu 37 °C ve %5 CO2'de sallamadan kuluçkaya yatırın ve plastik cuvettes kullanarak 1 mL aliquots ölçerek her 30 dakikada bir OD600'ü belirleyin.
  5. Bakteri kültürü, üstel büyüme aşamasına karşılık gelen 0,4'ün OD600'üne ulaşır ulaşmaz, oda sıcaklığında (RT) 10 dk'da bakteri kültürünün süspansiyonuna 10 dakika süreyle santrifüj edin.
    NOT: Yüksek pnömokok kültür yoğunluğu genel bakteriyel fitness etkileyebilir bakteriyel otoliz tetiklediği bilinmektedir, çünkü bir pnömokok kültürü, 1.0'dan fazla bir OD600 ulaşmak için izin vermeyin.
  6. Bakteriyel tortuyu 10 mL PBS ile hafifçe yeniden askıya alın ve 10 dk 10 dk'da RT'de 1.000 x g.'ya geri alın.
  7. Yıkanmış bakteriyel tortuyu 1 mL PBS'de hafifçe askıya alın ve referans olarak 1 mL PBS kullanarak bakteriyel süspansiyonun 10 μL'lik OD600'ü belirleyin.
  8. PBS'deki bakteri miktarını 2.0'lık Bir OD600'e ayarlayın. Önceden belirlenen bakteriyel sayıma göre, 2.0'lık bir OD600 2 x 109 koloni şekillendirme birimine (CFU) karşılık gelmektedir. Bakteriyel otolizi önlemek için hemen enfeksiyon prosedürüne devam edin.

3. Mikroakışkan Koşullarda HUVEC Endotel Hücre Ekimi

  1. Hücre kültürü şişesinden birincil endotel hücrelerini kontrollü proteolysis ile ayırın. Temiz bir tezgah kullanarak steril bir ortamda aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Yıkama adımları için 15 mL steril PBS hacmi hazırlayın.
    1. EkGM'yi alt tabakadan çıkarılan HUVEC tabakasından çıkarın ve hücre kültürü ortamından kurtulmak için serolojik pipet kullanarak hücre tabakasını 10 mL PBS ile yıkayın.
    2. Yıkanmış HUVEC'i 37 °C önceden ısıtılmış hücre ayrıştırma çözeltisi ile 37 °C'de 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Her dakika mikroskobik izleyerek proteolitik hücre ayrışma gözlemleyin.
    3. Pipet, proteozisi durdurmak ve rt'de 220 x g'de hücreleri 3 dakika boyunca tortul etmek için %2 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenerek 7 mL ECGM içeren bir tüpe ayrılmış hücre süspansiyonu.
    4. %5 FCS ve 1 mM MgSO4ile desteklenen 250 μL ECGM'de süpernatantı çıkarın ve HUVEC'i yeniden askıya alın. Neubauer hücre sayma odası nı kullanarak hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 10 μL'sini kullanın ve hücre sayısını %5 FCS ve 1 mM MgSO4ile desteklenen 4 x 106 hücre/mL ECGM olarak ayarlayın.
      NOT: Her akış deneyi için %5 FCS ve 1 mM MgSO4 ile desteklenen 30 mL ECGM ortamı gerekecektir. Buradan bu orta kompozisyon ECGMS-medium olarak adlandırılır. Kültür ortamındaki FCS konsantrasyonunun %2'den %5'e yükselmesi, kanal slaytında bulunan HUVEC'nin hücre eki ve hücre canlılığını destekler. Orta takviyeleri FCS ve MgSO4 önemli ölçüde kesme stres koşulları altında HUVEC hücre eki stabilize.
  2. Tohum ve bir kanal slayt HUVEC yetiştirmek. Temiz bir bank kullanarak steril bir ortamda çalışın. Hücreler 2 gün boyunca kesme stresi altında yetiştirilecek ve ardından bakterilerle enfeksiyon ve 2 saat boyunca mikroskobik izleme yapılacaktır.
    1. Hava kabarcıklarının sayısını azaltmak için 37 °C'de %5 CO2 atmosferine sahip bir kuvözde 24 saat boyunca, bir kanal slaytını, 1,6 mm çapında ve 50 cm uzunluğunda bir perfüzyon seti, ECGMS-orta sının bir aliquot'u ve 0,4 m yüksekliğinde luer kanal lı kaydırağı dengeleyin.
      NOT: Bu prosedür plastik ekipman gaz dan arındırmak ve orta, perfüzyon tüpleri ve rezervuarlar önceden ısınmak için tavsiye edilir. Rt'de veya buzdolabında malzeme veya sıvı depolanmışsa, deney sırasında kuvözde ısıtıldığında plastik ve sıvılarda çözünmüş gazlar serbest bırakılır. Gaz kabarcıkları daha sonra görünür. Deneyden önce tüm plastik bileşenlerin gazdan arındırılanması bu etkiyi ortadan kaldıracaktır. Sistem her kuvözden çıkarıldığında gaz emme işlemi yeniden başlar. Bu nedenle, RT'de hızlı çalışın ve akışkan üniteyi asla daha uzun süre kuvöz dışında bırakmayın.
    2. PBS çözeltisinde %2 steril filtrelenmiş domuz jelatin çözeltisinin 100 μL'sini sıcaklık dengesi olan kanal kaydırağının rezervuarlarından birine enjekte etmek için bir pipet kullanın. Jelatin çözeltisini 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve 1 mL Luer şırınga kullanarak steril koşullar altında 1 mL PBS ile slayt kanalını durulayın.
    3. Jelatin kaplı kanal kaydırağini ince bir polistiren veya strafor plakaüzerine yerleştirin ve slayt sıcaklığında bir düşüş önleyin. Slayta 1 mL Luer şırınga ile 4 x 106/mL HUVEC süspansiyonunun 100 μL'sini ekleyin.
      NOT: Kanal kaydırağının temiz tezgahın soğuk metal yüzeyine yerleştirilmesi, slayt alt ısısını düşürerek endotel hücrelerine soğuk stres yaratabilir. Hücre pipetleme sırasında hava kabarcıkları yükselişi ve slayt içinden kaybolmasına izin slayt biraz yukarı tutun.
    4. 37 °C ve %5 CO2'de 60 dk HUVEC ile kanal slaytını kuluçkaya yatırın ve kanalın her iki ucundaki orta rezervuarları 60 μL ECGMS-orta ile doldurun. 37 °C'de 1 saat ve %5 CO2'dekuluçka .
  3. Mikroakışkan pompayı ve yazılım ayarlarını ayarlayın.
    1. Dengedeki perfüzyon setini pompa ünitesine bağlayın, 13,6 mL ECGMS-medium ile doldurun ve pompa kontrol yazılımını çalıştırın. Akışkan birim kurulumu menüsündeki kaydırma pencereleri kullanarak yeterli perfüzyon kümesini ve oda slayt türünü seçin. Orta viskozite için yazılımda 0,007 (dyns/cm2)seçin. (Ek Şekil 1'dekikırmızı oklarla işaretlenmiş basınç pompası yazılım ayarlarına bakın).
    2. Kuvöz dışında, kurutma silika boncukları ile dolu bir cam şişeyi hava basıncı tüpüne bağlayın (Şekil 1, Inset 3'ebakın). Basınç pompası hava perfüzyon rezervuarları ve pompa arasında dolaşır ve pompa cihazı yeniden girmeden önce kuru olmalıdır. Yazılım menüsünde Akış Parametreleri'ni seçin, basıncı 40 mbar'a ayarlayın ve pompa tüplerini sürekli orta akışı başlatarak sıvı ortamla yıkayın. (Bu ayarlar ek şekil 1'dekırmızı oklarla da gösterilir).
    3. Akış ekiminin istenilen kesme gerilim döngülerini programla. 5 dyn/cm2ile başlayın, dengeli rezervuar pompalarını kontrol edin ve pompa sisteminde hava kabarcıklarının dolaşmayacağından emin olun.
      NOT: Bir kanal kaydırağındaki duvar kesme gerilimi akış hızına ve perfüzyon ortamının viskozitelerine bağlıdır. Başka bir pompa sistemi kullanıyorsanız, lütfen istenilen kesme gerilim ibarat düzeyini üreten bir akış hızı ayarlamak için girişte açıklanan denklemlere bakın. Açıklanan ayarlar 5,42 mL/dk akış hızına karşılık gelir (Basınç pompası yazılımındaki yeterli akış parametre ayarlarını gösteren örnek bir ekran görüntüsü Ek Şekil 2'degösterilmiştir).
    4. Pompa kontrol yazılımındaki akış sirkülasyonunu durdurun ve Luer bağlantılarının yakınındaki tüpleri sıkıştırarak perfüzyon borusundaki orta akışı tutun. Kanal slaytını bağlayın, bu nedenle hava kabarcıklarından kaçının ve akışkan üniteyi bağlı kanal kaydırağıyla 37 °C ve %5 CO2'deco2 kuluçka makinesine yerleştirin. Kesme gerilimini 30 dk için 5 dyn/cm2'de başlatarak, kesme gerilimini hızlandırmadan önce hücreleri kesme geriliminin oluşturduğu kuvvetlere sorunsuz bir şekilde uyarlayınız (Bkz. Ek Şekil 3).
      NOT: Akıştaki hava kabarcıklarının hareketi hücre kopmasına yol açabileceğinden, tüp sisteminde veya kaydırakta hiçbir hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin.
    5. Kesme gerilimini 10 dyn/cm2'ye (bu akış ayarında 10,86 mL/dk'ya karşılık gelir) hızlandırın ve hücre farklılaşmasına izinvermek için 37 °C'de küçük bir CO2 kuluçka makinesinde 48 saat boyunca kanal kaydıraği sürekli kesme geriliminde kuluçkaya yatırın ( ilgili yazılım settinngs Ek Şekil 4kırmızı oklar ile gösterilir.
      NOT: HUVEC hücreleri, akış ekimine doğrudan 10 dyn/cm2'debaşlanırsa kanal yüzeyinden kopma eğilimindedir. Akış ekimi en az 30 dk için 5 dyn/cm2 kullanılarak daha az kesme gerilimi ile başlatılırsa hücreler oda yüzeyine bağlı kalır ve ardından makas gerilimini istenilen 10 dyn/cm2'yekadar yavaşça artırmaktadır. 10 dyn/cm2'lik kesme gerilimi, VWF dize oluşumu için gerekli olan bu perfüzyon ayarındaki minimum değerdir.
    6. Mikroakışkan hücre ekimi 24 saat sonra, tam olarak dengeli bir orta seviyeye her iki orta rezervuarlarda ulaşıldığında pompa kontrol yazılımı ile orta akışı durdurmak. Akışkan üniteyi temiz bir tezgaha yerleştirin ve perfüzyon rezervuarlarının 10 mL'lik sirkülasyon ortamını 10 mL serolojik pipet kullanarak çıkarın. Ortamı yenilemek için rezervuarlara 10 mL ECGMS-medium ekleyin, akışkan üniteyi 37 °C ve %5 CO2'deCO2 kuluçka makinesine geri yerleştirin ve pompa kontrol yazılımını kullanarak akışkan ekimini yeniden başlatın.
      NOT: Basınç pompası nın işlevi aniden güçlü bir manyetik alan bozukluğu oluşturabilirsiniz büyük santrifüjler gibi laboratuvar makineleri tarafından bozulabilir. Bu ani bozulma hücre kopmasına yol açabilir. Bu tür makinelerin deney sırasında basınç pompasıyakınında aktif olmayana dikkat edin.
    7. Mikroskobik görüntülemeden 24 saat önce sıcaklık dengesi için floresan mikroskobun evresini kapsayan sıcaklık kuluçka odasının 37 °C'ye önceden ısınmasına başlayın. Mikroskop önceden ısındıktan sonra, mikroskop yazılım kontrolünü başlatın ve uygun filtre ayarlarını seçerek floresan mikroskobik izleme için temel ayarları ayarlayın (RFP ifade eden bakterilerin tespiti için 540 nm/590 nm ve FITC konjuge VWF spesifik antikorların floresan emisyonunun saptanması için 470 nm/515 nm). 37 °C'de akışkan ünitenin kuluçkaya yatması için ek bir ısıtma odasını önceden ısıtın.
      NOT: Enfeksiyon analizleri ve mikroskobik izleme sırasında kanal slayt ve sirkülasyon ortamı sıcaklığı önemli ölçüde azalmamalıdır, bu hücreler üzerinde soğuk stres üretecek çünkü. Genel olarak, mikroskop aşamasını kaplayan sıcaklık odalarının büyüklüğü tüm akışkan üniteyi kapsayacak kadar yeterli değildir. Bu nedenle, 37 °C'ye önceden ısıtılmış ek bir ısıtma odası kullanılması tavsiye edilir.
    8. Mikroskobik görüntüleme için, akışkan üniteyi 37 °C önceden ısıtılmış ısıtma odasına yerleştirin ve kanal kaydırasını 37 °C önceden ısıtılmış mikroskobun bir sahnesine yerleştirin.
      NOT: Mikroskobik görüntüleme için, perfüzyon borusu sınırlı uzunluğu nedeniyle co2 inkübatörden akışkan birim ve kanal slaytının çıkarılması gerekiyordu. PH tamponlama için %5 CO2 atmosferinin dışında enfeksiyon süreleri ve 180 dk'dan uzun mikroskobik izleme gerekiyorsa, mikroakışkan ekimi için pH tamponlu bir ortam kullanılmalıdır.
    9. Akış deneyi boyunca akış dolaşımına histamin ve bakterilerin enjeksiyonundan önce ve mikroskobun parlak alan modunu kullanarak akış deneyini tamamladıktan sonra hücre morfolojisini ve HUVEC tabakasının bütünlüğünü kontrol edin.

4. VWF-release indüksiyon ve Multimerized VWF Dizeleri Görselleştirme

  1. VWF'nin 200 MDa'ya kadar uzun dizelere çoklu merizasyonunu tetiklemek için 10 dyn/cm2'lik bir kesme gerilimi gerektiğinden, akış ayarını koruyun. VwF'nin endotel WPB'den salgılanmasına neden olarak 100 mM histamin stok çözeltisinin 136 mL'lik kısmını bir enjeksiyon portu kullanarak perfüzyon tüpünde dolaşan ECGMS-orta koğur içine enjekte edin. Akış ortamındaki histaminin son konsantrasyonu 1 mM olacaktır. Enjeksiyon portu yoksa, histamin pompa rezervuarlarının orta içine pipetleme ile alternatif olarak eklenebilir.
  2. Multimerized VWF dizelerin immünoresans tespiti için, rezervuarlarda dengeli bir orta seviyeye ulaşıldığında akışı durdurun ve 200 μL PBS (pH 7,4) hacminde 20 μg VWF'ye özgü FITC konjuge antikor enjekte edin. EcGMS-orta bir enjeksiyon portu kullanarak. Enjeksiyon portu yoksa, antikor pompa rezervuarlarının orta içine pipetleme ile alternatif olarak eklenebilir. Bu da 1.3 g/mL'lik son antikor konsantrasyonu ile sonuçlanır.
  3. Kısa sürede çeşitli görüş alanlarının mikroskobik taraması için, mikroskobun floresan ünitesini %30 güçte bir Ksenon floresan cihazı ve epifloresan kamera ile kullanın. VWF dizeleri görselleştirme için uygun temsil hücreleri seçmek için parlak alan modu ile HUVEC tabakasının şekil ve morfolojisini izleyin.
  4. Yeşil floresan VWF dizelerin görselleştirilmesi için mikroskop yazılımının (LasX) floresan ünitesi menüsünde 63x/1.40 yağ hedefi ve 470 nm algılama filtresi seçin. Her biri yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren en az 50 temsili alan görünümünden oluşan Z yığınlarının anlık görüntülerini oluşturun. Yeşil floresan VWF dizelerin farklı zaman noktalarında ölçülmesi için, çeşitli görüş alanlarını tarayabilirsiniz.

5. Gerçek Zamanlı AkışVWF-dizeleri Bakteriyel Eki Mikroskobik Değerlendirilmesi

  1. Immünororesans tespiti yoluyla HUVEC hücre yüzeylerinde üretilen VWF-string'lere pnökokok eki ölçün.
    1. Akışı tutun ve enjeksiyon portu kullanarak ECGMS-orta içine 1 mL maksimum hacimde 1.35 x 108 CFU/mL RFP ifade pnömokok enjekte. Alternatif olarak, pipet pompa rezervuar orta içine bakteri. 10 dyn/cm2'de kesme gerilimini yeniden başlatın ve bakterilerin pompa sistemi içinde dolaşmasını sağlar.
    2. Mikroskop büyütme için 63 x yağ daldırma hedefi seçin ve mikroskop yazılımındaki floresan filtre ayarlarını RFP-expressing pnömokokların tespiti için RFP kanalına (540 nm algılama filtresi) ayarlayın.
    3. VWF dizeleri bakteriyel eki nicelik için, akışı durdurmak ve en az 30 temsili alan görünümleri Z-yığınları anlık oluşturmak, her yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren, ve pnömokok miktarını saymak.
    4. Verileri değerlendirmek için ANOVA tek faktörlü istatistik algoritmasını kullanın ve ardından ayrıntılı istatistiksel karşılaştırma için iki kuyruklu olmayan örneklem testi nin ardından. <0.05 p değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

6. Örnek Fiksasyon Sonrası VWF-string'lere Bakteriyel Bağlanmanın Mikroskobik Değerlendirilmesi

  1. İmmünofluoresans boyama dan önce fiksasyon örneği.
    1. Akışı durdurun, pompa haznelerinden 10 mL ECGMS-orta yıkın ve %5 paraformaldehit (PFA) ile birlikte 10 mL PBS ekleyin. PFA çözeltisi 10 dyn/cm2'likbir kesme geriliminde 10 dakika boyunca dolaşsın.
    2. Kanal kaydıranını pompa ünitesinden çıkarın.
  2. Hücre yüzeyinde ki spesifik olmayan bağlanma alanlarını engelleyin ve VWF dizeleri ve bağlı bakterilerin immünositasyon gerçekleştirmek.
    1. Tüm yıkama adımları için %4 sakaroz ile takviye edilmiş 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) içeren 4 mL yıkama çözeltisi hazırlayın. Spesifik olmayan bağlama bölgelerinin engellenmesi için %4 sakaroz ve %2 büyükbaş hayvan serum albumini (BSA) ile takviye edilmiş 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) içeren bir bloklama çözeltisinin 1 mL'sini hazırlayın.
    2. 200 μL yıkama çözeltisine 200 μL enjekte etmek ve 200 μL engelleme çözeltisi ile 120 dakika boyunca rt'de kaydırağı kuluçkaya yatırmak için 1 mL Luer şırınganı kullanarak PFA inküböz kanal slayt3x yıkayın.
    3. Antikorların seyreltilmesi için %4 sakaroz ve %0,5 BSA ile takviye edilmiş 100 mM Na2CO3(pH 9.2) içeren başka bir bloklama çözeltisinin 4 mL'sini hazırlayın. Pnömokok spesifik tavşan antiserum1:100 seyreltmek için bu engelleme çözeltisinin 200 μL kullanın. VWF'ye özgü fare antikor1:50'yi seyreltmek için bu engelleme çözeltisinin 200 μL'sini kullanarak VWF'ye özgü 4 μg/mL antikor konsantrasyonu kullanın. 20g/mL'lik son konsantrasyonu oluşturmak için 2 mg/mL'lik bir stok çözeltisinden 2 mg/mL'lik pBS (pH 7.4) 1:100'den AlexaFluor488 konjuge sekonder antikor seyreltin.
      NOT: Açıklanan immünorfloresan ayarlarında, antikorlar yukarıda bahsedilen alkali karbonat tamponunda seyreltildiğinde antikor tespiti en iyi sonuçları vermiştir. Önceki sonuçlara göre, önerilen engelleme çözümleri ve antikor miktarı birçok uygulama için uygundur. Ancak, farklı deneyler antikor kombinasyonu, antikor konsantrasyonu, kuluçka süresi ve engelleme tampon anayasa bireysel optimizasyonu gerektirebilir. Alternatif olarak, nötr pH aralığına sahip fosfat tamponlu bir sistem uygun olabilir ve hatta kuluçka tamponu olarak tercih edilebilir. Zayıf floresan sinyalleri durumunda sekonder antikor konsantrasyonu artırılmalıdır. Çok fazla spesifik olmayan floresan arka plan gürültüsü tespit edilirse, bloke edici maddelerin miktarı artırılmalıdır.
    4. VWF-immünoreskans boyama için kanal slaytını 1 mL Luer şırıngonu kullanarak yıkama kakması 3x'lik 200 μL'lik yıkama solüsyonu enjekte ederek ve 30 dakika boyunca seyreltilmiş VWF spesifik antikorla kaydırağı inkübün. μL yıkama çözeltisi ve RT 30 dakika için 1:100 seyreltilmiş AlexaFluor488-konjuge fare özgü antikor ile slayt inkübün. Son olarak, kanal kaydırasını yıkama çözeltisinin 200 μL'si ile 3x tekrar yıkayın.
      NOT: AlexaFluor-floroforlar beyazlatmaya duyarlıdır. Bu nedenle, slayt florofor konjuge antikorlar ile kuluçka adımları sırasında karanlık bir odada tutularak korunmalıdır.
    5. Pnömokokların immünosital tespiti için, rt.'de 30 dakika boyunca 1:100 seyreltilmiş pnömokok özgü tavşan antikoru ile slaytı kuluçkaya yatırın, daha sonra kanal slaytını yıkama çözeltisinin 200 μL'si ile yıkayın ve 1:100 seyreltilmiş slaytı kuluçkaya yatırın AlexaFluor568-konjuge tavşan özgü antikor 30 dk RT. Yıkama çözeltisi 200 μL ile tekrar 3x kanal slayt yıkayın.
    6. Hücresel aktin sitoiskeletini floresan phalloidin ile lekelemek için HUVEC'yi 120 μL 0,1 Triton X-100 ile inkübasyon la permeabilize edin. AlexaFluor350 konjuge phalloidin. Bu kuluçka adımı polimerize aktin sitoiskeletini görselleştirecek ve hücre şeklinin ve olası strese bağlı morfolojik değişikliklerin izlenmesine olanak sağlayacaktır.
    7. Kanal kaydırasını 3x yıkama çözeltisinin 200 μL'si ile yıkayın. Son olarak, 200 μL ddH2O ile slayt 4x yıkayın ve floresan mikroskop uygun filtre ayarlarını kullanarak yeşil floresan VWF dizeleri, kırmızı floresan bakteri ve mavi floresan aktisin sitoskeleton görselleştirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sürekli tek yönlü akış ta birincil HUVEC Culturing mechanosensitive VWF13ile dolu hücresel WPBs üretimi teşvik bir confluent ve sıkıca paketlenmiş hücre tabakasıoluşumunda sonuçlanır,14. Bu protokol, insan kan akışında makas stres durumunu taklit gerektiren enfeksiyon analizi için bir hava basıncı pompa tabanlı, darbesiz sirkülasyon sisteminin kullanımını açıklar.

Bu sistem, akış koşullarının tanımlanmış, yazılım kontrollü bir ayarını sağlar. Şekil 1'deki akış şeması, birincil endotel hücrelerinin(Şekil 1, Inset 1) ve pnömokokların önlemi(Şekil 1, Inset 2) ile başlayan temel iş akışını göstermektedir. Uygulanan mikroakışkan sistem(Şekil 1, Inset 3) iki orta rezervuarlı perfüzyon boruya Luer adaptörü ile bağlanan özel bir kanal kaydıraktan oluşur. Perfüzyon boru seti bir stand olarak hizmet veren ve bir vana sistemi olarak perfüzyon tüpleri istihdam akışkan bir birim üzerine yerleştirilir. Akış ekimi için, orta dolgulu perfüzyon seti ve bağlı kanal kaydırağı ile akışkan birim CO2 inkübatöryerleştirilir(Şekil 1, Inset 3). Akışkan birim hava tüpü ile bir hava basıncı pompasına bağlanır. Borudaki hava, hava pompa sistemine yeniden pompalandırılmadan önce perfüzyon rezervuarlarından nem alınması için silika boncuklar içeren bir kurutma şişesinden geçmelidir(Şekil 1, Inset 3). Hava basınç pompası, kanal kaydırağının çapına, perfüzyon boru setinin uzunluğuna ve çapına ve kullanılan ortam(Şekil 1, Inset 3). VWF'nin WPB eksozozisi ile salgılanması, bir enjeksiyon portu kullanılarak perfüzyon tüpünde orta sirkülasyona uygulanan histamin stimülasyon8 ile indüklenir(Şekil 1, Inset 4). En az 10 dyn/cm2kesme stresinde, serbest bırakılan VWF proteinleri çok merize eder ve 100 μm'den uzun boylu uzun protein dizeleri oluşturur(Şekil 1, Inset 4,5,6 ve Şekil 2A). Bu protein dizeleri mikroskobik olarak tespit ve floresan izokyoyanat enjeksiyonu sonra görselleştirilmiş (FITC) ortama VWF özgü antikorlar konjuge. Dolaşan antikorlar hücre yüzeyine bağlı VWF dizelerin gerçek zamanlı olarak immünoresans algılanmasını sağlar(Şekil 1, Inset 5)8.

Birincil endotel hücreleri kullanılarak kurulan mikroakışkan tabanlı hücre kültürü enfeksiyon yaklaşımı, Streptococcus gibi bakteriyel patofobiler tarafından kan dolaşımının infiltrasyonu üzerine lokal iltihaplı vaskülatür durumunu taklit eder zatürree. Mikroakışkan endotel hücre yetiştiriciliği kullanılarak kesme stresi altındaki farklılaşmış vasküler hücrelerle bakteri etkileşiminin görselleştirilmesi ve kantitatif analizi örnekleri gösterilmiştir(Şekil 1, Insets 5,6). RFP ifade pnömokoklar akış içine enjekte edildi ve dolaşım 30 dakika sonra, histamin uyarılmış HUVEC VWF dizeleri bakteriyel eki ilk belirtileri mikroskopik tespit edildi (Şekil 1, Insets 5,6 ve Şekil 2A, B beyaz oklar)8. Böylece, RFP ifade pnömokok kullanımı bakteriyel antikor tespiti gerek kalmadan endotel hücreleri üzerinde VWF dizeleri bakteriyel eki niceliksel sağladı.

Floresan yoğunluklarının histogram bindirme çizimleri, Yeşil floresan antikorlarla tespit edilen VWF dizeleri ile RFP ifade eden pnömokokların colocalization görselleştirmek için Leica (yani, LasX) tarafından sağlanan değerlendirme yazılımı kullanılarak oluşturuldu. Bu, floresan görüntüsü içindeki belirli ilgi bölgelerindeki (YG) kolokalizasyon olasılığının nicel analizini sağladı. VWF floresan sinyalleri ile birlikte bakteri sinyallerinin histogram bindirmeleri kullanarak, her ikisi için de üst üste gelen floresan zirveleri görselleştirilebilir ve böylelikle VWF dizelerine pnömokok eki doğrulanabilir. Bakteriyel eki en az 25 dakika(Şekil 2B)8için sürekli uygulanan kesme gerilimine karşı dayanıklıdır.

Özetle, birincil HUVEC sürekli akış ekimi VWF salgılanması ve bakteri 8 dolaşan için yapışma siteleri olarak hizmet uzun VWF protein dizeleri üretimi etkin.

Figure 1
Şekil 1: Mikroakışkan endotel hücre yetiştiriciliği kullanılarak VWF dizeleri bakteriyel eki analizleri için iş akışı. Birincil endotel hücrelerinin hücre kültürü şişelerinde yer birleşimselliği için precultivation ile başlayan temel deneysel adımların iş akışı. Akışta hücre ekimi öncesinde, hücreler jelatin kaplı kanal slayt(Inset 1)içine tohumlu vardır. Bakteriler agar plakaları üzerinde yetiştirilen ve ardından karmaşık bir sıvı ortamdan orta günlük fazına kadar ekimi(Inset 2). Mikroakışkan hücre kültürü için, endotel hücreleri ile bir kanal slayt pompa sisteminin akışkan bir birimin perfüzyon tüpleri bağlı ve hücre farklılaşması için sürekli akış tabi(Inset 3). VWF dizeli (yeşil ok) üretimi histamin enjeksiyonu ile 10 dyn/cm2'lik bir kesme stresinde indüklendi ve FITC etiketli VWF'ye özgü antikorlar kullanılarak immünororesans tespiti ile mikroskobik olarak izlendi (Inset 4). RFP ifade eden bakterilerin sirkülasyon ortamına enjekte edildikten sonra, VWF-string'lere pnömokok eki (kırmızı ok) 450 nm 'de floresan emisyon ile gerçek zamanlı olarak mikroskobik olarak görüntülenmiştir (Inset 5). PfA kullanarak hücrelerin fiksasyonu sonra, diferansiyel immünfloresans boyama belirli enfeksiyon zaman noktalarında bakteriyel eki görselleştirme sağlar(Inset 6). Pompa sistemi ve 1, 3 adımlarında açıklanan HUVEC hücre tabakasının görüntüleri ve enjeksiyon portunun(Inset 4)görüntüsü dahildir. Insets 4 ve 5'te gösterilen immünoresans görüntüleri Jagau ve ark.8'inizniyle değiştirilmiş ve kullanılmıştır. Ölçek çubuklarının uzunlukları sağ alttabakada gösterilir.

Figure 2
Şekil 2: Histamin uyarılmış HUVEC'in yüzeyinde sürekli akış halinde üretilen VWF dizelerine bağlanan pnömokokların temsili immünororesans görüntüleri. (A) VWF dizeleri üretimi mikroskobik olarak 10 dyn / cm2bir mikroakışkan pompa sistemi kullanarak stres yamak için confluently yetiştirilen HUVEC maruz sonra ölçüldü. FITC konjuge VWF spesifik antikorlar VWF dizelerini tespit etti. Beyaz oklar uzun VWF dizeleri bağlı kırmızı floresan ile RFP ifade pnömokoklar işaret. (B) Yeşil floresan VWF dizelerine bakteriyel bağlılık mikroskobik olarak sabit akışta (beyaz oklar) 2 saate kadar gözlendi ve tanımlanmış bir yatırım getirisinin floresan yoğunluklarının yazılım tabanlı değerlendirilmesi ile doğrulandı. Gerçek zamanlı görüntüler bir konfokal lazer tarama mikroskobu (SP8, Leica) floresan ekipmanları ile alınmıştır. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakam değiştirilmiş ve Jagau ve ark.8izni ile kullanılmıştır.

Ek Şekil 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VWF gibi mekanoduyaran konak proteinleri ile bakteri etkileşiminin simülasyonu, tanımlanmış, tek yönlü ve sürekli sıvı akışını sağlayan ve dolayısıyla güvenilir kesme gerilimi üreten, perfusable bir hücre kültür sistemi gerektirir . Birçok mikroakışkan pompa sistemleri zaten tarif edilmiştir. Bergmann ve ark. kapsamlı bir inceleme farklı iki ve üç boyutlu hücre kültürü modelleri17temel yönlerini özetler.

Mikroakışkan teknoloji çok genç bir teknik 1990'ların başında kontrol edilebilir, tekrarlanabilir ve bir mikrometre ve hatta bir nanometre ölçekte geçirilebilir mikroortamların geliştirilmesi ile başladı18. Sunulan mikroakışkan yaklaşım aynı zamanda bakteriyel yapışma mekanizmaları ve ilgili proteinlerin geniş bir yelpazede çalışma için uygulanabilir. Genel olarak standart hücre kültürü teknikleri kullanılarak yaklaşılabilen VWF gibi mekanoyanıt yapışma bileşenleriiçeren herhangi bir etkileşim için en uygundur. Örneğin, birkaç hücre dışı matriks proteininin konformasyonunun konumlarına bağlı olarak farklılık gösterir olduğu bilinmektedir. Kan sistemi içinde, fibronektin gibi glikoproteinler küresel bir konformasyonda dolaşırken, ekstrasellüler matrikste proteinler çok bağlı di- ve çok merize iskele19,20olarak görünür. Ayrıca, mikroakışkan ekipman ın çeşitli distribütörleri farklı kollajen tipleri (örneğin, subendothelial kollajenler veya diğer plazma kaynaklı proteinler) ile önceden kaplanmış standart kanal slaytları sunar. Bu kanal slaytları farklı akış durumlarında spesifik ekstrasellüler matriks proteinlerine bakteriyel yapışmanın görselleştirilmesi ve kantitatif analizleri için uygundur.

Mikrocihaz üretiminde kullanılan farklı malzemelere göre farklı mikroakışkan sistemler sınıflandırılabilir. Bu bağlamda, cam/ silikon tabanlı platformlar polimer bazlı ve kağıt tabanlı platformlar21farklıdır. Polimer esaslı kanal slaytları elastik olarak desteklenen bir yüzey (ESS) ile üretilir, genellikle akış deneyleri sırasında hücre eki için bir yüzey kaplaması gerektirir. Kollajen gibi yapışma destekleyici bileşenlere sahip bir kaplamaya alternatif olarak, ticari olarak kullanılabilen bazı kanal slaytlarının yüzeyi fiziksel olarak modifiye edilmiştir ve bu da çoğu hücre tipine uygun hidrofilik ve yapışkan bir yüzey oluşturur. Ayrıca, bazı kanal slaytlar polidimethylsiloxane gibi substratlar kullanılarak oluşturulur (PDMS), hangi oksijen geçirgen ve aynı zamanda akışkan pompa sistemlerinde mikrokanalların iç yüzeyinde kan damarı hücrelerinin kültürünü sağlar22, 23. yıl.

Bu çalışmalarda kullanılan mikroakışkan sistem, staphylococcus aureus'un insan endotel hücrelerinin kültüründen sonra multimerized VWF lifleri ile etkileşiminin analizi için uygulanan etkin ve güvenilir bir sistem olarak hizmet vermiştir. 24,25. Bu mikroakışkan sistem, biyogüvenlik 2 koşulları altında patojenik bakteriler tarafından enfeksiyonun analizini sağlayan kapalı dairesel perfüzyon sistemidir. Ayrıca kanal slaytları akış sırasında mikroskobik izleme için uygundur ve hücre yapışmasını ve yüksek derecede deneysel tekrarlanabilirliği sağlayan farklı precoatings (örneğin, jelatin, poli-L-l-lizin veya kollajen-IV) ile mevcuttur. Bu protokol, S. pneumoniae için perfusable bir enfeksiyon modelinin oluşturulması için mikroakışkan bir sistem (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanır, böylece insan vasküler sistem içinde akış durumunu taklit8.

Bu mikroakışkan sistemde bakteri hücresi eki nin açıklanan genel prosedürü, steril bir ortamda tanımlanmış ve sürekli bir akış üreten diğer pompa sistemleri türleri ile de yapılabilir. Mikroakışkan amaçlar için, akış kontrol sistemleri esas olarak dört tip kullanılır: i) peristaltik pompalar ve bu protokolde kullanılan sirkülasyon pompaları, ii) şırınga pompaları, iii) basınç denetleyicileri, ve iv) akış anahtarı matrisleri ile basınç denetleyicileri. Her türlü akış kontrol sisteminin, özel mikroakışkan uygulamaya ve mikroskobik görselleştirmeyi gerçek zamanlı olarak gerçekleştirebilme yeteneğine bağlı olarak avantajları ve dezavantajları vardır. Numunelerin sürekli sirkülasyonunu gerektiren çoğu uygulamada, sirkülasyon pompaları tanımlı bir akış durumu sağlamak için yazılım tabanlı basınç denetleyicileri ile birleştirilir. Bu da pompa sistemi burada gösterilen optimize edilir. Şırınga bazlı pompa sistemleri akış salınımı üreten "klasik" şırınga pompaları ve "darbesiz" mikroakışkan şırınga pompaları olarak ikiye ayrılabilir. Bu şırınga pompası tabanlı sistemlerin kullanımı genellikle kolaydır, ancak çıkmaz kanallarda akış kontrolü şırınga pompaları kullanarak zordur. Ayrıca, çip içinde akış değişiklikleri biraz zaman alabilir ve akış hızını belirlemek için bir akış ölçer gereklidir. Darbesiz şırınga pompaları bile şırınga pompasının adım adım motoru nedeniyle akış hızında periyodik titreşim oluşturabilir. Başka bir iki şırınga pompası cihazı hücre yüzeylerinde tanımlanmış kesme kuvvetleri uygular ve pc bağımsız bir şekilde bile mikrodiyaliz uygulamaları için uygundur bir "aşılama ve geri çekme" tabanlı akışkan hareket oluşturmak mümkün. Bu sistem hücre ekimi için odacıkveya kanal slaytlarının bağlanması için mikrotübül ile birleştirilerek mikroskobik analizler yapılmalıdır.

Yukarıda bahsedilen basınç denetleyicileri, numuneyi içeren tankı basınçlandıran akış kontrol sistemleridir ve bu sistem mikroakışkan bir hazne veya bir çipe sorunsuz bir şekilde enjekte edilir. Basınç denetleyicileri darbesiz bir akış kurabilir ve akış ölçerlerle birlikte akış hızları sağlayabilir. Akış anahtarı matrisleri ile basınç denetleyicileri kombinasyonu, geri akışsız hızlı bir akış anahtarı sağlar. Burada sunulan recirculating sistemi genellikle insan vasküler sistemi için bildirilen kesme stres değerlerinin nesil etkin26. In vivo vasküler duvar kesme stresi non-invaziv olarak kaydedilen hız profilleri türetilmiş olarak duvar kesme oranları tahmin edilmiştir, ve arteriyollerde büyük arterlerde tam kan viskozitesi ve plazma viskozitesi26. Reneman ve Hoeks, özel olarak tasarlanmış ultrason sistemi kullanarak büyük arterlerde ve arteriyollerde floresan akış hızı izleyicileri26kullanarak optik teknikler kullanarak hız profilleri kaydetti. Karotis arterde ortalama 11-13 dyn/cm2 kesme stresine ulaşılırken, brakiyal arterde sadece 4-5 dyn/cm2'ye ulaşılır. Karotis arteriçin 25-70 dyn/cm2'ye kadar pik değerler izlendi. Küçük ve orta damarların kesme gerilim değerleri 0,1 ile 0,5 dyn/cm2arasında değişmektedir. Burada açıklanan mikroakışkan sistemde, uygulanabilir kesme gerilimi değeri seçilen perfüzyon boru çapına, kanal kaydırağının yüksekliğine ve kullanılan akışkan ortamın viskozitesine bağlıdır. Seçilen akışkan ayar, 50 cm uzunluğunda ve 1,6 mm çapında perfüzyon seti ile birlikte 0,4 cm yüksekliğinde (100 μl hacim) bir slayttan ve orta viskozite0.0072 [dyn·s]/cm2idi. Bu ayar, 3,8−33,9 mL/dk akış hızlarında 3,5 ile 31,2 dyn/cm2 arasındaki kesme gerilimi aralığı için uygundur. Buna ek olarak, basınç pompası yazılım kontrolü bir darbeli arteriyel kan akışını taklit edebilir bir darbeli orta akış uygulayabilirsiniz.

Bu kombine mikroakışkan enfeksiyon yönteminin başarılı, güvenilir ve tekrarlanabilir kullanımı akılda tutulması gereken bazı önlemler gerektirir. Mikroakışkan koşullar altında enfeksiyon süreci sırasında, hücre tabakası pnöyolizin gibi sitotoksik veya sitolitik bakteriyel bileşiklere maruz kalabilir, ökaryotik hücre canlılığını etkileyen ve slayt yüzeyine hücre bağlılığını zayıflatmak. Bu nedenle, deneyin tüm seyri boyunca sabit bir akış tutmak gereklidir ve hücre morfolojisinin bütünlüğü sık sık izlenmelidir. Ayrıca, akış kültürü orta enfeksiyon deneyi boyunca hücrelerin sıkı bir yüzey eki sağlamak için endotel hücrelerine tüm temel besin sağlamalıdır. Yine de, bu orta takviyeleri müdahale veya bakteri ve belirli konak proteinleri arasındaki etkileşimi inhibe maddeler içerdiği unutulmamalıdır. Örneğin pnömokok-VWF etkileşimi çalışmalarında, heparin hücre kültürü ortamdan tükenmiş olmalıdır, VWF için pnömokok bağlanmasını inhibe çünkü8.

Endotel hücrelerinin akış kültüründe bir diğer kritik adım, genel hücre canlılığına ve farklılaşma düzeyine bağlı olarak sıkı hücre adezyonunun sürdürülmesidir. Birincil endotel hücrelerinin kesme akışına dirençli hücre adezyonu sadece hücreler kesme stresine maruz kalmadan önce kesinlikle subfluency tutuldu elde edildi. Öte yandan, WPB üretimi doğrudan sıkı hücre-hücre temasları teşvik endotel hücre tabakasının birleşimi bağlıdır13. Birincil endotel hücrelerinin mikroakışkan hücre kültürünün yararı hızla akış koşulları altında bir confluent hücre tabakasıoluşumuna yol açan güçlü indüklenen hücre çoğalması kapsar. Hücreler sıkıca birbirine bağlı, topluca akış yönünde odaklı, ve salgı WPB üretmek için gerekli olan son derece farklılaşmış fenotip temsil eder. Bu WPB VWF, vazodilatasyon aktivatörleri ve histamin stimülasyon veya pnömoziz aktivitesi üzerine protein patlamaları olarak eksositozlar sitokinler için depolama vezikülleri olarak hizmet27,13. Bu nedenle, düşük proliferasyon pasajlarında farklılaştırılmış primer endotel hücrelerinin son derece yapışkan, konfluent hücre tabakasının oluşturulması, etkin VWF salınımı ve hücre yüzeyinde VWF dizeleri oluşumu ve akış koşullarında bakteri-VWF-etkileşim analizi. Bu nedenle, endotel hücrelerinin farklılaşması en az 48 saat akış ekimi aldı ve pompa basıncıherhangi bir varyasyon olmadan sabit bir kesme akışı gerekli unutulmamalıdır. Herhangi bir varyasyon ani bir orta patlamaya yol açabilir, bu da hücreleri slayttan dışarı atabilir. Ayrıca mikroskobik görüntüleme sırasında mikroakışkan kaydırak ve pompa sisteminin orta rezervuarlarının 37 °C sıcaklıkta tutulması gerekir, çünkü bu insan hücrelerinin optimum sıcaklığını temsil eder.

Ölümsüzleştirilmiş insan hücre hatları birçok bilimsel deneyler için uygundur ve genellikle hücre kültürü enfeksiyon çalışmalarında istihdam edilmektedir. Bu hücre hatları, düşük veya orta kültür gereksinimleri ve sınırsız çoğalma gibi bazı genel teknik avantajları paylaşır, bu da morfoloji veya reseptör profillerinde önemli değişiklikler olmadan birkaç yüz kez geçişi sağlar. Ancak, bu hücre hatları yalnız bir monokültür temsil eder ve yapay iki boyutlu büyüme koşullarına tabi tutulur. 28 Eksik fizyolojik kaynak doku ortamı, kültürün her geçişiile fonksiyonel ve morfolojik hücre fenotipinde önemli değişikliklere yol açar29. Diğer bakteriyel yapışma deneylerinden önce, farklı hücre kültürü pasajlarında yüzeye maruz kalan hücre tipi spesifik marker proteinlerin ve insan primer akciğer endotel hücrelerinin reseptörlerinin profili belirlendi. Akış sitometri analizi, trombosit endotel hücre adezyon molekülü 1 (PECAM1) gibi belirli yüzey proteinlerinin hücre geçişinin sekiz raunt içinde güçlü bir şekilde azaldığını ortaya koymuştur. Ayrıca, ifade integrin reseptör profili önemli ölçüde bir hücre tipi-spesifik integrin reseptör deseni ve azaltılmış hücre tipine özgü integrin reseptör deseni lehine yüksek hücre pasajlarında değiştirildi (Bergmann vd., yayınlanmamış veri). Bu sonuçlar özellikle enfeksiyon biyolojisi çalışmalarında patojen-konak etkileşimlerinin analizi için önemlidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında mikroakışkan hücre kültürü sırasında fenotibik hücre karakteristiklerinin ve yüksek düzeyde fonksiyonel farklılaşmanın sürdürülmesi amacıyla, birden fazla donörden primer endotel hücreleri seçilmiş ve sadece mümkün olduğunca spesifik olarak meme özellikleri tutmak için maksimum beş pasajlarkadar 8.

Akış sırasında bakterilerin ve belirli hücre yüzeyyapılarının birleştirilmiş görselleştirilmesi, optimize edilmiş bir floresan boyama protokolü gerektirir. Doğrudan etiketlenmiş proteinler, floresan protein ifade eden bakteriler ve floresan konjuge antikorların farklı kombinasyonları kullanılarak, immünoresans boyama prosedürleri özellikle görselleştirme hedeflerine uyarlanabilir. Bu prosedürler tanımlı ve net mikroskobik görüntüleme ve aynı zamanda bakteriyel yapışma ve içselleştirme3,13,30,31bir farklılaşma ve nicelik sağlar. İçselleştirilmiş bakterilerin immünoresaneses tabanlı tespiti, kısa bir Triton X-100 kuluçka gibi bir hücre permeabilizasyon adımı gerektirir, bu da hücre dekolmanı yol açabilir. Bu nedenle, bir akış kültüründe meydana gelen bakteriyel içselleştirme süreçlerinin saptanması, akış kuluçkadan sonra PFA-crosslinked örnekleri kullanılarak görselleştirilmelidir. Akıştaki bakterilerin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesi için, floresan proteinleri ifade eden genetiği değiştirilmiş bakterilerin kullanımı hızlı ve hedeflenen mikroskobik algılama sağlar. Bu deneysel çalışmada Kjos ve Veening16tarafından tasarlanan verimli bir genetik yapı kullanılarak oluşturulan RFP ifade eden pnömokok suşları kullanılmıştır. Akıştaki VWF dizelerin inalgılanması için, farklı VWF spesifik floresan etiketli antikorlar test edildi ve kullanılabilir. En aza indirgenmiş spesifik olmayan arka planda optimum sinyal yanıtı elde etmek için, uygulanan her antikor için yeterli antikor konsantrasyonu sürekli olarak titre edildi.

Mikroskobik canlı hücre görüntülemesi için, akışkan birim ve kanal slaytı CO2 inkübatörden çıkarılır ve mikroskopta 37 °C'ye önceden ısınmış bir odaya yerleştirilir. Bu oda %5 CO2'yeayarlanamadı. Karbonat tamponlu bir atmosfer olmadan, HUVEC morfolojisi ve bakteriyel uygunluk 180 dakikaya kadar bozulmadan kaldı, vwf aracılı bakteriyel yapışma analizi için yeterlidir. Daha uzun enfeksiyon süreleri ve CO2 inkübatör dışında mikroskobik izleme gerekiyorsa, yetersiz CO2 konsantrasyonu nedeniyle pH kaymalarını telafi etmek için tamponlu hücre kültürü ortamı kullanılmalıdır. Alternatif olarak, tüm sistem mikroskobik görüntüleme bir zaman serisinin adımları arasında CO2 kuluçka içine geri yerleştirilebilir.

Gerçek zamanlı floresan tespitine ek olarak, kanal slayt içinde endotel bakteriyel enfeksiyon durdurulabilir ve paraformaldehit ile orta değişimi ile korunabilir (PFA) bir fiksasyon maddesi olarak. Akışta fiksasyon dan sonra, kanal slayt içinde hücre yüzeyinin optimize edilmiş ve adım adım immunofluoresan boyama değerli mikroskobik anlık görüntü oluşturma sağlar ve çok yönlü bir kombine yapı algılama sağlar bakteri ve konak hücreleri arasındaki etkileşimde yer alan belirli hücresel bileşikler. Bu kombine yöntemin bilimsel yararı, PFA ile tedavi edilen kanal kaydırağının, ilgi çekici yapıların akış sonrası immünoresans boyaması için depolanabilmesi ve kullanılabilmesidir. PfA tedavisi bakterileri inaktive eder ve böylece RFP-protein ifadesini tutuklar. Bu nedenle tavşanda pnömokok özgü antiserum üretilmiş ve tavşana özgü AlexaFluor568 konjuge sekonder antikorkullanılarakgörselleştirme yapılmıştır 8 . Daha önce de belirtildiği gibi, farklı antikor kombinasyonları kullanımı antikor miktarları ve engelleme tampon bileşimi tam bir optimizasyon gerektirir. Aksi takdirde, belirsiz arka plan sinyalleri ve çapraz algılama etkileri yapay boyama sonuçlarına yol açabilir. Optimize edilmiş bir immünoresans boyama prosedürü kolayca aktin sitoiskelet veya endozomal belirteçleri13,31gibi birçok farklı hücresel hedeflerin tespiti için kullanılabilir.

Bu prosedür, histolojik, fizyolojik ve fonksiyonel açıdan fizyolojiyi taklit eden daha karmaşık bir doku ortamı oluşturmak için uyarlanabilir. Sunulan enfeksiyon analizleri, birkaç kanal slaytının bir perfüzyon kümesine bir satır bağlantısı kullanılarak aynı anda çeşitli bilimsel soruları yanıtlamak için verimli bir şekilde kullanılabilir. Bu genişletilmiş kurulum paralel olarak aynı akış ayarı içinde farklı hücre tipleri, hücre birleşimleri ve farklı slayt kaplamaları analizleri kolaylaştırmak ve farklı hücre türlerinin bakteriyel enfeksiyonların doğrudan karşılaştırılmasına olanak sağlar. Ayrıca, seri hat bağlantısı ve çeşitli kanal slaytlarının kombine analizleri de gen ekspresyonu profilleme (örneğin, enfeksiyon zamana bağlı virülans faktörü analizi için uygulanabilir zaman serisi deneyleri, imkanı sağlar gen ekspresyonu).

Enfeksiyon analizleri, uzun süreli kronik enfeksiyon evresini taklit eden koşullarda hücresel yanıtı analiz etmek için birkaç gün hatta hafta süren sabit bir laminar akış durumuna da genişletilebilir. Sunulan tek hücreli tip kültüre ek olarak, mikroakışkan hücre kültürü cihazlarında heterotipik hücre kültürünün bazı örnekleri zatenbildirilmiştir 32,33. Bu yüksek iş bölümü farmakolojik çalışmalar için izin verir ve sonuçta rejeneratif amaçlar için mikroakışkan hücre kültür sistemleri kullanarak neden olabilir de34.

Özetle, mikroakışkan sistem immün boyama prosedürleri ile birlikte vasküler sistem içindeki koşulları simüle eden bir ortamda bakteri ve konak hücreler arasındaki patomekanizmaların analizi için değerli bir model olarak hizmet vermiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Proje DFG (BE 4570/4-1) tarafından S.B.'ye finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-syringe Fisher Scientific 10303002 with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe Sarstedt 9077136 For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase eBioscience now thermo fisher 00-4555-56 protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin Abcam ab176751 no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody Thermo Fisher Sientific A11001 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody Thermo Fisher Scientific A-11011 stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth Becton Dickinson GmbH BD 249210 complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-25G solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter TPP 90026 subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R Beckman Coulter Life Sciences 392304 spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30 Beckman Coulter Life Sciences B06314 spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK Hermle 305.00 V05 - Z 216 M spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3886.2 used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing ibidi 10821 for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator Fisher Scientific MIDI 40 incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-Incubator Sanyo MCO-18 AIC for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar plates Becton Dickinson GmbH PA-254005.06 agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer Dell Latitude 3440 Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Leica DMi8 An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 3904.1 used for PBS buffer
Drying material Merck 101969 orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix Promocell C-39215 supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMS Promocell C-22010 ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use) Promocell C-22010 culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS) biochrome now Merck S 0415 supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody Abcam ab8822 stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit ibidi 10903 fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G-1890-100g for precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochloride Sigma Aldrich H-7250-10MG for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Promocell C-12203 Lot-Nr. 396Z042 primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal) Santa Cruz sc73268 stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port ibidi 10820 for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope Zeiss Axiovert 35M inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides) ibidi 80176 physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated) Sigma Aldrich M7506-500G For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump ibidi 10905 air pressure pump
Neubauer cell counting chamber Karl Hecht GmbH&Co KG 40442002 microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA) Electron Microscopy Sciences 15710-S for cross linking of samples
Perfusion Set ibidi 10964 Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS) the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes Sarstedt 67,741 (2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum Pineda raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe 6781.1 used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4) ibidi v1.5.4 Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mL Sarstedt 72.706/ 72.695.500 required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volume Sarstedt 6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci National Collection of Type Cultures, Public Health England 10,319 Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mL Sarstedt 86.1253.025/ 86.1254.025 for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free) Sigma Aldrich 451614-25G for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe P030.2 used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22 Biochrom 80-2115-20 measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose Sigma Aldrich S0389-500G for preparation of blocking buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284-500ML Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract oxoid LP0021 bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511 (2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218 (1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 152 Streptococcus pneumoniae,mikroakışkan endotel hücreleri mikroskopi floresan makas stresi yapışma
Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, … More

Jagau, H., Behrens, I. K., Steinert, M., Bergmann, S. Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow. J. Vis. Exp. (152), e60323, doi:10.3791/60323 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter