Summary
توضح هذه المقالة طريقة لاستزراع وتحليل الخلايا الظهارية الكبيبية خارج الخلايا المغلفة من glomeruli معزولة عن الكلى الماوس. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة المسارات التي ينطوي عليها انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة.
Abstract
تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية (PEC) هو أحد العوامل الرئيسية التي تشارك في تطوير وتطور تصلب الكبيمرتولوس. وبالتالي فإن تثبيط المسارات التي تشارك في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية يمكن أن يكون أداة لتكبيل تطور الأمراض الكبية. توضح هذه المقالة طريقة للثقافة وتحليل الخلايا الظهارية الجدارية خارج من كبيبات مغلفة معزولة من الكلى الماوس. بعد تشريح الكلى الماوس المعزولة ، يتم سلخ الأنسجة ، ويتم عزل الجلاميرولي عن طريق الغربلة. يتم جمع glomeruli مغلفة، ويتم استزراع glomeruli واحد لمدة 6 أيام للحصول على الخروج الكبيّة من الخلايا الظهارية الجدارية. خلال هذه الفترة، يمكن تحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة عن طريق تحديد عدد الخلايا أو المساحة السطحية للخلايا التي تتكاثر. وبالتالي يمكن استخدام هذا الفحص كأداة لدراسة آثار التعبير الجيني المتغير في الفئران المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب أو آثار ظروف الثقافة على خصائص نمو الخلايا الظهارية الجدارية والإشارة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن دراسة مسارات مهمة تشارك في عملية تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية وبالتالي في glomerulosclerosis.
Introduction
الأمراض الكبوية هي مجموعة هامة من اضطرابات الكلى وتمثل سببا رئيسيا للمرض الكلوي المرحلة النهائية (ESRD). لسوء الحظ، خيارات العلاج المحددة محدودة والتقدم إلى ESRD أمر لا مفر منه. يتم تعريف الأمراض الكبوية من خلال وجود إصابة glomerular ويمكن تجميعها في الأمراض الالتهابية وغير الالتهابية. على الرغم من أن الإهانة الأولية مختلفة ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الآلية الخلوية الشائعة تؤدي إلى تضخم الخلايا الظهارية الكبيّة وفي النهاية إلى تصلب الكبيات في جميع الأمراض الكبيات ، بغض النظر عن السبب الأساسي1،2،3،4.
على وجه التحديد، فقد تبين أن الآفات الكبيبية تتكون أساسا من الخلايا الظهارية الجدارية تنشيط5،6. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الخلايا الظهارية الجدارية خلايا ظهارية مسطحة هادئة تصطف كبسولة بومان من الجلجوميول. ومع ذلك، فإن أي إصابة الكبيّة إما بسبب الطفرات الوراثية (على سبيل المثال، podocyte محددة أو اعتلالات الميتوكوندريا)، أو الالتهاب أو فرط الترشيح (على سبيل المثال، الناجم عن انخفاض كتلة الكلى، وارتفاع ضغط الدم، والسمنة أو داء السكري) يمكن أن تؤدي إلى تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية تتكاثر و تودع مصفوفة خارج الخلية مما يؤدي إلى تكوين الهلال الخلوي أو الآفات الصلبة5,7,8. يؤدي تطور هذه العمليات إلى فقدان وظائف الكلى9. ولذلك، تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية هو عامل رئيسي في تطور وتطور glomerulosclerosis في كل من الأمراض الكبياتية الالتهابية وغير الالتهابية1،2،3،4،10.
والعمليات الجزيئية التي تتوسط في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وتظهر الدراسات الحديثة أن تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية دي نوفو أعرب CD44, مستقبلات التي هي مهمة لتفعيل مسارات مختلفة تشارك في انتشار الخلوية والهجرة. وعلاوة على ذلك، تم إظهار تثبيط CD44 لمنع تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية و الحد من تطور تشكيل الهلال و glomerulosclerosis في النماذج الحيوانية من الأمراض الكبيبية غير الالتهابية وكذلك11،12.
كما تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية هو لاعب رئيسي لتطوير glomerulosclerosis وتشكيل الهلال، تثبيط هذه الخلايا يمكن أن تبطئ تطور الأمراض الكبيات. قد يؤدي توضيح المسارات الجزيئية التي تقود تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية إلى تطوير تدخلات علاجية محددة تُعَطَّن تكوين الآفات الخافتة بالضمير الكيسي وتكبيبات الدم في الأمراض الكبيات.
في النماذج الحيوانية التجريبية، من الصعب في كثير من الأحيان تقديم أدلة على التأثير المباشر للتعبير الجيني المتغير (نماذج الماوس الناتجة عن الماوس أو نماذج الماوس المعدلة وراثيا) أو العلاج من المخدرات على الخلايا الظهارية الجدارية. في الماوس خروج المغلوب التقليدية لوحظ في التغيرات الجسمية يمكن تفسيرها من خلال التغيرات المباشرة في الخلايا الظهارية الجدارية. ومع ذلك، بما أن التعبير الجيني قد تغير أيضاً في أنواع الخلايا الأخرى داخل الماوس، فلا يمكن استبعاد الآثار غير المباشرة التي تتوسط فيها أنواع الخلايا الأخرى. وقد وفرت تطوير الفئران كري لوكس المشروطة التي يقودها المروجين النشطة أساسا في الخلايا الظهارية الجداري حلا في بعض الحالات13. ومع ذلك، فإن النماذج المعدلة وراثيا المشروطة معقدة، وعلى الرغم من أن هناك خطوطا أكثر مشروطا تصبح متاحة، فإن العديد من خطوط الماوس التقليدية أو الماوس المعدلة وراثيا لا يوجد بعد بديل مشروط.
لدراسة الآثار المباشرة على الخلايا الظهارية الجدارية، وقد وضعت مجموعتنا مقايسة الجسم الحي السابق باستخدام كبيبات مغلفة واحدة معزولة عن الكلى الماوس لقياس وتحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة. هذه الطريقة سوف تمكننا من تحديد الآثار الخاصة بالخلايا الظهارية الجدارية والعثور على مسارات مسؤولة لتنشيط الخلايا الظهارية الجدارية وخيارات العلاج الاختبار لمنع هذا التنشيط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة رادبود نيميغن.
ملاحظة: تم التضحية بالفئران غير المعالجة والصحية من النوع البري (WT) (n = 4) وcd44-/- (n = 4) الفئران في عمر 12-16 أسبوعاً. واستخدمت الفئران الذكور والإناث على حد سواء. كانت جميع الفئران على خلفية C57Bl/6.
1. ماوس تشريح الكلى
- التضحية الفئران WT صحية أو الفئران المعدلة وراثيا عن طريق خلع عنق الرحم.
- تشريح الكلى الماوس كله مباشرة بعد التضحية الفئران. لهذا, إجراء عملية استئصال البطن المتوسطة باستخدام مقص البطن, قطع الجلد ومن ثم عضلات البطن. إزالة الأمعاء ووضعها بجانب الماوس.
- حرّر الكلى من توصيل الأنسجة واسحب الكلى باستخدام ملقط جراحي، وقطع الشريان الكلوي والوريد الكلوي والوَلَب بالمقص.
- إزالة كبسولات الكلى من الكلى عن طريق عقد الكلى مع ملقط الجراحية وسحب قبالة كبسولة باستخدام زوج آخر من ملقط.
- ضع الكلى في طبق ثقافة 6 خلايا جيدًا (2 كليتين/بئر) تم إعداده مع 2 مل من محلول الملح المتوازن (HBSS) لكل بئر ووضع على الجليد.
2. عزل من الكبيبات من الكلى الماوس
- نقل الكلى إلى طبق بيتري 100 مم ويمرم الكلى إلى قطع صغيرة من 1−2 ملم باستخدام مشرطين. الحفاظ على قطع الكلى المفروم الرطب باستخدام 1−2 مل من HBSS.
- ضع قطع الكلى المفرومة فوق منخل معدني 300 ميكرومتر واضغط على الكلى من خلال المنخل باستخدام المكبس من حقنة 20 مل. شطف مرارا وتكرارا منخل مع HBSS في ما بين وجمع تدفق من خلال في طبق بيتري نظيفة باستخدام الأنابيب المصلية. جمع أيضا كل ما تبقى / العصي على الجانب السفلي من الغربال عن طريق كشط تشغيله مع مشرط ونقلها إلى تدفق التي تم جمعها من خلال (تجانس الكلى).
- شطف تجانس الكلى من خلال منخل 75 ميكرومتر مع HBSS. جمع تدفق من خلال وشطف بعد ذلك هذا التدفق من خلال من خلال منخل 53 ميكرومتر. غسل كل من الغربال باستخدام HBSS لإزالة جميع الهياكل الصغيرة.
ملاحظة: في هذه الخطوة يتم شطف التدفق على الرغم من ذلك فقط ولكن ليس الضغط من خلال 75 ميكرومتر و 53 ميكرومتر منخل. الغسيل مع HBSS ضروري لإزالة الحطام والهياكل الأصغر على المناخال. لذلك عادة يتم استخدام 200-300 مل من HBSS في المجموع. - جمع هياكل الكلي / المواد التي تبقى على 75 ميكرومتر و 53 ميكرومتر منخل عن طريق غسل السطح العلوي من الغربال مع متوسطة النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) تكملها 20٪ مصل عجل الجنين (FCS) ونقل المواد إلى 6-جيدا مرفقات منخفضة جدا microplate.
ملاحظة: لغسل السطح العلوي من المنخل، شطف منخل في وضع مائل (> 45 درجة) وجمع مواد الكلى على حافة منخل. يتم إثراء المواد التي تم جمعها لتغليف وكذلك كبيبات مفككة، تظهر سوى شظايا أنبوبية قليلة. glomeruli مغلفة لزجة جدا. لجمع كبيباتولي واحد، ولذلك من المهم لمنع كبيباتولي على التمسك سطح طبق بيتري أو لوحة جيدا. لتجنب الالتزام، استخدم المتوسطة مع 20% FCS واستخدم لوحات مرفقات منخفضة للغاية لهذه الخطوة.
3. زراعة من النمو الكبي
- جلب microplate مرفق منخفضة للغاية إلى المجهر ضوء مقلوب وجمع واحد مغلفة و / أو glomeruli مع ماص 20 ميكرول. تجنب الأنابيب الهياكل الأخرى والحطام. بعد جمع كبيبات واحدة في طرف الماصات، إضافة طازج DMEM المتوسطة دون جمع مواد الكلى في نفس تلميح ماصة إلى حجم 20 ميكرولتر.
- نقل الكبيبات واحد مع 20 ميكرول متوسطة DMEM إلى مركز بئر من 24 بئر خلية لوحة الثقافة واحتضان لمدة 3 ح في 37 درجة مئوية و 5٪ (v/ الخامس) CO2 للسماح مرفق من الكبيبات إلى مركز البئر. نقل لوحة بعناية لتجنب تعويم من الكبيات إلى الحدود من البئر.
- بعد 3 ح حضانة، يتم إرفاق الكبيّة إلى مركز البئر. إضافة بعناية 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي endothelial (EBM) تكملها مع مجموعة عوامل النمو التي تحتوي على الهيدروكورتيزون، عامل النمو endothelial الإنسان، استخراج الدماغ البقري وgentamicin كبريتات amphotericin B(جدول المواد)وإضافية 5٪ (v/v) FBS و 1٪ (v/v) البنسلين /الستريبتوميسين (القلم / strep).
- ثقافة [كهميمرولي] وحيدة ل 6 أيام في 37 [ك], 5% ([ف/ف]) CO2.
ملاحظة: في غضون 6 أيام يتم تشكيل خارج التي تتكون من الخلايا الظهارية الجدارية. إذا كان أحد يهدف إلى اختبار آثار مركبات معينة أو المخدرات على الخلايا الظهارية الجدارية ينبغي أن تضاف إلى المتوسطة في غضون هذه الفترة ستة أيام.
4 - تحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية
- تحليل خارج الكبيّة بعد 6 أيام. التقاط صور مجهرية باستخدام مجهر ضوئي رقمي مقلوب.
- استخدام برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال، ImageJ/FIJI) لتحديد مساحة السطح وقطر النمو الكبي، وعدد الخلايا الخارجة أو الكبيبات التي تتفوق على النمو.
- لتحديد مساحة سطح النتف الكبيّة، افتح الـtif. ملف من نمو glomerular مع شريط مقياس في ImageJ. رسم خط مستقيم على شريط مقياس وتحديد المسافة في بكسل عن طريق النقر على تحليل وقياس (على سبيل المثال، 1 مم = 460 بكسل).
- تحديد المقياس بالنقر على تحليل، تعيين مقياس واكتب المسافة المعروفة في بكسل (على سبيل المثال ، 460) ، وأيضا اكتب المسافة المعروفة (على سبيل المثال ، 1) ووحدة الطول (على سبيل المثال ، 1 مم). انقر فوق موافق.
- تحديد النتائج التي ستظهر في جدول النتائج بالنقر على تحليل ثم تعيين القياسات. لتحديد مساحة سطح الارتجاج الكبيائي، قم بتنشيط منطقة الخيارات وتسمية العرض. انقر فوق موافق.
- لتحديد مساحة سطح الارتجاج الكبيّة، رسم اختيار حر حول الهزّة الكبوية. انقر على تحليل ثم قياس، جدول النتائج سوف يطفو على السطح في ImageJ تظهر مساحة سطح خارج النمو في مقياس تحديد سابق (انظر الخطوة 4.4، على سبيل المثال، مم2).
5. توصيف الخلية الكبوية خارج النمو
ملاحظة: لتقييم التركيب الخلوي للذرة، يتم تنفيذ تلطيخ الفلورة المناعية لعلامات الخلية الخاصة على النمو الكبيائي في t = 6 أيام.
- إزالة بعناية المتوسطة وغسل بلطف الكبيبات مرتين باستخدام الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
- ثبّت ل 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام 2٪ (ث / الخامس) شبهformaldehyde (PFA) تكملها مع 4٪ (ث / الخامس) السكروز في برنامج تلفزيوني وغسل بعناية 2X باستخدام برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية مع التركيز المناسب (جدول المواد) المخفف في البي بي إس -أوفين المصل الألبومين (BSA) 1٪ (الخامس / الخامس) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة حل الأجسام المضادة وغسل بعناية 3X مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (جدول المواد) المخفف في PBS-BSA 1٪ (v/v) في الظلام لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل بعناية 3X مع برنامج تلفزيوني وجبل باستخدام 1−2 قطرات من المتوسط المتصاعد مائي مع 4′، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) لتصور النوى وتغطية البئر مع زلة غلاف مستديرة.
- التقاط صور مجهرية باستخدام مجهر الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض مخطط منهجي لطريقة تنفيذ مقايسة النمو الكبي في الشكل 1. ويبين الشكل 2A-D النمو الكبيبي من الكبيبات المغلفة في نقاط زمنية مختلفة كما لوحظ باستخدام المجهر الخفيف. وتظهر outgrowths في اليوم 2 و 4 و 6(الشكل 2B-D)في الثقافة بعد عزل الكبيبات من الكلى الماوس. من أجل التحقق من صحة أن الخلايا التي تتفوق هي خلايا ظهارية الجدارية ، تم أيضا عزل الكبيبات المزيلة وراثيا واستزراعها لمدة 6 أيام كما هو مبين في الشكل 2E, F. إزالة الكبيبات أظهرت لا خلية خارجة خلال فترة الحضانة في غضون 6 أيام. في الشكل 3، تم تنفيذ تلطيخ الفلوروسنس المناعي لعلامات الخلايا الظهارية الجدارية المختلفة ، وعلامات podocyte محددة وكذلك علامات الخلايا البطانية. النتائج التحقق من صحة أن الخلايا التي تتفوق هي في الواقع الخلايا الظهارية الجدارية. يظهر الشكل 4 نمو كبيبات مغلفة معزولة من cd44-/- مقابل WT الفئران بعد 6 أيام في الثقافة. Glomeruli معزولة عن cd44 -/- وأظهرت الفئران انخفاض عدد الخلايا الخارجة وكذلك انخفاض مساحة السطح من خارج كبيبة مقارنة مع glomeruli معزولة عن الفئران WT، مما يشير إلى دور مهم لD44 في تنشيط الخلية الظهارية الجدارية كما نشرت سابقا11. في الشكل 5، يتم إعطاء مثال ، حيث يتم تحديد مساحة سطح الخلايا الظهارية الجدارية التي تتفوق باستخدام ImageJ.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على طريقة إجراء مقايسة نمو كبيبية لتحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية. (1) يتم تشريح الكلى من الماوس التضحية وممومومة إلى قطع صغيرة. (2) يتم الضغط على أنسجة الكلى من خلال منخل 300 ميكرومتر وشطفها من خلال 75 ميكرومتر و 53 ميكرومتر منخل. (3) يتم جمع Glomeruli التي تبقى على رأس من الغربال باستخدام متوسطة + 20٪ (الخامس / الخامس) FCS ويتم نقلها إلى لوحة مرفق منخفضة للغاية. (4) يتم جمع glomeruli واحد باستخدام مجهر ضوء مقلوب ويتم نقلها إلى لوحات ثقافة 24-well. (5) بعد الحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ (الخامس / الخامس) CO2 لمدة 6 أيام، يمكن تحليل نمو كبيبات الكريات باستخدام المجهر الرقمي المقلوب الضوء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نمو جبيبي من الكبيبات المغلفة المعزولة من الكلى تشريح من الفئران WT. يظهر نمو الجلجومي المغلفة المحتضنة عند 37 درجة مئوية في نقاط زمنية مختلفة: (A) 0 أيام ، (B) 2 أيام ، (C) 4 أيام ، و (D) 6 أيام. كما تم عزل الكبيبات المُفكّلة واستزراعها عند 37 درجة مئوية، وتم التقاط صور مجهرية في( E)يوم 0 و (F)يوم 6 لا يظهر خلايا مجزّأة. قضبان المقياس: (A,E,F)200 ميكرومتر،(B)400 ميكرومتر،(C,D)1000 ميكرومتر. Please click here to view a larger version of this figure.
الشكل 3: الخلايا الكبائلة تتفوق تظهر التعبير عن علامة الخلية الظهارية الجدارية. تم تنفيذ تلطيخ الفلوروس المناعي في اليوم 6 بعد عزل كبيباتولي مغلفة واحدة لوصف الخلايا الظهارية التي تتفوق. الخلايا المطّردة تلطخت إيجابية لعلامات الخلية الظهارية الجدارية: (A) CD44، (B) SSeCKS، و (C) كلودين-1، ولكن لم تظهر التعبير عن (D) علامة الـsaptopodin الخاصة بـ podocyte أو (E)علامة CD31 الخاصة بالخلايا البطانية ، والتي كانت مترجمة حصريًا داخل الكبيّرولو. أشرطة مقياس: (A, B, D, E) 100μm, (C) 50 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ضعف النمو الغلوي في كبيباتولي معزولة من فئران خروج المغلوب CD44. تم عزل كبيباتولي مغلفة من الكلى تشريح (A) WT الفئران و (B) cd44 - / - الفئران. تم التقاط صور مجهرية بعد 6 أيام في الثقافة باستخدام مجهر ضوئي مقلوب رقمي. وقد زاد عدد الخلايا الظهارية الجدارية تتفوق وكذلك مساحة السطح من خارج النمو في كبيبات من الفئران WT مقارنة بcd44-/- الفئران, مما يشير إلى دور مهم لD44 في تنشيط الخلايا الظهارية الجداري. أشرطة المقياس: 1000 μm. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال على تحليل المساحة السطحية للارتزاء الكبيّر كعلامة لانتشار الخلايا الظهارية الجدارية باستخدام ImageJ (فيجي). (أ) Glomerular الخروج من كبيبات مغلفة من WT الماوس بعد 6 أيام في الثقافة في 37 درجة مئوية. (ب) أولاً، يتم تحديد مقياس لتحليل مساحة السطح في مم2. هنا: 1 مم = 460 بكسل. (C) بعد وضع المقياس ، يتم رسم خط التحديد حول منطقة النمو الكبيائي. (D) يمكن بعد ذلك قياس هذه المنطقة المحددة (مساحة السطح في هذا المثال = 2.235 مم2). أشرطة المقياس: 1000 μm. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام البروتوكول الموضح في هذه المقالة، يمكن للمرء استخدام كبيبات مغلفة واحدة لتقييم انتشار الخلايا الظهارية الجدارية التي هي نتيجة لتنشيط خلية الظهارية الجدارية. هذا النموذج السابق vivo سوف تمكننا من دراسة مفصلة المسارات الجزيئية، والتي تشارك في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. تعتمد الطريقة الموصوفة على المفهوم البسيط لتشريح الكلى وغربلة لعزل وثقافة مغلفة الكبيبات ومقارنة انتشار و / أو هجرة الخلايا الظهارية الجدارية في ظل ظروف تجريبية مختلفة. النتائج التي يمكن تحليلها بعد 6 أيام في الثقافة هي ، على سبيل المثال ، مساحة سطح أو قطر النمو أو عدد الخلايا التي تُنم من كبيبات واحدة منحلة. تطبيق آخر لهذا الفحص يمكن أن يكون لدراسة آثار الأدوية التي تحفز أو تمنع المسارات الجزيئية التي قد تشارك في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية.
وأكد تلطيخ الفلوروسين أن الخلايا المتجيشة بعد 6 أيام في الثقافة هي الخلايا الظهارية الجدارية لأنها ملطخة إيجابية لعلامات الخلية الظهارية الجدارية (CD44، كلودين-1، SSeCKS) ولكنها لم تعبر عن علامة المناظير الخاصة بـ podocyte، ولا علامة الخلايا البطانية CD31. تمشيا مع نتائج تلطيخ، لا يمكن ملاحظة الخلايا تتفوق 6 أيام بعد العزل وثقافة الكبيبات أحادية مزيلة، مما يدل على أن هناك تلوث محدود من الخلايا الكبيبية الأخرى في الخلايا خارج نمو خلال هذه الفترة 6 أيام. كما حللت دراسة أخرى النمو الكبيائي وأظهرت أن الخلايا المتكاثرة السريعة المستمدة من النمو الخارجي الكبيائي هي في الواقع تنحدر من الخلايا الظهارية الجدارية14.
ويمكن أيضا أن بروتوكول تلطيخ التي استخدمت لتحليل التعبير علامة من الخلايا التي تتفوق على التكيف لاختبار جزيئات أخرى من الفائدة. تم إجراء الكبت المناعي داخل آبار الألواح التي تم احتضان الكبيميرولي فيها لمدة 6 أيام. ولم تكن هذه الآبار مغلفة، بل كانت كبيبات الآبار مربوطة بالآبار خلال فترة الحضانة الأولى التي كانت 2-3 ساعات. لم يكن من الممكن احتضان على إدراج الزجاج أو نظام شرائح الغرفة التي من شأنها أن تؤدي إلى تحسين التصوير كما لم glomeruli لا نعلق تماما على السطح وتبعية كبيبية كان ضعيفا. تم إعداد هذا البروتوكول المحدد مؤخرًا لدراسة خلية الظهارة الجدارية من glomeruli من WT صحية وcd44-/- الفئران11. وباستخدام هذه الطريقة، تبين أن الخلايا الظهارية الجدارية التي تعاني من نقص في CD44 تظهر انخفاض معدل الانتشار، وهو ما يظهر أيضا في الشكل 4. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للفئران من سلالات أخرى وأيضا للفئران الأخرى المعدلة وراثيا. في دراسة سابقة على سبيل المثال، تم استخدام نهج مماثل لتحليل آثار مستقبلات الجلوكوكورتيكويد التي تشيرإلى 15.
استخدام هذه التقنية لعزل glomeruli من الفئران وتحليل خارج الخلايا لها العديد من المزايا نحو استخدام خطوط الخلايا الظهارية الجدارية الخليدة لتحليل المسارات المشاركة في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية أو الأدوية التي يمكن أن تؤثر على عملية انتشار الخلايا الظهارية. أولا، في هذه الطريقة، وتستخدم الخلايا الأولية التي تنمو مباشرة من الكبيبات و 6 أيام فقط في الثقافة. لذلك، خضعت الخلايا الظهارية الجدارية من النمو الكبيائي لتغييرات أقل في النمط الظاهري مقارنة بخطوط الخلايا الخالدة، والتي تحتاج إلى ممرات نمو إضافية لإنشاء خط الخلية16. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطريقة المذكورة هنا لمقارنة تأثير ضربة قاضية جين معين على انتشار الخلايا الجدارية أيضا بالنسبة للمسارات التي يصعب ضربها في خطوط الخلايا بسبب ضعف نمو الخلايا أو كفاءة خروج الجينات بالضربة القاضية باستخدام أساليب إسكات.
لتكييف البروتوكول مع نماذج حيوانية أخرى أو أنسجة الكلى البشرية، ينبغي تحسين حجم المناخل للحصول على أفضل نتيجة. وذلك لأن حجم الكبيات يختلف بين الأنواع، وبالتالي فإن حجم المناخال الذي يمكن جمع الكبيات يختلف. أيضا، من المهم عزل كريميميرولي مغلفة سليمة لغرض هذا الأسلوب. ولذلك، لا ينبغي الضغط على الكبيبولي ولكن برفق من خلال شطف الغربال الصغيرة.
خطوة أخرى حاسمة في البروتوكول هو جمع glomeruli مغلفة بعد غربلة. هنا، من المهم استخدام المتوسطة مع 20٪ FCS لتجنب التعلق من الكبيبات إلى بعضها البعض. وبالإضافة إلى ذلك، الحل المخصب مع glomeruli ينبغي أن تنقل مباشرة إلى لوحات التصاق منخفضة للغاية لأنه، خلاف ذلك، سوف ترفق بشكل مباشر glomeruli سطح لوحات ثقافة الخلايا العادية وحتى على سطح الأنابيب البلاستيكية مما يجعل من الصعب التقاط وعزل glomeruli واحد.
بعد جمع من كبيباتولي مغلفة واحدة، وينبغي أن تكون هذه مثقف 3 ح في حجم صغير من الاستزراع المتوسطة في مركز البئر للسماح الالتزام. وينبغي تجنب تعويم من الكبيبات نحو الحدود من الآبار لتحسين القراءة أثناء تحليل الصور.
للحصول على أفضل النتائج باستخدام البروتوكول الموضح هنا، نوصي بثقافة glomeruli واحدة وإجراء القراءة في اليوم 6. في هذه المرحلة الزمنية، يمكن ملاحظة نمو خلوي متجانس يتكون من خلايا ظهارية الجدارية. في وقت لاحق من النقاط ، تصبح الانتمائي الكبيّة هدّامة ظاهريًا تشير إلى نمو الخلايا الأخرى. لذلك، لا يبدو أن البروتوكول مناسب لأوقات الحضانة الطويلة جداً. وينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن أوقات الحضانة لرقم الخلية الظهارية الجدارية يمكن أن تختلف بين الأنواع أو بين سلالات الماوس المختلفة. لذلك، ينبغي اختبار أوقات الاستزراع وتحسينها لكل سلالة أو أنواع ماوس. بالإضافة إلى ذلك، يجب التحقق من أصل النمو الكبيائي دائمًا عن طريق تلطيخ علامات الخلايا الظهارية الجدارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة الكلى الهولندية (منحة 14A3D104) والمنظمة الهولندية للبحث العلمي (منحة NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
