Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het kweken en analyseren van glomerulaire pariëtale epitheelceluitgroeien van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Deze methode kan worden gebruikt om trajecten te bestuderen die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie.
Abstract
Pariëtale epitheelcel (PEC) activering is een van de belangrijkste factoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose. Remming van trajecten die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcelactivering kan daarom een hulpmiddel zijn om de progressie van glomerulaire ziekten te verzachten. Dit artikel beschrijft een methode om te cultuur en analyseren pariëtale epitheelcel uitgroei van ingekapselde glomeruli geïsoleerd van de muis nier. Na het ontleden van geïsoleerde muizennieren wordt het weefsel gehakt en glomeruli geïsoleerd door te zeven. Ingekapselde glomeruli worden verzameld, en enkele glomeruli worden gekweekt voor 6 dagen tot glomerulaire uitgroei van pariëtale epitheelcellen te verkrijgen. Tijdens deze periode kunnen pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie worden geanalyseerd door het celgetal of het oppervlak van ontgroeiende cellen te bepalen. Deze test kan daarom worden gebruikt als een instrument om de effecten van een veranderde genexpressie bij transgene- of knock-outmuizen of de effecten van cultuuromstandigheden op pariëtale epitheelcelgroeikenmerken en signalering te bestuderen. Met behulp van deze methode kunnen belangrijke trajecten worden bestudeerd die betrokken zijn bij het proces van pariëtale epitheliale celactivering en bijgevolg bij glomerulosclerose.
Introduction
Glomerulaire ziekten zijn een belangrijke groep nieraandoeningen en vormen een belangrijke oorzaak van nierziekten in het eindstadium (ESRD). Helaas zijn specifieke behandelingsopties beperkt en is progressie naar ESRD onvermijdelijk. Glomerulaire ziekten worden gedefinieerd door de aanwezigheid van glomerulair letsel en kunnen worden gegroepeerd bij ontstekings- en niet-ontstekingsziekten. Hoewel de eerste belediging anders is, hebben recente studies aangetoond dat een gemeenschappelijk cellulair mechanisme leidt tot glomerulaire epitheliale celhyperplasie en uiteindelijk tot glomerulosclerose bij alle glomerulaire ziekten, ongeacht de onderliggende oorzaak1,2,3,4.
Concreet werd aangetoond dat glomermerosclerotische laesies voornamelijk bestaan uit geactiveerde pariëtale epitheelcellen5,6. Onder fysiologische omstandigheden zijn pariëtale epitheelcellen platte rustige epitheliale cellen die de Bowman's capsule van de glomerulus belijnen. Echter, elke glomerulaire schade als gevolg van genetische mutaties (bijvoorbeeld podocyte specifieke of mitochondriale cytopathieën), ontsteking of hyperfiltratie (bijvoorbeeld veroorzaakt door verminderde niermassa, hypertensie, obesitas of diabetische mellitus) kan leiden tot de activering van pariëtale epitheelcellen. Geactiveerde pariëtale epitheelcellen vermenigvuldigen en deponeren extracellulaire matrix wat resulteert in de vorming van cellulaire halve maan of sclerotische laesies5,7,8. Progressie van deze processen resulteert in verlies van nierfunctie9. Daarom is pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke factor in de ontwikkeling en progressie van glomerulosclerose bij zowel ontstekings- als niet-inflammatoire glomerulare ziekten1,2,3,4,10.
De moleculaire processen die pariëtale epitheelcelactivering bemiddelen zijn nog grotendeels onbekend. Recente studies tonen aan dat geactiveerde pariëtale epitheelcellen de novo express CD44, een receptor die belangrijk is voor de activering van verschillende trajecten die betrokken zijn bij cellulaire proliferatie en migratie. Bovendien bleek dat remming van CD44 pariëtale epitheelcelactivering remt en de progressie van halve maanvorming en glomermerorose in diermodellen van ontstekings- en niet-inflammatoire glomerrale ziekten11,12.
Aangezien pariëtale epitheelcelactivering een belangrijke speler is voor de ontwikkeling van glomerulosclerose en halve maanvorming, kan remming van deze cellen de progressie van glomerulaire ziekten vertragen. Opheldering van de moleculaire paden die pariëtale epitheelcelactivering stimuleren, kan leiden tot de ontwikkeling van specifieke therapeutische interventies die de vorming van de hyperplastische en glomerolosclerotische laesies bij glomerrale ziekte verzachten.
In experimentele diermodellen is het vaak moeilijk om bewijs te leveren voor een direct effect van een veranderde genexpressie (knock-outmodellen of transgene muismodellen) of medicamenteuze behandeling op de pariëtale epitheelcellen. Bij een conventionele knock-outmuis kunnen de waargenomen in vivo veranderingen worden verklaard door directe veranderingen in pariëtale epitheelcellen. Aangezien de genexpressie echter ook in andere celtypen binnen de muis wordt gewijzigd, kan men indirecte effecten die door andere celtypen worden bemiddeld, niet uitsluiten. De ontwikkeling van voorwaardelijke cre-lox muizen gedreven door promotors voornamelijk actief in pariëtale epitheelcellen heeft een oplossing in sommige gevallen13. Niettemin zijn voorwaardelijke transgene modellen complex en hoewel er meer voorwaardelijke lijnen beschikbaar komen, is er voor veel van de conventionele knock-out- of transgene muislijnen nog geen voorwaardelijk substituut.
Om de directe effecten op pariëtale epitheelcellen te bestuderen, heeft onze groep een ex vivo test ontwikkeld met behulp van enkele ingekapselde glomeruli geïsoleerd van muizennieren om pariëtale epitheelcelproliferatie en migratie te meten en te analyseren. Deze methode zal ons in staat stellen om pariëtale epitheelcelspecifieke effecten te bepalen en verantwoordelijke trajecten te vinden voor pariëtale epitheelcelactivering en testbehandelingsopties om deze activering te remmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Commissie Dierethiek van de Radboud Universiteit Nijmegen.
OPMERKING: Onbehandelde, gezonde wilde type (WT) muizen (n = 4) en cd44-/- (n = 4) muizen werden geofferd op de leeftijd van 12−16 weken. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt. Alle muizen waren op de C57Bl/6 achtergrond.
1. Muis nierdissectie
- Offer gezonde WT muizen of genetisch veranderde muizen door cervicale dislocatie.
- Ontleden hele muis nieren direct na het offeren van de muizen. Hiervoor voert u een mediane laparotomie uit met een buikschaar, het snijden van de huid en vervolgens de buikspieren. Verwijder de darm en plaats deze naast de muis.
- Bevrijd de nieren van het aansluiten van weefsel en trek de nier met behulp van chirurgische tangen, het snijden van de nierslagader, nierader en ureter met een schaar.
- Verwijder de niercapsules uit de nieren door de nier vast te houden met chirurgische tangen en trek de capsule af met behulp van een ander paar tangen.
- Plaats de nieren in een 6-well cell cultuur plaat (2 nieren / goed) bereid met 2 mL van hanks ' evenwichtige zoutoplossing (HBSS) per goed en plaats op ijs.
2. Isolatie van glomeruli van de muizennier
- Breng de nieren over op een petrischaal van 100 mm en hak de nieren in kleine stukjes van 1−2 mm met behulp van twee scalpels. Houd de gehakte nierstukken nat met behulp van 1−2 mL HBSS.
- Plaats de gehakte nierstukken bovenop een 300 μm metalen zeef en druk de nier door de zeef met behulp van een zuiger van een spuit van 20 mL. Spoel de zeef herhaaldelijk met HBSS ertussen en verzamel de flow-through in een schone petrischaal met behulp van een serologische pipet. Verzamel ook alles wat overblijft / kleeft aan de onderkant van de zeef door het af te schrapen met de scalpel en breng het over naar de verzamelde flow-through (nierhomogenaat).
- Spoel het nierhomogenaat door een 75 μm zeef met HBSS. Verzamel de doorstroom en spoel deze flow-through vervolgens door een zeef van 53 μm. Was beide zeven met HBSS om alle kleinere structuren te verwijderen.
LET OP: In deze stap wordt de stroom-al alleen gespoeld, maar niet geperst door de 75 μm en 53 μm zeef. Wassen met HBSS is noodzakelijk om puin en kleinere structuren op de zeven te verwijderen. Daarom wordt normaal gesproken 200−300 mL HBSS gebruikt. - Verzamel de nierstructuren/het materiaal dat op de zeef van 75 μm en 53 μm achterblijft door het bovenste oppervlak van de zeven te wassen met Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 20% foetaal kalfsserum (FCS) en breng het materiaal over in een 6-well ultra-low attachment microplate.
OPMERKING: Om het bovenste oppervlak van de zeef te wassen, spoelt u de zeef in een gekantelde positie (>45°) en verzamelt u het niermateriaal aan de rand van de zeef. Het verzamelde materiaal is verrijkt voor ingekapselde en gedecapsuleerde glomeruli, met slechts een paar buisvormige fragmenten. Ingekapselde glomeruli zijn erg plakkerig. Om enkele glomeruli te verzamelen, is het daarom belangrijk om te voorkomen dat glomeruli zich aan het oppervlak van een petrischaal of putplaat hechten. Om hechting te voorkomen, gebruik medium met 20% FCS en gebruik ultra-lage bevestigingsplaten voor deze stap.
3. Culturing van glomerulaire uitgroei
- Breng de ultralaage bevestigingsmicroplate naar een omgekeerde lichtmicroscoop en verzamel enkele ingekapselde en/of gedecapsuleerde glomeruli met een pipet van 20 μL. Vermijd het pipetteren van andere structuren en puin. Na het verzamelen van een enkele glomerulus in de pipetpunt, voeg vers DMEM-medium zonder verzameld niermateriaal toe in dezelfde pipetpunt tot een volume van 20 μL.
- Breng de enkele glomerulus met het 20 μL DMEM-medium over naar het midden van een put van een 24-bron celkweekplaat en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C en 5% (v/v) CO2 om gehechtheid van de glomerulus aan het midden van de put mogelijk te maken. Beweeg de plaat voorzichtig om te voorkomen dat de glomerulus naar de boorden van de put zweeft.
- Na 3 uur incubatie is de glomerulus bevestigd aan het midden van de put. Voeg voorzichtig 500 μL endotheel basaal medium (EBM) toe, aangevuld met een groeifactorkit met hydrocortison, menselijke endotheelgroeifactor, runderhersenextract en gentamicine sulfaat-amphotericine B (Tabel van materialen)en nog eens 5% (v/v) FBS en 1% (v/v) penicilline/strep (pen/strep) voor elke put.
- Kweek de enkele glomeruli gedurende 6 dagen bij 37 °C, 5% (v/v) CO2.
OPMERKING: Binnen 6 dagen wordt de uitgroei bestaande uit pariëtale epitheelcellen gevormd. Als men ernaar streeft om de effecten van specifieke verbindingen of geneesmiddelen op de pariëtale epitheelcellen te testen, moet het binnen deze periode van zes dagen aan het medium worden toegevoegd.
4. Analyse van pariëtale epitheelcelproliferatie
- Analyseer de glomerulaire uitgroei na 6 dagen. Maak microscopische beelden met behulp van een digitale omgekeerde lichtmicroscoop.
- Gebruik een beeldanalysesoftware (bijvoorbeeld ImageJ/FIJI) om het oppervlak en de diameter van de glomerular uitgroei te bepalen, en het aantal ontgroeiende cellen of ontgroeiende glomeruli.
- Open de tif om het oppervlak van de glomerulaire uitgroei te bepalen. bestand van de glomerular uitgroei met schaalbalk in ImageJ. Teken een rechte lijn op de schaalbalk en bepaal de afstand in pixels door op analyseren te klikken en te meten (bijvoorbeeld 1 mm = 460 pixel).
- Bepaal de schaal door op analyserente klikken, schaal in te stellen en de bekende afstand in pixel te typen (bijvoorbeeld 460), typ ook de bekende afstand (bijvoorbeeld 1) en de lengte-eenheid (bijvoorbeeld 1 mm). Klik op ok.
- Bepaal welke resultaten in de resultatentabel worden weergegeven door op analyseren te klikken en vervolgens metingen in te stellen. Activeer het optiegebied en het weergavelabel om de oppervlakte van de glomerulaire uitgroei te bepalen. Klik op ok.
- Om de oppervlakte van de glomerulaire uitgroei te bepalen, trek een vrije hand selectie rond de glomerulaire uitgroei. Klik op analyseren en meet vervolgens, er verschijnt een resultaattabel in ImageJ met het oppervlak van uitgroei in de eerder bepaalde schaal (zie stap 4.4, bijvoorbeeld mm2).
5. Karakterisering van de glomerulaire celuitgroei
OPMERKING: Om de cellulaire samenstelling van de uitgroei te beoordelen, worden immunofluorescentievlekken voor celspecifieke markers uitgevoerd op de glomerulaire uitwassen bij t = 6 dagen.
- Verwijder het medium voorzichtig en was de glomeruli twee maal voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Fixeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) aangevuld met 4% (w/v) sacharose in PBS en zorgvuldig wassen 2x met PBS.
- Incubeer met het primaire antilichaam met de juiste concentratie(Tabel van materialen) verdund in PBS-eiine serum albumine (BSA) 1% (v/v) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de antilichaamoplossing en was 3x voorzichtig met PBS.
- Incubeer met secundair antilichaam (Tabel van materialen) verdund in PBS-BSA 1% (v/v) in het donker gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
- Zorgvuldig wassen 3x met PBS en monteren met behulp van 1−2 druppels waterige montage medium met 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om kernen te visualiseren en de put te bedekken met een ronde cover slip.
- Neem microscopische beelden met behulp van een fluorescerende microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een systematisch diagram van de methode om de glomerulaire uitgroeitest uit te voeren wordt weergegeven in figuur 1. Figuur 2A-D toont glomerulaire uitwassen van ingekapselde glomeruli op verschillende tijdstippen zoals waargenomen met behulp van lichte microscopie. Uitwassen worden op dag 2, 4 en 6(figuur 2B-D)in de cultuur weergegeven na glomerulus isolatie van de muizennier. Om te valideren dat de uitgroeiende cellen pariëtale epitheelcellen zijn, zijn de uitgesloten glomeruli ook 6 dagen geïsoleerd en gekweekt, zoals blijkt uit figuur 2E,F. Gedecapsuleerde glomeruli vertoonde geen celuitgroei tijdens de incubatietijd binnen 6 dagen. In figuur 3werd immunofluorescentiekleuring uitgevoerd voor verschillende pariëtale epitheelcelmarkeringen, podocytespecifieke markers en endotheelcelmarkeringen. De resultaten valideren dat de ontgroeiende cellen inderdaad pariëtale epitheelcellen zijn. Figuur 4 toont de uitvloeisel van geïsoleerde ingekapselde glomeruli van cd44-/- vs WT-muizen na 6 dagen in cultuur. Glomeruli geïsoleerd van cd44-/- muizen toonden een verminderd aantal uitwassende cellen, evenals een verminderd oppervlak van glomerulaire uitgroei in vergelijking met de glomeruli geïsoleerd van WT muizen, wat wijst op een belangrijke rol voor CD44 in pariëtale epitheelcelactivering zoals eerder gepubliceerd11. In figuur 5wordt een voorbeeld gegeven, waarin het oppervlak van de ontgroeiende pariëtale epitheelcellen wordt bepaald met ImageJ.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de methode om een glomerulaire uitgroeitest uit te voeren om pariëtale epitheelcelproliferatie te analyseren. (1) Nieren worden ontleed van geofferde muis en gehakt in kleine stukjes. (2) Nierweefsel wordt door de zeef van 300 μm geperst en door de zeven van 75 μm en 53 μm gespoeld. (3) Glomeruli die bovenop de zeven blijven, worden verzameld met behulp van medium + 20% (v/v) FCS en worden overgebracht naar een ultralaage bevestigingsplaat. (4) Enkele glomeruli worden verzameld met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop en worden overgebracht naar 24-well kweekplaten. (5) Na incubatie bij 37 °C, 5% (v/v) CO2 gedurende 6 dagen, kan glomerulaire uitgroei worden geanalyseerd met behulp van een digitale omgekeerde lichtmicroscoop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Glomerulaire uitvloeisel van geïsoleerde ingekapselde glomeruli uit nieren ontleed van WT-muizen. De uitgroei van ingekapselde glomeruli geïncubeerd bij 37 °C wordt weergegeven op verschillende tijdstippen: (A) 0 dagen, (B) 2 dagen, (C) 4 dagen en (D) 6 dagen. Gedecapsuleerde glomeruli werden ook geïsoleerd en gekweekt bij 37 °C en microscopische beelden werden genomen op (E) dag 0 en (F) dag 6 waaruit geen uitwassen cellen. Schaalbalken: (A,E,F) 200 μm, (B) 400 μm, (C,D) 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Ontgroeiende glomerulaire cellen vertonen expressie van pariëtale epitheelcelmarkering. Immunofluorescentie kleuring werd uitgevoerd op dag 6 na isolatie van enkele ingekapselde glomeruli om de ontgroeiende epitheelcellen te karakteriseren. Uitgroeiende cellen gekleurd positief voor pariëtale epitheelcelmarkers: (A) CD44, (B) SSeCKS, en (C) claudin-1, maar niet tonen expressie van (D) de podocyte-specifieke marker synaptopodin of (E) de endotheel cel-specifieke marker CD31, die uitsluitend werden gelokaliseerd in de glomerulus. Schaalbalken: (A,B,D,E) 100μm, (C) 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Glomerulaire uitgroei is aangetast in glomeruli geïsoleerd van CD44 knock-out muizen. Ingekapselde glomeruli werden geïsoleerd uit ontleede nieren van (A) WT muizen en (B) cd44-/- muizen. Microscopische foto's werden genomen na 6 dagen in de cultuur met behulp van een digitale omgekeerde lichtmicroscoop. Het aantal ontgroeiende pariëtale epitheelcellen en het oppervlak van uitgroei werd verhoogd in de glomeruli van WT-muizen in vergelijking met cd44-/- muizen, wat een belangrijke rol suggereert voor CD44 in pariëtale epitheliale celactivering. Schaalbalken: 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Een voorbeeld van de analyse van het oppervlak van de glomerulaire uitgroei als een marker voor pariëtale epitheelcelproliferatie met ImageJ (FIJI). (A) Glomerulaire uitgroei van een ingekapselde glomerulus van een WT-muis na 6 dagen in cultuur bij 37 °C. (B) Ten eerste wordt de schaal bepaald om het oppervlak in mm2te analyseren . Hier: 1 mm = 460 pixel. (C) Na het instellen van de schaal wordt een selectielijn getrokken rond het gebied van glomerulaire uitgroei. (D) Dit geselecteerde gebied kan dan worden gemeten (oppervlakte in dit voorbeeld = 2.235 mm2). Schaalbalken: 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van het protocol beschreven in dit artikel, kan men gebruik maken van enkele ingekapselde glomeruli te evalueren pariëtale epitheelcelproliferatie die een gevolg is van pariëtale epitheelcel activering. Dit ex vivo model zal ons in staat stellen om in detail te bestuderen van de moleculaire trajecten, die betrokken zijn bij pariëtale epitheelcel activering. De beschreven methode is gebaseerd op het eenvoudige concept van nierdissectie en zeven om glomeruli te isoleren en te kweken en te vergelijken en proliferatie en/of migratie van pariëtale epitheelcellen onder verschillende experimentele omstandigheden te vergelijken. De resultaten die kunnen worden geanalyseerd na 6 dagen in de cultuur zijn, bijvoorbeeld, het oppervlak of de diameter van de uitgroei of het aantal uitgroeiende cellen van een enkele capsulated glomerulus. Een andere toepassing voor deze test zou kunnen zijn om de effecten van geneesmiddelen die induceren of remmen moleculaire trajecten die kunnen worden betrokken bij pariëtale epitheliale cel activering te bestuderen.
Immunofluorescentie kleuring bevestigd dat de ontgroeiende cellen na 6 dagen in de cultuur zijn pariëtale epitheelcellen als ze gekleurd positief voor de pariëtale epitheelcelmarkeringen (CD44, claudin-1, SSeCKS), maar niet uitdrukken de podocyte-specifieke marker synaptopodine, noch de endothelial cell marker CD31. In overeenstemming met de resultaten van de kleuring, geen uitgroeiende cellen kunnen worden waargenomen 6 dagen na isolatie en cultuur van enkele decapsulated glomeruli, wat aangeeft dat er beperkte besmetting van andere glomerulaire cellen in de cel uitgroei binnen deze periode van 6 dagen. Een andere studie analyseerde ook glomerulaire uitgroei en toonde aan dat de snel vermenigvuldigende cellen afgeleid van de glomerulaire uitgroei inderdaad afstammeling zijn van pariëtale epitheelcellen14.
Het kleuringsprotocol dat werd gebruikt om de markerexpressie van de ontgroeiende cellen te analyseren, kan ook worden aangepast om andere moleculen van belang te testen. De immunostaining werd uitgevoerd in de putten van de platen waarin glomeruli gedurende 6 dagen werden geïncubeerd. Deze putten waren niet gecoat, maar glomeruli bevestigd aan de putten tijdens de eerste 2−3 h incubatie. Incubatie op glazen wisselplaten of een schuifsysteem voor kamers dat zou leiden tot een betere beeldvorming was niet mogelijk omdat glomeruli zich niet volledig aan het oppervlak hechtte en de glmervormige uitgroei werd aangetast. Dit specifieke protocol is onlangs opgezet om de pariëtale epithelia celgroei te bestuderen van glomeruli van gezonde WT en cd44-/- muizen11. Met behulp van deze methode werd aangetoond dat CD44-deficiënte pariëtale epitheelcellen een verminderde proliferatie vertonen, wat ook wordt aangetoond in figuur 4. Deze methode kan ook worden gebruikt voor muizen van andere stammen en ook voor andere genetisch veranderde muizen. In een eerdere studie bijvoorbeeld werd een vergelijkbare benadering gebruikt om de effecten van glucocorticoïde receptor signalering15te analyseren.
Het gebruik van deze techniek om glomeruli te isoleren van muizen en de cellulaire uitwassen te analyseren heeft vele voordelen ten opzichte van het gebruik van vereeuwigde pariëtale epitheelcellijnen voor de analyse van paden die betrokken zijn bij pariëtale epitheliale celactivering of geneesmiddelen die het proces van epitheliale celproliferatie kunnen beïnvloeden. Ten eerste worden bij deze methode primaire cellen gebruikt die rechtstreeks uit de glomerulus groeien en slechts 6 dagen in cultuur zijn. Daarom ondergingen de pariëtale epitheelcellen uit glomerulaire uitwassen minder veranderingen in fenotype in vergelijking met vereeuwigde cellijnen, die extra groeipassages nodig hebben om de cellijn16te creëren. Bovendien kan de hier beschreven methode worden gebruikt om het effect van specifieke gen-knock-out op pariëtale celproliferatie te vergelijken, ook voor trajecten die moeilijk uit te schakelen zijn in cellijnen vanwege verminderde celgroei of efficiëntie van gen knock-out met behulp van uitschakelingsmethoden.
Om het protocol aan te passen aan andere diermodellen of aan menselijk nierweefsel, moet de grootte van de zeven worden geoptimaliseerd om het beste resultaat te verkrijgen. Dit komt omdat de glomerulaire grootte verschilt tussen soorten en dus de grootte van de zeven waarop de glomeruli kunnen worden verzameld varieert. Ook is het belangrijk om intact ingekapselde glomeruli te isoleren voor het doel van deze methode. Daarom mag de glomeruli niet worden ingedrukt, maar voorzichtig door de kleinere zeven worden gespoeld.
Een andere kritieke stap in het protocol is de inzameling van ingekapselde glomeruli na het zeven. Hier is het belangrijk om medium met 20% FCS te gebruiken om gehechtheid van glomeruli aan elkaar te voorkomen. Bovendien moet de met glomeruli verrijkte oplossing rechtstreeks worden overgebracht naar ultralaage hechtingsplaten, omdat glomeruli anders rechtstreeks zal worden bevestigd aan het oppervlak van gewone celkweekplaten en zelfs aan het oppervlak van kunststof buizen, waardoor het moeilijk is om enkele glomeruli vast te leggen en te isoleren.
Na het verzamelen van enige ingekapselde glomeruli, zouden deze 3 h in een klein volume van het kwekende middel in het centrum van de put moeten worden gekweekt om aanhankelijkheid toe te staan. Zweven van de glomeruli naar de koster van de putten moet worden vermeden om de uitlezing tijdens beeldanalyse te optimaliseren.
Om de beste resultaten te verkrijgen met behulp van het protocol dat hier wordt beschreven, raden we aan om een enkele glomeruli te cultuur en de uitlezing uit te voeren op dag 6. Op dit moment kan een homogene cellulaire uitgroei bestaande uit pariëtale epitheelcellen worden waargenomen. Op latere punten wordt glomerulaire uitgroei fenotypisch heterogene aangeeft dat uitgroei van andere celtypen. Daarom lijkt het protocol niet geschikt voor zeer lange incubatietijden. Men moet in gedachten houden dat incubatietijden voor pariëtale epitheelceluitgroei kan variëren tussen soorten of tussen verschillende muizenstammen. Daarom moeten de kweektijden worden getest en geoptimaliseerd voor elke muissoort of -soort. Bovendien moet de oorsprong van glomerulaire uitgroei altijd worden gevalideerd door kleuring voor pariëtale epitheelcelspecifieke markers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door Dutch Kidney Foundation (subsidie 14A3D104) en NWO VIDI subsidie: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
