Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultivierung und Analyse glomerulären parietalen Epithelzellauswüchsen von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert sind. Diese Methode kann verwendet werden, um Wege zu untersuchen, die an der Proliferation und Migration von parietalen Epithelzellen beteiligt sind.
Abstract
Die Aktivierung der Parietalepithelzelle (PEC) ist einer der Schlüsselfaktoren, die an der Entwicklung und Progression der Glomerulosklerose beteiligt sind. Die Hemmung von Wegen, die an der Aktivierung parietaler Epithelzellen beteiligt sind, könnte daher ein Werkzeug sein, um das Fortschreiten glomerulärer Erkrankungen abzumildern. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Kultur und Analyse parietaler Epithelzellauswüchse von verkapselten Glomeruli, die aus der Mausniere isoliert wurden. Nach der Sezieren isolierter Mausnieren wird das Gewebe gehackt, und Glomeruli werden durch Sieben isoliert. Verkapselte Glomeruli werden gesammelt, und einzelne Glomeruli werden für 6 Tage kultiviert, um ein glomeruläres Auswachsen von parietalen Epithelzellen zu erhalten. Während dieser Zeit kann die Verbreitung und Migration von parietalen Epithelzellen analysiert werden, indem die Zellzahl oder die Oberfläche der auswachsenden Zellen bestimmt wird. Dieser Assay kann daher als Werkzeug verwendet werden, um die Auswirkungen einer veränderten Genexpression bei transgenen oder Knockout-Mäusen oder die Auswirkungen von Kulturbedingungen auf parietale Epithelzellwachstumseigenschaften und Signalisierung zu untersuchen. Mit dieser Methode können wichtige Wege untersucht werden, die am Prozess der parietalen Epithelzellaktivierung und damit bei Glomerulosklerose beteiligt sind.
Introduction
Glomeruläre Erkrankungen sind eine wichtige Gruppe von Nierenerkrankungen und stellen eine Hauptursache für Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD) dar. Leider sind spezifische Behandlungsmöglichkeiten begrenzt, und der Übergang zum ESRD ist unvermeidlich. Glomeruläre Erkrankungen werden durch das Vorhandensein von glomerulären Verletzungen definiert und können in entzündlichen und nicht-entzündlichen Erkrankungen gruppiert werden. Obwohl die anfängliche Beleidigung anders ist, haben neuere Studien gezeigt, dass ein gemeinsamer zellulärer Mechanismus zu glomerulärer Epithelzellhyperplasie und letztlich zu Glomerulosklerose bei allen glomerulären Erkrankungen führt, unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache1,2,3,4.
Insbesondere wurde gezeigt, dass glomerulosklerotische Läsionen hauptsächlich aus aktivierten parietalen Epithelzellen5,6bestehen. Unter physiologischen Bedingungen sind parietale Epithelzellen flache, ruhende Epithelzellen, die die Bowman-Kapsel des Glomerulus säumen. Jedoch kann jede glomeruläre Verletzung, die entweder auf genetische Mutationen (z. B. Podozytenspezifische oder mitochondriale Zytopathien), Entzündungen oder Hyperfiltrationen (z. B. verursacht durch verminderte Nierenmasse, Bluthochdruck, Fettleibigkeit oder diabetischen Mellitus) zurückzuführen sind, die Aktivierung parietaler Epithelzellen auslösen. Aktivierte parietale Epithelzellen vermehren sich und deponieren extrazelluläre Matrix, was zur Bildung von zellulären Halbmonken oder sklerotischen Läsionen5,7,8führt. Das Fortschreiten dieser Prozesse führt zum Verlust der Nierenfunktion9. Daher ist die Aktivierung der parietalen Epithelzellaktivierung ein Schlüsselfaktor für die Entwicklung und das Fortschreiten der Glomerulosklerose bei entzündlichen und nicht-entzündlichen glomerulären Erkrankungen1,2,3,4,10.
Die molekularen Prozesse, die die Aktivierung parietaler Epithelzellen vermitteln, sind noch weitgehend unbekannt. Jüngste Studien zeigen, dass aktivierte parietale Epithelzellen de novo EXPRESS CD44, ein Rezeptor, der für die Aktivierung verschiedener Wege an der Zellproliferation und Migration beteiligt ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Hemmung von CD44 die aktivierung der parietalen Epithelzellaktivierung hemmt und das Fortschreiten der Halbmondbildung und Glomerulosklerose in Tiermodellen entzündlicher sowie nichtentzündlicher glomerulärer Erkrankungen11,12abmildert.
Da die Aktivierung der parietalen Epithelzellen ein wichtiger Akteur für die Entwicklung von Glomerulosklerose und Halbmondbildung ist, könnte die Hemmung dieser Zellen das Fortschreiten glomerulärer Erkrankungen verlangsamen. Die Aufklärung der molekularen Bahnen, die die Aktivierung parietaler Epithelzellen vorantreiben, kann zur Entwicklung spezifischer therapeutischer Interventionen führen, die die Bildung der hyperplastischen und glomeruloklerotischen Läsionen bei glomerulären Erkrankungen dämpfen.
In experimentellen Tiermodellen ist es häufig schwierig, Beweise für eine direkte Wirkung einer veränderten Genexpression (Knock-out-Modelle oder transgene Mausmodelle) oder einer medikamentösen Behandlung auf die parietalen Epithelzellen zu liefern. Bei einer herkömmlichen Knock-out-Maus können die beobachteten In-vivo-Veränderungen durch direkte Veränderungen in parietalen Epithelzellen erklärt werden. Da die Genexpression jedoch auch in anderen Zelltypen innerhalb der Maus verändert wird, kann man indirekte Effekte, die von anderen Zelltypen vermittelt werden, nicht ausschließen. Die Entwicklung von bedingten Cre-Lox-Mäusen, die von Promotoren angetrieben werden, die hauptsächlich in parietalen Epithelzellen aktiv sind, hat in einigen Fällen eine Lösung für13geliefert. Dennoch sind bedingte transgene Modelle komplex, und obwohl mehr bedingte Linien verfügbar werden, gibt es für viele der herkömmlichen Knock-out- oder transgenen Mauslinien noch keinen bedingten Ersatz.
Um die direkten Auswirkungen auf parietale Epithelzellen zu untersuchen, hat unsere Gruppe einen Ex-vivo-Assay mit einzelnen verkapselten Glomeruli entwickelt, die aus Mausnieren isoliert wurden, um die Proliferation und Migration parietaler Epithelzellen zu messen und zu analysieren. Diese Methode wird es uns ermöglichen, parietale epitheliale zellspezifische Effekte zu bestimmen und verantwortliche Wege für die Aktivierung parietaler Epithelzellen zu finden und Behandlungsoptionen zu testen, um diese Aktivierung zu hemmen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Tierethikkommission der Radboud Universität Nijmegen durchgeführt.
HINWEIS: Unbehandelte, gesunde Wildtyp-Mäuse (n = 4) und cd44-/- (n = 4) Mäuse wurden im Alter von 12 bis 16 Wochen geopfert. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet. Alle Mäuse waren auf dem C57Bl/6 Hintergrund.
1. Maus-Nieren-Sektion
- Opfern Sie gesunde WT-Mäuse oder genetisch veränderte Mäuse durch zervikale Dislokation.
- Sezieren Sie ganze Mausnieren direkt nach dem Opfern der Mäuse. Führen Sie dazu eine mediane Laparotomie mit einer Bauchschere durch, schneiden Sie die Haut und dann die Bauchmuskeln. Entfernen Sie den Darm und legen Sie ihn neben die Maus.
- Befreien Sie die Nieren vom Verbinden des Gewebes und ziehen Sie die Niere mit chirurgischen Zangen heraus, schneiden Sie die Nierenarterie, Nierenvene und Harnleiter mit einer Schere.
- Entfernen Sie die Nierenkapseln von den Nieren, indem Sie die Niere mit chirurgischen Zangen halten und ziehen Sie die Kapsel mit einem anderen Paar Zangen ab.
- Die Nieren in eine 6-Well-Zellkulturplatte (2 Nieren/gut) mit 2 ml Von Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) pro Brunnen aufbereiten und auf Eis legen.
2. Isolierung von Glomeruli von der Mausniere
- Die Nieren in eine 100 mm Petrischale geben und die Nieren mit zwei Skalpellen in kleine Stücke von 1 x 2 mm zerkleinern. Halten Sie die gehackten Nierenstücke nass mit 1 x 2 ml HBSS.
- Legen Sie die gehackten Nierenstücke auf ein 300 m großes Metallsieb und drücken Sie die Niere mit einem Kolben einer 20 ml Spritze durch das Sieb. Spülen Sie das Sieb mit HBSS dazwischen wiederholt ab und sammeln Sie den Durchfluss in einer sauberen Petrischale mit einer serologischen Pipte. Sammeln Sie auch alles, was an der Unterseite des Siebes bleibt/klebt, indem Sie es mit dem Skalpell abkratzen und auf den gesammelten Durchfluss (Nierenhomogenat) übertragen.
- Spülen Sie die Niere durch ein 75-m-Sieb mit HBSS. Sammeln Sie den Durchfluss und spülen Sie diesen Durchfluss anschließend durch ein 53 m Sieb. Waschen Sie beide Siebe mit HBSS, um alle kleineren Strukturen zu entfernen.
ANMERKUNG: In diesem Schritt wird der Durchfluss nur durch das 75-m- und 53-m-Sieb gepresst, aber nicht gedrückt. Das Waschen mit HBSS ist notwendig, um Schmutz und kleinere Strukturen auf den Sieben zu entfernen. Daher werden in der Regel insgesamt 200 bis 300 ml HBSS verwendet. - Sammeln Sie die Nierenstrukturen/-materialien, die auf dem 75'm- und 53-m-Sieb verbleiben, indem Sie die Oberseite der Siebe mit dem modifizierten Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 20% fetalem Kalbsserum (FCS) waschen und das Material in eine 6-Well ultra-low Attachment Mikroplatte übertragen.
HINWEIS: Um die Oberseite des Siebes zu waschen, spülen Sie das Sieb in einer gekippten Position (>45°) ab und sammeln Sie das Nierenmaterial am Rand des Siebs. Das gesammelte Material ist für gekapselte sowie entkapselte Glomeruli angereichert und zeigt nur wenige röhrenförmige Fragmente. Verkapselte Glomeruli sind sehr klebrig. Um einzelne Glomeruli zu sammeln, ist es daher wichtig, zu verhindern, dass Glomeruli an der Oberfläche einer Petrischale oder einer Brunnenplatte haften. Um die Haftung zu vermeiden, verwenden Sie Medium mit 20% FCS und verwenden Sie ultra-niedrige Befestigungsplatten für diesen Schritt.
3. Kultivierung des glomerulären Auswuchses
- Bringen Sie die ultra-niedrige Befestigungsmikroplatte zu einem invertierten Lichtmikroskop und sammeln Sie einzelne gekapselte und/oder gekapselte Glomeruli mit einer 20-L-Pipette. Vermeiden Sie Pipettierung anderer Strukturen und Trümmer. Nach dem Sammeln eines einzelnen Glomerulus in der Pipettenspitze, fügen Sie frisches DMEM-Medium ohne gesammeltes Nierenmaterial in die gleiche Pipettenspitze zu einem Volumen von 20 l.
- Übertragen Sie den einzelnen Glomerulus mit dem 20-L-DMEM-Medium in die Mitte eines Brunnens einer 24-Well-Zellkulturplatte und brüten für 3 h bei 37 °C und 5% (v/v)CO2, um die Befestigung des Glomerulus an der Mitte des Brunnens zu ermöglichen. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um das Schweben des Glomerulus zu den Boardern des Brunnens zu vermeiden.
- Nach 3 h Inkubation ist der Glomerulus an der Mitte des Brunnens befestigt. Fügen Sie sorgfältig 500 l Endothel-Basalmedium (EBM) hinzu, ergänzt durch ein Wachstumsfaktor-Kit, das Hydrocortison, humanen endothelialen Wachstumsfaktor, Rinderhirnextrakt und Gentamicinsulfat-Amphotericin B (Materialtabelle)und zusätzliche 5% (v/v) FBS und 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) enthält.
- Kultur die einzelnen Glomeruli für 6 Tage bei 37 °C, 5% (v/v) CO2.
HINWEIS: Innerhalb von 6 Tagen bildet sich das Auswuchs, das aus parietalen Epithelzellen besteht. Wenn man die Auswirkungen bestimmter Verbindungen oder Medikamente auf die parietalen Epithelzellen testen will, sollte es innerhalb dieses Sechs-Tage-Zeitraums dem Medium zugesetzt werden.
4. Analyse der parietalen Epithelzellproliferation
- Analysieren Sie das glomeruläre Auswuchs nach 6 Tagen. Nehmen Sie mikroskopische Bilder mit einem digitalen invertierten Lichtmikroskop auf.
- Verwenden Sie eine Bildanalyse-Software (z. B. ImageJ/FIJI), um die Oberfläche und den Durchmesser des glomerulären Auswuchses und die Anzahl der auswachsenden Zellen oder überwachsenden Glomeruli zu bestimmen.
- Um die Oberfläche des glomerulären Auswuchses zu bestimmen, öffnen Sie das tif. Datei des glomerulären Auswuchses mit Skalenbalken in ImageJ. Zeichnen Sie eine gerade Linie auf der Maßstabsleiste und bestimmen Sie den Abstand in Pixeln, indem Sie auf Analysieren und Messen klicken (z. B. 1 mm = 460 Pixel).
- Bestimmen Sie die Skala, indem Sie auf analysierenklicken, die Skala festlegen und den bekannten Abstand in Pixel (z. B. 460) eingeben, geben Sie auch den bekannten Abstand (z. B. 1) und die Längeneinheit (z. B. 1 mm) ein. Klicken Sie auf OK.
- Bestimmen Sie, welche Ergebnisse in der Ergebnistabelle angezeigt werden, indem Sie auf Analysieren klicken und dann Messungen festlegen. Um die Oberfläche des glomerulären Auswachsens zu bestimmen, aktivieren Sie den Optionsbereich und die Anzeigebeschriftung. Klicken Sie auf OK.
- Um die Oberfläche des glomerulären Auswuchses zu bestimmen, ziehen Sie eine Freihandauswahl um das glomeruläre Auswachsen. Klicken Sie auf Analysieren und dann messen, eine Ergebnistabelle erscheint in ImageJ, die die Fläche des Auswachsens in der zuvor ermittelten Skala anzeigt (siehe Schritt 4.4, z. B. mm2).
5. Charakterisierung des glomerulären Zellwachstums
HINWEIS: Um die zelluläre Zusammensetzung des Auswuchses zu beurteilen, werden Immunfluoreszenzfärbungen für zellspezifische Marker an den glomerulären Auswüchsen bei t = 6 Tagen durchgeführt.
- Entfernen Sie das Medium vorsichtig und waschen Sie die Glomeruli vorsichtig zweimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS).
- Fixieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur mit 2% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) ergänzt mit 4% (w/v) Saccharose in PBS und sorgfältig 2x mit PBS waschen.
- Mit dem primärantikörper mit entsprechender Konzentration (Materialtabelle) in PBS-Ovine Serumalbumin (BSA) 1% (v/v) für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt inkubieren.
- Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie 3x sorgfältig mit PBS.
- Inkubieren mit sekundärem Antikörper (Materialtabelle) in PBS-BSA 1% (v/v) im Dunkeln für 45 min bei Raumtemperatur verdünnt.
- 3x mit PBS sorgfältig waschen und mit 1-2 Tropfen wässrigem Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) montieren, um Kerne zu visualisieren und den Brunnen mit einem runden Deckelschlupf zu bedecken.
- Nehmen Sie mikroskopische Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.
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Representative Results
Abbildung 1zeigt ein systematisches Diagramm der Methode zur Durchführung des glomerulären Auswuchs-Assays. Abbildung 2A-D zeigt glomeruläre Auswüchse von gekapselten Glomeruli zu verschiedenen Zeitpunkten, wie sie mit der Lichtmikroskopie beobachtet wurden. Auswüchse werden an Tag 2, 4 und 6 (Abbildung 2B-D) in der Kultur nach Glomerulus-Isolierung von der Mausniere gezeigt. Um zu bestätigen, dass es sich bei den auswachsenden Zellen um parietale Epithelzellen handelt, wurden auch entkapselte Glomeruli für 6 Tage isoliert und kultiviert, wie in Abbildung 2E,Fdargestellt. Decapsulated glomeruli zeigte während der Inkubationszeit innerhalb von 6 Tagen kein Zellwachstum. In Abbildung 3wurde die Immunfluoreszenzfärbung für verschiedene parietale Epithelzellmarker, Podozyten-spezifische Marker sowie Endothelzellmarker durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei den auswachsenden Zellen tatsächlich um parietale Epithelzellen handelt. Abbildung 4 zeigt das Wachstum isolierter verkapselter Glomeruli von cd44-/- vs. WT-Mäusen nach 6 Tagen in der Kultur. Glomeruli, isoliert von cd44-/- Mäusen, zeigten eine verringerte Anzahl von auswachsenden Zellen sowie eine verminderte Oberfläche des glomerulären Auswuchses im Vergleich zu den von WT-Mäusen isolierten Glomeruli, was auf eine wichtige Rolle für CD44 bei der parietalen Epithelzellaktivierung hindeutet, wie zuvor veröffentlicht11. In Abbildung 5wird ein Beispiel gegeben, in dem die Oberfläche der überwachsenden parietalen Epithelzellen mit ImageJ bestimmt wird.
Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Methode zur Durchführung eines glomerulären Auswuchs-Assays zur Analyse der epitheliaalen Zellproliferation. (1) Nieren werden von geopferter Maus seziert und in kleine Stücke zerkleinert. (2) Nierengewebe wird durch das 300-m-Sieb gepresst und durch die 75-m- und 53-m-Siebe abspült. (3) Glomeruli, die auf den Sieben bleiben, werden mit medium + 20% (v/v) FCS gesammelt und auf eine ultraniedrige Befestigungsplatte übertragen. (4) Einzelne Glomeruli werden mit einem invertierten Lichtmikroskop gesammelt und auf 24-Well-Kulturplatten übertragen. (5) Nach der Inkubation bei 37 °C, 5% (v/v)CO2 für 6 Tage kann das glomeruläre Auswachsen mit einem digitalen invertierten Lichtmikroskop analysiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Glomeruläres Auswachsen von isolierten verkapselten Glomeruli aus Nieren, die von WT-Mäusen seziert wurden. Das Wachstum von verkapselten Glomeruli, die bei 37 °C inkubiert werden, wird zu verschiedenen Zeitpunkten angezeigt: (A) 0 Tage, (B) 2 Tage, (C) 4 Tage und (D) 6 Tage. Dekapitulierte Glomeruli wurden ebenfalls isoliert und bei 37 °C kultiviert, und mikroskopische Bilder wurden amTag0 und (F) Tag 6 aufgenommen, die keine auswachsenden Zellen zeigten. Skalenbalken: (A,E,F) 200 'm, (B) 400 'm, (C,D) 1000 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswachsende glomeruläre Zellen zeigen die Expression des parietalen Epithelzellmarkers. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde am 6. Tag nach Isolierung einzelner verkapselter Glomeruli durchgeführt, um die überwachsenden Epithelzellen zu charakterisieren. Auswachsende Zellen, die positiv für parietale Epithelzellmarker gefärbt wurden: (A) CD44, (B) SSeCKS und (C) claudin-1, zeigten aber keine Expression von (D) dem podozytenspezifischen Marker Synaptopodin oder (E) dem endotheliaalen zellspezifischen Marker CD31, die ausschließlich im Glomerulus lokalisiert waren. Skalenbalken: (A,B,D,E) 100'm, (C) 50 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Glomeruläres Auswuchs wird in Glomeruli beeinträchtigt, die von CD44-Knockout-Mäusen isoliert sind. Verkapselte Glomeruli wurden aus sezierten Nieren von (A) WT-Mäusen und (B) cd44-/- Mäusen isoliert. Mikroskopische Bilder wurden nach 6 Tagen in Kultur mit einem digitalen invertierten Lichtmikroskop aufgenommen. Die Anzahl der auswachsenden parietalen Epithelzellen sowie die Oberfläche des Auswuchses wurde in den Glomeruli von WT-Mäusen im Vergleich zu cd44-/- Mäusen erhöht, was auf eine wichtige Rolle für CD44 bei der Aktivierung parietaler Epithelzellen hindeutet. Maßstabsbalken: 1000 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ein Beispiel für die Analyse der Oberfläche des glomerulären Auswuchses als Marker für die parietale Epithelzellproliferation mit ImageJ (FIJI). (A) Glomeruläres Auswachsen eines verkapselten Glomerulus einer WT-Maus nach 6 Tagen in Kultur bei 37 °C. (B) Zunächst wird die Skala bestimmt, um die Oberfläche in mm2zu analysieren. Hier: 1 mm = 460 Pixel. (C) Nach dem Festlegen der Skala wird eine Auswahllinie um den Bereich des glomerulären Auswuchses gezeichnet. (D) Dieser ausgewählte Bereich kann dann gemessen werden (Oberfläche in diesem Beispiel = 2.235 mm2). Maßstabsbalken: 1000 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll kann man einzelne gekapselte Glomeruli verwenden, um die parietale Epithelzellproliferation zu bewerten, die eine Folge der parietalen Epithelzellaktivierung ist. Dieses Ex-vivo-Modell wird es uns ermöglichen, die molekularen Bahnen, die an der parietalen Epithelzellaktivierung beteiligt sind, im Detail zu untersuchen. Die beschriebene Methode beruht auf dem einfachen Konzept der Nierensektion und Siebung, um verkapselte Glomeruli zu isolieren und zu kulturieren und die Proliferation und/oder Migration von parietalen Epithelzellen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu vergleichen. Die Ergebnisse, die nach 6 Tagen in der Kultur analysiert werden können, sind zum Beispiel die Oberfläche oder der Durchmesser des Auswuchses oder die Anzahl der auswachsenden Zellen eines einzelnen capsulierten Glomerulus. Eine weitere Anwendung für diesen Test könnte sein, die Wirkung von Medikamenten zu untersuchen, die molekulare Bahnen induzieren oder hemmen, die an der Aktivierung parietaler Epithelzellen beteiligt sein können.
Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte, dass die auswachsenden Zellen nach 6 Tagen in der Kultur parietale Epithelzellen sind, da sie positiv für die parietalen Epithelzellmarker (CD44, claudin-1, SSeCKS) gefärbt wurden, aber weder den podozytenspezifischen Marker Synaptopodin noch den endotheliale Zellmarker CD31 ausdrückten. Im Einklang mit den Ergebnissen der Färbung konnten 6 Tage nach der Isolierung und Kultur einzelner entkapselter Glomeruli keine auswachsenden Zellen beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass es innerhalb dieses 6-Tage-Zeitraums eine begrenzte Kontamination anderer glomerulärer Zellen im Zellauswachsen gibt. Eine andere Studie analysierte auch glomeruläres Auswuchs und zeigte, dass die schnellen vermehrenden Zellen, die aus dem glomerulären Auswuchs abgeleitet sind, tatsächlich von parietalen Epithelzellen14abstammen.
Das Färbeprotokoll, das zur Analyse der Markerexpression der auswachsenden Zellen verwendet wurde, kann auch an andere Moleküle von Interesse angepasst werden. Die Immunostainierung wurde in den Brunnen der Platten durchgeführt, in denen Glomeruli für 6 Tage inkubiert wurden. Diese Brunnen wurden während der ersten 2-3 h Inkubation nicht beschichtet, sondern glomeruli an den Brunnen befestigt. Die Inkubation auf Glaseinsätzen oder einem Kammerschiebesystem, das zu einer besseren Bildgebung führen würde, war nicht möglich, da Glomeruli nicht vollständig an der Oberfläche befestigt wurden und das glomeruläre Auswachsen beeinträchtigt wurde. Dieses spezifische Protokoll wurde vor kurzem eingerichtet, um das parietale Epitheliezellwachstum aus Glomeruli gesunder WT und cd44-/- Mäusen 11zu untersuchen. Mit dieser Methode wurde gezeigt, dass CD44-defizide parietale Epithelzellen eine verminderte Proliferationsrate aufweisen, die auch in Abbildung 4gezeigt wird. Diese Methode kann auch für Mäuse anderer Stämme und auch für andere genetisch veränderte Mäuse verwendet werden. In einer früheren Studie wurde beispielsweise ein vergleichbarer Ansatz verwendet, um die Auswirkungen der Glukokortikoid-Rezeptor-Signalisierung15zu analysieren.
Die Verwendung dieser Technik, um Glomeruli von Mäusen zu isolieren und die zellulären Auswüchse zu analysieren, hat viele Vorteile gegenüber der Verwendung von verewigten parietalen Epithelzelllinien für die Analyse von Pfaden, die an der aktivierung parietaler Epithelzellen beteiligt sind, oder Medikamenten, die den Prozess der Epithelzellproliferation beeinflussen könnten. Zunächst werden bei dieser Methode Primärzellen verwendet, die direkt aus dem Glomerulus wachsen und nur 6 Tage in der Kultur sind. Daher wurden die parietalen Epithelzellen aus glomerulären Auswüchsen weniger Veränderungen im Phänotyp erfahren als verewigte Zelllinien, die zusätzliche Wachstumspassagen benötigen, um die Zelllinie16zu erzeugen. Darüber hinaus kann die hier beschriebene Methode verwendet werden, um die Wirkung spezifischer Gen-Knockouts auf die Parietalzellproliferation auch für Wege zu vergleichen, die aufgrund des beeinträchtigten Zellwachstums oder der Effizienz von GenKnockout mit Silencing-Methoden schwer in Zelllinien herausschlagen können.
Um das Protokoll an andere Tiermodelle oder an menschliches Nierengewebe anzupassen, sollte die Größe der Siebe optimiert werden, um das beste Ergebnis zu erzielen. Dies liegt daran, dass sich die glomeruläre Größe zwischen den Arten unterscheidet und daher die Größe der Siebe, auf denen die Glomeruli gesammelt werden können, variiert. Auch ist es wichtig, intakt gekapselte Glomeruli für den Zweck dieser Methode zu isolieren. Daher sollten die Glomeruli nicht gedrückt, sondern sanft durch die kleineren Siebe abspült werden.
Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist die Sammlung der gekapselten Glomeruli nach dem Sieben. Hier ist es wichtig, Medium mit 20% FCS zu verwenden, um das Anbringen von Glomeruli aneinander zu vermeiden. Darüber hinaus sollte die mit Glomeruli angereicherte Lösung direkt auf ultraniedrige Haftplatten übertragen werden, da glomeruli sonst direkt an der Oberfläche regulärer Zellkulturplatten und sogar an der Oberfläche von Kunststoffrohren befestigt werden, was es schwierig macht, einzelne Glomeruli zu erfassen und zu isolieren.
Nach der Sammlung von einzelnen gekapselten Glomeruli sollten diese 3 h in einem kleinen Volumen des Kultivierungsmediums in der Mitte des Brunnens kultiviert werden, um die Haftung zu ermöglichen. Das Schweben der Glomeruli in Richtung der Bordlinie der Brunnen sollte vermieden werden, um das Auslesen während der Bildanalyse zu optimieren.
Um die besten Ergebnisse mit dem hier beschriebenen Protokoll zu erzielen, empfehlen wir, einzelne Glomeruli zu kulturieren und das Auslesen an Tag 6 durchzuführen. Zu diesem Zeitpunkt kann ein homogenes zelluläres Auswachsen beobachtet werden, das aus parietalen Epithelzellen besteht. Zu späteren Zeitpunkten wird das glomeruläre Auswuchs phänotypisch heterogen, was auf das Wachstum anderer Zelltypen hindeutet. Daher scheint das Protokoll nicht für sehr lange Inkubationszeiten geeignet zu sein. Man sollte bedenken, dass die Inkubationszeiten für parietale Epithelzellauswüchse zwischen den Arten oder zwischen verschiedenen Mausstämmen variieren können. Daher sollten Kulturzeiten für jeden Mausstamm oder jede Mausart getestet und optimiert werden. Darüber hinaus sollte der Ursprung des glomerulären Auswuchses immer durch Färbung für parietale epitheliale zellspezifische Marker validiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der Niederländischen Nierenstiftung (Grant 14A3D104) und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO VIDI-Stipendium: 016.156.363) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
