Summary
यह लेख माउस गुर्दे से अलग किए गए एनकैप्सुली ग्लोमेरुली के ग्लोमेरुलर पैराइटल एपिथेलियल सेल आउटग्रोथ का विश्लेषण करने और विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार और माइग्रेशन में शामिल रास्तों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
पैराइटल एपिथेलियल सेल (पीईसी) सक्रियण ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस के विकास और प्रगति में शामिल प्रमुख कारकों में से एक है। इसलिए पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण में शामिल रास्तों का अवरोध ग्लोमेरुलर रोगों की प्रगति को कम करने के लिए एक उपकरण हो सकता है। यह लेख संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करता है और माउस गुर्दे से अलग किए गए एनकैप्सुली ग्लोमेरुली के पार्श्व एपिथेलियल सेल वृद्धि का विश्लेषण करता है। अलग माउस गुर्दे विच्छेदन के बाद, ऊतक कीमा बनाया हुआ है, और ग्लोमेरुली को सिविंग द्वारा अलग किया जाता है। एनकैप्सुलेटेड ग्लोमेरुली एकत्र किए जाते हैं, और एकल ग्लोमेरुली को पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं की ग्लोमेरुलर वृद्धि प्राप्त करने के लिए 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। इस अवधि के दौरान, पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार और माइग्रेशन का विश्लेषण सेल संख्या या आउटग्रोइंग कोशिकाओं के सतह क्षेत्र का निर्धारण करके किया जा सकता है। इसलिए इस परख का उपयोग ट्रांसजेनिक-या नॉकआउट-चूहों में एक परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति के प्रभावों या पार्श्व एपिथेलियल सेल विकास विशेषताओं और सिग्नलिंग पर संस्कृति की स्थितियों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण की प्रक्रिया में शामिल महत्वपूर्ण रास्तों और इसके परिणामस्वरूप ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस का अध्ययन किया जा सकता है।
Introduction
ग्लोमेरुलर रोग गुर्दे के विकारों का एक महत्वपूर्ण समूह हैं और अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ईएसआरडी) का एक प्रमुख कारण प्रतिनिधित्व करते हैं। दुर्भाग्य से, विशिष्ट उपचार विकल्प सीमित हैं और ईएसआरडी के लिए प्रगति अपरिहार्य है। ग्लोमेरुलर रोगों को ग्लोमेरुलर चोट की उपस्थिति से परिभाषित किया जाता है और भड़काऊ और गैर-भड़काऊ बीमारियों में समूहित किया जा सकता है। यद्यपि प्रारंभिक अपमान अलग है, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक सामान्य सेलुलर तंत्र ग्लोमेरुलर एपिथेलियल सेल हाइपरप्लासिया की ओर जाता है और अंततः सभी ग्लोमेरुलरस्लोरोसिस में ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस की ओर जाता है, चाहे अंतर्निहित कारण1,,2,,3,,4हो।
विशेष रूप से, यह दिखाया गया था कि ग्लोमेरुलोस्क्लेरोटिक घाव मुख्य रूप से सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं5,,6से बने होते हैं। शारीरिक परिस्थितियों में, पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं सपाट शांत एपिथेलियल कोशिकाएं होती हैं जो ग्लोमेरुलस के बोमन कैप्सूल को लाइन करती हैं। हालांकि, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों (जैसे, पोडोकोन्ड्रियल साइटोपैथी), सूजन या हाइपरफिल्ट्रेशन (उदाहरण के लिए, कम गुर्दे के द्रव्यमान, उच्च रक्तचाप, मोटापा या मधुमेह मेलिटस के कारण) के कारण किसी भी ग्लोमेरुलर चोट पैरिटल एपिथेलियल कोशिकाओं की सक्रियता को ट्रिगर कर सकती है। सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं जन्म देती हैं और बाह्य कोशिकाओं को जमा करती हैं जिसके परिणामस्वरूप सेलुलर वर्धमान या स्क्लेरोटिक घाव5,7,8होते हैं ।8 इन प्रक्रियाओं की प्रगति के परिणामस्वरूप गुर्दे के कार्य9की हानि होती है । इसलिए, पार्श्व एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन भड़काऊ और गैर-भड़काऊ ग्लोमेरुलरस्लोरुलरसिवसैस दोनों में ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस के विकास और प्रगति में एक महत्वपूर्ण कारक है1,2,,3,,4,,10.
आणविक प्रक्रियाएं मध्यस्थता पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सक्रिय पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं de novo एक्सप्रेस CD44, एक रिसेप्टर है कि सेलुलर प्रसार और प्रवास में शामिल विभिन्न रास्तों की सक्रियता के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सीडी 44 के अवरोध को पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण को बाधित करने और भड़काऊ के साथ-साथ गैर-भड़काऊ ग्लोमेरुलर रोगों के पशु मॉडलों में वर्धमानगठन,और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस की प्रगति को कम करने के लिए दिखाया गयाथा।
चूंकि पार्श्व एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन ग्लोमेरुलोस्क्लेरोसिस और वर्धमान गठन के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है, इन कोशिकाओं का अवरोध ग्लोमेरुलर रोगों की प्रगति को धीमा कर सकता है। पैराइटल एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन को चलाने वाले आणविक रास्तों की स्पष्टता से विशिष्ट चिकित्सीय हस्तक्षेपों का विकास हो सकता है जो ग्लोमरुलर रोग में हाइपरप्लास्टिक और ग्लोमेरुलोस्क्लेरोटिक घावों के गठन को कम करते हैं।
प्रायोगिक पशु मॉडलों में, पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं पर एक परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति (नॉक-आउट मॉडल या ट्रांसजेनिक माउस मॉडल) या दवा उपचार के प्रत्यक्ष प्रभाव के लिए सबूत प्रदान करना अक्सर मुश्किल होता है। एक पारंपरिक नॉक आउट माउस में वीवो परिवर्तनों में मनाया गया पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में सीधे परिवर्तन ों द्वारा समझाया जा सकता है। हालांकि, चूंकि जीन अभिव्यक्ति को माउस के भीतर अन्य सेल प्रकारों में भी बदल दिया जाता है, इसलिए कोई अन्य कोशिका प्रकारों द्वारा मध्यस्थता किए गए अप्रत्यक्ष प्रभावों को बाहर नहीं कर सकता है। मुख्य रूप से पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में सक्रिय प्रमोटरों द्वारा संचालित सशर्त क्रे-लोक्स चूहों के विकास ने कुछ मामलों में एक समाधान प्रदान किया है13। फिर भी, सशर्त ट्रांसजेनिक मॉडल जटिल हैं और हालांकि अधिक सशर्त लाइनें उपलब्ध हो जाती हैं, पारंपरिक नॉक आउट या ट्रांसजेनिक माउस लाइनों में से कई के लिए अभी तक सशर्त विकल्प नहीं है।
पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं पर प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमारे समूह ने पैराशियल एपिथेलियल सेल प्रसार और प्रवासन को मापने और विश्लेषण करने के लिए माउस गुर्दे से अलग एकल समझाया ग्लोमेरुली का उपयोग करके एक पूर्व वीवो परख विकसित की है। यह विधि हमें पार्श्व एपिथेलियल सेल विशिष्ट प्रभावों को निर्धारित करने और इस सक्रियण को बाधित करने के लिए पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण और परीक्षण उपचार विकल्पों के लिए जिम्मेदार रास्ते खोजने में सक्षम करेगी।
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Protocol
सभी पशु प्रयोग राबोड विश्वविद्यालय निजमेगेन की पशु आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार किए गए ।
नोट: अनुपचारित, स्वस्थ जंगली प्रकार (WT) चूहों (n = 4) और cd44-/-(n = 4) चूहों 12−16 सप्ताह की उम्र में बलिदान किया गया । नर और मादा दोनों चूहों का इस्तेमाल किया गया। सभी चूहों C57Bl/6 पृष्ठभूमि पर थे ।
1. माउस गुर्दे विच्छेदन
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा स्वस्थ डब्ल्यूटी चूहों या आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों का बलिदान करें।
- चूहों का त्याग करने के बाद सीधे पूरे माउस गुर्दे को काटना। इसके लिए पेट की कैंची, त्वचा को काटने और फिर पेट की मांसपेशियों का उपयोग करके मीडियन लेप्रोटॉमी करें। आंत निकालें और इसे माउस के बगल में रखें।
- ऊतक को जोड़ने से गुर्दे मुक्त और सर्जिकल संदंश का उपयोग कर गुर्दे बाहर खींच, गुर्दे धमनी, गुर्दे नस और कैंची के साथ मूत्रवर्धक काटने ।
- गुर्दे से गुर्दे कैप्सूल को सर्जिकल संदंश के साथ पकड़कर निकालें और संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करके कैप्सूल को खींचें।
- गुर्दे को 6-वेल सेल कल्चर प्लेट (2 गुर्दे/अच्छी तरह से) में रखें जो कि 2 एमएल हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ अच्छी तरह से तैयार होते हैं और बर्फ पर जगह देते हैं।
2. माउस गुर्दे से ग्लोमेरुली का अलगाव
- गुर्दे को 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और दो स्केलपेल का उपयोग करके गुर्दे को 1−2 मिमी के छोटे टुकड़ों में कीमा करें। एचबीएसएस के 1−2 एमएल का उपयोग करके कीमा बनाया हुआ गुर्दे के टुकड़े गीला रखें।
- एक 300 माइक्रोन धातु छलनी के शीर्ष पर कीमा बनाया हुआ गुर्दे के टुकड़े रखें और एक 20 मिलीएल सिरिंज के एक प्लंजर का उपयोग कर छलनी के माध्यम से गुर्दे प्रेस। बार-बार बीच में एचबीबीएस के साथ छलनी कुल्ला और एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर एक साफ पेट्री डिश में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा । यह भी सब कुछ है कि रहता है/यह स्केलपेल के साथ बंद खुरचन और एकत्र प्रवाह के माध्यम से (गुर्दे समरूप) को स्थानांतरित करके छलनी के नीचे की ओर चिपक जाती है ।
- एचबीएसएस के साथ 75 माइक्रोन छलनी के माध्यम से किडनी समरूप कुल्ला। प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और बाद में एक ५३ μm छलनी के माध्यम से इस प्रवाह के माध्यम से कुल्ला । सभी छोटे संरचनाओं को हटाने के लिए एचबीएसएस का उपयोग करके दोनों छलनी धोएं।
नोट: इस चरण में प्रवाह-हालांकि केवल कुल्ला किया जाता है लेकिन 75 माइक्रोन और 53 माइक्रोन छलनी के माध्यम से दबाया नहीं जाता है। छलनी पर मलबे और छोटे संरचनाओं को हटाने के लिए एचबीबीएस के साथ धोना आवश्यक है। इसलिए सामान्य रूप से एचबीएसएस के 200−300 एमएल का उपयोग कुल मिलाकर किया जाता है। - गुर्दे की संरचनाओं/सामग्री है कि ७५ माइक्रोन और ५३ माइक्रोन छलनी पर रहते है Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के साथ छलनी की ऊपरी सतह धोने के द्वारा 20% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ पूरक और एक 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव माइक्रोप्लेट में सामग्री हस्तांतरण ले लीजिए ।
नोट: छलनी की ऊपरी सतह को धोने के लिए, छलनी को झुका हुआ स्थिति (>45°) में कुल्ला करें और छलनी के किनारे पर गुर्दे की सामग्री एकत्र करें। एकत्र की गई सामग्री को समझाया गया और साथ ही संक्षिप्त चमकदार ग्लोमेरुली के लिए समृद्ध किया जाता है, जिसमें केवल कुछ ट्यूबलर टुकड़े दिखाई देते हैं। समझाया ग्लोमेरुली बहुत चिपचिपा हैं। एकल ग्लोमेरुली इकट्ठा करने के लिए, इसलिए पेट्री डिश या अच्छी तरह से प्लेट की सतह का पालन करने के लिए ग्लोमेरुली को रोकना महत्वपूर्ण है। पालन से बचने के लिए, 20% एफसीएस के साथ माध्यम का उपयोग करें और इस चरण के लिए अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेटों का उपयोग करें।
3. ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ की संस्कृति
- अल्ट्रा-कम अटैचमेंट माइक्रोप्लेट को एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप में लाएं और 20 माइक्रोल पिपेट के साथ एकल संक्षिप्त और/या डीकैप्सुलेटेड ग्लोमेरुली एकत्र करें । अन्य संरचनाओं और मलबे को पाइपिंग करने से बचें। पिपेट टिप में एक भी ग्लोमेरुलस इकट्ठा करने के बाद, 20 माइक्रोन की मात्रा में एक ही पिपेट टिप में एकत्र गुर्दे की सामग्री के बिना ताजा डीएमईएम माध्यम जोड़ें।
- 20 μL DMEM माध्यम के साथ एकल ग्लोबरुलस को 24-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट के कुएं के केंद्र में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और 5% (v/v) सीओ2 को कुएं के केंद्र में ग्लोबरुलस के लगाव की अनुमति देने के लिए। कुएं के बोर्डर्स को ग्लोमेरुलस के तैरने से बचने के लिए प्लेट को सावधानी से स्थानांतरित करें।
- 3 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, ग्लोमेरुलस कुएं के केंद्र से जुड़ा हुआ है। ध्यान से हाइड्रोकॉर्टिसोन युक्त एक विकास कारक किट के साथ पूरक एंडोथेलियल बेसल माध्यम (ईबीएम) के 500 माइक्रोल जोड़ें, मानव एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर, गोजातीय मस्तिष्क निकालने और जेंटामिसिन सल्फेट-एफ्फोटेट्रीसिन बी(सामग्री की तालिका)और अतिरिक्त 5% (v/v) एफबीएस और 1% (v/v) पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप) प्रत्येक कुएं में ।
- संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस, 5% (v/v) सीओ2पर 6 दिनों के लिए एकल ग्लोमेरुली ।
नोट: 6 दिनों के भीतर पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं से मिलकर वृद्धि का गठन कर रहे हैं । यदि किसी का उद्देश्य पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं पर विशिष्ट यौगिकों या दवाओं के प्रभावों का परीक्षण करना है तो इसे इस छह दिन की अवधि के भीतर माध्यम में जोड़ा जाना चाहिए ।
4. पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार का विश्लेषण
- 6 दिनों के बाद ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ का विश्लेषण करें। डिजिटल उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सूक्ष्म छवियां लें।
- सतह क्षेत्र और ग्लोबरुलर आउटग्रोथ के व्यास और आउटग्रोइंग कोशिकाओं की संख्या या ग्लोमेरुली को बाहर करने के लिए एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, इमेजजे/फिजी) का उपयोग करें।
- ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ के सतह क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, टिफ खोलें। इमेजजे में स्केल बार के साथ ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ की फाइल। स्केल बार पर एक सीधी रेखा बनाएं और विश्लेषण और माप पर क्लिक करके पिक्सल में दूरी निर्धारित करें (उदाहरण के लिए, 1 मिमी = 460 पिक्सेल)।
- विश्लेषणपर क्लिक करके पैमाने का निर्धारण करें, स्केल सेट करें और पिक्सेल (जैसे, 460) में ज्ञात दूरी टाइप करें, ज्ञात दूरी (जैसे, 1) और लंबाई की इकाई (जैसे, 1 मिमी) भी टाइप करें। ठीक क्लिककरें ।
- विश्लेषण पर क्लिक करके और फिर माप सेट करके परिणाम तालिका में कौन से परिणाम दिखाई देंगे निर्धारित करें। ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ के सतह क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए, विकल्प क्षेत्र और डिस्प्ले लेबल को सक्रिय करें। ठीक क्लिककरें ।
- ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ के सतह क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए, ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ के चारों ओर एक फ्रीहैंड चयन आकर्षित करें। विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर उपाय, एक परिणाम तालिका पहले निर्धारित पैमाने में वृद्धि की सतह क्षेत्र दिखा ImageJ में पॉप अप होगा (चरण 4.4 देखें, उदाहरण के लिए,मिमी 2)।
5. ग्लोमेरुलर सेल वृद्धि का लक्षण वर्णन
नोट: आउटग्रोथ की सेलुलर संरचना का आकलन करने के लिए, सेल-विशिष्ट मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस को टी = 6 दिनों में ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ पर किया जाता है।
- माध्यम को सावधानी से हटा दें और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग करके दो बार ग्लोमेरुली को धीरे से धोएं।
- पीबीएस में 4% (w/v) सुक्रोज के साथ पूरक 2% (w/v) पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए फिक्सेट करें और पीबीएस का उपयोग करके 2x को ध्यान से धोएं ।
- उचित एकाग्रता के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट(सामग्री की मेज)PBS-ovine सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में पतला 1% (v/v) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
- एंटीबॉडी समाधान निकालें और ध्यान से PBS के साथ 3x धोने।
- पीबीएस-बीएसए में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका) केसाथ इनक्यूबेट कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए अंधेरे में 1% (v/v) ।
- ध्यान से पीबीएस और माउंट के साथ 3x धोने के साथ 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ जलीय बढ़ते माध्यम की 1−2 बूंदें का उपयोग कर नाभिक कल्पना और एक गोल कवर पर्ची के साथ अच्छी तरह से कवर ।
- फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सूक्ष्म छवियां लें।
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Representative Results
ग्लोमरुलर आउटग्रोथ परख करने की विधि का एक व्यवस्थित आरेख चित्र 1में दिखाया गया है । चित्रा 2ए-डी प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मनाया गया विभिन्न समय बिंदुओं पर एन्कैप्सुलेटेड ग्लोमेरुली के ग्लोबरुलर आउटग्रोथ दिखाता है। माउस गुर्दे से ग्लोमेरुलस अलगाव के बाद संस्कृति में2, 4 और 6 (चित्रा 2बी-डी)में आउटग्रोथ दिखाए जाते हैं। यह मान्य करने के लिए कि आउटग्रोइंग कोशिकाएं पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं हैं, 6 दिनों के लिए भी अलग-थलग और सुसंस्कृत किया गया है जैसा कि चित्र 2ई, एफमें दिखाया गया है। Decapsulated glomeruli 6 दिनों के भीतर इनक्यूबेशन अवधि के दौरान कोई सेल वृद्धि दिखाई । चित्र 3में, विभिन्न पार्श्व एपिथेलियल सेल मार्कर, पोडोसाइट विशिष्ट मार्कर के साथ-साथ एंडोथेलियल सेल मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला किया गया था। परिणाम मान्य करते हैं कि आउटग्रोइंग कोशिकाएं वास्तव में पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं हैं। चित्रा 4 संस्कृति में 6 दिनों के बाद cd44-/-बनाम WT चूहों से अलग समझाया glomeruli की वृद्धि से पता चलता है । cd44-/-चूहों से अलग Glomeruli outgrowing कोशिकाओं की संख्या में कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से WT चूहों से अलग glomeruli की तुलना में glomeruli के एक कम सतह क्षेत्र दिखाया, पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण में CD44 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव के रूप में पहलेप्रकाशित 11। चित्र 5में, एक उदाहरण दिया गया है, जिसमें आउटग्रोइंग पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं का सतह क्षेत्र इमेजजे का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है।
चित्रा 1: पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार का विश्लेषण करने के लिए एक चमकदार वृद्धि परख करने के लिए विधि का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। (1) गुर्दे बलिदान माउस से विच्छेदित कर रहे हैं और छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया हुआ है। (2) गुर्दे के ऊतकों को 300 माइक्रोन छलनी के माध्यम से दबाया जाता है और 75 माइक्रोन और 53 माइक्रोन छलनी के माध्यम से धोया जाता है। (3) छलनी के शीर्ष पर रहने वाली ग्लोमेरुली को मध्यम + 20% (v/v) FCS का उपयोग करके एकत्र किया जाता है और इसे अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेट में स्थानांतरित कर दिया जाता है । (4) एकल ग्लोमेरुली एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकत्र कर रहे है और 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में स्थानांतरित कर रहे हैं । (5) 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद, 6 दिनों के लिए 5% (v/v) सीओ2, एक डिजिटल उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ग्लोमेरल आउटग्रोथ का विश्लेषण किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: डब्ल्यूटी चूहों से विच्छेदित गुर्दे से अलग-अलग एन्कैप्सुलेटेड ग्लोमेरुली की ग्लोमेरुलर वृद्धि। 37 डिग्री सेल्सियस पर संलग्न ग्लोमेरुली की वृद्धि अलग-अलग समय बिंदुओं पर दिखाई जाती है:(ए)0 दिन,(बी)2 दिन,(सी)4 दिन, और(D)6 दिन। Decapsulated glomeruli भी अलग और ३७ डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत थे और सूक्ष्म छवियों(ई)दिन 0 और(एफ)दिन 6 में कोई outgrowing कोशिकाओं को दिखा लिया गया । स्केल बार:(A, E,F)200 μm,(B)400 μm,(C,D)1000 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: आउटग्रोइंग ग्लोमेरलर कोशिकाएं पार्श्व एपिथेलियल सेल मार्कर की अभिव्यक्ति दिखाती हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला 6 दिन में किया गया था एकल समझाया ग्लोमेरुली के अलगाव के बाद बाहर निकलना एपिथेलियल कोशिकाओं की विशेषता है । पार्श्व एपिथेलियल सेल मार्कर के लिए सकारात्मक रूप से दाग कोशिकाओं:(ए)सीडी 44,(बी)SSeCKS, और(C)क्लाउडिन-1, लेकिन(डी)की अभिव्यक्ति नहीं दिखा नाओडोसाइट-विशिष्ट मार्कर सिंप्टोपोडिन या(ई)एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट मार्कर CD31, जो विशेष रूप से ग्लोबरुलुस के अंदर स्थानीय थे । स्केल बार:(A, B, D, E)100μm,(C)50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: सीडी 44 नॉकआउट चूहों से अलग ग्लोमेरुली में ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ बिगड़ा हुआ है। एनकैप्सुलेटेड ग्लोमेरुली(ए)डब्ल्यूटी चूहों और(बी) cd44-/-चूहों के विच्छेदित गुर्दे से अलग किया गया था । सूक्ष्म चित्रों को एक डिजिटल उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संस्कृति में 6 दिनों के बाद लिया गया । सीडी 44-/-चूहों की तुलना में डब्ल्यूटी चूहों से ग्लोमेरुली में बाहरी पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ-साथ आउटग्रोथ के सतह क्षेत्र की संख्या में वृद्धि की गई थी, जो पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण में CD44 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देता है। स्केल बार: 1000 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: इमेजजे (फिजी) का उपयोग करके पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार के लिए एक मार्कर के रूप में ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ के सतह क्षेत्र के विश्लेषण का एक उदाहरण। (क)संस्कृति में 6 दिनों के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर डब्ल्यूटी माउस के एक एन्कैप्सुलुलर ग्लोमेरुलस की वृद्धि। (ख)सबसे पहले, पैमाने मिमी2में सतह क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए निर्धारित है । यहां: 1 मिमी = 460 पिक्सेल। (ग)स्केल सेट करने के बाद, ग्लोमरुलर आउटग्रोथ के क्षेत्र के चारों ओर एक चयन रेखा खींची जाती है । (घ)इस चयनित क्षेत्र को तब मापा जा सकता है (इस उदाहरण में सतह क्षेत्र = 2.235मिमी 2)। स्केल बार: 1000 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कोई भी पार्श्व एपिथेलियल सेल प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए एकल एनक्सुलेटेड ग्लोमेरुली का उपयोग कर सकता है जो पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण का परिणाम है। यह पूर्व वीवो मॉडल हमें आणविक मार्गों का विस्तार से अध्ययन करने में सक्षम बनाएगा, जो पार्श्व एपिथेलियल सेल एक्टिवेशन में शामिल हैं। वर्णित विधि गुर्दे विच्छेदन और अलग और संस्कृति को अलग करने और विभिन्न प्रायोगिक परिस्थितियों में पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार और/या प्रवास की तुलना करने के लिए sieving की सरल अवधारणा पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, संस्कृति में 6 दिनों के बाद जिन परिणामों का विश्लेषण किया जा सकता है, वे हैं, सतह क्षेत्र या आउटग्रोथ का व्यास या एकल कैप्सुलेटेड ग्लोमेरुलस की आउटग्रोइंग कोशिकाओं की संख्या। इस परख के लिए एक और आवेदन दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए हो सकता है जो आणविक रास्तों को प्रेरित या बाधित करते हैं जो पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण में शामिल हो सकते हैं।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला ने पुष्टि की कि संस्कृति में 6 दिनों के बाद आउटग्रोइंग कोशिकाएं पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं हैं क्योंकि वे पार्श्व एपिथेलियल सेल मार्कर (सीडी 44, क्लाउडिन-1, एसएसके) के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन पोडोसाइट-विशिष्ट मार्कर सिंप्टोपोडिन को व्यक्त नहीं करते थे, न ही एंडोथेलियल सेल मार्कर सीडी 31। धुंधला के परिणामों के अनुरूप, अलगाव और एकल decapsulated glomeruli की संस्कृति के 6 दिन बाद कोई वृद्धि कोशिकाओं को देखा जा सकता है, यह दर्शाता है कि इस 6 दिन की अवधि के भीतर कोशिका वृद्धि में अन्य ग्लोमेरुलर कोशिकाओं का सीमित संदूषण है। एक अन्य अध्ययन में भी ग्लोमरल आउटग्रोथ का विश्लेषण किया गया और पता चला कि ग्लोमेरुलर वृद्धि से प्राप्त तेजी से प्रसारित कोशिकाएं वास्तव में पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं से वंशज हैं14।
आउटग्रोइंग कोशिकाओं की मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले धुंधला प्रोटोकॉल को ब्याज के अन्य अणुओं का परीक्षण करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। इम्यूनोदाता प्लेटों के कुओं के अंदर किया गया था जिसमें 6 दिनों के लिए glomeruli इनक्यूबेटेड थे । इन कुओं को लेपित नहीं बल्कि पहले 2−3 घंटे के इनक्यूबेशन के दौरान कुओं से जुड़ा हुआ था । कांच के आवेषण या एक कक्ष स्लाइड सिस्टम पर इनक्यूबेशन जिसके परिणामस्वरूप बेहतर इमेजिंग संभव नहीं थी क्योंकि ग्लोमेरुली पूरी तरह से सतह से संलग्न नहीं था और ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ बिगड़ा हुआ था। यह विशिष्ट प्रोटोकॉल हाल ही में स्वस्थ डब्ल्यूटी और cd44-/-चूहों 11के glomeruli से पार्श्व epithelia सेल वृद्धि का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया गया था । इस विधि का उपयोग करके, यह दिखाया गया था कि CD44-कमी पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में प्रसार दर में कमी दिखाई देती है, जो चित्र 4में भी प्रदर्शित की जाती है। इस विधि का उपयोग अन्य उपभेदों के चूहों के लिए और अन्य आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए पिछले अध्ययन में, ग्लूकोकॉर्टिकोइड रिसेप्टर सिग्नलिंग15के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए एक तुलनीय दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था।
चूहों से ग्लोमेरुली को अलग करने और सेलुलर आउटग्रोथ का विश्लेषण करने के लिए इस तकनीक का उपयोग पार्श्व एपिथेलियल सेल सक्रियण या दवाओं में शामिल रास्तों के विश्लेषण के लिए अमर पार्श्व एपिथेलियल सेल लाइनों के उपयोग की दिशा में कई फायदे हैं जो एपिथेलियल सेल प्रसार की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। सबसे पहले, इस विधि में, प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है जो सीधे ग्लोमेरुलस से बाहर निकलते हैं और संस्कृति में केवल 6 दिन होते हैं। इसलिए, ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ से पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाओं में अमर कोशिका रेखाओं की तुलना में फेनोटाइप में कम परिवर्तन हुए, जिन्हें सेल लाइन16बनाने के लिए अतिरिक्त विकास मार्ग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यहां वर्णित विधि का उपयोग पैरीटल सेल प्रसार पर विशिष्ट जीन नॉकआउट के प्रभाव की तुलना उन रास्तों के लिए भी किया जा सकता है जो बिगड़ा सेल विकास या जीन नॉकआउट की दक्षता के कारण कोशिका लाइनों में दस्तक देना मुश्किल है।
प्रोटोकॉल को अन्य पशु मॉडल या मानव गुर्दे के ऊतकों में अनुकूलित करने के लिए, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए छलनी के आकार को अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसका कारण यह है कि ग्लोमेरुलर आकार प्रजातियों के बीच अलग होता है और इसलिए छलनी का आकार जिस पर ग्लोमेरुली एकत्र किया जा सकता है, भिन्न होता है। इसके अलावा, इस विधि के उद्देश्य के लिए बरकरार समझाया ग्लोमेरुली को अलग करना महत्वपूर्ण है। इसलिए, ग्लोमेरुली को दबाया नहीं जाना चाहिए बल्कि छोटे छलनी के माध्यम से धीरे-धीरे धोया जाना चाहिए।
प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम सिविंग के बाद समझाया ग्लोमेरुली का संग्रह है। यहां, एक दूसरे के प्रति ग्लोमेरुली के लगाव से बचने के लिए 20% एफसीएस के साथ माध्यम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ग्लोमेरुली से समृद्ध समाधान को सीधे अल्ट्रा-कम आसंजन प्लेटों में स्थानांतरित किया जाना चाहिए क्योंकि, अन्यथा, ग्लोमेरुली सीधे नियमित सेल संस्कृति प्लेटों की सतह से और यहां तक कि प्लास्टिक ट्यूबों की सतह से भी जुड़ा होगा जो एकल ग्लोमेरुली को पकड़ना और अलग करना मुश्किल बनाता है।
एकल समझाया ग्लोमेरुली के संग्रह के बाद, इन पालन की अनुमति देने के लिए अच्छी तरह से केंद्र में खेती माध्यम की एक छोटी मात्रा में 3 घंटे सुसंस्कृत किया जाना चाहिए । छवि विश्लेषण के दौरान पढ़ने वाले को अनुकूलित करने के लिए कुओं के बोर्डर की ओर ग्लोमेरुली के फ्लोटिंग से बचा जाना चाहिए।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम एकल ग्लोमेरुली संस्कृति की सिफारिश करेंगे और 6 दिन में रीड-आउट का प्रदर्शन करेंगे। इस समय बिंदु पर, एक समरूप सेलुलर वृद्धि जिसमें पार्श्व एपिथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं। बाद के समय के बिंदुओं पर, ग्लोमेरुलर वृद्धि अन्य कोशिका प्रकारों की वृद्धि का संकेत देते हुए फेनोथिक रूप से विषम हो जाती है। इसलिए, प्रोटोकॉल बहुत लंबे समय तक उपयुक्त नहीं लगता इनक्यूबेशन। किसी को ध्यान में रखना चाहिए कि पार्श्व एपिथेलियल सेल आउटग्रोथ के लिए इनक्यूबेशन बार प्रजातियों के बीच या विभिन्न माउस उपभेदों के बीच भिन्न हो सकते हैं। इसलिए, संस्कृति समय का परीक्षण किया जाना चाहिए और प्रत्येक माउस तनाव या प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, ग्लोमेरुलर आउटग्रोथ की उत्पत्ति को हमेशा पार्श्व एपिथेलियल सेल-विशिष्ट मार्कर के लिए धुंधला करके मान्य किया जाना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस शोध को डच किडनी फाउंडेशन (ग्रांट 14A3D104) और नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ विडी ग्रांट: 016.156.363) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
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