Summary
В этой статье описывается метод культивирования и анализа гломерулярных темеальных эпителиальных клеточных заростов инкапсулированных гломерули, изолированных от мышиных почек. Этот метод может быть использован для изучения путей, участвующих в теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции.
Abstract
Активация париетальных эпителиальных клеток (УИК) является одним из ключевых факторов, влияющих на развитие и прогрессирование гломерулокслероза. Ингибирование путей, участвующих в теменной активации эпителиальных клеток, может быть инструментом для ослабления прогрессирования гломерулярных заболеваний. В этой статье описывается метод культуры и анализа теменной эпителиальной клетки нарост инкапсулированных гломерули, изолированных от мышиных почек. После вскрытия изолированных почек мыши, ткань измельчается, а гломерули изолированы сито. Инкапсулированные гломерули собираются, и одиночные гломерули культивируются в течение 6 дней, чтобы получить гломерулярные нарост темеетальных эпителиальных клеток. В течение этого периода, теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции могут быть проанализированы путем определения числа клеток или площади поверхности перерастающей клетки. Этот анализ может поэтому использоваться в качестве инструмента для изучения последствий измененного экспрессии генов у трансгенных или нокаут-мышей или влияние условий культуры на теменные характеристики эпителиального роста клеток и сигнализации. Используя этот метод, важные пути, участвующие в процессе активации теменной эпителиальной клетки и, следовательно, при гломерулокслерозе могут быть изучены.
Introduction
Гломерулярные заболевания являются важной группой заболеваний почек и представляют собой основную причину заболевания почек на конечной стадии (ESRD). К сожалению, конкретные варианты лечения ограничены и прогрессирование в ESRD неизбежна. Гломерулярные заболевания определяются наличием гломерулярных травм и могут быть сгруппированы в воспалительных и невоспалительных заболеваниях. Хотя первоначальное оскорбление отличается, последние исследования показали, что общий клеточный механизм приводит к гломерулярной гиперплазии клеток и в конечном итоге гломерулосклероз во всех гломерулярных заболеваний, независимо от основной причины1,2,3,4.
В частности, было показано, что гломерулоклеротические поражения в основном состоят из активированных темеальных эпителиальных клеток5,,6. В физиологических условиях, теменные эпителиальные клетки плоские тихие эпителиальные клетки, которые выстиляют капсулу Боумана из гломерула. Однако любая гломерулярная травма, вызванная генетическими мутациями (например, специфическими подоцитами или митохондриальными цитопатиями), воспалением или гиперфильтрацией (например, вызванной снижением почечной массы, гипертонией, ожирением или диабетическим меллитом), может вызвать активацию темных эпителиальных клеток. Активированные теметальные эпителиальные клетки размножаются и откладывают внеклеточную матрицу, что приводит к образованию клеточных полумесяцев или склеротических поражений5,,7,,8. Прогрессирование этих процессов приводит к потере функции почек9. Поэтому активация теменной эпителиальной клетки является ключевым фактором в развитии и прогрессировании гломерулосклероза как при воспалительных, так и при невоспалительных гломерулярных заболеваниях1,,2,,3,,4,,10.
Молекулярные процессы, посреднительные темиетальной активации эпителиальных клеток, до сих пор в значительной степени неизвестны. Недавние исследования показывают, что активированные теметальные эпителиальные клетки de novo экспресс CD44, рецептор, который имеет важное значение для активации различных путей, участвующих в клеточной пролиферации и миграции. Кроме того, было показано, что ингибирование CD44 ингибирует активацию теменных эпителиальных клеток и опутывает прогрессирование образования полумесяца и гломерулезплероза у животных моделей воспалительных, а также невоспалительных гломерулярных заболеваний11,,12.
Поскольку активация теменной эпителиальной клетки является ключевым игроком для развития гломерулосклероза и формирования полумесяца, ингибирование этих клеток может замедлить прогрессирование гломерулярных заболеваний. Выяснение молекулярных путей активации теменной эпителиальной клетки может привести к развитию специфических терапевтических вмешательств, которые смягчат образование гиперпластических и гломеруклеротических поражений при гломерулярных заболеваниях.
В экспериментальных моделях животных часто трудно представить доказательства прямого влияния измененного экспрессии генов (модели нокаутирования или трансгенные мышиные модели) или медикаментозного лечения теменных эпителиальных клеток. В обычной выдаваемой мыши наблюдаемые изменения in vivo могут быть объяснены прямыми изменениями в теменных эпителиальных клетках. Однако, поскольку экспрессия генов также изменяется в других типах клеток в мыши, нельзя исключать косвенных эффектов, опосредованных другими типами клеток. Развитие условных кре-локс мышей, управляемых промоутерами, в основном активными в теменных эпителиальных клетках, обеспечило решение в некоторых случаях13. Тем не менее, условные трансгенные модели являются сложными и, хотя более условные линии становятся доступными, для многих обычных нокаут-аут или трансгенных линий мыши еще не условный заменитель.
Для изучения прямого воздействия на теменной эпителиальной клетки, наша группа разработала ex vivo анализ с использованием одного инкапсулированных гломерули изолированы от мышиных почек для измерения и анализа теменной эпителиальной пролиферации клеток и миграции. Этот метод позволит нам определить теменной эпителиальной клетки конкретные эффекты и найти ответственные пути для теменной активации эпителиальных клеток и варианты лечения теста, чтобы ингибировать эту активацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Радбуда Неймегена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные, здоровые дикие мыши типа (N No 4) и cd44-/- (n q 4) мыши были принесены в жертву в возрасте от 12 до 16 недель. Использовались как самцы, так и самки мышей. Все мыши были на фоне C57Bl/6.
1. Вскрытие почки мыши
- Пожертвование здоровых мышей WT или генетически измененных мышей путем вывиха шейки матки.
- Вскрывайте целые мышиные почки сразу после того, как пожертвуют мышами. Для этого выполните медианную лапаротомию с помощью брюшных ножниц, разрезая кожу, а затем мышцы живота. Удалить кишечник и поместите его рядом с мышью.
- Освободите почки от соединительной ткани и вытащите почку с помощью хирургических щипцов, разрезая почечную артерию, почечную вену и мочеточника ножницами.
- Удалите почечные капсулы из почек, удерживая почки с хирургическими щипцами и снять капсулу с помощью другой пары щипцов.
- Поместите почки в 6-ну клеточной культуры пластины (2 почки / хорошо), подготовленные с 2 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) в колодец и место на льду.
2. Изоляция гломерули из мышиной почки
- Перенесите почки в 100 мм чашку Петри и фарш почки в мелкие кусочки 1-2 мм с помощью двух скальпелей. Держите измельченные кусочки почки влажными, используя 1-2 мл HBSS.
- Поместите фарш куски почки на вершине 300 мкм металлического сито и нажмите почки через сито с помощью поршеня 20 мл шприца. Повторно промыть сито с HBSS между ними и собирать поток через в чистой чашке Петри с помощью серологических пипет. Соберите также все, что остается / палочки в нижней стороне сито, соскоб его с скальпелем и передать его в собранный поток через (гомогенат почек).
- Промыть гомогенат почек через 75-м сито с HBSS. Соберите поток через и затем промыть этот поток через 53 мкм сито. Вымойте оба сито с помощью HBSS для удаления всех небольших структур.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе поток, хотя только промыть, но не нажата через 75 мкм и 53 мкм сито. Мытье с HBSS необходимо для удаления мусора и небольших структур на сито. Поэтому обычно в общей сложности используется 200–300 мл HBSS. - Соберите структуры почки/материал, которые остаются на 75 мкм и 53 мкм сито, промывая верхнюю поверхность сито с модифицированной средой Орла Dulbecco (DMEM) дополнены 20% фетальной сыворотки икры (FCS) и передачи материала в 6-хорошо ультра-низкой микропластечной привязанности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мытья верхней поверхности сито, промыть сито в наклонном положении ()gt;45 ") и собрать материал почек на краю сито. Собранный материал обогащается как для инкапсулированного, так и для декапсулированного гломерули, показывая лишь несколько трубчатых фрагментов. Инкапсулированные гломерули очень липкие. Поэтому для сбора одногломерули важно предотвратить то, чтобы гломерули прилип к поверхности чашки Петри или хорошо пластины. Чтобы избежать присоединения, используйте среды с 20% FCS и использовать ультра-низкие пластины крепления для этого шага.
3. Культивирование гломерулярных наростов
- Принесите ультра-низкое вложение микроплиты к перевернутому световому микроскопу и соберите одиночный инкапсулированный и/или декапсулированный гломерули с пипеткой 20 МЛ. Избегайте трубирования других конструкций и мусора. После сбора одного glomerulus в наконечник пипетки, добавить свежие DMEM среды без собранного материала почек в тот же наконечник пипетки на объем 20 МЛ.
- Передача одного glomerulus с 20-Л DMEM среды к центру колодца 24-ну клеточной культуры пластины и инкубировать в течение 3 ч при 37 градусов по Цельсию и 5% (v/v) CO2, чтобы позволить крепление glomerulus к центру колодца. Тщательно переместите пластину, чтобы избежать плавания glomerulus к бордеры скважины.
- После 3 ч инкубации, glomerulus прилагается к центру колодца. Тщательно добавьте 500 мл эндотелиальной базальной среды (EBM) дополнены набор фактора роста, содержащий гидрокортизон, человеческий эндотелиальный фактор роста, экстракт бычьего мозга и гентамицин сульфат-амфотерицин B(Таблица материалов)и дополнительные 5% (v/v) FBS и 1% (v/v) пенициллин/стрептмицин (пен/ стрептомицин)
- Культура одного гломерули в течение 6 дней при 37 градусов по Цельсию, 5% (v/v) CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 6 дней образуются нарост, состоящий из теменной эпителиальных клеток. Если кто-то стремится проверить влияние конкретных соединений или препаратов на теменной эпителиальных клеток она должна быть добавлена в среду в течение этого шестидневного периода.
4. Анализ пролиферации теменной эпителиальной клетки
- Проанализируйте гломерулярный нарост через 6 дней. Возьмите микроскопические изображения с помощью цифрового перевернутого светового микроскопа.
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений (например, ImageJ/FIJI) для определения площади поверхности и диаметра гломерулярного нароста, а также количества переросевых клеток или вырастающие гломерули.
- Чтобы определить площадь поверхности гломерулярного нароста, откройте tif. файл гломерулярного нароста с масштабом бар в ImageJ. Нарисуйте прямую линию на строке шкалы и определите расстояние в пикселях, нажав на анализ и измерение (например, 1 мм и 460 пикселей).
- Определите шкалу, нажав на анализ,установите шкалу и введите известное расстояние в пикселе (например, 460), а также введите известное расстояние (например, 1) и единицу длины (например, 1 мм). Нажмите ОК.
- Определите, какие результаты будут отображаться в таблице результатов, нажав на анализ, а затем установите измерения. Чтобы определить площадь поверхности гломерулярного нароста, активируйте область параметров и этикетку дисплея. Нажмите ОК.
- Чтобы определить площадь поверхности гломерулярного нароста, нарисуйте выбор от руки вокруг гломерулярного нароста. Нажмите на анализ, а затем измерьте, таблица результатов появится в ImageJ, показывающей область поверхности нароста в ранее определенной шкале (см. шаг 4.4, например, мм2).
5. Характеристика гломерулярных наростов клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки клеточного состава нарост, иммунофлуоресценция окрашивания для клеточной конкретных маркеров выполняются на гломерулярных наростов на т 6 дней.
- Аккуратно удалите средний и аккуратно промойте гломерули дважды, используя фосфат-буферизированный солевой раствор (PBS).
- Фиксировать в течение 10 минут при комнатной температуре с использованием 2% (w/v) параформальдегид (PFA) дополняется 4% (w/v) сахарозой в PBS и тщательно мыть 2x с помощью PBS.
- Инкубировать первичным антителом с соответствующей концентрацией(Таблица материалов),разбавленной в PBS-овинной сыворотке альбумин (BSA) 1% (v/v) на 1 ч при комнатной температуре.
- Удалите раствор антитела и тщательно вымыть 3x с PBS.
- Инкубировать вторичным антителом(Таблица материалов),разбавленным в PBS-BSA 1% (v/v) в темноте в течение 45 мин при комнатной температуре.
- Тщательно мыть 3x с PBS и смонтировать с помощью 1'2 капель aqueous монтажа среды с 4 ,6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI), чтобы визуализировать ядра и покрыть хорошо с круглой крышкой скольжения.
- С помощью флуоресцентного микроскопа возьмите микроскопические снимки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1показана систематическая диаграмма метода выполнения гломерулярного анализа наростов. Рисунок 2A-D показывает гломерулярные наросты инкапсулированного гломерули в разных точках времени, как это наблюдается с помощью световой микроскопии. Наросты показаны в день 2, 4 и 6(Рисунок 2B-D) в культуре после glomerulus изоляции от мышиных почек. Для того, чтобы проверить, что перерастающие клетки теменной эпителиальной клетки, декапсулированные гломерули также были изолированы и культивируются в течение 6 дней, как показано на рисунке 2E, F. Декапсулированные гломерули не показали клеточного нароста во время инкубационного периода в течение 6 дней. На рисунке 3,иммунофлуоресценция окрашивания была выполнена для различных теменной эпителиальных клеточных маркеров, podocyte конкретных маркеров, а также эндотелиальных маркеров клеток. Результаты подтверждают, что перерастающие клетки действительно являются теменными эпителиальными клетками. Рисунок 4 показывает рост изолированных инкапсулированных гломерули из cd44-/- против WT мышей после 6 дней в культуре. Glomeruli изолированы от cd44-/- мышей показали уменьшенное количество перерастающих клеток, а также снижение площади поверхности гломерулярных нарост по сравнению с glomeruli изолированы от WT мышей, предлагая важную роль для CD44 в теменной активации эпителиальных клеток, как опубликовано ранее11. На рисунке 5приводится пример, в котором площадь поверхности перерастающихся темных эпителиальных клеток определяется с помощью ImageJ.
Рисунок 1: Схематический обзор метода выполнения гломерулярного анализа нароста для анализа тейетальной эпителиальной пролиферации клеток. (1) Почки вскрываются от жертвенных мыши и измельчаются на мелкие кусочки. (2) Ткань почек нажата через 300 мкм сито и промыть через 75 мкм и 53 мкм сито. (3) Glomeruli, которые остаются на вершине сито собираются с помощью среднего 20% (v/v) FCS и передаются в ультра-низкой пластины крепления. (4) Одиночные гломерули собираются с помощью перевернутого светового микроскопа и переносятся на 24-ну культурные пластины. (5) После инкубации при 37 градусов по Цельсию, 5% (v/v) CO2 в течение 6 дней, гломерулярный нарост может быть проанализирован с помощью цифрового перевернутого светового микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Гломерулярный нарост изолированных инкапсулированных гломерули из почек, расчлененных у мышей WT. Нарост инкапсулированного гломерули, инкубированного при 37 ккc, показан в разных точках времени: (A) 0 дней, (B) 2 дня,C) 4 дня, и(D) 6 дней. Декапсулированные гломерули были также изолированы и культивируется при 37 градусов по Цельсию и микроскопические изображения были приняты в (E) день 0 и (F) день 6 показаны не перерастающие клетки. Масштабные бары: (A,E,F) 200 мкм, (B) 400 мкм, (C,D) 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Израстающие гломерулярные клетки показывают выражение теменного эпителиального клеточного маркера. Иммунофлуоресцентное окрашивание было выполнено на 6-й день после изоляции одного инкапсулированного гломерули, чтобы охарактеризовать перерастающие эпителиальные клетки. Перерастающие клетки окрашены положительные для теменной эпителиальной клетки маркеров: (A) CD44,( B) SSeCKS, и (C) клаудин-1, но не показали выражение (D) podocyte-специфический маркер синаптопон или (E) эндотелиальный клеточный специфический маркер CD31, которые были исключительно локализованы внутри glomerulus. Масштабные бары: (A,B,D,E) 100 мкм,C) 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Гломерулярный рост нарушается в гломерули изолированы от CD44 нокаут мышей. Инкапсулированные гломерули были выделены из расчлененных почек(A) мышей WT и(B) cd44-/- мышей. Микроскопические фотографии были сделаны после 6 дней в культуре с помощью цифрового перевернутого светового микроскопа. Число переросших теменных эпителиальных клеток, а также площадь поверхности роста было увеличено в гломерули от мышей WT по сравнению с cd44-/- мышей, предлагая важную роль для CD44 в теменной активации эпителиальных клеток. Масштабные бары: 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Пример анализа площади поверхности гломерулярного нароста в качестве маркера для тейетальной эпителиальной клеточной пролиферации с помощью ImageJ (FIJI). ()Гломерулярный нарост инкапсулированного гломерула мыши WT после 6 дней в культуре при 37 градусов по Цельсию. (B) Во-первых, шкала определяется для анализа площади поверхности в мм2. Здесь: 1 мм и 460 пикселей. (C) После установки шкалы, линия выбора нарисована вокруг области гломерулярного нароста. (D) Эта выбранная область может быть измерена (площадь поверхности в данном примере 2,235 мм2). Масштабные бары: 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя протокол, описанный в этой статье, можно использовать одиночные инкапсулированные гломерули для оценки тейетальной эпителиальной пролиферации клеток, которая является следствием тейетальной активации клеток. Эта модель ex vivo позволит нам детально изучить молекулярные пути, которые участвуют в теменной активации эпителиальных клеток. Описанный метод опирается на простую концепцию вскрытия и просеивания почек, чтобы изолировать и культуры инкапсулированных гломерули и сравнить распространение и / или миграции теменной эпителиальных клеток в различных экспериментальных условиях. Результаты, которые могут быть проанализированы после 6 дней в культуре, например, площадь поверхности или диаметр нарост или количество перерастающие клетки одного капсульного гломерула. Другое применение для этого анализа может быть изучение эффектов препаратов, которые вызывают или ингибируют молекулярные пути, которые могут быть вовлечены в теменной активации эпителиальных клеток.
Immunofluorescence окрашивания подтвердил, что перерастающие клетки после 6 дней в культуре теменной эпителиальных клеток, как они окрашены положительные для теменной эпителиальной клеточной маркеров (CD44, claudin-1, SSeCKS), но не выразить podocyte-специфический маркер синаптородин, ни эндотелиальной клеточной маркер CD31. В соответствии с результатами окрашивания, не перерастает клеток может наблюдаться 6 дней после изоляции и культуры одного декапсуляции гломерули, что свидетельствует о том, что существует ограниченное загрязнение других гломерулярных клеток в клетке зарастания в течение этого 6-дневного периода. Другое исследование также проанализировало гломерулярный нарост и показало, что быстро распространяющиеся клетки, полученные из гломерулярных наростов, действительно являются потомками теменной эпителиальной клетки14.
Протокол окрашивания, который был использован для анализа экспрессии маркера перерастающих клеток, также может быть адаптирован для проверки других молекул, представляющих интерес. Иммуносхейтинг проводился внутри колодцев пластин, в которых гломерули инкубировали в течение 6 дней. Эти колодцы не были покрыты, но гломерули прикреплялись к скважинам во время первой инкубации в 2–3 ч. Инкубация на стеклянных вставках или камерной слайд-системе, которая привела бы к улучшению изображения, была невозможна, поскольку гломерули не прикреплялись полностью к поверхности, а гломерулярный рост был нарушен. Этот конкретный протокол был создан недавно для изучения теменной эпителии клеточной нарост из glomeruli здорового WT и cd44-/- мышей11. Используя этот метод, было показано, что CD44-дефицитные теметальные эпителиальные клетки показывают снижение скорости распространения, что также продемонстрировано на рисунке 4. Этот метод также может быть использован для мышей других штаммов, а также для других генетически измененных мышей. В предыдущем исследовании, например, сопоставимый подход был использован для анализа эффектов глюкокортикоидных рецепторов сигнализации15.
Использование этого метода, чтобы изолировать glomeruli от мышей и анализировать клеточные наросты имеет много преимуществ в отношении использования увековеченных теменной эпителиальных клеточных линий клетки для анализа путей, участвующих в теменной активации эпителиальных клеток или препаратов, которые могли бы повлиять на процесс эпителиальной пролиферации клеток. Во-первых, в этом методе используются первичные клетки, которые непосредственно вырастают из гломерула и занимают всего 6 дней в культуре. Таким образом, теменной эпителиальных клеток из гломеркулярных наростов претерпели меньше изменений в фенотип по сравнению с увековеченных клеточных линий, которые нуждаются в дополнительных проходов роста для создания клеточной линии16. Кроме того, метод, описанный здесь, может быть использован для сравнения влияния конкретного гена нокаутом на пролиферацию теменной клетки также для путей, которые трудно выбить в клеточных линиях из-за нарушения роста клеток или эффективности гена нокаутом с помощью методов глушиния.
Чтобы адаптировать протокол к другим животным моделям или к тканям почек человека, размер сито должен быть оптимизирован для получения наилучшего результата. Это потому, что гломерулярный размер отличается между видами и, следовательно, размер сито, на котором гломерули могут быть собраны варьируется. Кроме того, важно изолировать нетронутыми инкапсулированные гломерули для целей этого метода. Поэтому гломерули не следует нажимать, а аккуратно промыть через небольшие сито.
Другим важным шагом в протоколе является сбор инкапсулированных гломерули после сито. Здесь важно использовать среды с 20% FCS, чтобы избежать привязанности гломерули друг к другу. Кроме того, раствор, обогащенный гломерули, должен быть непосредственно перенесен на сверхнизкие пластины сцепления, потому что, в противном случае, гломерули будет непосредственно прикрепляться к поверхности обычных пластин клеточной культуры и даже к поверхности пластиковых трубок, что затрудняет захват и изоляцию одного гломерули.
После сбора одного инкапсулированного гломерули, они должны быть культивированы 3 ч в небольшом объеме культивирования среды в центре скважины, чтобы обеспечить присоединение. При переносе гломерули к бордеру скважин следует избегать оптимизации считывать во время анализа изображений.
Чтобы получить лучшие результаты, используя описанный здесь протокол, мы рекомендуем культурировать одиночный гломерули и выполнять чтение в день 6. В этот момент можно наблюдать однородный клеточный рост, состоящий из теменной эпителиальных клеток. В более поздних точках времени, гломерулярный рост становится фенотипически неоднородным, указывающим на рост других типов клеток. Таким образом, протокол, как представляется, не подходит для очень долгого инкубации раз. Следует иметь в виду, что инкубационное время для теменной эпителиальной клетки нарост может варьироваться в зависимости от вида или между различными штаммами мыши. Таким образом, культура раз должны быть проверены и оптимизированы для каждого штамма мыши или видов. Кроме того, происхождение гломерулярных наростов всегда должно быть подтверждено путем окрашивания теменных эпителиальных клеточных маркеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Голландским фондом почек (грант 14A3D104) и Нидерландской организацией научных исследований (грант NWO VIDI: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
