Summary
Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli glomeruli glomerual hücre outgrowths kültürve analiz için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem parietal epitel hücre çoğalması ve göç ile ilgili yolları incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Parietal epitel hücre (PEC) aktivasyonu glomerülosklerozun gelişimi ve ilerlemesinde rol oynayan önemli faktörlerden biridir. Parietal epitel hücre aktivasyonunda yer alan yolların inhibisyonu bu nedenle glomerüler hastalıkların ilerlemesini zayıflatmak için bir araç olabilir. Bu makalede, fare böbreği izole kapsüllü glomeruli parietal epitel hücre büyümesini analiz etmek ve kültür ve analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İzole fare böbrekleri kesildikten sonra doku doğrlanır ve glomeruli eeving tarafından izole edilir. Kapsüllü glomeruli toplanır ve parietal epitel hücreleringlomerüler outgrowth elde etmek için 6 gün boyunca tek glomeruli kültürlenir. Bu dönemde parietal epitel hücre çoğalması ve göç hücre sayısı veya büyüyen hücrelerin yüzey alanı belirlenerek analiz edilebilir. Bu nedenle bu tetki, değişmiş gen ekspresyonunun transgenik veya nakavt farelerdeki etkilerini veya kültür koşullarının parietal epitel hücre büyüme özellikleri ve sinyalizasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için bir araç olarak kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak parietal epitel hücre aktivasyonu ve dolayısıyla glomerüloz sürecinde önemli yollar incelenebilir.
Introduction
Glomerüler hastalıklar böbrek hastalıklarının önemli bir grubudur ve son dönem böbrek hastalığının (ESRD) önemli bir nedenini temsil eder. Ne yazık ki, özel tedavi seçenekleri sınırlıdır ve ESRD ilerlemesi kaçınılmazdır. Glomerüler hastalıklar glomerüler yaralanma varlığı ile tanımlanır ve inflamatuar ve inflamatuar olmayan hastalıklarda gruplandırılabilir. İlk hakaret farklı olmasına rağmen, son çalışmalar da ortak bir hücresel mekanizma glomerüler epitel hücre hiperplazi yol açar ve sonuçta tüm glomerüler hastalıklarda glomerüskleroz yol göstermiştir, ne olursa olsun altta yatan neden1,2,3,4.
Özellikle glomerülülsikerotik lezyonların esas olarak aktive parietal epitel hücrelerinden oluştuğu gösterilmiştir5,6. Fizyolojik koşullar altında, parietal epitel hücreleri glomerulus Bowman kapsül hattı düz quiescent epitel hücreleridir. Ancak, genetik mutasyonlara bağlı glomerüler yaralanmalar (örn. podositspesifik veya mitokondriyal sitopatiler), inflamasyon veya hiperfiltrasyon (örn. böbrek kitlesinin azalması, hipertansiyon, obezite veya diyabetik mellitus nedeniyle) parietal epitel hücrelerinaktivasyonunu tetikleyebilir. Aktif parietal epitel hücreleri çoğalır ve hücre dışı matriks oluşumu ile sonuçlanan hücre dışı matriks mevduat5,7,8. Bu süreçlerin ilerlemesi böbrek fonksiyon kaybı ile sonuçlanır9. Bu nedenle parietal epitel hücre aktivasyonu hem inflamatuar hem de inflamatuar olmayan glomerüler hastalıklarda glomerülozun gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir faktördür1,2,3,4,10.
Parietal epitel hücre aktivasyonuna aracılık eden moleküler süreçler hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Son çalışmalar, hücresel proliferasyon ve göçle ilgili farklı yolların aktivasyonu için önemli olan bir reseptör olan aktif parietal epitel hücrelerinin de novo express CD44 olduğunu göstermektedir. Ayrıca, CD44 inhibisyonu parietal epitel hücre aktivasyonunu inhibe etmek ve inflamatuar yanı sıra non-inflamatuar glomerüler hastalıkların hayvan modellerinde hilal oluşumu ve glomeruloskleroz ilerlemesini zayıflatmak gösterilmiştir11,12.
Parietal epitel hücre aktivasyonu glomerüloz ve hilal oluşumu gelişimi için önemli bir oyuncu olduğundan, bu hücrelerin inhibisyonu glomerüler hastalıkların ilerlemesini yavaşlatabilir. Parietal epitel hücre aktivasyonunu yönlendiren moleküler yolların açıklanması, glomerüler hastalıkta hiperplastik ve glomeruloscl lezyonlarının oluşumunu zayıflatan spesifik terapötik girişimlerin gelişmesine yol açabilir.
Deneysel hayvan modellerinde, parietal epitel hücreleri üzerinde değiştirilmiş gen ekspresyonu (nakavt modelleri veya transgenik fare modelleri) veya ilaç tedavisinin doğrudan etkisi için kanıt sağlamak sıklıkla zordur. Konvansiyonel bir nakavt farede in vivo değişiklikler gözlenen parietal epitel hücrelerinde doğrudan değişiklikler ile açıklanabilir. Ancak, gen ekspresyonu fareiçindeki diğer hücre türlerinde de değiştirildiği için, diğer hücre türleri tarafından aracılık edilen dolaylı etkileri dışlayamaz. Parietal epitel hücrelerinde ağırlıklı olarak aktif organizatörler tarafından tahrik koşullu cre-lox farelerin geliştirilmesi bazı durumlarda bir çözüm sağlamıştır13. Bununla birlikte, koşullu transgenik modeller karmaşıktır ve daha koşullu çizgiler kullanılabilir hale gelmesine rağmen, geleneksel nakavt veya transgenik fare hatlarının çoğu için henüz koşullu bir alternatif yoktur.
Parietal epitel hücreleri üzerindeki doğrudan etkileri incelemek için grubumuz parietal epitel hücre proliferasyonu ve göçlerini ölçmek ve analiz etmek için fare böbreklerinden izole edilmiş tek kapsüllü glomeruli kullanarak bir ex vivo tayini geliştirmiştir. Bu yöntem parietal epitel hücre spesifik etkilerini belirlememize ve parietal epitel hücre aktivasyonu ve bu aktivasyonu inhibe etmek için test tedavi seçenekleri için sorumlu yollar bulmamızı sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Radboud Üniversitesi Nijmegen Hayvan Etik Komitesi yönergelerine göre yapılmıştır.
NOT: Tedavi edilmeyen, sağlıklı yabani tip (WT) fareler (n = 4) ve cd44-/- (n = 4) fareler 12−16 haftalıkken kurban edildi. Hem erkek hem de dişi fareler kullanıldı. Tüm fareler C57Bl/6 arka plan vardı.
1. Fare böbrek diseksiyonu
- Kurban sağlıklı WT fareler veya servikal dislokasyon tarafından genetik olarak değiştirilmiş fareler.
- Fareleri feda ettikten sonra farenin tüm böbreklerini doğrudan inceleyin. Bunun için, karın makas kullanarak bir median laparotomi gerçekleştirmek, cilt ve daha sonra karın kasları kesme. Bağırsağı çıkarın ve farenin yanına yerleştirin.
- Doku bağlayan böbrekler ücretsiz ve cerrahi forceps kullanarak böbrek çekin, makas ile böbrek arter, böbrek ven ve üreter kesme.
- Böbrekleri cerrahi forceps ile tutarak böbrek kapsüllerini çıkarın ve başka bir çift forceps kullanarak kapsülü çekin.
- Böbrekleri, Hanks'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 2 mL'si ile hazırlanan 6-iyi hücreli kültür plakası (2 böbrek/kuyu) yerleştirin ve buza yerleştirin.
2. Fare böbreğinden glomeruli izolasyonu
- Böbrekleri 100 mm Petri kabına aktarın ve iki neşter kullanarak böbrekleri 1−2 mm'lik küçük parçalara bölün. 1−2 mL HBSS kullanarak kıyılmış böbrek parçalarını ıslak tutun.
- Kıyılmış böbrek parçalarını 300 m'lik metal elek üzerine yerleştirin ve 20 mL'lik bir şırınganın bir pistonkullanarak böbreği elekten geçirin. Elek arasında HBSS ile tekrar tekrar durulayın ve serolojik bir pipet kullanarak temiz bir Petri kabında akışı toplayın. Neşterle kazıyarak elek alt tarafına kalan/yapışan her şeyi toplayın ve toplanan akışa (böbrek homojenate) aktarın.
- HBSS ile 75 μm elek ile homojen böbrek durular. Akış tantana layın ve daha sonra bu akışı 53 μm'lik bir elekten durulayın. Tüm küçük yapıları kaldırmak için HBSS kullanarak her iki elek yıkayın.
NOT: Bu adımda akış sadece durulanır ancak 75 μm ve 53 μm elekten geçirilir. HBSS ile yıkama, elekteki enkaz ve daha küçük yapıları gidermek için gereklidir. Bu nedenle normalde toplam 200−300 mL HBSS kullanılır. - 75 μm ve 53 m eleküzerinde kalan böbrek yapılarını/malzemesini, %20 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenen Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) ile eleklerin üst yüzeyini yıkayarak toplayın ve malzemeyi 6-iyi ultra-düşük ek mikroplakaya aktarın.
NOT: Elek üst yüzeyini yıkamak için eleği eğik bir pozisyonda (>45°) durulayın ve elek kenarında böbrek malzemesini toplayın. Toplanan malzeme kapsüllü yanı sıra decapsulated glomeruli için zenginleştirilmiş, sadece birkaç boru parçaları gösteren. Kapsüllü glomeruli çok yapışkan. Tek glomeruli toplamak için, bu nedenle glomeruli bir Petri çanak veya iyi plaka yüzeyine uymak önlemek için önemlidir. Yapışmayı önlemek için % 20 FCS ile orta kullanın ve bu adım için ultra düşük ek plakaları kullanın.
3. Glomerüler büyümenin culturing
- Ultra düşük eki mikroplakayı ters ışık mikroskobuna getirin ve 20 μL pipetle tek kapsüllü ve/veya decapsulated glomeruli toplayın. Diğer yapıları ve enkaz borulama kaçının. Pipet ucunda tek bir glomerulus topladıktan sonra, aynı pipet ucuna 20 μL'lik bir hacme böbrek malzemesi toplamadan taze DMEM ortamı ekleyin.
- Glomerulusun kuyunun merkezine bağlanmasıiçin 20°L DMEM ortamına sahip tek glomerülü 24 kuyulu hücre kültür plakasının ortasına aktarın ve 37 °C'de 3 saat ve %5 (v/v) CO2'de kuluçkaya yatırın. Glomerulusun kuyunun yatılılarına sıçramasını önlemek için plakayı dikkatlice hareket ettirin.
- 3 saat kuluçkadan sonra glomerulus kuyunun merkezine bağlanır. Dikkatle hidrokortizon içeren bir büyüme faktörü kiti ile desteklenen endotel bazal orta (EBM) 500 μL ekleyin, insan endotel büyüme faktörü, sığır beyin ekstresi ve gentamicin sülfat-amphotericin B (Malzeme Tablosu) ve ek 5% (v / v) FBS ve 1% (v / v) penisilin / streptomisin (kalem / streprep) her iyi.
- Kültür tek glomeruli için 6 gün için 37 °C, 5% (v /v) CO2.
NOT: 6 gün içinde parietal epitel hücrelerinden oluşan büyüme oluşur. Belirli bileşiklerin veya ilaçların parietal epitel hücreleri üzerindeki etkilerini test etmeyi amaçlıyorsa, bu altı günlük süre içinde ortama eklenmelidir.
4. Parietal epitel hücre proliferasyonunun analizi
- 6 gün sonra glomerüler büyümeyi analiz edin. Dijital ters ışık mikroskobu kullanarak mikroskobik görüntüler alın.
- Yüzey alanını ve glomerüler büyümenin çapını ve büyüyen hücrelerin sayısını veya büyüyen glomerül sayısını belirlemek için bir görüntü analizi yazılımı (örneğin, ImageJ/FIJI) kullanın.
- Glomerüler büyümenin yüzey alanını belirlemek için tif'i açın. ImageJ ölçek çubuğu ile glomerüler outgrowth dosyası. Ölçek çubuğuna düz bir çizgi çizin ve analiz ve ölçme (örneğin, 1 mm = 460 piksel) tıklayarak pikselmesafesini belirleyin.
- Analiz etıklayarak ölçeği belirleyin, ölçeği ayarlayın ve bilinen mesafeyi piksele yazın (örn. 460), bilinen mesafeyi (örn. 1) ve uzunluk birimini (örn. 1 mm) yazın. Tamam'ıtıklatın.
- Analiz e tıklayarak sonuç tablosunda hangi sonuçların görüneceğini belirleyin ve ölçümleri ayarlayın. Glomerüler büyümenin yüzey alanını belirlemek için seçenekler alanını etkinleştirin ve etiketi görüntüleyin. Tamam'ıtıklatın.
- Glomerüler büyüme yüzey alanını belirlemek için, glomerüler büyüme etrafında bir serbest seçim çizin. Analiz ve sonra ölçmek tıklayın, bir sonuç tablosu ImageJ önceki belirlenen ölçekte outgrowth yüzey alanını gösteren açılır (adım 4.4, örneğin, mm2bakınız).
5. Glomerüler hücre büyümesinin karakterizasyonu
NOT: Büyümenin hücresel bileşimini değerlendirmek için, hücreye özgü belirteçler için immünororesans boyama t = 6 gün glomerüler çıkıntılar üzerinde yapılır.
- Dikkatle orta çıkarın ve yavaşça fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak iki kez glomeruli yıkayın.
- PBS'de %4 (w/v) sakaroz ile takviye edilen %2 (w/v) paraformaldehit (PFA) kullanarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sabitlein ve PBS kullanarak 2 kat dikkatlice yıkayın.
- Uygun konsantrasyonda birincil antikor(Malzeme Tablosu)ile inkübatPBS-ovine serum albumin (BSA) 1% (v/v) oda sıcaklığında 1 saat seyreltilmiş.
- Antikor solüsyonu çıkarın ve PBS ile 3x dikkatlice yıkayın.
- Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca karanlıkta PBS-BSA%1 (v/v) seyreltilmiş ikincil antikor(Malzeme Tablosu)ile kuluçka.
- Dikkatle PBS ile 3x yıkayın ve 4 ile sulu montaj orta 1−2 damla kullanarak monte,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) çekirdekleri görselleştirmek ve yuvarlak bir kapak kayma ile kuyu kapağı.
- Floresan mikroskop kullanarak mikroskobik görüntüler alın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Glomerüler büyüme çıktısını gerçekleştirmek için yöntemin sistematik bir diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2A-D, ışık mikroskobu kullanılarak gözlenen farklı zaman noktalarında kapsüllü glomeruli glomerüler çıkıntıları göstermektedir. Büyümeler fare böbreğiglomerulus izolasyonundan sonra kültürde 2, 4 ve 6(Şekil 2B-D)gün lerinde gösterilmiştir. Büyüyen hücrelerin parietal epitel hücreleri olduğunu doğrulamak için, dekapsüle glomerül de şekil 2 E,F'degösterildiği gibi 6 gün boyunca izole edilmiş ve kültürlüdür. Decapsulated glomeruli 6 gün içinde kuluçka döneminde hiçbir hücre büyüme gösterdi. Şekil 3'tefarklı parietal epitel hücre belirteçleri, podosit spesifik belirteçler ve endotel hücre belirteçleri için immünororesans boyama yapıldı. Sonuçlar büyüyen hücrelerin gerçekten parietal epitel hücreleri olduğunu doğrular. Şekil 4, kültürde 6 gün sonra cd44-/- vs WT farelerden izole edilmiş kapsüllü glomerulin büyümesini göstermektedir. Cd44-/- farelerden izole edilen glomeruli, WT farelerinden izole edilen glomeruli'ye göre azalmış sayıda büyüyen hücre nin yanı sıra glomerüler büyümenin azalmış yüzey alanını göstererek, daha önce11olarak yayınlanan parietal epitel hücre aktivasyonunda CD44 için önemli bir rol düşündürmektedir. Şekil5'te, büyüyen parietal epitel hücrelerinin yüzey alanının ImageJ kullanılarak belirlendiği bir örnek verilmiştir.
Şekil 1: Parietal epitel hücre proliferasyonlarını analiz etmek için glomerüler büyüme analizi yapma yönteminin şematik genel bakışı. (1) Böbrekler kurban fareden kesilir ve küçük parçalara ayrılır. (2) Böbrek dokusu 300 μm elekten geçirilir ve 75 μm ve 53 m elek ile durulanır. (3) Eleklerin üstünde kalan glomeruli orta + %20 (v/v) FCS kullanılarak toplanır ve ultra düşük ek plakasına aktarılır. (4) Tek glomeruli ters ışık mikroskobu kullanılarak toplanır ve 24 kuyulu kültür plakalarına aktarılır. (5) 37 °C'de kuluçkadan sonra, 6 gün boyunca %5 (v/v) CO2,, glomerüler büyüme dijital ters ışık mikroskobu kullanılarak analiz edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: WT farelerinden parçalanan böbreklerden izole kapsüllü glomerulin glomerüler büyüme. 37 °C'de kuluçkaya yatan glomerulin büyümesi farklı zaman noktalarında gösterilir: (A) 0 gün, (B) 2 gün, (C) 4 gün ve (D) 6 gün. Decapsulated glomeruli de izole edildi ve 37 °C'de kültürlendi ve mikroskobik görüntüler(E) gün 0 ve (F) gün 6'da büyüme gösteren hücreler yoktu. Ölçek çubukları: (A,E,F) 200 μm, (B) 400 μm, (C,D) 1000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Büyüyen glomerüler hücreler parietal epitel hücre belirteci ekspresyonu göstermektedir. İmmünofloresan boyama, büyüyen epitel hücrelerini karakterize etmek için tek kapsüllü glomerüli izolasyonundan sonra 6. Parietal epitel hücre belirteçleri için pozitif boyanmış hücreler: (A) CD44, (B) SSeCKS, ve (C) claudin-1, ancak ekspresyonu göstermedi (D) podosite özgü marker sinaptopodin veya (E) endotel hücrespesifik marker CD31, glomerulus içinde sadece lokalize edildi. Ölçek çubukları: (A,B,D,E) 100μm, (C) 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CD44 nakavt farelerden izole glomeruli glomerüler büyüme bozulur. Kapsüllü glomeruli (A) WT farelerin ve (B) cd44-/- farelerin parçalanmış böbreklerinden izole edildi. Mikroskobik resimler 6 gün sonra kültürde dijital ters ışık mikroskobu kullanılarak çekildi. Büyüyen parietal epitel hücrelerinin sayısı ve büyüme yüzey alanı WT farelerden cd44-/- farelere göre glomeruli artmış, parietal epitel hücre aktivasyonunda CD44 için önemli bir rol düşündürmektedir. Ölçek çubukları: 1000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ImageJ (FIJI) kullanılarak parietal epitel hücre çoğalması için bir belirteç olarak glomerüler büyümenin yüzey alanının analizine bir örnek. (A) 37 °C'de 6 gün kültürden sonra bir WT farenin kapsüllü glomerulusunun glomerüler büyümesi. (B) İlk olarak, mm2'dekiyüzey alanının analiz edilmesi için ölçek belirlenir. Burada: 1 mm = 460 piksel. (C) Ölçeği ayarladıktan sonra, glomerüler büyüme alanının etrafına bir seçim çizgisi çizilir. (D) Bu seçili alan daha sonra ölçülebilir (bu örnekte yüzey alanı = 2.235 mm2). Ölçek çubukları: 1000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan protokolü kullanarak, parietal epitel hücre aktivasyonunun bir sonucu olan parietal epitel hücre proliferasyonunu değerlendirmek için tek kapsüllü glomeruli kullanabilirsiniz. Bu ex vivo modeli, parietal epitel hücre aktivasyonunda rol oynayan moleküler yolları ayrıntılı olarak incelememizi sağlayacaktır. Açıklanan yöntem, glomeruli kapsüllü glomeruli izole etmek ve kültür ve farklı deneysel koşullar altında parietal epitel hücrelerinin çoğalması ve / veya göç karşılaştırmak için böbrek diseksiyonu ve eleme basit kavramına dayanır. Kültürde 6 gün sonra analiz edilebilen sonuçlar, örneğin, büyümenin yüzey alanı veya çapı veya tek bir kapsüllü glomerulusun büyüyen hücrelerin sayısıdır. Bu araştırma için başka bir uygulama parietal epitel hücre aktivasyonu dahil olabilir moleküler yolları neden veya inhibe ilaçların etkilerini incelemek olabilir.
İmmünofloresan boyama kültürde 6 gün sonra büyüyen hücrelerin parietal epitel hücre belirteçleri (CD44, claudin-1, SSeCKS) için pozitif lekeli olarak parietal epitel hücreleri olduğunu doğruladı ama podosit-spesifik marker sinaptopodin ifade etmedi, ne de endotel hücre belirteci CD31. Boyama sonuçları doğrultusunda, izole edildikten 6 gün sonra büyüyen hücreler gözlenmez ve tek decapsulated glomeruli kültürü, bu 6 günlük süre içinde hücre büyümesinde diğer glomerüler hücrelerin sınırlı kontaminasyon olduğunu gösterir. Başka bir çalışmada da glomerüler outgrowth analiz ve glomerüler outgrowth elde edilen hızlı çoğalan hücrelerin gerçekten parietal epitel hücrelerinden soyundan olduğunu gösterdi14.
Büyüyen hücrelerin marker ekspresyonunu analiz etmek için kullanılan boyama protokolü, diğer ilgi çekici molekülleri test etmek için de uyarlanabilir. İmmünoboyama glomeruli 6 gün boyunca kuluçkaya yatan plakaların kuyularında yapıldı. Bu kuyular kaplanmış değil, glomeruli ilk 2−3 h kuluçka sırasında kuyulara bağlı idi. Glomeruli yüzeye tamamen bağlanmadığı ve glomerüler büyümenin bozulduğu için cam uçlarda veya daha iyi görüntüleme ile sonuçlanabilecek bir hazne slayt sistemi üzerinde kuluçka mümkün değildi. Bu özel protokol son zamanlarda sağlıklı WT ve cd44-/- fareler11glomeruli parietal epitel hücre outgrowth çalışmak için kurulmuştur. Bu yöntem kullanılarak CD44 eksikliği olan parietal epitel hücrelerinde azalma gösteren proliferasyon oranının azaldığı gösterilmiştir ve bu oran Şekil 4'tede gösterilmiştir. Bu yöntem aynı zamanda diğer suşların fareler için ve aynı zamanda diğer genetik olarak değiştirilmiş fareler için kullanılabilir. Örneğin bir önceki çalışmada, glukokortikoid reseptör sinyalizasyon etkilerini analiz etmek için karşılaştırılabilir bir yaklaşım kullanılmıştır15.
Glomerruli farelerden izole etmek ve hücresel büyümeleri analiz etmek için bu tekniğin kullanımı parietal epitel hücre aktivasyonu veya epitel hücre çoğalması sürecini etkileyebilecek ilaçların analizi için ölümsüzleştirilmiş parietal epitel hücre hatlarının kullanımına karşı birçok avantaja sahiptir. İlk olarak, bu yöntemde, birincil hücreler doğrudan glomerulus dışında büyümek ve kültür sadece 6 gün kullanılır. Bu nedenle, glomerüler outgrowths parietal epitel hücreleri fenotip daha az değişiklik yapıldı ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ile karşılaştırıldığında, hangi hücre hattı oluşturmak için ek büyüme pasajları gerekir16. Ayrıca, burada açıklanan yöntem, hücre büyümesinin bozulması veya susturma yöntemleri kullanılarak gen nakavtının etkinliği nedeniyle hücre hatlarında nakavt edilmesi zor olan yollar için de parietal hücre proliferasyonu üzerindeki özel gen nakavtının etkisini karşılaştırmak için kullanılabilir.
Protokolü diğer hayvan modellerine veya insan böbrek dokusuna uyarlamak için eleklerin büyüklüğü en iyi sonucu elde etmek için optimize edilmelidir. Glomerüler boyutu türler arasında farklılık ve bu nedenle glomeruli toplanabilir elek boyutu değişir olmasıdır. Ayrıca, bu yöntemin amacı için bozulmamış kapsüllü glomeruli izole etmek önemlidir. Bu nedenle glomeruli preslenmemeli, küçük eleklerden hafifçe durulanmalıdır.
Protokoldeki bir diğer kritik adım da kapsüllenmiş glomeruli'nin eevleme den sonra toplanmasıdır. Burada glomerulin birbirine bağlanmasını önlemek için %20 FCS ile orta kullanılır. Buna ek olarak, glomeruli ile zenginleştirilmiş çözelti doğrudan ultra-düşük yapışma plakalarına aktarılmalıdır, çünkü, aksi takdirde, glomeruli doğrudan normal hücre kültür plakaları yüzeyine ve hatta zor yakalamak ve tek glomeruli izole yapar plastik tüplerin yüzeyine bağlanacaktır.
Tek kapsüllü glomeruli koleksiyonundan sonra, bu yapışma sağlamak için kuyunun merkezinde kültür ortamı küçük bir hacim de 3 saat kültürlü olmalıdır. Glomerulin in kuyuların yatılı doğru yüzen görüntü analizi sırasında okuma optimize etmek için kaçınılmalıdır.
Burada açıklanan protokolü kullanarak en iyi sonuçları elde etmek için, tek glomeruli kültürü ve 6. Bu noktada parietal epitel hücrelerden oluşan homojen bir hücresel büyüme görülebilir. Daha sonraki zaman noktalarında, glomerüler outgrowth diğer hücre tiplerinin büyümesini gösteren fenotipik heterojen olur. Bu nedenle, protokol çok uzun kuluçka süreleri için uygun görünmüyor. Parietal epitel hücre büyümesi için kuluçka sürelerinin türler arasında veya farklı fare suşları arasında değişebileceğini unutmamak gerekir. Bu nedenle, kültür süreleri test edilmeli ve her fare veya tür için optimize edilmelidir. Buna ek olarak, glomerüler outgrowth kökeni her zaman parietal epitel hücre spesifik belirteçleri için boyama ile doğrulanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Hollanda Böbrek Vakfı (grant 14A3D104) ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO VIDI hibe: 016.156.363) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
