Summary
モデル生物の大きな遺伝的スクリーンは、陰性の遺伝的相互作用の同定につながっている。ここでは、モデル生物の遺伝的スクリーンからのデータを用いて、がんにおける合成致死的相互作用を標的とした薬物の組み合わせを描写するデータ統合ワークフローについて述べている。
Abstract
2つの遺伝子のどちらかのノックアウトが細胞生存率に影響を与えないが、両方の合成致死性インターアクターのノックアウトが細胞生存率または細胞死の喪失につながる場合、2つの遺伝子間の合成致死的相互作用が与えられる。最もよく研究された合成致死的相互作用はBRCA1/2とPARP1の間で、PARP1阻害剤はBRCA1/2変異腫瘍の患者を治療するために臨床現場で使用されている。モデル生物だけでなくハプロイドヒト細胞株においても大きな遺伝的スクリーンは、多数の追加の合成致死的相互作用対の同定につながり、いずれも新しい腫瘍療法の開発に関心のある潜在的な標的である。1つのアプローチは、目的の腫瘍で突然変異または有意にダウンレギュレートされる合成致死的相互作用器を有する遺伝子を治療的に標的にすることである。第二のアプローチは、合成致死的相互作用に対処する薬物の組み合わせを策定することです.この記事では、合成致死的相互作用を対象とした薬物の組み合わせを評価および同定するためのデータ統合ワークフローの概要を説明します。合成致死性相互作用ペア、相同性マッピングリソース、専用データベースからの薬物標的リンク、および対象疾患領域の臨床試験で調査されている薬物に関する情報に関する利用可能なデータセットを利用しています。我々はさらに、卵巣癌と乳癌の文脈における薬物組み合わせ評価に関する我々のグループの2つの最近の研究の主要な知見を強調する。
Introduction
合成致死性は、1つの遺伝子の喪失が生存率に影響を与えないが、両方の遺伝子の喪失が細胞死につながる2つの遺伝子の関連を定義する。ホモ接合体変異体1を飼育することによりショウジョウバエの様々な表現型を分析しながら、ドブジャンスキーによって1946年に最初に記述された。生存可能な子孫を生じなかった変異体は、生存可能であるが、ある特定の他の変異体と交配すると致死的な現象型を示し、合成致死性の理論の確立のための根拠を設定した。Hartwellたちの研究グループは、この概念がヒト2のがん治療に適用できる可能性を示唆した。薬理学的に誘発された合成致死性は、変異遺伝子の合成致死性パートナーが薬理学的化合物によって標的に可能であることを考えると、たった1つの突然変異に依存する可能性がある。合成致死性の薬理学的誘導を可能にする最初の遺伝子ペアはBRCA(1/2)およびPARP1であった。PARP1はDNA損傷のセンサーとして機能し、二重および単一DNAの鎖の破断、スーパーコイルおよびクロスオーバー3の部位に結びついている。BRCA1および2は、相同組換え4を介したDNA二本鎖破断の修復において大きな役割を果たす。Farmerたちは、BRCA1/2に対して欠損した細胞がPARP阻害の影響を受けやすいという知見を発表したが、BRCA野生型細胞5では細胞毒性は認められなかった。最終的に、PARP阻害剤は、BRCA欠損乳癌および卵巣癌6,7の治療のために承認された。また、薬理化合物の臨床承認につながる合成致死性遺伝子ペアが大いに期待されており、最近のがん研究の主要分野8.
合成致死的な遺伝子相互作用は、フルーツハエ、C.エレガンスおよび酵母2を含む複数の生物でモデル化された。RNA干渉とCRISPR/CASライブラリノックアウトを含む様々なアプローチを使用して、新しい合成致死性遺伝子ペアは、近年9、10、11で発見されました。CRISPR/CASと組み合わせたRNAiの実験手順に関するプロトコルが最近、Housdenと同僚12によって発表されました。一方、研究者はまた、合成致死的相互作用を同定するためにハプロイドヒト細胞で大画面を実施しました13,14.生物学的ネットワーク解析や機械学習のようなシンリコ法では、合成致死的相互作用の発見においても約束を示している。
概念的には、抗腫瘍療法の文脈で合成致死的相互作用を利用する1つのアプローチは、腫瘍細胞内の変異タンパク質または非機能的タンパク質を同定し、その合成致死的相互作用パートナーが治療介入のための薬物標的を有望なものにすることである。ほとんどの腫瘍タイプの不均一性のために、研究者はいわゆる合成致死性ハブタンパク質の探索を開始しました。これらの合成致死的なハブは、変異され、したがって、腫瘍サンプルで非機能的または有意にダウンレギュレートされる合成致死的相互作用パートナーの数を有する。このような合成致死的なハブに対処することは、例えばビンクリスチン耐性神経芽細胞腫17の文脈で示すことができるように、薬物の有効性を高めるか、薬剤耐性を克服する約束を保持する。合成致死的相互作用の概念を利用して薬物治療を強化する第2のアプローチは、合成致死的相互作用を標的とする薬物の組み合わせを同定することです。これは、既に承認された単一の抗腫瘍療法の新しい組み合わせと、他の疾患領域から腫瘍学の分野への薬物の再配置につながる可能性があります。
この記事では、合成致死的相互作用ペアを標的とする薬物組み合わせのリストを生成するためのステップバイステップの手順を提示する。このワークフローでは、(i)BioGRIDからの合成致死的相互作用に関するデータと(ii)Ensemblの相同遺伝子に関する情報を使用し、(iii)DrugBankから薬物と標的のペアを取り出し、(iv)ClinicalTrials.gov から疾患と薬物の関連を構築し、(v)合成致死的相互作用に対処する一連の薬物組み合わせを生成する。最後に、代表結果セクションで卵巣癌と乳癌の文脈で薬物の組み合わせを提供する。
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Protocol
1. 合成致死性遺伝子の組を取り出す
- バイオグリッドからのデータ取得。
- web ブラウザを使用するか、curl または wget18を使用して Linux コマンドラインから直接 https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip から tab2 形式の最新の BioGRID インタラクション ファイルをダウンロードします。
##downloadし、最新のバイオグリッド相互作用ファイルを解凍
カールを使用して最新のバイオグリッド相互作用ファイルを#download
カール -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
ダウンロードしたデータ ファイルを#unpackします。
biogrid_latest.zipを解凍する
BG="バイオグリッド-ALL-3.5.171.tab2.txt"
- zip アーカイブがダウンロードされた後、アーカイブをアンパックし、実際のデータセット ファイルの名前をメモする必要があります (BIOGRID-ALL-X.後続の手順の X.X.tab2.txt)BioGRID データファイルは、次のステップでフィルタリングされるさまざまなタイプの相互作用を保持します。
注:議論で概説されているように、合成致死的相互作用を保持する他の情報源(例えばDRYGIN、SynlethDB)が存在する。
- web ブラウザを使用するか、curl または wget18を使用して Linux コマンドラインから直接 https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip から tab2 形式の最新の BioGRID インタラクション ファイルをダウンロードします。
- 合成致死性と陰性の遺伝的相互作用のためのフィルター(実験システム)。
- 合成致死的相互作用を識別するための相互作用の裏付けとなる証拠の性質を示す「実験システム」(列番号12)の列の情報を使用します。
- 値が負の遺伝的または合成致死性のエントリにデータセットを制限します。同じ手順で、列をフィルター処理し、次の表 1 に示すように、後続の分析ステップに関連する列のみを保持します。
##restrict関連する列にBioGRID相互作用ファイルを保存し、負の遺伝的および合成致死性として分類された相互作用のみを保持します
カット -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
|awk -F "\t" 'BEGIN{
OFS="\t"
}
{
if(NR == 1){
印刷 $0
}else if($4 == 「負の遺伝」|| $4 == 「合成致死性」)
印刷 $0
}
}' > bg_synlet.txt
注: コード スニペットでは、横のタブを表すために ^I が使用されます。合成増殖欠陥などの追加の BioGRID カテゴリーを含む場合があります。このワークフローに関連するその他の列を表 1に示します。バイオグリッドはまた、個々の相互作用のためのスコアを保持します。カットオフは、強い/高信頼の相互作用を識別するために使用することができます。
| 列番号 | 列ヘッダー名 |
| 3 | 遺伝子名 |
| 12 | 種 |
| 13 | 薬物ID |
表 1: BioGRID データファイルの関連する列。
- 合成致死的相互作用が報告された種を特定する。
- 合成致死的相互作用パートナーの税 ID の数を決定して、生物ごとに利用可能な合成致死的相互作用の数の推定値を取得します。
##count以前に抽出された合成致死的相互作用における各税IDの出現回数
カット -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt |テール -n +2 |tr "\t" "\n" \
|並べ替え|ユニク -c |ソート -r -g
注:ステップ1の結果として、相互作用が決定された生物からの遺伝子シンボルとの合成致死的相互作用のリスト。合成致死的相互作用の大部分は、モデル生物で決定されている。スプレッドシートプログラム(例えば、Excel)にファイルをロードするとき、ジーンシンボル19、20を台無しにすることを避けます。
- 合成致死的相互作用パートナーの税 ID の数を決定して、生物ごとに利用可能な合成致死的相互作用の数の推定値を取得します。
2. 合成致死性遺伝子のペアをヒトのオルトログに翻訳する
- ステップ 1.3 で特定された関連するモデル生物の人間のオルソログを取得します。
- それぞれのモデル生物遺伝子データセットをヒト遺伝子データセットと連結することにより、Ensembl BioMart21 からヒトオルソログを取得する。このタスクには、モデル生物およびヒト遺伝子の遺伝子を示す遺伝子記号を使用します。Ensembl BioMart ウェブサービスを使用して、検索プロセスを自動化し、そのクエリを BioMart RESTful アクセスに直接送信して、オルソロゴス遺伝子ペアを取得します (詳細については、以下の例と Ensembl BioMart ヘルプとドキュメントを参照してください)。
##retrieve、カールを使用してBioMart RESTfulアクセスサービスに直接バイオマートクエリを送信することで、エンセンブルバイオマートのサッカロミセスセレビシエの人間のオルソパチウス
curl -o s_cerevisiae.txt --データ urlencode 'query=
<クエリ仮想スキーマ名 = "デフォルト" フォーマッタ = "TSV" ヘッダー = "0" 一意な行 = "1" カウント = "" データセットConfigVersion = "0.6" >
<データセット名 = "scerevisiae_gene_ensembl" インターフェイス = "既定" >
<属性名 = "external_gene_name" />
<データセット名 = "hsapiens_gene_ensembl" インターフェイス = "既定" >
<属性名 = "external_gene_name" />
' "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"
他のモデル生物のヒト遺伝子のオーソニエンスを取得するには、最初の Dataset 要素の name 属性の値を、それぞれの Ensembl データセットの名前に置き換えて、クエリを再実行します。
メモ: オルソログマッピングのプロセスは、Ensembl BioMartヘルプ&ドキュメンテーション(http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html)で十分に文書化されています。
- ステップ1.3で特定された上位種であるサッカロミセス・セレビシエのヒトオルソログのバイオマートクエリのサンプルに、URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensemblを使用してアクセスします。
注:この原稿の議論のセクションで概説されているように、相同性マッピングのための他の情報源(例えば、ラウンドアップ、オマブラウザ、ホモロジーン、インパラノイド)が存在します。
- それぞれのモデル生物遺伝子データセットをヒト遺伝子データセットと連結することにより、Ensembl BioMart21 からヒトオルソログを取得する。このタスクには、モデル生物およびヒト遺伝子の遺伝子を示す遺伝子記号を使用します。Ensembl BioMart ウェブサービスを使用して、検索プロセスを自動化し、そのクエリを BioMart RESTful アクセスに直接送信して、オルソロゴス遺伝子ペアを取得します (詳細については、以下の例と Ensembl BioMart ヘルプとドキュメントを参照してください)。
- 抽出された合成致死的相互作用に人間のオルソログを追加します。
- ステップ2.1で取得したオーソリンシーペアと生物税IDと遺伝子シンボルに基づく合成致死的相互作用に参加する。ヒト合成致死的相互作用ペアの場合、データセットに存在するヒト遺伝子ごとに人工的な直交対を作成するか、結合中にヒト合成致死的相互作用が廃棄されないようにし、新たに追加された列にヒト遺伝子記号を移す。
##collect単一ファイル内のオルソログマッピングと合成致命的相互作用ファイルと結合
オルソログ マッピングを収集するためのヘッダーを含むターゲット ファイルを#createします。
エコー "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol">マッピング.txt
各モデル生物のこのステップ#repeat、入力ファイル名とtax-IDを適応するように注意してください
マッピングの新しいエントリをs_cerevisiae.txtの各オルソログペアの#adds.txt: ジーンシンボルには、合成致命的な相互作用ファイルとのその後の結合を容易にするために、税 ID が付きます
awk -F "\t" 'BEGIN{
OFS="\t"
org_tax_id="559292"
}
{
if($1!= "" && $2 != ""){
印刷org_tax_id"/"$1,$2
}
}' s_cerevisiae.txt >> マッピング.txt
ヒト遺伝子の人工マッピングエントリを#create
awk -F "\t" 'BEGIN{
OFS="\t"
human_tax_id="9606"
}
{
if($5 == human_tax_id){
印刷 $5"/"$2, $2
}
if($6 == human_tax_id){
印刷 $6"/"$3, $3
}
}' bg_synlet.txt |-u >>マッピングをソートします.txt
合成致死性相互作用に必要な結合キー(税id/遺伝子シンボル)を#add
awk -F "\t" 'BEGIN{
OFS="\t"
}
{
if(NR == 1){
印刷 $0,"キー・インターアクタA"「キー・インターアクタB」
}その他の {
印刷 $0, $5"/"$2, $6"/"$3
}
}' bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt
#joinオルソのペアとの合成致死的相互作用
マージ tmp_bg_synlet_w_keys.txt マッピング.txt 7 1 > tmp.txt
tmp.txt マッピングをマージ.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt
注: この例で使用されているマージ コマンドは、標準の Unix コマンドではありません。しかし、GNUコアユーティリティのソートと結合の助けを借りてその実装は簡単です。このコマンドは、コマンド結合で結合する前に、ファイルをソートする複雑さを隠すために導入されました。マージの実装は、https://github.com/aheinzel/merge-sh で見つけることができます。
- 最良の結果を得るには、特定の名前空間で遺伝子を一意に識別する遺伝子識別子を使用する。
注:ステップ2は、ヒト遺伝子にマッピングされた複数の生物からの合成致死的相互作用のリストをもたらす。
- ステップ2.1で取得したオーソリンシーペアと生物税IDと遺伝子シンボルに基づく合成致死的相互作用に参加する。ヒト合成致死的相互作用ペアの場合、データセットに存在するヒト遺伝子ごとに人工的な直交対を作成するか、結合中にヒト合成致死的相互作用が廃棄されないようにし、新たに追加された列にヒト遺伝子記号を移す。
合成致死性相互作用パートナーの薬物へのマッピング
- ドラッグバンクから薬物と標的のペアを取得します。
- DrugBankのダウンロードセクションからDrugBankのデータをダウンロードし、まだ作成していない場合は、最初にアカウントを作成します 22.薬物ターゲット識別子(タンパク質識別子セクション:https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers)とDrugBankの語彙(オープンデータセクション:https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data)を含むCSVファイルをDrugBankの識別子と名前で使用します。または、XML データベース ダンプから必要な情報を抽出します。
##restrict DrugBankの薬物標的ファイルを関連する列に保存し、ヒト分子エンティティのエントリのみを保持する
DB_TARGETS="すべて".csv"
DB_NAMES=「ドラッグバンク語彙.csv」
関連する列を#extractし、タブを列セペレーターとして使用するように再フォーマットする
csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt
awk -F "\t" 'BEGIN{
OFS="\t"
}
{
if(NR == 1 || $2 == "人間"){
印刷 $1, $3
}
}' target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt
注: ドラッグバンクのデータは、2つの主要な形式で提供されています。データベース全体が XML ファイルとして使用できます。さらに、データの大部分は、一連のコンマ区切り値 (CSV) ファイルで使用できます。
- ドラッグバンクはまた、非ヒト薬物標的を記録していることに注意してください。種列(カラム番号12)を用い、ヒトの薬物標的を抽出することができる。
注: 抽出された列の読みやすさを高めるため、 表 2に記載されています。他の情報源(例えば、治療標的データベースまたはChembl)は、議論のセクションで概説されているように、薬物標的リンクを保持する存在する。
- DrugBankのダウンロードセクションからDrugBankのデータをダウンロードし、まだ作成していない場合は、最初にアカウントを作成します 22.薬物ターゲット識別子(タンパク質識別子セクション:https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers)とDrugBankの語彙(オープンデータセクション:https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data)を含むCSVファイルをDrugBankの識別子と名前で使用します。または、XML データベース ダンプから必要な情報を抽出します。
| 列番号 | 列ヘッダー名 |
| 3 | 遺伝子名 |
| 12 | 種 |
| 13 | 薬物ID |
- 薬物ターゲットに薬物名を追加します。
- 薬物名と薬物標的情報は2つの別々のCSVファイルで提供されるため、2つのファイルの情報をマージして、合成致死的相互作用パートナーを標的とする薬物の名前を合成致死的相互作用に追加する。一般的なドラッグバンク薬- ID列を使用して、2 つのデータセットを結合します。最初のファイルは、タンパク質が複数の薬物によって標的にされている場合、複数のDrugBank薬物IDを連続して保持する可能性があるため、最初に薬物標的データセットを正規化します。
##generate薬物標的遺伝子シンボル、ドラッグバンク薬物IDおよび薬物名を保持する単一のファイル
#normalize薬物標的データセット
awk -F "\t" 'BEGIN{
OFS="\t"
}
{
if(NR == 1){
印刷 $0
}その他の if($1!= "" && $2 != ""){
分割($2、drug_targets、";")
for(i in drug_targets){
drug_target = drug_targets[i]
gsub(/ /, "" , drug_target)
印刷 $1, drug_target |"並べ替え -u"
}
}
}' human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt
関連する列を#extractし、タブを列区切りとして使用するように再フォーマットする
csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt
human_target_to_drug.txtをマージする \
drugbank_id_to_name.txt 2 1 > db_human_drug_targets.txt
注:ドラッグバンク語彙の列1と3は.csvファイルは、DrugBankの薬物IDとそれぞれの名前を保持しています。
- 薬物名と薬物標的情報は2つの別々のCSVファイルで提供されるため、2つのファイルの情報をマージして、合成致死的相互作用パートナーを標的とする薬物の名前を合成致死的相互作用に追加する。一般的なドラッグバンク薬- ID列を使用して、2 つのデータセットを結合します。最初のファイルは、タンパク質が複数の薬物によって標的にされている場合、複数のDrugBank薬物IDを連続して保持する可能性があるため、最初に薬物標的データセットを正規化します。
- 合成致死的相互作用のパートナーを標的とする薬物を合成致死的相互作用データセットに追加します。
- 合成致死的相互作用に薬物を追加する遺伝子シンボル列を使用して、前のステップで生成された薬物標的薬物名ファイルと合成致死的相互作用データセットに参加します。各合成致死的相互作用の両方のパートナーの薬物名を追加するように注意してください。.
##enhance各合成致死的相互作用のパートナーを標的とした薬物を追加することによって、合成致死的相互作用ファイル
9 1 > tmp bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txtマージ.txt
マージ tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt
注:ステップ3は、複数の生物とそれらのオーソリンジヒト遺伝子およびこれらの遺伝子を標的とする薬物との合成致死的相互作用をもたらす。
- 合成致死的相互作用に薬物を追加する遺伝子シンボル列を使用して、前のステップで生成された薬物標的薬物名ファイルと合成致死的相互作用データセットに参加します。各合成致死的相互作用の両方のパートナーの薬物名を追加するように注意してください。.
臨床試験で現在試験されている薬剤の組み合わせのセットを確立する
- ClinicalTrials.gov データへのアクセスを取得します。
- (i) 個別の試験、(ii) 検索クエリから得られた試験、または(iii) データベース内のすべての試験で、ClinicalTrials.gov から臨床試験に関する情報をXML形式で取得します。また、臨床試験の変換イニシアチブによって提供されるリソースを使用して、リレーショナル データベース内の ClinicalTrials.gov からのすべてのデータをホストすることもできます。詳細については、ステップ 4.4 を参照してください。
注: 臨床試験変革イニシアチブによってホストされているクラウドホスト型データベース インスタンスにアクセスするには、無料アカウントが必要です。さらに、plsql クライアントが必要です。
- (i) 個別の試験、(ii) 検索クエリから得られた試験、または(iii) データベース内のすべての試験で、ClinicalTrials.gov から臨床試験に関する情報をXML形式で取得します。また、臨床試験の変換イニシアチブによって提供されるリソースを使用して、リレーショナル データベース内の ClinicalTrials.gov からのすべてのデータをホストすることもできます。詳細については、ステップ 4.4 を参照してください。
- 介入試験に焦点を当てる。
- 対象の表示に固有の試験を抽出します。
注:ClinicalTrials.gov NCBI医療科目見出し(MeSH)制御語彙から病気の名前を提供します。提出者が提供する疾患名とは対照的に、制御された語彙は、関心の指標のための試験を効率的に識別することを可能にする。それにもかかわらず、NCBI MeSH 制御語彙はシソーラスであることを覚えておいてください。したがって、関心のある一般的な表示に子/狭い項が含まれている場合は、MeSH ブラウザ (https://meshb.nlm.nih.gov) をチェックし、必要に応じてそれらを含めます。 - これらの試験でテストされた薬物と一緒に同定された試験を取得します。卵巣癌の一般的な適応症における試験の問い合わせは以下に提供される。
##retrieve臨床試験変換イニシアチブからの一般的な適応症卵巣癌の介入試験 ClinicalTrials.gov データを含むリレーショナルデータベースをホスト
猫<<|
\pset フッターをオフにします
個別s.nct_id、s.brief_title、i.intervention_type、i.name を選択
研究から
内部結合 browse_conditions c ON(s.nct_id = c.nct_id)
内部結合介入 i ON(s.nct_id = i.nct_id)
s.study_type = 「介入」
そしてc.mesh_term(
「卵巣新生物」、
「癌、卵巣上皮」、
「グラヌロサ細胞腫瘍」、
「遺伝性乳癌と卵巣癌症候群」、
「ルテオマ」、
「メイグス症候群」、
「セルトリ・レイディッグ細胞腫瘍」、
「テコマ」
)
s.nct_id、i.intervention_typeによる注文。
EOF
psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --ユーザー名="XXX" --パスワード --no-align --フィールド区切り記号="^I" --出力="clinical_trials.txt"
- 薬物名を抽出し、ドラッグバンクの名前にマップします。
注:関心のある臨床試験から取得した薬物名を直接使用するのは魅力的ですが、ClinicalTrials.gov の介入名は、提出者がフリーテキストとして入力されることに注意する必要があります。その結果、名前は標準化されておらず、ブランド名は一般的な化合物名の代わりに使用され、適切なデータ正規化の保証はありません(例えば、1つのエントリで複数の薬物名)。また、薬物は、薬物とは異なる異なる介入タイプで提出されるのが一般的である。したがって、取得した介入名をDrugBankの薬物名にマッピングするのが最善です。
##Obtain以前に取得した臨床試験のセットで使用される介入のリストです。
カット -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt |テール -n +2 |並べ替え -u
注: 列 3 と 4 は、それぞれ介入名と介入名のタイプを保持します。
- ガイドラインから既に臨床使用中の薬物との補完
注:ステップ4は、関心の指標のために評価/使用中の薬物のリストになります。
5. 合成致死的相互作用を標的とした薬剤の組み合わせの同定
- 目的の2つの薬物によって標的とされている合成致死的相互作用を検索します。薬物Aと薬物Bの両方を保持するファイル内の行を除外することによって、データセットをステップ3から対象の薬物に制限します。
##only、両方のパートナーが関心のある2つの薬物(drug_aとdrug_b)によって標的にされる合成致死的相互作用およびそれらを引き起こす薬物のエントリを保持します
awk -F "\t" '{
if($12 == drug_a && $14 == drug_b) ||($12 == drug_b && $14 == drug_a){
印刷 $0
}
}' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt
- 2つの薬物のどちらも両方の合成致死的相互作用パートナーを標的にされていないことを確認してください。ステップ 3.2 からデータセットで特定された各薬物の薬物標的を確認し、両方の同定された合成致死的パートナーが特定の薬物の標的であるかどうかを評価する。
##find特定の薬物名のすべての薬物ターゲットエントリ
awk -F "\t" '{
if($3 ==薬物){
印刷 $0
}
}' 薬物="XXX" db_human_drug_targets.txt
注:両方の合成致死的相互作用経路を標的とする薬物は、どの細胞にも有毒であるため、理論的には貴重なマルチターゲット剤ではありません。これがアルゴリズムのこのステップでこの可能性が除外される理由です。
6. 試験は、試験の新しい薬剤の組み合わせでインビトロ
- ヒト乳癌細胞株およびヒト良性乳腺上皮細胞を、様々な薬剤の組合せで5%CO2の加湿された37°C雰囲気で培養した標準的な体外培養法で治療する。
- 細菌感染を妨げるために牛の血清とペニシリンだけでなく、ストレプトマイシン硫酸を補ったメディアを使用してください。
- DMSOやリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒中の希釈剤は、以前に確立されたIC50(阻害濃度)に基づいて少なくとも4つの異なる濃度で、それらを組み合わせてまたは単独で細胞の治療に使用します。
- アネキシンV/7-AAD染色などの細胞生存アッセイおよびアポトーシスアッセイを行い、治療によって引き起こされる細胞傷害効果を決定する。
- ウェスタンブロットを用いて、疑わしい分子標的の薬理学的阻害を監視する。
- 合成致死性と、Chouと他の人によって記述される組み合わせ指数(CI)を計算する純粋に加法的効果と区別する。
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Representative Results
我々のグループは最近、卵巣癌と乳癌の文脈における合成致死的相互作用を標的とする薬物の組み合わせを同定するために、この原稿に描かれているワークフローを適用する2つの研究を発表した。最初の研究では、現在後期臨床試験でテストされている薬物の組み合わせ(第III相およびIV)、または合成致死的相互作用への影響に関する卵巣癌患者の治療に既に臨床現場で使用されている薬物の組み合わせを評価した。さらに、現在臨床試験でテストされていないが、合成致死的相互作用を標的とする観点から根拠を提供している薬物の組み合わせを同定した。したがって、我々は後期卵巣癌試験ですべての化合物のプールから薬物を選択するすべての可能な薬物の組み合わせを評価した。我々は、68後期卵巣癌試験で調査された61の薬物組み合わせのユニークなセットを同定した。これらの61の薬物の組み合わせのうち12は、少なくとも1つの合成致死的相互作用に対処した。これまでに臨床試験で調査されることなく、合成致死的相互作用に対処するために84の追加の薬物組み合わせが提案された。図1に示すように、21のユニークな薬物が、39の合成致死性インターアクターのセットを標的とした84の同定された薬物の組み合わせに寄与した。
図1:卵巣癌の文脈における提案された新規薬物の組み合わせのネットワーク。図1は、臨床試験で現在試験されていない2つの薬物によってインターアクターが対処されている合成致死的相互作用を示しています。シンレットの相互作用は赤で表示され、薬物とターゲットのリンクは灰色のエッジで示されます。点線は、後期卵巣癌臨床試験で他の薬物の組み合わせによって対処されている合成致死的相互作用を表す。これらの調査された薬物の組み合わせは、それぞれ、セディラニブとオラパリブの追加の調査組み合わせと共に、アスタリスク(*)を有して示され、円(o)[25から適応]である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2番目の研究で同じワークフローを使用して、乳癌の文脈で166の合成致死性遺伝子ペアを標的とした243の有望な薬物組み合わせを同定した。我々は、2つの乳癌細胞株における細胞生存率およびアポトーシスへの影響に関する選択された薬物組み合わせを実験的に試験した。特に、セレコキシブとゾレドロン酸の併用低毒性薬は、それらの組み合わせ指数によって決定される乳癌細胞株における付加的効果を超える細胞毒性を示した。この薬剤の組み合わせに対する生存率およびアポトーシスアッセイの結果を 図2に示す。
図2:セレコキシブおよびゾレドロン酸がSKBR-3細胞の生存率およびアポトーシスに及ぼす影響(A)セレコキシブ(CEL)、ゾレドロン酸(ZOL)、およびゾレドロン酸とセレコキシブ(ZOL+CEL)の組み合わせに対する生存率アッセイの結果がSKBR-3乳癌細胞株である。使用した低および高のCEL濃度は50μMおよび75μMであったが、使用した低及び高いZOL濃度は500μMおよび750μMであった。この薬剤の組み合わせは、細胞生存率に有意な相乗効果を有した(**p<0.001)。(B、C)セネキシンV(ANXA5)および7-AAD染色は、CEL、ZOL、および薬物併用ZOL+CELで処理されたSKBR-3細胞の染色。7-AADpos/ANXA5pos細胞の割合は、薬物併用ZOL + CELでの治療後に増加した[24から適合]。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
合成致死的相互作用に影響を与える薬物の組み合わせを特定するワークフローを概説しました。本ワークフローでは、モデル生物からの合成致死的相互作用に関する(i)データ、(ii)ヒト直交体の情報、(iii)薬物標的関連に関する情報、(iv)がんの文脈における臨床試験に関する薬物情報、および(v)科学文献から抽出された薬物疾患および遺伝子疾患関連の情報に関する情報を利用する。統合された情報は、合成致死性遺伝子ペアに対する調査中の特定の薬物組み合わせの影響を評価するために使用することができます。さらに、統合データを使用して、がんの文脈で臨床試験で現在調査または試験中の一連の薬物を評価して、最も関連性の高い合成致死的相互作用を標的とした組み合わせを見つけることができ、したがって腫瘍細胞の生存に影響を与える可能性が高い。最後に、生成されたデータを使用して、腫瘍治療のために最初に開発されていない薬物からなる薬物の組み合わせをスクリーニングすることができ、したがって、計算的に駆動される薬物再配置ケースのための方法を提供する。
データ統合ワークフローの各ステップでは、データワークフロー全体を完了するための主要なデータ ソースを提示しますが、追加のデータ ソースを使用することで、ワークフローをさまざまな段階でさらに強化できることを指摘します。我々のワークフローでは、BioGRID データベース18から合成致死的相互作用ペアを抽出した。特に実験タイプ「合成致死性」と「陰性遺伝」の相互作用に焦点を当てた。合成致死的相互作用に関するBioGRIDの情報には、例えば、DRYGINデータベース27でも入手可能なコスタンツォと同僚26が発表したデータセットや、科学文献の個々の実験に記載されている単一の合成致死的相互作用に関するデータなど、大きな遺伝的スクリーンからのデータセットが含まれています。SynLethDB28のように、合成致命的な相互作用を収集して格納する追加のデータソースがあります。さらに、オーソロジーマッピングのレベルでは、多数の異なるツールやデータベースが存在します。Ensemblバイオマートを利用して、モデル生物で同定された合成致死的相互作用パートナーを対応するヒトオルソログにマッピングする方法を提示します。その他のオーソロジーデータベースとサービスには、NCBIのホモロジーンデータベース29、スイスバイオインフォマティクス研究所30のOMAorologyデータベース、またはストックホルムバイオインフォマティクスセンター31によって維持されているInParanoidオルソロググループデータベースが含まれます。私たちのワークフローでは、酵母からの合成致死的相互作用の数が最も多い、複数のモデル生物からの合成致死的相互作用に焦点を当てました。オーソロジーマッピングの入力セットをマウスとラットからのデータのみに制限することを検討するかもしれません。合成致死的相互作用の入力セットを定義する追加の方法は、複数の種で保存されている合成致死的相互作用のみに焦点を当てることであり、それによって合成致死的相互作用が本当に肯定的である可能性を高める。一方、これは、S.セレビシエとS.ポンベの間に同定された合成致死的相互作用に既に大きな違いがあるため、合成致死的相互作用のセットを劇的に減少させる可能性があります。もう一つのアプローチは、最初に厳しすぎないようにし、代表的な結果セクションに記載されている2つの研究で行ったように、機械学習アルゴリズムによる実験的な合成致死的相互作用のセットを拡張することさえあります。簡単に言えば、ランダムな森林モデルを使用して、酵母にオーソリンジ遺伝子が存在しないヒト遺伝子の合成致死的相互作用を予測した。ランダムフォレストモデルは、先に説明した経路関連、遺伝子オントロジーの割り当て、疾患および薬物関連に関するデータを使用して、酵母とその直交性ヒト遺伝子からの合成致死相互作用対のセットについて訓練された。これにより、統合ワークフローでオルソログマッピング情報が利用できないヒト遺伝子を考慮することができました。薬物と対象の関連付けに関する情報を格納する広く使用されているデータベースは、ワークフローの主要な相互作用源でもあるDrugBankです。薬物標的に関する補完的な情報がある程度保持している他のデータベースは、治療標的データベース(TTD)32またはChEMBL33である。ワークフローの主要なコンポーネントは、南洋理工大学の研究者によって開発されたemergentecとSynLethDBのe.評価プラットフォームにも組み込まれています。しかし、2015 年の SynLethDB の最後の更新は、それぞれの Web ページ28のダウンロード セクションに保存されているデータセットに基づいていました。
同定された薬物の組み合わせと標的化された合成致死的相互作用ペアをランク付けする方法は、合成致死的パートナーおよび/または薬物と、文献採掘方法を介して関心のある疾患との関連付けを使用することです。卵巣癌の文脈における薬物組み合わせの評価に関する我々の研究では、卵巣癌に関する出版物の数に基づいて、それぞれの薬物組み合わせの2つの合成致死的なインターアクターのいずれかに言及する新しい提案薬物の組み合わせをランク付けした。PubmedのMeSH注釈は、主要なMeSHブランチCで与えられた正確な疾患用語を使用して特定の疾患の出版物を同定するために使用され、同定された出版物の遺伝子に関する情報は、他の34に記載されているようにNCBIのgene2pubmedマッピングファイルを使用して抽出することができる。また、比較毒性学データベース35、DisGeNET36、またはe.評価ソフトウェアプラットフォームなどの遺伝子疾患および/または薬物疾患リンクを保持する専用データベースがあります。疾患関連に基づく薬物の組み合わせのランキングは、実験的検査のための薬物組み合わせの最終的な選択をサポートする1つの方法です。さらなる検査のために薬物の組み合わせを選択する際には、例えば、薬物の個々の毒性プロファイルや、それぞれの標的器官における合成致死性インターアクターの発現状態など、追加の側面を考慮する必要がある。
代表結果セクションでは、セレコキシブとゾレドロン酸の薬剤の組み合わせに関するデータを提示し、乳癌の文脈における薬物の組み合わせを同定するワークフローに従って同定した。この特定の薬剤の組み合わせは、両方の化合物の低毒性プロファイルのために実験的試験のために選択された。インビトロ実験では、細胞の生存率とアポトーシスに対する薬物の組み合わせの影響を評価するために、様々な濃度を使用しました。理想的には、薬物濃度は、副作用を最小限に抑えながら、2つの薬物を組み合わせることで有効性を最大化するために、個々の薬物について有意に低下させることができる。より低用量での生存率への影響を見ることはさらに有意義であり、インビトロ検査に使用される薬物濃度は、生体内モデルでは到達していない超治療的であると批判される可能性がある。しかし、濃度は、文献中のこれらの与えられた薬物を用いた細胞培養実験に基づいて選択された。ほとんどの化合物は複数の薬物標的を有するため、薬物の服用は主に影響を受ける標的にさらに影響を及ぼし、既知および未知の下流分子の大規模なセットにも影響を与える可能性があります。インビトロ細胞培養系における細胞生存能に対する相乗効果を示す薬物の組み合わせは、3Dモデルまたはインビボモデルでさらに調査されるべきである。
要約すると、我々は、合成致死的相互作用を対象とした薬物の組み合わせを評価し、提案するために、異なるデータソースからの情報を統合するワークフローを提示する。現在までに、合成致死的相互作用に関する最大の情報は、まだモデル生物から来ているため、ヒトゲノムへの必須の腫瘍学マッピングステップが必要です。ヒトハプロイド細胞の最初のスクリーンは、ヒト細胞における合成致死的相互作用の同定につながっている。さらに、CRISPR/CAS技術は、細胞レベルで合成致死的相互作用を研究する新しい方法を開きました。より高品質な生物学的合成致死的相互作用データが利用可能になる中で、我々のようなデータ統合の取り組みは、BRCA(1/2)/PARP1以外の新しく臨床的に意味のある合成致死性遺伝子のペアを発見することによって、将来的に臨床癌治療を変革することを提案する。
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Disclosures
AHとPPは、代表的な結果セクションに示された結果につながる分析を行った時点でのEmergentecバイオデベロップメントGmbHの従業員でした。MMとMKは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
データ統合ワークフローの開発のための資金は、補助金契約のnuの下で欧州共同体の第7の枠組みプログラムから得られました。279113 (オチップ)。この出版物内のデータの適応は、科学出版物とインパクトジャーナルの公共図書館、LLCによって親切に承認されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioGRID | n/a | n/a | thebiogrid.org |
| ClinicalTrials.gov | n/a | n/a | ClinicalTrials.gov |
| DrugBank | n/a | n/a | drugbank.ca |
| Ensembl BioMart | n/a | n/a | ensembl.org |
| for alternative computational databases please refer to the manuscript | |||
| 7-AAD | ebioscience | 00-6993-50 | |
| AnnexinV-APC | BD Bioscience | 550474 | |
| celecoxib | Sigma-Aldrich | PZ0008-25MG | |
| CellTiter-Blue Viability Assay | Promega | G8080 | |
| FACS Canto II | BD Bioscience | n/a | |
| fetal bovine serum | Fisher Scientific/Gibco | 16000044 | |
| FloJo Software | FloJo LLC | V10 | |
| McCoy's 5a Medium Modified | Fisher Scientific/Gibco | 16600082 | |
| penicillin G/streptomycin sulfate | Fisher Scientific/Gibco | 15140122 | |
| SKBR-3 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC HTB-30 | |
| zoledronic acid | Sigma-Aldrich | SML0223-50MG | |
| further materials or equipment will be made available upon request |
References
- Dobzhansky, T. Genetics of natural populations; recombination and variability in populations of Drosophila pseudoobscura. Genetics. 31, 269-290 (1946).
- Hartwell, L. H., Szankasi, P., Roberts, C. J., Murray, A. W., Friend, S. H. Integrating genetic approaches into the discovery of anticancer drugs. Science. 278 (5340), New York, N.Y. 1064-1068 (1997).
- D'Amours, D., Desnoyers, S., D'Silva, I., Poirier, G. G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. The Biochemical Journal. 342 (2), 249-268 (1999).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
- McCann, K. E., Hurvitz, S. A. Advances in the use of PARP inhibitor therapy for breast cancer. Drugs in Context. 7, 212540 (2018).
- Franzese, E., et al. PARP inhibitors in ovarian cancer. Cancer Treatment Reviews. 73, 1-9 (2019).
- Ashworth, A., Lord, C. J. Synthetic lethal therapies for cancer: what’s next after PARP inhibitors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (9), 564-576 (2018).
- Yu, B., Luo, J. Synthetic lethal genetic screens in Ras mutant cancers. The Enzymes. 34, Pt B 201-219 (2013).
- Thompson, J. M., Nguyen, Q. H., Singh, M., Razorenova, O. V. Approaches to identifying synthetic lethal interactions in cancer. The Yale Journal of Biology and Medicine. 88 (2), 145-155 (2015).
- Ruiz, S., et al. A Genome-wide CRISPR Screen Identifies CDC25A as a Determinant of Sensitivity to ATR Inhibitors. Molecular Cell. 62 (2), 307-313 (2016).
- Housden, B. E., Nicholson, H. E., Perrimon, N. Synthetic Lethality Screens Using RNAi in Combination with CRISPR-based Knockout in Drosophila Cells. Bio-Protocol. 7 (3), (2017).
- Blomen, V. A., et al. Gene essentiality and synthetic lethality in haploid human cells. Science. 350 (6264), New York, N.Y. 1092-1096 (2015).
- Forment, J. V., et al. Genome-wide genetic screening with chemically mutagenized haploid embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 13 (1), 12-14 (2017).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Systems. 1 (6), 383-395 (2015).
- Madhukar, N. S., Elemento, O., Pandey, G. Prediction of Genetic Interactions Using Machine Learning and Network Properties. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 172 (2015).
- Fechete, R., et al. Synthetic lethal hubs associated with vincristine resistant neuroblastoma. Molecular BioSystems. 7 (1), 200-214 (2011).
- Oughtred, R., et al. The BioGRID interaction database: 2019 update. Nucleic Acids Research. 47, D1 529-541 (2019).
- Zeeberg, B. R., et al. Mistaken identifiers: gene name errors can be introduced inadvertently when using Excel in bioinformatics. BMC bioinformatics. 5, 80 (2004).
- Ziemann, M., Eren, Y., Gene El-Osta, A. name errors are widespread in the scientific literature. Genome Biology. 17 (1), 177 (2016).
- Kersey, P. J., et al. Ensembl Genomes 2018: an integrated omics infrastructure for non-vertebrate species. Nucleic Acids Research. 46, D1 802-808 (2018).
- Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46, D1 1074-1082 (2018).
- Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
- Marhold, M., et al. Synthetic lethal combinations of low-toxicity drugs for breast cancer identified in silico by genetic screens in yeast. Oncotarget. 9 (91), 36379-36391 (2018).
- Heinzel, A., et al. Synthetic lethality guiding selection of drug combinations in ovarian cancer. PloS One. 14 (1), 0210859 (2019).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
- Koh, J. L. Y., et al. DRYGIN: a database of quantitative genetic interaction networks in yeast. Nucleic Acids Research. 38, 502-507 (2010).
- Guo, J., Liu, H., Zheng, J. SynLethDB: synthetic lethality database toward discovery of selective and sensitive anticancer drug targets. Nucleic Acids Research. 44, 1011-1017 (2016).
- NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
- Altenhoff, A. M., et al. The OMA orthology database in 2018: retrieving evolutionary relationships among all domains of life through richer web and programmatic interfaces. Nucleic Acids Research. 46 (1), 477-485 (2018).
- Sonnhammer, E. L. L., Östlund, G. InParanoid 8: orthology analysis between 273 proteomes, mostly eukaryotic. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 234-239 (2015).
- Li, Y. H., et al. Therapeutic target database update 2018: enriched resource for facilitating bench-to-clinic research of targeted therapeutics. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1121 (2018).
- Gaulton, A., et al. The ChEMBL database in 2017. Nucleic Acids Research. 45 (1), 945-954 (2017).
- Heinzel, A., Mühlberger, I., Fechete, R., Mayer, B., Perco, P. Functional molecular units for guiding biomarker panel design. Methods in Molecular Biology. 1159 (12), 109-133 (2014).
- Davis, A. P., et al. The Comparative Toxicogenomics Database: update 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 948-954 (2019).
- Piñero, J., et al. DisGeNET: a comprehensive platform integrating information on human disease-associated genes and variants. Nucleic acids research. 45 (1), 833-839 (2017).
