Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

En arbeidsflyt for dataintegrering for å identifisere stoffkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/60328

Summary

Store genetiske skjermer i modellorganismer har ført til identifisering av negative genetiske interaksjoner. Her beskriver vi en arbeidsflyt for dataintegrasjon ved hjelp av data fra genetiske skjermer i modellorganismer for å avgrense legemiddelkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner i kreft.

Abstract

En syntetisk dødelig interaksjon mellom to gener gis når knock-out av enten ett av de to genene ikke påvirker cellens levedyktighet, men knock-out av begge syntetiske dødelige interagere fører til tap av celle levedyktighet eller celledød. Den best studerte syntetiske dødelige interaksjonen er mellom BRCA1/2 og PARP1, med PARP1-hemmere som brukes i klinisk praksis for å behandle pasienter med BRCA1/2 muterte svulster. Store genetiske skjermer i modellorganismer, men også i haploide menneskelige cellelinjer har ført til identifisering av mange ekstra syntetiske dødelige interaksjonspar, som alle er potensielle mål av interesse for utvikling av nye tumorterapier. En tilnærming er å terapeutisk målrette gener med en syntetisk dødelig interaktivitet som er mutert eller betydelig nedregulert i svulsten av interesse. En annen tilnærming er å formulere legemiddelkombinasjoner som omhandler syntetiske dødelige interaksjoner. I denne artikkelen skisserer vi en arbeidsflyt for dataintegrasjon for å evaluere og identifisere legemiddelkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner. Vi benytter oss av tilgjengelige datasett om syntetiske dødelige interaksjonspar, homologikartleggingsressurser, narkotikamålkoblinger fra dedikerte databaser, samt informasjon om legemidler som undersøkes i kliniske studier på sykdomsområdet av interesse. Vi fremhever videre nøkkelfunn i to nyere studier av vår gruppe om legemiddelkombinasjonsvurdering i sammenheng med eggstokk- og brystkreft.

Introduction

Syntetisk dødelighet definerer en sammenslutning av to gener, hvor tap av ett gen ikke påvirker levedyktigheten, men tap av begge genene fører til celledød. Det ble først beskrevet i 1946 av Dobzhansky mens du analyserte ulike fenotyper av drosophila ved avl av homozygote mutanter1. Mutanter som ikke produserte levedyktige avkom, selv om de var levedyktige selv, viste dødelige fenotyper når de krysset med visse andre mutanter, og satte bakken for etableringen av teorien om syntetisk dødelighet. Hartwell og kolleger foreslo at dette konseptet kunne gjelde for kreftbehandling hos mennesker2. Farmakologisk provosert syntetisk dødelighet kan stole på bare en mutasjon, gitt at det muterte genets syntetiske dødelige partner er målbar av en farmakologisk forbindelse. Det første genparet som muliggjør farmakologisk induksjon av syntetisk dødelighet var BRCA(1/2) og PARP1. PARP1 fungerer som en sensor for DNA-skade, og er knyttet til steder med doble og enkle DNA-strandbrudd, supercoils og crossovers3. BRCA1 og 2 spiller store roller i reparasjon av DNA dobbeltstreng bryter gjennom homolog rekombinasjon4. Farmer og kolleger publiserte funn om at celler mangelfulle for BRCA1/2 var utsatt for PARP-hemming, mens ingen cytotoksisitet ble observert i BRCA wild-type celler5. Til slutt ble PARP-hemmere godkjent for behandling av BRCA mangelfull bryst- og eggstokkkreft6,7. Videre er syntetiske dødelighet genpar som fører til klinisk godkjenning av farmakologiske forbindelser mye forventet og et stort område av nyere kreftforskningsinnsats8.

Syntetiske dødelige geninteraksjoner ble modellert i flere organismer, inkludert fruktfluer, C. elegans og gjær2. Ved hjelp av ulike tilnærminger, inkludert RNA-interferens- og CRISPR/CAS-bibliotek knockouts, ble nye syntetiske dødelige genpar oppdaget de siste årene9,10,11. En protokoll om eksperimentelle prosedyrer av RNAi i kombinasjon med CRISPR / CAS ble nylig publisert av Housden og kolleger12. I mellomtiden gjennomførte forskere også store skjermer i haploide menneskelige celler for å identifisere syntetiske dødelige interaksjoner13,14. I silico metoder som biologisk nettverksanalyse og maskinlæring har også vist løfte i oppdagelsen av syntetiske dødelige interaksjoner15,16.

Conceptionally, en tilnærming for å gjøre bruk av syntetiske dødelige interaksjoner i sammenheng med anti-tumor terapi er å identifisere muterte eller ikke-funksjonelle proteiner i tumorceller, noe som gjør deres syntetiske dødelige interaksjon partnere lovende narkotika mål for terapeutisk intervensjon. På grunn av heterogeniteten til de fleste tumortyper har forskere startet søket etter såkalte syntetiske dødelige knutepunktproteiner. Disse syntetiske dødelige knutepunktene har en rekke syntetiske dødelige interaksjonspartnere som enten er mutert og derfor ikke-funksjonelle eller betydelig nedregulert i tumorprøver. Å adressere slike syntetiske dødelige knutepunkter holder løfter om å øke legemiddeleffekten eller overvinne narkotikaresistens som for eksempel kan vises i sammenheng med vincristineresistent nevroblastom17. En annen tilnærming for å forbedre legemiddelbehandlingen ved bruk av begrepet syntetiske dødelige interaksjoner er å identifisere legemiddelkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner. Dette kan føre til nye kombinasjoner av allerede godkjente enkelt anti-tumor terapier og til reposisjonering av legemidler fra andre sykdomsområder til onkologi.

I denne artikkelen presenterer vi en trinnvis prosedyre for å gi en liste over legemiddelkombinasjoner som retter seg mot syntetiske dødelige interaksjonspar. I denne arbeidsflyten bruker vi (i) data om syntetiske dødelige interaksjoner fra BioGRID og (ii) informasjon om homologe gener fra Ensembl, (iii) henter narkotikamålpar fra DrugBank, (iv) bygger sykdomsmedisinske foreninger fra ClinicalTrials.gov, og (v) genererer derfor et sett med legemiddelkombinasjoner som omhandler syntetiske dødelige interaksjoner. Til slutt tilbyr vi legemiddelkombinasjoner i sammenheng med eggstokk- og brystkreft i den representative resultatseksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Henting av syntetiske dødelige genpar

  1. Henting av data fra BioGrid.
    1. Last ned den nyeste BioGRID-interaksjonsfilen i tab2-format fra https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip enten ved hjelp av en nettleser eller direkte fra Linux-kommandolinjen ved hjelp av krøll eller wget18.

      ##download og pakk ut den nyeste BioGRID-samhandlingsfilen
      #download nyeste BioGRID-interaksjonsfilen ved hjelp av krøll
      krøll -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack den nedlastede datafilen
      pakke ut biogrid_latest.zip
      BG="BIOGRID-ALL-3.5.171.tab2.txt"

       
    2. Når zip-arkivet er lastet ned, må pakke ut arkivet og notere navnet på den faktiske datasettfilen (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) for påfølgende trinn. BioGRID datafile har interaksjoner av forskjellige typer som vil bli filtrert i neste trinn.
      MERK: Det finnes andre kilder (f.eks. DRYGIN, SynlethDB) som holder syntetiske dødelige interaksjoner, som beskrevet i diskusjonen.
  2. Filter for syntetisk dødelighet og negative genetiske interaksjoner (Eksperimentelt system).
    1. Bruk informasjon i kolonnen "Eksperimentelt system" (kolonne nummer 12) som indikerer arten av å støtte bevis for en interaksjon for å identifisere syntetiske dødelige interaksjoner.
    2. Begrens datasettet til oppføringer med verdien Negativ genetisk eller Syntetisk dødelighet. I samme trinn filtrerer du kolonner og beholder bare kolonner som er relevante for etterfølgende analysetrinn, som oppført i tabell 1 nedenfor.

      ##restrict BioGRID-interaksjonsfilen til relevante kolonner og beholder bare interaksjoner klassifisert som negativ genetisk og syntetisk dødelighet
      klipp ut -d ^I -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      skrive ut $0
      }ellers hvis($4 == "Negativ genetisk" || $4 == "Syntetisk dødelighet"){
      skrive ut $0
      }
      }' > bg_synlet.txt


      MERK: I kodesnuttene ^I brukes til å representere vannrette faner. Ytterligere BioGRID-kategorier som syntetisk vekstfeil kan inkluderes. Andre kolonner som er relevante for denne arbeidsflyten, er oppført i Tabell 1. BioGRID beholder også poengsummene for individuelle interaksjoner. Avskjæringer kan brukes til å identifisere sterke/høy tillitssamhandlinger.
Kolonnenummer Navn på kolonneoverskrift
3 Gen navn
12 art
13 Narkotika-IDer

Tabell 1: Relevante kolonner for BioGRID-datafilen.

  1. Identifiser arter som det ble rapportert syntetiske dødelige interaksjoner for.
    1. Bestemme antall syntetiske dødelige interaksjonspartnerskatt-IDer for å få et estimat på antall syntetiske dødelige interaksjoner som er tilgjengelige per organisme.

      ##count antall opptredener for hver skatte-ID i de tidligere utvunnet syntetiske dødelige interaksjonene
      klipp ut -d ^I -f5,6 bg_synlet.txt | hale -n +2 | tr "\t" "\n" \

      | sortere | uniq -c | sortere -r -g

      MERK: Som et resultat av trinn 1 ble det bestemt en liste over syntetiske dødelige interaksjoner med gensymboler fra organismer der interaksjonene ble bestemt. De fleste syntetiske dødelige interaksjoner er bestemt i modellorganismer. Når du laster inn filer i et regnearkprogram (f.eks.

2. Oversette syntetiske dødelige genpar til menneskelige ortologer

  1. Hent menneskelige ortologer for relevante modellorganismer identifisert i trinn 1.3.
    1. Hent menneskelige ortologer fra Ensembl BioMart21 ved å koble den respektive modellorganismens gendatasett til det menneskelige gendatasettet. Bruk gensymbolene som betegner genet i modellorganismen og ortologe menneskelige gener for denne oppgaven. Bruk Ensembl BioMart-nettjenesten til å automatisere gjenfinningsprosessen og sende spørringen direkte til BioMart RESTful-tilgang for å hente de ortopetiske genparene (se eksempel nedenfor og Ensembl BioMart Help &Documentation for mer informasjon).

      ##retrieve menneskelig orthologous for Saccharomyces Cerevisiae fra Ensembl BioMart ved å bruke krøll for å sende BioMart-spørringen direkte til BioMart RESTful access service
      krølle -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=











      ' "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"


      For å hente de ortopetinøse menneskelige genene for andre modellorganismer, erstatt verdien av navneattributtet til det første Dataset-elementet med navnet på det respektive Ensembl-datasettet og utfør spørringen på nytt.

      MERK: Prosessen med ortologkartlegging er godt dokumentert i Ensembl BioMart Help &Documentation (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html).
    1. Få tilgang til et eksempel på en BioMart-spørring for menneskelige ortologer for Saccharomyces cerevisiae, de øverste artene identifisert i trinn 1.3, via URL-adressen http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel.
      MERK: Det finnes andre kilder (f.eks. roundup, oma browser, HomoloGene, inparanoid) for homologikartlegging, som skissert i diskusjonsdelen av dette manuskriptet.
  2. Tilsett menneskelige ortologer for å ekstrahere syntetiske dødelige interaksjoner.
    1. Bli med på syntetiske dødelige interaksjoner basert på organismeskatt-ID og gensymbol med de ortopediske parene hentet i trinn 2.1. For humane syntetiske dødelige interaksjonspar skaper enten kunstige ortopediske par for hvert menneskelig gen som er tilstede i datasettet, eller sørg for at menneskelige syntetiske dødelige interaksjoner ikke kastes mens du blir med og overfører de menneskelige gensymbolene til de nylig tilføyde kolonnene.

      ##collect ortologtilordninger i en enkelt fil og bli med i syntetisk dødelig interaksjonsfil
      #create en målfil med overskrifter for innsamling av ortologtilordninger
      echo "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol" > tilordning.txt

      #repeat dette trinnet for hver modellorganisme, må du passe på å tilpasse inndatafilnavn og skatte-ID
      #adds for hvert ortologpar i s_cerevisiae.txt en ny oppføring i kartlegging.txt: Gensymbolet er prefikset med skatte-ID-en for å lette etterfølgende sammenføyning med den syntetiske dødelige interaksjonsfilen
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      if($1 != "" & $2 != ""){
      skrive ut org_tax_id"/"$1, $2
      }
      }' s_cerevisiae.txt >> tilordning.txt


      #create kunstige kartleggingsoppføringer for menneskelige gener
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      hvis($5 == human_tax_id){
      skrive ut $5"/"$2, $2
      }
      hvis($6 == human_tax_id){
      skrive ut $6"/"$3, $3
      }
      }' bg_synlet.txt | sorter -u >> tilordning.txt

      #add nødvendige sammenføyningsnøkler (skatte-ID/Gensymbol) til syntetiske dødelige interaksjoner
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      skrive ut $0, "Key Interactor A", "Key Interactor B"
      }ellers{
      skrive ut $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      }' bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt


      #join syntetiske dødelige interaksjoner med ortopediske par
      slå sammen tmp_bg_synlet_w_keys.txt tilordning.txt 7 1 > tmp.txt
      slå sammen tmp.txt tilordning.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt


      MERK: Flettekommandoen som brukes i dette eksemplet, er ikke en standard Unix-kommando. Imidlertid er implementeringen ved hjelp av GNU Core Utilities sortering og sammenføyning grei. Kommandoen er introdusert for å skjule kompleksiteten ved sortering av filene før de kan føyes sammen med kommandokoblingen. Du finner en implementering av fletting på https://github.com/aheinzel/merge-sh.
    1. Bruk av en hvilken som helst genidentifikator som unikt identifiserer genet i et bestemt navneområde for best mulig resultat.
      MERK: Trinn 2 resulterer i en liste over syntetiske dødelige interaksjoner fra flere organismer kartlagt til menneskelige gener.

3. Kartlegging av syntetiske dødelige interaksjonspartnere til narkotika

  1. Hent narkotika-målpar fra DrugBank.
    1. Last ned DrugBank-data fra nedlastingsdelen av DrugBank og opprett en konto først hvis ikke allerede opprettet22. Bruk CSV-filen med narkotikamålidentifikatorer (proteinidentifikatorseksjonen: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) og DrugBank-ordforrådet (åpen data-seksjon: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) med DrugBank-identifikatorer og -navn. Du kan også trekke ut den nødvendige informasjonen fra XML-databasedumpen.

      ##restrict drugbank narkotika målfilen til relevante kolonner og bare beholde oppføringer for menneskelige molekylære enheter
      DB_TARGETS="alle.csv"
      DB_NAMES="narkotikabank ordforråd.csv"


      #extract relevante kolonner og formatere på nytt for å bruke kategorien som kolonneseperator
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt


      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1 || $2 == "Mennesker"){
      skrive ut $1, $3
      }
      }' target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt


      MERK: DrugBank-data leveres i to hovedformater. Hele databasen er tilgjengelig som XML-fil. I tillegg blir mesteparten av dataene gjort tilgjengelig i en serie kommadelte filer (CSV).
    1. Vær oppmerksom på at DrugBank også registrerer ikke-menneskelige narkotikamål. Artskolonnen (kolonne nummer 12) kan brukes til å trekke ut menneskelige narkotikamål.
      MERK: For bedre lesbarhetsnavn på de utpakkede kolonnene finnes i tabell 2. Andre kilder (f.eks. den terapeutiske måldatabasen eller Chembl) som har koblinger til narkotikamål finnes, som beskrevet i diskusjonsdelen.
Kolonnenummer Navn på kolonneoverskrift
3 Gen navn
12 art
13 Narkotika-IDer
  1. Legg til narkotikanavn i narkotikamål.
    1. Siden narkotikanavn og narkotika-mål informasjon er gitt i to separate CSV-filer, slå sammen informasjonen fra de to filene for senere å legge til navn på narkotika rettet mot en syntetisk dødelig interaksjon partner til syntetiske dødelige interaksjoner. Bli med i de to datasettene ved hjelp av den vanlige DrugBank-drug-ID-kolonnen. Normaliser narkotikamåldatasettet først at det bare inneholder en enkelt DrugBank-drug-ID per rad, da den første filen kan inneholde flere DrugBank-legemiddel-ID-er på rad hvis et protein er målrettet av flere stoffer.

      ##generate en enkelt fil som inneholder gensymbol for narkotikamål, Narkotikabank-ID og legemiddelnavn
      #normalize datasett for narkotikamål
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      skrive ut $0
      }ellers hvis($1 != "" &$2 != ""){
      deling($2, drug_targets, ";")
      for(i i i drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      skrive ut $1, drug_target | "sorter -u"
      }
      }
      }' human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt


      #extract relevante kolonner og formatere på nytt for å bruke tabulator som kolonneskilletegn
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt


      slå sammen human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 21 > db_human_drug_targets.txt


      MERK: Kolonne en og tre i narkotikabankens ordforråd.csv fil inneholder DrugBank-narkotika-ID-en og det respektive navnet.
  1. Legg til legemidler rettet mot syntetiske dødelige interaksjonspartnere til syntetisk dødelig interaksjonsdatasett.
    1. Bli med i det syntetiske dødelige interaksjonsdatasettet med legemiddelnavnfilen som ble generert i forrige trinn, ved hjelp av gensymbolkolonnene for å legge til stoffer i syntetiske dødelige interaksjoner. Pass på å legge til stoffnavn for begge partnerne i hver syntetisk dødelig interaksjon.
       
      ##enhance den syntetiske dødelige interaksjonsfilen ved å legge til legemidler rettet mot partnerne i hver syntetiske dødelige interaksjon
      slå sammen bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      slå sammen tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt


      MERK: Trinn 3 resulterer i syntetisk dødelig interaksjon fra flere organismer med deres ortopediske menneskelige gener og stoffer rettet mot disse genene.

4. Etablering av settet med for tiden testede legemiddelkombinasjoner i kliniske studier

  1. Få tilgang til ClinicalTrials.gov data.
    1. Hent informasjon om kliniske studier i XML-format fra ClinicalTrials.gov på enten (i) individuelle studier, (ii) studier som følge av en søkespørring, eller (iii) alle studier i databasen. Alternativt kan du bruke ressursene fra transformasjonsinitiativet for kliniske studier som også er vert for alle data fra ClinicalTrials.gov i en relasjonsdatabase. Se trinn 4.4 hvis du vil ha mer informasjon.
      MERK: En gratis konto kreves for å få tilgang til den skybaserte databaseforekomsten som driftes av initiativet for transformasjon av kliniske studier. I tillegg er det nødvendig med en plsql-klient.
  2. Fokuser på intervensjonsforsøk.
  3. Filtrer etter forsøk som er spesifikke for angivelse av interesse.
    MERK: ClinicalTrials.gov gir sykdomsnavn fra det NCBI Medical Subject Headings (MeSH) kontrollerte ordforrådet. I motsetning til innsender gitt sykdomsnavn, gjør det kontrollerte ordforrådet det mulig å effektivt identifisere studier for indikasjon av interesse. Likevel må man huske på at det NCBI MeSH-kontrollerte ordforrådet er en synonymordbok. Sjekk derfor MeSH Browser (https://meshb.nlm.nih.gov) hvis den generelle indikasjonen på interesse har underordnede / smalere vilkår og inkluder dem hvis det er hensiktsmessig.
  4. Hent de identifiserte studiene sammen med stoffene som ble testet i disse studiene. En spørring for studier i den generelle indikasjonen på eggstokkkreft er gitt nedenfor.

    ##retrieve intervensjonsstudier for den generelle indikasjonen på eggstokkkreft fra det kliniske forsøkstransformasjonsinitiativet som var vert for relasjonsdatabase som inneholder ClinicalTrials.gov data
    katt <\pset-bunntekst av
    VELG DISTINCT s.nct_id, s.brief_title, i.intervention_type i.name
    FROM-studier s
    INDRE SAMMENFØYNING browse_conditions c PÅ(s.nct_id = c.nct_id)
    INNER JOIN intervensjoner i ON(s.nct_id = i.nct_id)
    WHERE s.study_type = 'Intervensjon'
    OG c.mesh_term IN (
    'Ovarie neoplasmer',
    'Karsinom, ovarie epitelial',
    "Granulosa cellesvulst",
    'Arvelig bryst- og eggstokkkreftsyndrom',
    "Luteoma",
    'Meigs syndrom',
    "Sertoli-Leydig cellesvulst",
    'Thecoma'
    )
    BESTILL ETTER s.nct_id, i.intervention_type;
    Eof
    psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact
  1. Trekk ut narkotikanavn og tilordne til DrugBank-navn.
    MERK: Selv om det er fristende å bruke legemiddelnavnene direkte hentet fra kliniske studier av interesse, må man være klar over at intervensjonsnavn i ClinicalTrials.gov er angitt av innsenderen som fritekst. Som en konsekvens er navnene ikke standardisert, merkenavn kan brukes i stedet for det vanlige sammensatte navnet, og det er ingen garanti for riktig datanormalisering (f.eks. flere legemiddelnavn i en oppføring). I tillegg er det vanlig at legemidler sendes inn med en annen intervensjonstype, forskjellig fra stoff. Derfor utføres kartlegging av de gjenvunne intervensjonsnavnene til DrugBanks narkotikanavn best manuelt.

      ##Obtain en liste over intervensjoner som ble brukt i det tidligere innhentede settet med kliniske studier.
    klipp ut -d ^I -f3,4 clinical_trials.txt | hale -n +2 | sortere -u


    MERK: Kolonne tre og fire inneholder henholdsvis intervensjons- og intervensjonsnavn.

  1. Komplement med legemidler som allerede er i klinisk bruk fra retningslinjer
    MERK: Trinn 4 resulterer i en liste over legemidler som er under evaluering/i bruk for indikasjon av interesse.

5. Identifisering av legemiddelkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner

  1. Søk etter syntetiske dødelige interaksjoner som blir målrettet av to stoffer av interesse. Begrens datasettet fra trinn 3 til medikamenter av interesse ved å filtrere ut linjer i filen som inneholder både legemiddel A og legemiddel B.

    ##only beholde oppføringer for syntetiske dødelige interaksjoner og legemidler som utløser dem der begge partnerne er målrettet av de to medikamentene av interesse (drug_a og drug_b)
    awk -F "\t" '{
    if( ($12 == drug_a && $14 == drug_b) || ($12 == drug_b &14 == drug_a) ) {
    skrive ut $0
    }
    }' drug_a="XXX" drug_b="ÅYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt
  1. Forsikre deg om at ingen av de to stoffene alene er rettet mot begge syntetiske dødelige interaksjonspartnere. Kontroller narkotikamålene for hvert identifiserte legemiddel i datasettet fra trinn 3.2 og vurder om begge identifiserte syntetiske dødelige partnere er mål for det spesifikke stoffet.

    ##find alle narkotikamåloppføringer for et gitt legemiddelnavn
    awk -F "\t" '{
    hvis($3 == legemiddel){
    skrive ut $0
    }

    }' drug="XXX" db_human_drug_targets.txt

    MERK: Et stoff som vil målrette begge syntetiske dødelige interaksjonsveier ville være giftig for enhver celle, så teoretisk sett er det ikke et verdifullt multimålmiddel. Det er grunnen til at denne muligheten er utelukket i dette trinnet i algoritmen.
     

6. Testing av utvalgte nye legemiddelkombinasjoner in vitro

  1. Behandle cellelinjer for human brystkreft og humane godartede pattedyr epitelceller dyrket i standard in vitro culturing metoder i en fuktet en 37 °C atmosfære med 5% CO2 med ulike legemiddelkombinasjoner.
  2. Bruk medier supplert med foster bovint serum og penicillin samt streptomycinsulfat for å hindre bakteriell infeksjon.
  3. Fortynn legemidler i løsemidler som DMSO eller fosfatbufret saltvann i minst fire forskjellige konsentrasjoner basert på deres tidligere etablerte IC50 (hemmende konsentrasjon) og bruk dem i kombinasjon eller alene for behandling av celler.
  4. Utfør celle levedyktighetsanalyser og apoptoseanalyser som AnnexinV / 7-AAD farginger for å bestemme cytotoksiske effekter forårsaket av behandlinger.
  5. Overvåk farmakologisk hemming av mistenkte molekylære mål ved hjelp av vestlige flekker.
  6. Skille syntetisk dødelighet fra rent additiv effekter som beregner kombinatorisk indeks (CI) som beskrevet av Chou og andre23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår gruppe har nylig publisert to studier som anvender arbeidsflyten som er avbildet i dette manuskriptet for å identifisere stoffkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner i sammenheng med eggstokk- og brystkreft24,25. I den første studien evaluerte vi legemiddelkombinasjoner som for tiden testes i kliniske studier i senfase (fase III og IV) eller allerede brukes i klinisk praksis for å behandle eggstokkkreftpasienter angående deres innvirkning på syntetiske dødelige interaksjoner. I tillegg identifiserte vi legemiddelkombinasjoner som for tiden ikke testes i kliniske studier, men som gir en begrunnelse fra perspektivet med å målrette syntetiske dødelige interaksjoner. Vi evaluerte derfor alle mulige legemiddelkombinasjoner som valgte medisiner fra bassenget av alle forbindelser i senfase eggstokkkreftforsøk. Vi identifiserte et unikt sett med 61 legemiddelkombinasjoner som hadde blitt undersøkt i 68 senfase ovariekreftforsøk. Tolv av disse 61 legemiddelkombinasjonene tok for seg minst én syntetisk dødelig interaksjon. 84 ekstra legemiddelkombinasjoner ble foreslått for å håndtere syntetiske dødelige interaksjoner uten å bli undersøkt i kliniske studier frem til denne datoen. 21 unike legemidler bidro til de 84 identifiserte legemiddelkombinasjonene rettet mot et sett med 39 syntetiske dødelige interagere som angitt i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Nettverk av foreslåtte nye legemiddelkombinasjoner i sammenheng med eggstokkkreft. Figur 1 viser syntetiske dødelige interaksjoner der interagere håndteres av to legemidler som for tiden ikke testes i kliniske studier. Synlet interaksjoner vises i rødt, mens narkotika-mål linker er indikert av grå kanter. Stiplede linjer representerer syntetiske dødelige interaksjoner som håndteres av andre legemiddelkombinasjoner i kliniske studier med senfase eggstokkkreft. Disse undersøkte legemiddelkombinasjonene er indikert med en stjerne (*), hver i kombinasjon med paclitaxel med den ekstra undersøkte kombinasjonen av cediranib og olaparib som indikeres av en sirkel (o) [tilpasset fra 25]. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved hjelp av den samme arbeidsflyten i en annen studie identifiserte vi 243 lovende legemiddelkombinasjoner rettet mot 166 syntetiske dødelige genpar i sammenheng med brystkreft. Vi testet eksperimentelt utvalgte legemiddelkombinasjoner angående deres innvirkning på celle levedyktighet og apoptose i to brystkreftcellelinjer. Spesielt viste den foreslåtte lavtoksisitetsmedisinkombinasjonen av celecoxib og zoledronsyre cytotoksisitet utover additiveffekter i brystkreftcellelinjer som bestemt av deres kombinatoriske indeks. Resultater av levedyktighet og apoptoseanalyser for denne legemiddelkombinasjonen vises i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Virkningen av celecoxib og zoledronsyre på levedyktighet og apoptose i SKBR-3 celler. (A) Levedyktighetsanalyseresultater for celecoxib (CEL), zoledronsyre (ZOL) og kombinasjonen av zoledronsyre og celecoxib (ZOL + CEL) i SKBR-3 brystkreftcellelinjer. Lave og høye CEL-konsentrasjoner som ble brukt var 50μM og 75μM. Lave og høye ZOL-konsentrasjoner som ble brukt var 500μM og 750μM. Legemiddelkombinasjonen hadde en signifikant synergistisk effekt på celle levedyktighet (** p < 0,001). (B, C) Annexin V (ANXA5) og 7-AAD farginger av SKBR-3 celler behandlet med CEL, ZOL, og legemiddelkombinasjonen ZOL + CEL. Andelen celler med 7 AADpos/ANXA5pos ble økt etter behandling med legemiddelkombinasjonen ZOL + CEL [tilpasset fra 24]. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har skissert en arbeidsflyt for å identifisere legemiddelkombinasjoner som påvirker syntetiske dødelige interaksjoner. Denne arbeidsflyten bruker (i) data om syntetiske dødelige interaksjoner fra modellorganismer, (ii) informasjon om humane ortologer, (iii) informasjon om narkotikamålforeninger, (iv) legemiddelinformasjon om kliniske studier i sammenheng med kreft, samt (v) om informasjon om narkotikasykdom og gensykdomsforeninger hentet fra vitenskapelig litteratur. Den konsoliderte informasjonen kan brukes til å evaluere virkningen av en gitt legemiddelkombinasjon under undersøkelse på syntetiske dødelige genpar. I tillegg kan konsoliderte data brukes til å evaluere et sett med legemidler som for tiden undersøkes eller testes i kliniske studier i sammenheng med kreft for å finne kombinasjoner rettet mot de mest relevante syntetiske dødelige interaksjonene, og har derfor større sjanse for å påvirke tumorcelleoverlevelse. Til slutt kan dataene som genereres brukes til å screene for legemiddelkombinasjoner som består av legemidler som ikke opprinnelig er utviklet for tumorbehandling, og dermed gir en måte for et beregningsdrevet legemiddelreposisjoneringstilfelle.

For hvert trinn i arbeidsflyten for dataintegrering presenterer vi viktige datakilder for å fullføre hele dataarbeidsflyten, men påpeker at arbeidsflyten kan forbedres ytterligere på ulike stadier ved å bruke flere datakilder. I arbeidsflyten vår hentet vi ut syntetiske dødelige interaksjonspar fra BioGRID-databasen18. Vi fokuserte spesielt på interaksjoner mellom eksperimenttyper "syntetisk dødelighet" og "negativ genetisk". Informasjon i BioGRID om syntetiske dødelige interaksjoner inneholder datasett fra stor genetisk skjerm som for eksempel et datasett publisert av Costanzo og kolleger26, som også er tilgjengelig i DRYGIN-databasen27, samt data om enkeltsyntetiske dødelige interaksjoner som beskrevet i individuelle eksperimenter i vitenskapelig litteratur. Det finnes flere datakilder som samler inn og lagrer syntetiske dødelige interaksjoner, som for eksempel SynLethDB28. Videre finnes det et stort antall forskjellige verktøy og databaser på nivået av ortologitilordning. Vi presenterer en måte å benytte ensembl biomart for å kartlegge syntetiske dødelige interaksjonspartnere identifisert i modellorganismer til deres tilsvarende menneskelige ortologer. Andre ortologidatabaser og -tjenester inkluderer NCBI's HomoloGene database29, OMA ortologi database fra Swiss Institute of Bioinformatics30, eller InParanoid ortholog grupper database vedlikeholdt av Stockholm Bioinformatics Center31. I arbeidsflyten vår fokuserte vi på syntetiske dødelige interaksjoner fra flere modellorganismer, med det største antallet syntetiske dødelige interaksjoner som kommer fra gjær. Man kan vurdere å begrense inndatasettet for ortologikartleggingen til data bare fra mus og rotte, som er evolusjonære nærmere mennesker. En annen måte å definere inngangssettet med syntetiske dødelige interaksjoner på er å bare fokusere på syntetiske dødelige interaksjoner som bevares i flere arter, og dermed øke sjansene for at det syntetiske dødelige samspillet virkelig er positivt. Dette kan derimot redusere settet med syntetiske dødelige interaksjoner dramatisk, da det allerede er stor forskjell i de identifiserte syntetiske dødelige interaksjonene mellom S. cerevisiae og S. pombe. En annen tilnærming er å ikke være for streng i begynnelsen og til og med utvide settet med eksperimentelle syntetiske dødelige interaksjoner ved maskinlæringsalgoritmer som vi gjorde i de to studiene som er oppført i den representative resultatdelen. Kort sagt ble en tilfeldig skogmodell brukt til å forutsi syntetiske dødelige interaksjoner for menneskelige gener som ingen ortopediske gener eksisterte i gjær. Den tilfeldige skogmodellen ble opplært på settet av syntetiske dødelige interaksjonspar fra gjær og deres ortopediske menneskelige gener ved hjelp av data om veiforeninger, Gene Ontology-oppdrag samt sykdoms- og legemiddelforeninger som beskrevet tidligere24,25. Dette tillot oss å vurdere menneskelige gener som ingen ortolog kartleggingsinformasjon var tilgjengelig i vår integrasjonsarbeidsflyt. En mye brukt database som lagrer informasjon om narkotikamålforeninger er DrugBank, som også er den viktigste kilden til interaksjoner i arbeidsflyten. Andre databaser som til en viss grad inneholder utfyllende informasjon om narkotikamål, er Therapeutic Target Database (TTD)32 eller ChEMBL33. Hovedkomponenter i arbeidsflyten er også innlemmet i e.valuation-plattformen fra emergentec og SynLethDB, som er utviklet av forskere fra Nanyang Technological University. Den siste oppdateringen av SynLethDB i 2015 var imidlertid basert på datasettene som er lagret i nedlastingsdelen på deres respektive webside28.

En måte å rangere identifiserte legemiddelkombinasjoner og målrettede syntetiske dødelige interaksjonspar bruker foreningen av syntetiske dødelige partnere og / eller narkotika med sykdommen av interesse via litteraturutvinningsmetoder. I arbeidet med evaluering av legemiddelkombinasjoner i sammenheng med eggstokkkreft rangerte vi nye foreslåtte legemiddelkombinasjoner basert på antall publikasjoner om eggstokkkreft som nevner enten en av de to syntetiske dødelige interaktivitetene i en respektive legemiddelkombinasjon. MeSH-merknad i Pubmed kan brukes til å identifisere publikasjoner for en bestemt sykdom ved hjelp av de eksakte sykdomsbegrepene som er angitt i den store MeSH-grenen C. Informasjon om gener i de identifiserte publikasjonene kan trekkes ut ved hjelp av NCBI's gen2pubmed kartleggingsfil som beskrevet andre steder34. Videre er det dedikerte databaser som inneholder gensykdom og / eller narkotika-sykdomskoblinger som Comparative Toxicogenomics Database35, DisGeNET36eller e.valuation programvareplattform. Rangering av legemiddelkombinasjoner basert på sykdomsforeninger er en måte å støtte det endelige utvalget av legemiddelkombinasjoner for eksperimentell testing. Ytterligere aspekter må vurderes ved valg av legemiddelkombinasjoner for videre testing, for eksempel individuelle toksisitetsprofiler av stoffene eller uttrykksstatus for syntetiske dødelige interagere i det respektive målorganet.

I den representative resultatseksjonen presenterer vi data for legemiddelkombinasjonen av celecoxib og zoledronsyre, som ble identifisert etter arbeidsflyten for å identifisere legemiddelkombinasjoner i sammenheng med brystkreft. Denne spesielle legemiddelkombinasjonen ble valgt for eksperimentell testing på grunn av de lave toksisitetsprofilene til begge forbindelsene. Vi brukte ulike konsentrasjoner i in-vitro eksperimenter for å evaluere virkningen av legemiddelkombinasjonen på celle levedyktighet og apoptose. Ideelt sett kan legemiddelkonsentrasjonene reduseres betydelig for individuelle legemidler for å minimere bivirkninger samtidig som effekten maksimeres ved å kombinere to legemidler. Å se innvirkning på levedyktighet ved lavere doser er enda mer meningsfylt, da legemiddelkonsentrasjoner som brukes til in vitro-testing kan kritiseres for å være supratherapeutical, som ikke nås i in vivo-modeller. Konsentrasjonene ble imidlertid valgt basert på cellekultureksperimenter med disse gitte stoffene i litteraturen. Dosering av narkotika kan påvirke hvilke mål som først og fremst påvirkes, ettersom de fleste forbindelser har mer enn ett legemiddelmål, noe som potensielt kan påvirke et stort sett med kjente og ukjente nedstrømsmolekyler også. Legemiddelkombinasjoner som viser synergistiske effekter på celle levedyktighet i in-vitro cellekultursystemer bør derfor undersøkes nærmere i 3D- eller in-vivo-modeller.

Oppsummering presenterer vi en arbeidsflyt som integrerer informasjon fra ulike datakilder for å evaluere og foreslå legemiddelkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner. Til dags dato kommer fortsatt den største informasjonen om syntetiske dødelige interaksjoner fra modellorganismer, som krever et obligatorisk ortologikartleggingstrinn til det menneskelige genom. Første skjermer i menneskelige haploide celler har ført til identifisering av syntetiske dødelige interaksjoner i menneskelige celler. I tillegg har CRISPR/CAS-teknologien åpnet nye måter å studere syntetiske dødelige interaksjoner på cellenivå. Med mer biologiske syntetiske dødelige interaksjonsdata av høy kvalitet tilgjengelig, foreslår vi at dataintegrasjonsinnsats som vår vil transformere klinisk kreftbehandling i fremtiden, ved å oppdage nye og klinisk meningsfulle syntetiske dødelige genpar bortsett fra BRCA (1/2)/PARP1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

AH og PP var ansatte i emergentec biodevelopment GmbH på tidspunktet for gjennomføring av analysene som førte til resultatene som ble presentert i den representative resultatseksjonen. MM og MK har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Støtten til å utvikle arbeidsflyten for dataintegrasjon ble innhentet fra EUs syvende rammeprogram under tilskuddsavtale nu. 279113 (OCTIPS). Tilpasning av data i denne publikasjonen ble vennligst godkjent av Public Library of Sciences Publications and Impact Journals, LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioGRID n/a n/a thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov n/a n/a ClinicalTrials.gov
DrugBank n/a n/a drugbank.ca
Ensembl BioMart n/a n/a ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD ebioscience 00-6993-50
AnnexinV-APC BD Bioscience 550474
celecoxib Sigma-Aldrich PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay Promega G8080
FACS Canto II BD Bioscience n/a
fetal bovine serum Fisher Scientific/Gibco 16000044
FloJo Software FloJo LLC V10
McCoy's 5a Medium Modified Fisher Scientific/Gibco 16600082
penicillin G/streptomycin sulfate Fisher Scientific/Gibco 15140122
SKBR-3 cells American Type Culture Collection (ATCC) ATCC HTB-30
zoledronic acid Sigma-Aldrich SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dobzhansky, T. Genetics of natural populations; recombination and variability in populations of Drosophila pseudoobscura. Genetics. 31, 269-290 (1946).
  2. Hartwell, L. H., Szankasi, P., Roberts, C. J., Murray, A. W., Friend, S. H. Integrating genetic approaches into the discovery of anticancer drugs. Science. 278 (5340), New York, N.Y. 1064-1068 (1997).
  3. D'Amours, D., Desnoyers, S., D'Silva, I., Poirier, G. G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. The Biochemical Journal. 342 (2), 249-268 (1999).
  4. Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
  5. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  6. McCann, K. E., Hurvitz, S. A. Advances in the use of PARP inhibitor therapy for breast cancer. Drugs in Context. 7, 212540 (2018).
  7. Franzese, E., et al. PARP inhibitors in ovarian cancer. Cancer Treatment Reviews. 73, 1-9 (2019).
  8. Ashworth, A., Lord, C. J. Synthetic lethal therapies for cancer: what’s next after PARP inhibitors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (9), 564-576 (2018).
  9. Yu, B., Luo, J. Synthetic lethal genetic screens in Ras mutant cancers. The Enzymes. 34, Pt B 201-219 (2013).
  10. Thompson, J. M., Nguyen, Q. H., Singh, M., Razorenova, O. V. Approaches to identifying synthetic lethal interactions in cancer. The Yale Journal of Biology and Medicine. 88 (2), 145-155 (2015).
  11. Ruiz, S., et al. A Genome-wide CRISPR Screen Identifies CDC25A as a Determinant of Sensitivity to ATR Inhibitors. Molecular Cell. 62 (2), 307-313 (2016).
  12. Housden, B. E., Nicholson, H. E., Perrimon, N. Synthetic Lethality Screens Using RNAi in Combination with CRISPR-based Knockout in Drosophila Cells. Bio-Protocol. 7 (3), (2017).
  13. Blomen, V. A., et al. Gene essentiality and synthetic lethality in haploid human cells. Science. 350 (6264), New York, N.Y. 1092-1096 (2015).
  14. Forment, J. V., et al. Genome-wide genetic screening with chemically mutagenized haploid embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 13 (1), 12-14 (2017).
  15. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Systems. 1 (6), 383-395 (2015).
  16. Madhukar, N. S., Elemento, O., Pandey, G. Prediction of Genetic Interactions Using Machine Learning and Network Properties. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 172 (2015).
  17. Fechete, R., et al. Synthetic lethal hubs associated with vincristine resistant neuroblastoma. Molecular BioSystems. 7 (1), 200-214 (2011).
  18. Oughtred, R., et al. The BioGRID interaction database: 2019 update. Nucleic Acids Research. 47, D1 529-541 (2019).
  19. Zeeberg, B. R., et al. Mistaken identifiers: gene name errors can be introduced inadvertently when using Excel in bioinformatics. BMC bioinformatics. 5, 80 (2004).
  20. Ziemann, M., Eren, Y., Gene El-Osta, A. name errors are widespread in the scientific literature. Genome Biology. 17 (1), 177 (2016).
  21. Kersey, P. J., et al. Ensembl Genomes 2018: an integrated omics infrastructure for non-vertebrate species. Nucleic Acids Research. 46, D1 802-808 (2018).
  22. Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46, D1 1074-1082 (2018).
  23. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
  24. Marhold, M., et al. Synthetic lethal combinations of low-toxicity drugs for breast cancer identified in silico by genetic screens in yeast. Oncotarget. 9 (91), 36379-36391 (2018).
  25. Heinzel, A., et al. Synthetic lethality guiding selection of drug combinations in ovarian cancer. PloS One. 14 (1), 0210859 (2019).
  26. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
  27. Koh, J. L. Y., et al. DRYGIN: a database of quantitative genetic interaction networks in yeast. Nucleic Acids Research. 38, 502-507 (2010).
  28. Guo, J., Liu, H., Zheng, J. SynLethDB: synthetic lethality database toward discovery of selective and sensitive anticancer drug targets. Nucleic Acids Research. 44, 1011-1017 (2016).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
  30. Altenhoff, A. M., et al. The OMA orthology database in 2018: retrieving evolutionary relationships among all domains of life through richer web and programmatic interfaces. Nucleic Acids Research. 46 (1), 477-485 (2018).
  31. Sonnhammer, E. L. L., Östlund, G. InParanoid 8: orthology analysis between 273 proteomes, mostly eukaryotic. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 234-239 (2015).
  32. Li, Y. H., et al. Therapeutic target database update 2018: enriched resource for facilitating bench-to-clinic research of targeted therapeutics. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1121 (2018).
  33. Gaulton, A., et al. The ChEMBL database in 2017. Nucleic Acids Research. 45 (1), 945-954 (2017).
  34. Heinzel, A., Mühlberger, I., Fechete, R., Mayer, B., Perco, P. Functional molecular units for guiding biomarker panel design. Methods in Molecular Biology. 1159 (12), 109-133 (2014).
  35. Davis, A. P., et al. The Comparative Toxicogenomics Database: update 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 948-954 (2019).
  36. Piñero, J., et al. DisGeNET: a comprehensive platform integrating information on human disease-associated genes and variants. Nucleic acids research. 45 (1), 833-839 (2017).

Tags

Kreftforskning Utgave 171 syntetisk dødelighet genetiske skjermer dataintegrasjon homologikartlegging legemiddelkombinasjoner brystkreft behandling celle levedyktighetsanalyse
En arbeidsflyt for dataintegrering for å identifisere stoffkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marhold, M., Heinzel, A., Merchant,More

Marhold, M., Heinzel, A., Merchant, A., Perco, P., Krainer, M. A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions. J. Vis. Exp. (171), e60328, doi:10.3791/60328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter