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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Um fluxo de trabalho de integração de dados para identificar combinações de drogas visando interações letais sintéticas

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/60328
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Internal Medicine I - Division of Oncology, Comprehensive Cancer Center, Medical University of Vienna, 2Department of Nephrology, Medical University of Vienna, 3Department of Internal Medicine IV, Medical University Innsbruck

Summary

Grandes telas genéticas em organismos modelo levaram à identificação de interações genéticas negativas. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho de integração de dados usando dados de telas genéticas em organismos modelo para delinear combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas no câncer.

Abstract

Uma interação letal sintética entre dois genes é dada quando o knock-out de qualquer um dos dois genes não afeta a viabilidade celular, mas o nocaute de ambos os interagedores letais sintéticos leva à perda de viabilidade celular ou morte celular. A interação letal sintética mais bem estudada é entre BRCA1/2 e PARP1, com inibidores PARP1 sendo utilizados na prática clínica para tratar pacientes com tumores mutados BRCA1/2. Grandes telas genéticas em organismos modelo, mas também em linhas de células humanas haploides levaram à identificação de numerosos pares adicionais de interação letal sintética, todos sendo potenciais alvos de interesse no desenvolvimento de novas terapias tumorais. Uma abordagem é atingir os genes terapeuticamente com um interagente letal sintético que seja mutado ou significativamente downregulado no tumor de interesse. Uma segunda abordagem é formular combinações de drogas abordando interações letais sintéticas. Neste artigo, delineamos um fluxo de trabalho de integração de dados para avaliar e identificar combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas. Fazemos uso de conjuntos de dados disponíveis em pares de interação letal sintética, recursos de mapeamento de eremologia, links de alvos de drogas de bancos de dados dedicados, bem como informações sobre medicamentos que estão sendo investigados em ensaios clínicos na área de interesse da doença. Destacamos ainda os principais achados de dois estudos recentes do nosso grupo sobre avaliação da combinação de medicamentos no contexto do câncer de ovário e de mama.

Introduction

A letalidade sintética define uma associação de dois genes, onde a perda de um gene não afeta a viabilidade, mas a perda de ambos os genes leva à morte celular. Foi descrito pela primeira vez em 1946 por Dobzhansky enquanto analisava vários fenótipos de drosophila, criando mutantes homozigos1. Mutantes que não produziam descendentes viáveis, embora viáveis, exibiam fenótipos letais quando cruzados com certos outros mutantes, estabelecendo terreno para o estabelecimento da teoria da letalidade sintética. Hartwell e colegas sugeriram que esse conceito poderia ser aplicável para a terapia do câncer em humanos2. A letalidade sintética provocada farmacologicamente poderia contar com apenas uma mutação, dado que o parceiro letal sintético do gene mutante é alvo de um composto farmacológico. O primeiro par genético a permitir a indução farmacológica da letalidade sintética foi o BRCA(1/2) e PARP1. PARP1 funciona como um sensor para danos de DNA, e está ligado a locais de quebras de fios de DNA duplo e único, superligas e crossovers3. BRCA1 e 2 desempenham papéis importantes na reparação de quebras de duplo fio de DNA através da recombinação homólogo4. Agricultor e colegas publicaram achados de que as células deficientes para BRCA1/2 eram suscetíveis à inibição de PARP, enquanto nenhuma citotoxicidade foi observada nas células do tipo selvagem BRCA5. Em última análise, foram aprovados os inibidores parp para o tratamento de câncer de mama e ovário deficiente brca6,7. Além disso, os pares de genes de letalidade sintética que levam à aprovação clínica de compostos farmacológicos são muito esperados e uma área importante dos recentes esforços de pesquisa sobre câncer8.

Interações genéticas letais sintéticas foram modeladas em múltiplos organismos, incluindo moscas frutíferas, C. elegans eleveduras 2. Usando várias abordagens, incluindo a interferência de RNA e os nocautes na biblioteca CRISPR/CAS, novos pares de genes letais sintéticos foram descobertos nos últimos anos9,10,11. Um protocolo sobre os procedimentos experimentais da RNAi em combinação com o CRISPR/CAS foi publicado recentemente por Housden e colegas12. Enquanto isso, os pesquisadores também realizaram grandes telas em células humanas haploides para identificar interações letais sintéticas13,14. Em métodos silico, como análise de rede biológica e machine learning também mostraram-se promissores na descoberta de interações letais sintéticas15,16.

Concepção, uma abordagem para fazer uso de interações letais sintéticas no contexto da terapia anti-tumor é identificar proteínas mutantes ou não funcionais em células tumorais, fazendo com que seus parceiros de interação letal sintéticas prolvam de alvos medicamentosos para intervenção terapêutica. Devido à heterogeneidade da maioria dos tipos de tumores, pesquisadores iniciaram a busca pelas chamadas proteínas do hub letal sintético. Esses hubs letais sintéticos têm uma série de parceiros de interação letal sintética que são mutados e, portanto, não funcionais ou significativamente baixos em amostras de tumores. Abordar tais polos letais sintéticos é promissor no aumento da eficácia medicamentosa ou na superação da resistência a medicamentos, como poderia ser mostrado, por exemplo, no contexto do neuroblastoma resistente à vincristina17. Uma segunda abordagem para melhorar o tratamento medicamentoso fazendo uso do conceito de interações letais sintéticas é identificar combinações de drogas visando interações letais sintéticas. Isso poderia levar a novas combinações de terapias anti-tumores individuais já aprovadas e ao reposicionamento de medicamentos de outras áreas da doença para o campo da oncologia.

Neste artigo, apresentamos um procedimento passo a passo para produzir uma lista de combinações de drogas que visam pares de interação letal sintética. Neste fluxo de trabalho, nós (i) usamos dados sobre interações letais sintéticas do BioGRID e (ii) informações sobre genes homólogos da Ensembl, (iii) recuperar pares de alvos de drogas do DrugBank, (iv) construir associações de drogas contra doenças a partir de ClinicalTrials.gov, e (v) assim gerar um conjunto de combinações de drogas que abordam interações letais sintéticas. Por fim, fornecemos combinações de medicamentos no contexto do câncer de ovário e de mama na seção de resultados representativos.

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Protocol

1. Recuperando pares de genes letais sintéticos

  1. Recuperação de dados da BioGrid.
    1. Baixe o arquivo de interação BioGRID mais recente no formato tab2 de https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip usando um navegador da Web ou diretamente da linha de comando Linux usando curl ou wget18.

      ##download e desempacota o mais recente arquivo de interação BioGRID
      #download mais recente arquivo de interação BioGRID usando curl
      enrolar -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack o arquivo de dados baixado
      biogrid_latest.zip de abrir zíper
      BG="BIOGRID-ALL-3.5.171.tab2.txt"
       
    2. Depois que o arquivo zip tiver sido baixado, o arquivo desempacotar deve e observar o nome do arquivo de conjunto de dados real (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) para etapas subsequentes. O arquivo de dados BioGRID contém interações de diferentes tipos que serão filtradas na próxima etapa.
      NOTA: Existem outras fontes (por exemplo, DRYGIN, SynlethDB) que detêm interações letais sintéticas, conforme descrito na discussão.
  2. Filtro para letalidade sintética e interações genéticas negativas (Sistema Experimental).
    1. Use informações na coluna "Sistema Experimental" (coluna número 12) que indique a natureza de evidências de apoio para uma interação para identificar interações letais sintéticas.
    2. Restringir o conjunto de dados a entradas com um valor de Letalidade Genética Negativa ou Sintética. Na mesma etapa, filtrar colunas e somente reter colunas relevantes para etapas de análise subsequentes, conforme listado na tabela 1 abaixo.

      ##restrict o arquivo de interação BioGRID para colunas relevantes e apenas retêm interações classificadas como letalidade genética e sintética negativa
      corte -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1){
      imprimir $0
      }mais se ($4 == "Genética Negativa" || $4 == "Letalidade Sintética"){
      imprimir $0
      }
      > bg_synlet.txt

      NOTA: Nos trechos de código ^Sou usado para representar guias horizontais. Podem ser incluídas categorias adicionais de BioGRID, como defeito de crescimento sintético. Outras colunas de relevância para este fluxo de trabalho estão listadas na Tabela 1. BioGRID também mantém os escores para interações individuais. Os cortes podem ser usados para identificar interações fortes/de alta confiança.
Número da coluna Nome do cabeçalho da coluna
3 Nome de Gene
12 espécie
13 IDs de drogas

Tabela 1: Colunas relevantes do arquivo de dados BioGRID.

  1. Identificar espécies para as quais foram relatadas interações letais sintéticas.
    1. Determine o número de idas fiscais de parceiros de interação letal sintética para obter uma estimativa sobre o número de interações letais sintéticas disponíveis por organismo.

      ##count o número de aparições de cada identificação fiscal nas interações letais sintéticas anteriormente extraídas
      corte -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | cauda -n +2 | tr "\t" "\n" \
      | classificar | uniq -c | classificar -r -g

      NOTA: Como resultado da etapa 1, uma lista de interações letais sintéticas com símbolos genéticos de organismos nos quais as interações foram determinadas. A maioria das interações letais sintéticas foram determinadas em organismos modelo. Ao carregar arquivos em um programa de planilha (por exemplo, Excel) evite arruinar gene symbols19,20.

2. Traduzir pares de genes letais sintéticos para ortologs humanos

  1. Recuperar ortopos humanos para organismos modelos relevantes identificados na etapa 1.3.
    1. Recuperar ortopologs humanos do Ensembl BioMart21 ligando o respectivo conjunto de dados genéticos do organismo modelo com o conjunto de dados genéticos humanos. Use os símbolos genéticos denotando o gene no organismo modelo e genes humanos ortologos para esta tarefa. Use o webservice Ensembl BioMart para automatizar o processo de recuperação e enviar a consulta diretamente ao acesso BioMart RESTful para recuperar os pares genéticos ortologos (veja o exemplo abaixo e Ensembl BioMart Help & Documentation para obter mais detalhes).

      ##retrieve ortologos humanos para Saccharomyces Cerevisiae da Ensembl BioMart usando curl para enviar a consulta BioMart diretamente para o serviço de acesso BioMart RESTful
      curl -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=







      "padrão"



      " http://www.ensembl.org/biomart/martservice"

      A fim de recuperar os genes humanos ortomanos para outros organismos modelo, substitua o valor do atributo de nome do primeiro elemento Dataset com o nome do respectivo conjunto de dados Ensembl e re-execute a consulta.

      NOTA: O processo de mapeamento de ortolog está bem documentado no Ensembl BioMart Help & Documentation (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html).
    1. Acesse uma consulta biomart de exemplo para ortologs humanos para Saccharomyces cerevisiae, as principais espécies identificadas na etapa 1.3, através do URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel.
      NOTA: Existem outras fontes (por exemplo, roundup, navegador oma, HomoloGene, inparanoide) para mapeamento de homologia, conforme descrito na seção de discussão deste manuscrito.
  2. Adicione ortopedias humanas às interações letais sintéticas extraídas.
    1. Junte-se a interações letais sintéticas baseadas no id fiscal do organismo e no símbolo genético com os pares ortologos recuperados na etapa 2.1. Para os pares de interação letal sintética humana, ou criam pares ortologos artificiais para cada gene humano presente no conjunto de dados ou garantem que as interações letais sintéticas humanas não sejam descartadas durante a junção e transferência dos símbolos genéticos humanos para as colunas recém-adicionadas.

      ##collect mapeamentos de ortolog em um único arquivo e junte-se ao arquivo de interação letal sintética
      #create um arquivo de destino com cabeçalhos para coletar mapeamentos de ortolog
      echo "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol" mapeamento >.txt

      #repeat este passo para cada organismo modelo, tome cuidado para adaptar o nome do arquivo de entrada e o ID fiscal
      #adds para cada par de ortolog em s_cerevisiae.txt uma nova entrada no mapeamento.txt: O símbolo genético é prefixado com o id fiscal para facilitar a adesão subsequente com o arquivo de interações letais sintéticas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      se ($1 != "" && $2 != "){
      imprimir org_tax_id"/"$1, $2
      }
      }' mapeamento s_cerevisiae.txt >>.txt

      #create entradas de mapeamento artificial para genes humanos
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      se ($5 == human_tax_id){
      imprimir $5"/"$2, $2
      }
      se ($6 == human_tax_id){
      imprimir $6"/"$3, $3
      }
      bg_synlet.txt | classificar -u mapeamento >>.txt

      #add chaves de adesão necessárias (tax id/Gene Symbol) para interações letais sintéticas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1){
      imprimir $0, "Key Interactor A", "Key Interactor B"
      }else{
      imprimir $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt

      #join interações letais sintéticas com pares ortologos
      mesclar tmp_bg_synlet_w_keys.txt mapeamento.txt 7 1 > tmp.txt
      fusão tmp.txt mapeamento.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt

      NOTA: O comando de mesclagem usado neste exemplo não é um comando Unix padrão. No entanto, sua implementação com a ajuda do tipo GNU Core Utilities e junte-se é simples. O comando foi introduzido para esconder a complexidade de classificar os arquivos antes que eles possam ser unidos com a junta de comando. Uma implementação de mesclagem pode ser encontrada em https://github.com/aheinzel/merge-sh.
    1. Uso de qualquer identificador genético identificando exclusivamente o gene em um determinado namespace para obter os melhores resultados possíveis.
      NOTA: O passo 2 resulta em uma lista de interações letais sintéticas de múltiplos organismos mapeados para genes humanos.

3. Mapeando parceiros de interação letal sintética para drogas

  1. Recuperar pares de alvos de drogas do DrugBank.
    1. Baixe dados do DrugBank da seção de downloads do DrugBank e crie uma conta primeiro se ainda não tiver criado22. Use o arquivo CSV com identificadores de alvo de drogas (seção de identificadores de proteínas: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) e o vocabulário do DrugBank (seção de dados abertos: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) com identificadores e nomes do DrugBank. Alternativamente, extrair as informações necessárias do despejo do banco de dados XML.

      ##restrict o arquivo de alvo de drogas do DrugBank para colunas relevantes e só reter entradas para entidades moleculares humanas
      DB_TARGETS="tudo.csv"
      DB_NAMES="vocabulário do banco de medicamentos.csv"

      #extract colunas e reformat relevantes para usar a guia como seperador de colunas
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt

      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1 || $2 == "Humanos"){
      imprimir $1, $3
      }
      target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt

      NOTA: Os dados do DrugBank são fornecidos em dois formatos principais. O banco de dados completo está disponível como arquivo XML. Além disso, a maioria dos dados é disponibilizada em uma série de arquivos de valor separados por círio (CSV).
    1. Esteja ciente de que o DrugBank também registra alvos de drogas não humanos. A coluna de espécies (coluna número 12) pode ser usada para extrair alvos de drogas humanas.
      NOTA: Para melhor legibilidade, os nomes das colunas extraídas são fornecidos na Tabela 2. Existem outras fontes (por exemplo, o Banco de Dados de Alvos Terapêuticos ou Chembl) que detêm links de alvo de drogas, conforme descrito na seção de discussão.
Número da coluna Nome do cabeçalho da coluna
3 Nome de Gene
12 espécie
13 IDs de drogas
  1. Adicione nomes de drogas a alvos de drogas.
    1. Uma vez que o nome da droga e as informações de alvo de drogas são fornecidas em dois arquivos CSV separados, mescla as informações dos dois arquivos para posteriormente adicionar nomes de drogas direcionadas a um parceiro de interação letal sintética para interações letais sintéticas. Junte-se aos dois conjuntos de dados usando a coluna comum DrugBank-drug-ID. Normalize o conjunto de dados de alvo de drogas primeiro que ele contém apenas um único DrugBank-drug-iD por linha, como o arquivo inicial pode conter várias IDs de drogas DrugBank em uma fileira se uma proteína é alvo de múltiplas drogas.

      ##generate um único arquivo que mantém símbolo genético alvo de drogas, ID de drogas do DrugBank e nome de droga
      #normalize conjunto de dados de alvo de drogas
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      se (NR == 1){
      imprimir $0
      }else se ($1 != "" && $2 != "){
      split ($2, drug_targets, ";")
      para(i em drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      imprimir $1, drug_target | "sort -u"
      }
      }
      human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt

      #extract colunas e reformat relevantes para usar a guia como separador de colunas
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt

      mesclar human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 21 > db_human_drug_targets.txt

      NOTA: Coluna um e três no vocabulário do banco de medicamentos.csv arquivo detém a ID de drogas do DrugBank e o respectivo nome.
  1. Adicione drogas direcionadas a parceiros de interação letal sintética ao conjunto de dados de interação letal sintética.
    1. Junte-se ao conjunto de dados de interação letal sintética com o arquivo de nome de droga-alvo gerado na etapa anterior usando as colunas de símbolos genéticos para adicionar drogas às interações letais sintéticas. Tome cuidado para adicionar nomes de drogas para ambos os parceiros de cada interação letal sintética.
       
      ##enhance o arquivo de interação letal sintética adicionando drogas direcionadas aos parceiros de cada interação letal sintética
      mesclar bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      mesclar tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt

      NOTA: O passo 3 resulta em interação letal sintética de múltiplos organismos com seus genes e drogas humanas ortologos visando esses genes.

4. Estabelecendo o conjunto de combinações de medicamentos atualmente testados em ensaios clínicos

  1. Tenha acesso aos dados ClinicalTrials.gov.
    1. Recuperar informações sobre ensaios clínicos em formato XML a partir de ClinicalTrials.gov em (i) ensaios individuais, (ii) ensaios resultantes de uma consulta de pesquisa ou (iii) todos os ensaios no banco de dados. Alternativamente, utilizar os recursos fornecidos pela iniciativa de transformação de ensaios clínicos, que também hospeda todos os dados de ClinicalTrials.gov em uma base de dados relacional. Consulte o passo 4.4 para mais detalhes.
      NOTA: Uma conta gratuita é necessária para acessar a instância de banco de dados hospedada na nuvem hospedada pela iniciativa de transformação de ensaios clínicos. Além disso, é necessário um cliente plsql.
  2. Concentre-se em ensaios intervencionais.
  3. Filtro para ensaios específicos para a indicação de interesse.
    NOTA: ClinicalTrials.gov fornece nomes de doenças do vocabulário controlado por Títulos de Sujeitos Médicos do NCBI (MeSH). Ao contrário do que o submetida forneceu nomes de doenças, o vocabulário controlado permite identificar eficientemente ensaios para a indicação de interesse. No entanto, é preciso ter em mente que o vocabulário controlado pelo NCBI MeSH é um dicionário. Portanto, verifique o Navegador MeSH (https://meshb.nlm.nih.gov) se a indicação geral de interesse tem algum termo filho/mais estreito e inclua-os se for o caso.
  4. Recuperar os ensaios identificados junto com as drogas testadas nestes ensaios. Uma consulta para ensaios na indicação geral de câncer de ovário é fornecida abaixo.

    ##retrieve ensaios intervencionais para a indicação geral do câncer de ovário a partir da iniciativa de transformação de ensaios clínicos hospedado banco de dados relacionais contendo dados ClinicalTrials.gov
    | gato <\pset footer off
    SELECIONE S.NCT_ID DISTINTAS, s.brief_title, i.intervention_type i.name
    DOS estudos s
    INSIENTOU BROWSE_CONDITIONS c ON (s.nct_id = c.nct_id)
    Intervenções internas da JOIN i ON (s.nct_id = i.nct_id)
    ONDE s.study_type = 'Intervencionista'
    E c.mesh_term IN (
    'Neoplasias ovarianas',
    'Carcinoma, Epitelial Ovariana',
    'Tumor de células de Granulosa',
    'Síndrome do Câncer de Mama e Ovário Hereditário',
    'Luteoma',
    'Síndrome de Meigs',
    'Tumor celular sertoli-leydig',
    'Thecoma'
    )
    ORDEM POR s.nct_id, i.intervention_type;
    Eof
    psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact
  1. Extrair nomes de drogas e mapear os nomes do DrugBank.
    NOTA: Embora seja tentador usar diretamente os nomes dos medicamentos recuperados de ensaios clínicos de interesse, deve-se estar ciente de que os nomes de intervenção em ClinicalTrials.gov são inseridos pelo apresentador como texto gratuito. Como consequência, os nomes não são padronizados, as marcas podem ser usadas em vez do nome do composto comum e não há garantia para a normalização adequada dos dados (por exemplo, vários nomes de medicamentos em uma entrada). Além disso, é comum que os medicamentos sejam submetidos com um tipo de intervenção diferente, diferente da droga. Portanto, o mapeamento dos nomes de intervenção recuperados para nomes de medicamentos do DrugBank é melhor realizado manualmente.

      ##Obtain uma lista de intervenções utilizadas no conjunto de ensaios clínicos previamente recuperados.
    corte -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | cauda -n +2 | classificar -u

    NOTA: As colunas três e quatro possuem tipo de nome de intervenção e intervenção, respectivamente.

  1. Complemente com medicamentos já em uso clínico a partir de diretrizes
    NOTA: O passo 4 resulta em uma lista de medicamentos sob avaliação/uso para a indicação de interesse.

5. Identificação de combinações de drogas visando interações letais sintéticas

  1. Busca por interações letais sintéticas sendo alvo de duas drogas de interesse. Restringir o conjunto de dados da etapa 3 para drogas de interesse filtrando linhas no arquivo que seguram tanto a droga A quanto a droga B.

    ##only reter entradas para interações letais sintéticas e drogas desencadeando-as onde ambos os parceiros são alvo das duas drogas de interesse (drug_a e drug_b)
    awk -F "\t" '{
    se ($12 == drug_a && $14 == drug_b) || ($12 == drug_b && $14 == drug_a) ) {
    imprimir $0
    }
    }' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt
  1. Certifique-se de que nenhuma das duas drogas sozinhas está mirando ambos os parceiros de interação letal sintética. Verifique os alvos de drogas de cada droga identificada no conjunto de dados a partir da etapa 3.2 e avalie se ambos os parceiros letais sintéticos identificados são alvos da droga específica.

    ##find todas as entradas de alvo de drogas para um determinado nome de droga
    awk -F "\t" '{
    se ($3 == droga){
    imprimir $0
    }
    }' droga="XXX" db_human_drug_targets.txt

    NOTA: Uma droga que atingiria ambas as vias de interação letal sintética seria tóxica para qualquer célula, então teoricamente não é um agente multi-alvo valioso. Essa é a razão pela qual essa possibilidade é excluída nesta etapa do algoritmo.
     

6. Testando novas combinações de drogas selecionadas in vitro

  1. Tratar linhas de células cancerígenas de mama humanas e células epiteliais benignas humanas cultivadas em métodos padrão de cultivo in vitro em uma atmosfera umidificada de 37 °C com 5% de CO2 com várias combinações de drogas.
  2. Use mídia suplementada com soro bovino fetal e penicilina, bem como sulfato de estreptomicina para dificultar a infecção bacteriana.
  3. Diluir drogas em solventes como DMSO ou soro fisiológico tamponado com fosfato em pelo menos quatro concentrações diferentes com base em seu IC50 previamente estabelecido (concentração inibitória) e usá-los em combinação ou sozinho para o tratamento de células.
  4. Realizar ensaios de viabilidade celular e ensaios de apoptose tais manchas anexadas/7-AAD para determinar efeitos citotóxicos causados por tratamentos.
  5. Monitore a inibição farmacológica de alvos moleculares suspeitos usando manchas ocidentais.
  6. Distinguir a letalidade sintética dos efeitos puramente aditivos que calculam o índice combinatório (IC) como descrito por Chou e outros23.

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Representative Results

Nosso grupo publicou recentemente dois estudos aplicando o fluxo de trabalho retratado neste manuscrito para identificar combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas no contexto do câncer de ovário e de mama24,25. No primeiro estudo, avaliamos combinações de medicamentos que atualmente são testados em ensaios clínicos em estágio final (fase III e IV) ou já sendo utilizados na prática clínica para tratar pacientes com câncer de ovário em relação ao seu impacto nas interações letais sintéticas. Além disso, identificamos combinações de medicamentos que atualmente não estão sendo testadas em ensaios clínicos, mas fornecem uma lógica a partir da perspectiva de direcionar interações letais sintéticas. Por isso, avaliamos todas as combinações de medicamentos possíveis escolhendo drogas da piscina de todos os compostos em testes de câncer de ovário em estágio avançado. Identificamos um conjunto único de 61 combinações de drogas que haviam sido investigadas em 68 testes de câncer de ovário em estágio avançado. Doze dessas 61 combinações de drogas abordaram pelo menos uma interação letal sintética. 84 combinações adicionais de medicamentos foram propostas para abordar interações letais sintéticas sem serem investigadas em ensaios clínicos até esta data. 21 drogas únicas contribuíram para as 84 combinações de drogas identificadas visando um conjunto de 39 interagidores letais sintéticos, conforme dado na Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Rede de novas combinações de drogas propostas no contexto do câncer de ovário. A Figura 1 exibe interações letais sintéticas onde os interagedores são abordados por duas drogas que atualmente não estão sendo testadas em ensaios clínicos. As interações de synlet são exibidas em vermelho, enquanto as ligações de alvo de drogas são indicadas por bordas cinzas. Linhas pontilhadas representam interações letais sintéticas sendo abordadas por outras combinações de drogas em ensaios clínicos de câncer de ovário em estágio avançado. Estas combinações de drogas investigadas são indicadas com um asterisco (*), cada uma em combinação com paclitaxel com a combinação adicional investigada de cediranib e olaparibe sendo indicado por um círculo (o) [adaptado a partir de 25]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Usando o mesmo fluxo de trabalho em um segundo estudo, identificamos 243 combinações promissoras de medicamentos visando 166 pares de genes letais sintéticos no contexto do câncer de mama. Testamos experimentalmente combinações de medicamentos selecionados sobre seu impacto na viabilidade celular e apoptose em duas linhas de células cancerígenas de mama. Em particular, a proposta de combinação de drogas de baixa toxicidade de celecoxib e ácido zoledrônico mostrou citotoxicidade além dos efeitos aditivos nas linhas celulares do câncer de mama, conforme determinado pelo seu índice combinatório. Os resultados da viabilidade e dos ensaios de apoptose para esta combinação de drogas são exibidos na Figura 2.

Figure 2
Figura 2: Impacto do ácido celecoxib e zoledrônico na viabilidade e apoptose nas células SKBR-3. (A) Resultados do ensaio de viabilidade para celecoxib (CEL), ácido zoledrônico (ZOL) e a combinação de ácido zoledrônico e celecoxib (ZOL + CEL) nas linhas de células cancerígenas de mama SKBR-3. As concentrações CEL baixas e altas utilizadas foram de 50μM e 75μM. As concentrações de ZOL baixas e altas utilizadas foram de 500μM e 750μM. A combinação de drogas teve um efeito sinérgico significativo na viabilidade celular (** p < 0,001). (B, C) As manchas anexa v (ANXA5) e 7-AAD de células SKBR-3 tratadas com CEL, ZOL e a combinação de drogas ZOL + CEL. A porcentagem de células 7-AADpos/ANXA5pos foi aumentada após o tratamento com a combinação de medicamentos ZOL + CEL [adaptada a partir de 24]. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Delineamos um fluxo de trabalho para identificar combinações de drogas que impactam as interações letais sintéticas. Este fluxo de trabalho faz uso de (i) dados sobre interações letais sintéticas de organismos modelo, (ii) informações de ortologs humanos, (iii) informações sobre associações de alvos de drogas, (iv) informações sobre medicamentos sobre ensaios clínicos no contexto do câncer, bem como (v) sobre informações de associações de doenças-drogas e doenças genéticas extraídas da literatura científica. As informações consolidadas podem ser usadas para avaliar o impacto de uma determinada combinação de drogas sob investigação em pares de genes letais sintéticos. Além disso, dados consolidados podem ser usados para avaliar um conjunto de medicamentos atualmente sendo investigados ou testados em ensaios clínicos no contexto do câncer para encontrar combinações visando as interações letais sintéticas mais relevantes, tendo assim maior chance de impactar a sobrevivência das células tumorais. Por fim, os dados gerados podem ser usados para rastrear combinações de medicamentos que consistem em drogas não desenvolvidas inicialmente para o tratamento do tumor, fornecendo assim uma maneira de um caso de reposicionamento computacional de drogas.

Para cada etapa do fluxo de trabalho de integração de dados, apresentamos as principais fontes de dados para completar o fluxo de trabalho completo dos dados, mas apontamos que o fluxo de trabalho pode ser melhorado em várias etapas, fazendo uso de fontes de dados adicionais. Em nosso fluxo de trabalho extraímos pares de interação letal sintética do banco de dados BioGRID18. Focamos especificamente nas interações dos tipos de experimentos "letalidade sintética" e "genética negativa". Informações no BioGRID sobre interações letais sintéticas contêm conjuntos de dados de grande tela genética como, por exemplo, um conjunto de dados publicado por Costanzo e colegas26, que também está disponível no banco de dados DRYGIN27, bem como dados sobre interações letais sintéticas únicas, conforme descrito em experimentos individuais na literatura científica. Existem fontes de dados adicionais coletando e armazenando interações letais sintéticas, como por exemplo o SynLethDB28. Além disso, no nível de mapeamento ortologia, existem um grande número de diferentes ferramentas e bancos de dados. Apresentamos uma maneira de fazer uso do biomart Ensembl para mapear parceiros de interação letal sintética identificados em organismos modelo para seus ortologs humanos correspondentes. Outras bases de dados e serviços de ortologia incluem o banco de dados HomoloGene29da NCBI, o banco de dados de ortologia OMA do Instituto Suíço de Bioinformática30, ou o banco de dados de grupos de ortolog inParanoid mantido pelo Centro de Bioinformática de Estocolmo31. Em nosso fluxo de trabalho, focamos em interações letais sintéticas de múltiplos organismos modelo, com o maior número de interações letais sintéticas provenientes da levedura. Pode-se considerar restringir o conjunto de entrada para o mapeamento ortologia para dados apenas de camundongos e ratos, que são evolutivos mais próximos dos humanos. Uma maneira adicional de definir o conjunto de entrada de interações letais sintéticas é focar apenas nas interações letais sintéticas sendo conservadas em várias espécies, aumentando assim as chances de que a interação letal sintética seja verdadeiramente positiva. Isso, por outro lado, pode reduzir drasticamente o conjunto de interações letais sintéticas, já que já há uma grande diferença nas interações letais sintéticas identificadas entre S. cerevisiae e S. pombe. Outra abordagem é não ser muito rigoroso no início e até mesmo estender o conjunto de interações letais sintéticas experimentais por algoritmos de aprendizagem de máquina como fizemos nos dois estudos listados na seção de resultados representativos. Resumindo, um modelo florestal aleatório foi usado para prever interações letais sintéticas para genes humanos para os quais não existiam genes ortologos na levedura. O modelo florestal aleatório foi treinado no conjunto de pares de interação letal sintética a partir de leveduras e seus genes humanos ortologos usando dados sobre associações de caminhos, atribuição de Ontologia genética, bem como associações de doenças e drogas, como descrito anteriormente24,25. Isso nos permitiu considerar genes humanos para os quais não havia informações de mapeamento de ortolog disponíveis em nosso fluxo de trabalho de integração. Um banco de dados amplamente utilizado armazenando informações sobre associações de alvos de drogas é o DrugBank, que também é a principal fonte de interações no fluxo de trabalho. Outras bases de dados que guardam, em certa medida, informações complementares sobre alvos de medicamentos são o Banco de Dados de Alvos Terapêuticos (TTD)32 ou ChEMBL33. Os principais componentes do fluxo de trabalho também são incorporados na plataforma de avaliação e.do emergentec e do SynLethDB, que foi desenvolvida por pesquisadores da Universidade Tecnológica de Nanyang. A última atualização do SynLethDB em 2015, no entanto, foi baseada nos conjuntos de dados armazenados na seção de download em sua respectiva página28.

Uma maneira de classificar combinações de medicamentos identificados e pares de interação letal sintética direcionados é usando a associação de parceiros letais sintéticos e/ou drogas com a doença de interesse através de métodos de mineração de literatura. Em nosso trabalho sobre a avaliação de combinações de drogas no contexto do câncer de ovário, classificamos novas combinações de drogas propostas com base no número de publicações sobre câncer de ovário mencionando qualquer um dos dois interajadores letais sintéticos de uma respectiva combinação de drogas. A anotação do MeSH em Pubmed pode ser usada para identificar publicações para uma doença específica usando os termos exatos da doença, conforme dado no principal ramo do MeSH C. Informações sobre genes nas publicações identificadas podem ser extraídas usando o arquivo de mapeamento gene2pubmed da NCBI, conforme descrito em outros lugares34. Além disso, existem bancos de dados dedicados que guardam vínculos de doenças genéticas e/ou medicamentos, como o Banco de Dados Toxicogenomicos Comparativo35,DisGeNET36ou a plataforma de software e.valuation. O ranking de combinações de medicamentos baseados em associações de doenças é uma forma de apoiar a seleção final de combinações de medicamentos para testes experimentais. Aspectos adicionais precisam ser considerados ao selecionar combinações de medicamentos para testes posteriores, como, por exemplo, perfis de toxicidade individual das drogas ou status de expressão de interagidores letais sintéticos no respectivo órgão alvo.

Na seção de resultados representativos, apresentamos dados para a combinação de medicamentos de celecoxib e ácido zoledrônico, que foi identificado seguindo o fluxo de trabalho para identificar combinações de medicamentos no contexto do câncer de mama. Esta combinação de drogas em particular foi selecionada para testes experimentais devido aos baixos perfis de toxicidade de ambos os compostos. Usamos várias concentrações em experimentos in vitro para avaliar o impacto da combinação de drogas na viabilidade celular e apoptose. Idealmente, as concentrações de medicamentos poderiam ser significativamente reduzidas para drogas individuais para minimizar os efeitos colaterais e, ao mesmo tempo, maximizar a eficácia combinando duas drogas. Ver o impacto na viabilidade em doses mais baixas é ainda mais significativo, pois as concentrações de medicamentos utilizadas para testes in vitro poderiam ser criticadas como supraterapêuticas, que não são alcançadas em modelos in vivo. No entanto, as concentrações foram escolhidas com base em experimentos de cultura celular com essas drogas dadas na literatura. A dosagem de drogas pode influenciar ainda mais quais alvos são afetados principalmente, já que a maioria dos compostos tem mais de um alvo de drogas, potencialmente impactando um grande conjunto de moléculas conhecidas e desconhecidas a jusante também. As combinações de medicamentos que mostram efeitos sinérgicos na viabilidade celular em sistemas de cultura celular in vitro devem, portanto, ser mais investigadas em modelos 3D ou in vivo.

Resumindo, apresentamos um fluxo de trabalho que integra informações de diferentes fontes de dados para avaliar e propor combinações de medicamentos visando interações letais sintéticas. Até o momento, as maiores informações sobre interações letais sintéticas ainda vêm de organismos modelo, exigindo uma etapa obrigatória de mapeamento ortologia para o genoma humano. As primeiras telas em células haploides humanas levaram à identificação de interações letais sintéticas em células humanas. Além disso, a tecnologia CRISPR/CAS abriu novas formas de estudar interações letais sintéticas em nível celular. Com dados de interação letal sintética sintética de mais alta qualidade se tornando disponíveis, propomos que esforços de integração de dados como o nosso transformarão o tratamento clínico do câncer no futuro, descobrindo novos e clinicamente significativos pares de genes letais sintéticos, além do BRCA(1/2)/PARP1.

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Disclosures

A AH e o PP foram funcionários do Biodesenvolvimento EmergenteC GmbH no momento da realização das análises que levaram aos resultados apresentados na seção de resultados representativos. MM e MK não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O financiamento para o desenvolvimento do fluxo de trabalho de integração de dados foi obtido do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia sob o acordo de subvenção nu. 279113 (OCTIPS). A adaptação dos dados dentro desta publicação foi gentilmente aprovada pela Public Library of Sciences Publications and Impact Journals, LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioGRID n/a n/a thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov n/a n/a ClinicalTrials.gov
DrugBank n/a n/a drugbank.ca
Ensembl BioMart n/a n/a ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD ebioscience 00-6993-50
AnnexinV-APC BD Bioscience 550474
celecoxib Sigma-Aldrich PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay Promega G8080
FACS Canto II BD Bioscience n/a
fetal bovine serum Fisher Scientific/Gibco 16000044
FloJo Software FloJo LLC V10
McCoy's 5a Medium Modified Fisher Scientific/Gibco 16600082
penicillin G/streptomycin sulfate Fisher Scientific/Gibco 15140122
SKBR-3 cells American Type Culture Collection (ATCC) ATCC HTB-30
zoledronic acid Sigma-Aldrich SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request

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References

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