Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا قويا لقياس 40 المركبات المشاركة في استقلاب الكربون المركزي والطاقة في تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا. وديريفاتيزيد خليط التوليف الخالي من الخلايا مع الانيلين للفصل الفعال باستخدام الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة ثم تحديده كميا عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام معايير داخلية موسومة بالنظائر.

Abstract

تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو تكنولوجيا ناشئه في النظم والبيولوجيا التركيبية لإنتاج البروتينات في المختبر. ومع ذلك ، إذا CFPS هو الذهاب إلى الانتقال إلى ما وراء المختبر وتصبح واسعه النطاق والقياسية فقط في الوقت تصنيع التكنولوجيا ، يجب علينا ان نفهم حدود الأداء لهذه الانظمه. نحو هذا السؤال ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتحديد كميه المركبات 40 المشاركة في تحلل الجلوكوز ، ومسار الفوسفات خماسي ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. يستخدم الأسلوب المعايير الداخلية الموسومة مع 13ج-الانيلين ، في حين ان المركبات في العينة هي ديريفاتيزيد مع 12ج-الانيلين. وكانت المعايير والعينات الداخلية مختلطة ومحلله بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة-قياس الطيف الكتلي (LC/MS). التخلص من المركبات القضاء علي قمع الأيونات ، والسماح للقياس الدقيق لتركيزات المستقلب أكثر من 2-3 أوامر الحجم حيث كان معامل الارتباط المتوسط 0.988. وكانت خمسه من المركبات 40 غير الموسومة مع الانيلين ، ومع ذلك ، كانت لا تزال الكشف عنها في عينه CFPS وكميتها مع طريقه منحني قياسي. يستغرق التشغيل الكروماتوغرافي حوالي 10 دقائق لإكماله. معا ، قمنا بتطوير طريقه سريعة وقويه لفصل وتحديد كميات 40 المركبات المشاركة في CFPS في واحد LC/MS تشغيل. الأسلوب هو نهج شامل ودقيق لتوصيف الأيض خاليه من الخلايا ، بحيث في نهاية المطاف ، يمكننا فهم وتحسين الغلة والانتاجيه وكفاءه الطاقة من الانظمه الخالية من الخلايا.

Introduction

تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو منصة واعده لتصنيع البروتينات والمواد الكيميائية ، وهو التطبيق الذي تم حجزه تقليديا للخلايا الحية. وتستمد الانظمه الخالية من الخلايا من مستخلصات الخلايا الخام وتزيل المضاعفات المرتبطة بنمو الخلايا1. الاضافه إلى ذلك ، يسمح CFPS للوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون تدخل جدار الخلية. ومع ذلك ، فقد افتقر إلى فهم أساسي لحدود أداء العمليات الخالية من الخلايا. الطرق عاليه الانتاجيه للقياس المستقلب هي قيمه لتوصيف الأيض وحاسمه لبناء نماذج الحسابية الايضيه2,3,4. وتشمل الأساليب الشائعة المستخدمة لتحديد تركيزات المستقلب الرنين المغناطيسي النووي (nmr) ، تحويل fourier-الطيفي الاشعه تحت الحمراء (FT-IR) ، والاختبارات القائمة علي انزيم ، والطيف الكتلي (MS)5،6،7 ،8. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه الطرق محدوده بسبب عدم قدرتها علي قياس مركبات متعددة بكفاءة في ان واحد ، وغالبا ما تتطلب حجم عينه أكبر من ردود الفعل النموذجية الخالية من الخلايا. علي سبيل المثال ، يمكن غالبا استخدام الاختبارات المستندة إلى الانزيم فقط لقياس مركب واحد في التشغيل ، وتكون محدوده عندما يكون حجم العينة صغيرا ، مثل تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا (عاده ما يتم تشغيلها علي مقياس 10-15 μL). وفي الوقت نفسه ، يتطلب NMR وفره عاليه من نواتج الأيض للكشف والتقدير الكمي5.  النسبة لأوجه القصور هذه ، توفر أساليب الفصل اللوني بالترادف مع قياس الطيف الكتلي (LC/MS) العديد من المزايا ، بما في ذلك الحساسية العالية وقدره الأنواع المتعددة فيان واحد فينفس الوقت ؛ ومع ذلك ، فان التعقيد التحليلي يزيد كثيرا مع عدد وتنوع الأنواع التي يجري قياسها. ولذلك ، من المهم تطوير أساليب تحقق بالبالكامل الإمكانات العالية الانتاجيه لأنظمه LC/MS. يتم فصل المركبات في عينه بواسطة اللوني السائل وتحديدها من خلال قياس الطيف الكتلي. تعتمد اشاره المركب علي تركيزه وكفاءه التاين ، حيث يمكن ان يختلف التاين بين المركبات وقد يعتمد أيضا علي مصفوفة العينة.

ويمثل تحقيق نفس كفاءه التاين بين العينة والمعايير تحديا عند استخدام LC/MS لقياس التحاليل. وعلاوة علي ذلك ، يصبح القياس الكمي أكثر تحديا مع تنوع المستقلب بسبب تقسيم الاشاره والتغاير في تقارب البروتون والقطبية10. وأخيرا ، يمكن لمصفوفة العينة المشتركة ان تؤثر أيضا علي كفاءه تاين المركبات. لمعالجه هذه القضايا ، يمكن ان تكون الأيض ديريفاتيزيد كيميائيا ، وزيادة دقه الفصل والحساسية من قبل أنظمه LC/MS ، في حين خفض تقسيم الاشاره في وقت واحد في بعض الحالات10،11. اشتقاق الكيميائية يعمل عن طريق وضع علامات مجموعات وظيفية محدده من الأيض لضبط خصائصها الفيزيائية مثل تهمه أو هيدروفوبيسيتي لزيادة كفاءه التاين11. يمكن استخدام عوامل الوسم المختلفة لاستهداف مجموعات وظيفية مختلفه (علي سبيل المثال ، الأمينات ، هيدروكسي ls ، الفوسفات ، الأحماض الكربوكسيليه ، الخ). انيلين ، واحده من هذه العوامل اشتقاق ، تستهدف مجموعات وظيفية متعددة في وقت واحد ، ويضيف مكون مسعور في جزيئات هيدروفيله ، التالي زيادة قرار الانفصال واشاره12. للتصدي للتاثير المشترك لقمع أيون المصفوفة ، قام يانغ وزملاء البحث بتطوير تقنيه تستند إلى وضع العلامات الخاصة بالتكنولوجيا القياسية الداخلية الخاصة بالمجموعة (جسيست) حيث يتم تمييز المعايير مع نظائر الانيلين 13ج ومزجها مع العينة 12,13. المستقلب والمعايير الداخلية المقابلة لها نفس كفاءه التاين لأنها مشتركه ، ويمكن استخدام نسبه شدتها لقياس التركيز في العينة التجريبية.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول للكشف عن وكميه 40 المركبات المشاركة في تحلل الجلوكوز ، والمسار الفوسفات البنتوز ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. ويستند هذا الأسلوب علي نهج جسيست, حيث استخدمنا 12ج-الانيلين و 13ج-الانيلين لوسم, كشف, وقياس الأيض باستخدام عكس المرحلة LC/MS. وامتدت المجموعة الخطية لجميع المركبات 2-3 أوامر الحجم بمعامل ارتباط متوسطه 0.988. التالي ، فان الأسلوب هو نهج قوي ودقيق لاستجواب الأيض خاليه من الخلايا ، وربما مقتطفات خليه كامله.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اعداد الكواشف لوضع العلامات الانيلين

  1. اعداد محلول انيلين 6 م في 4.5 pH. العمل في هود ، والجمع بين 550 μL من الانيلين مع 337.5 μL من المياه LCMS الصف و 112.5 μL من حمض الهيدروكلوريك 12 م (HCl) في أنبوب الطرد المركزي. دوامه جيدا وتخزين في 4 درجه مئوية.
    ملاحظه: يمكن تخزين الانيلين في 4 درجه مئوية لمده شهرين.
    تحذير: الانيلين شديد السمية ويجب ان يعمل معه في غطاء الدخان. حمض الهيدروكلوريك هو تاكل للغاية
  2. اعداد محلول انيلين 6 م 13ج في 4.5 pH. الجمع بين 250 ملغ من 13ج6-انيلين مع 132 μl من الماء و 44 Μl من 12 م HCl. دوامه جيدا وتخزين في 4 درجه مئوية.
  3. اعداد 200 ملغ/مل N-(3-ديميثيلامينوبروبيل)-ن-ايثيل كربوديوميد هيدروكلوريد (أدك) الحل. تذوب 2 ملغ من أدك في 10 μL من الماء لكل عينه ليتم الموسومة ودوامه جيدا.
    ملاحظه: يجب اعداد حل أدك في نفس يوم رد الفعل. تعمل أدك كمحفز لاشتقاق المركبات مع الانيلين12.

2-اعداد المعايير

  1. جعل حلول الأسهم منفصلة من جميع المركبات المذابة في LC/MS الصف المياه (الجدول 1).
  2. اعداد حل المخزون القياسي الداخلي
    1. الجمع بين جميع المركبات باستثناء نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد (NAD) ، نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد الفوسفات (NADP) ، فلافين ادينين دينوكليوتيد (بدعه) ، انزيم اسيتيل A (ACA) ، والجلسرين 3-الفوسفات (Gly3P) ، مع وحدات التخزين المناسبة إنشاء حل الأسهم 2 مم من جميع المركبات.
  3. الجمع بين NAD ، NADP ، بدعه ، ACA ، و Gly3P مع وحدات التخزين المناسبة لإنشاء حل الأسهم 2 مم.

3-اعداد العينة (الشكل 1)

  1. إخماد ويعجل البروتينات في رد فعل تخليق البروتين خاليه من الخلايا عن طريق أضافه كميه متساوية من الجليد البارد 100 ٪ الايثانول إلى رد الفعل. الطرد المركزي العينة في 12,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 ° c. نقل ماده طافي إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد.
    ملاحظه: يمكن تخزين عينات في-80 درجه مئوية في هذه المرحلة وتحليلها في وقت لاحق

4. وضع العلامات رد فعل

  1. تسميه عينه مع 12ج-الانيلين الحل
    1. نقل 6 μL من عينه في أنبوب الطرد المركزي الجديد وجعل حجم إلى 50 μL مع الماء.
      ملاحظه: حجم نموذج وحده التخزين قد تعتمد علي رد فعل CFPS محدده.
    2. أضافه 5 μL من 200 mg/mL الحل أدك.
    3. أضافه 5 μL من 12C-حل الانيلين.
      ملاحظه: الحل الانيلين يفصل إلى مرحلتين. تخلط جيدا قبل أضافه إلى رد الفعل.
    4. دوامه رد فعل مع اهتزاز لطيف لمده 2 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
    5. بعد 2 ح ، وأزاله الأنابيب من شاكر وأضافه 1.5 μl من ثلاثي الايثيلامين (الشاي) إلى رد فعل في غطاء الدخان.
      ملاحظه: تريثيلاميني يرفع درجه الحموضة من الحل الذي يوقف تفاعل العلامات الانيلين ويستقر المركبات.
      تحذير: تريثيلاميني سمي ويسبب تهيج العينين والجهاز التنفسي.
    6. الطرد المركزي في 13,500 x g لمده 3 دقائق.
  2. وصف المعايير الداخلية مع 13ج-حل الانيلين
    1. تمييع حل الأسهم الداخلية إلى 80 μM مع حجم النهائي من 50 μL.
      ملاحظه: يمكن تعديل تركيز المعايير الداخلية إلى مستويات قريبه من العينة التجريبية.
    2. أضافه 5 μL من 200 mg/mL الحل أدك.
    3. أضافه 5 μL من 13C-حل الانيلين.
    4. دوامه رد فعل مع اهتزاز لطيف لمده 2 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
    5. بعد 2 ح ، وأزاله الأنابيب من شاكر وأضافه 1.5 μL من الشاي إلى رد فعل في غطاء الدخان.
    6. الطرد المركزي في 13,500 x g لمده 3 دقائق.
  3. الجمع بين الموسومة القياسية الداخلية وعينه الموسومة
    1. مزيج 25 μL من 12ج-الانيلين المسمي عينه مع 25 μl من 13ج-الانيلين المسمي القياسية.
    2. نقل إلى قارورة لصناعه السيارات في العينات وتحليلها من قبل LC/MS الاجراء.
  4. إنشاء منحني قياسي لنواتج الأيض غير الموسومة
    1. محلول الأسهم تمييع من الأيض غير الموسومة (NAD ، NADP ، بدعه ، ACA ، و Gly3P) إلى تركيزات النهائية من 320 μM ، 80 μM ، 20 μM و 5 μM مع حجم 50 μL.
    2. أضافه 5 μL من 200 mg/mL الحل أدك.
    3. أضافه 5 μL من 12C-حل الانيلين.
    4. دوامه رد فعل مع اهتزاز لطيف لمده 2 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
    5. بعد 2 ح ، وأزاله الأنابيب من شاكر وأضافه 1.5 μL من الشاي إلى رد فعل في غطاء الدخان.
    6. الطرد المركزي في 13,500 x g لمده 3 دقائق.
    7. نقل ماده طافي إلى قارورة لصناعه السيارات في العينات وتحليلها من قبل LC/MS الاجراء.
      ملاحظه: الأيض غير الموسومة تتبع نفس الاجراء مثل العينة للنسخ المتماثل نموذج مصفوفة من أجل الحفاظ علي كفاءه التاين مماثله.

5. اعداد LC/MS الاجراء

  1. اعداد المذيبات
    1. اعداد محلول مائي ثلاثي butylamine (الذي تم تعديله) بمعدل 5 مم لدرجه الحموضة 4.75 مع حمض الخليك.
      ملاحظه: يساعد التالية في مرحله المحمول التحليلات تحقيق دقه جيده والانفصال14.
    2. اعداد 5 مم التالية في اسيتلونيتريل (ACN).
    3. اعداد المذيبات يغسل مع 5 ٪ المياه و 95 ٪ ACN.
    4. اعداد المذيبات تطهير مع 95 ٪ المياه و 5 ٪ ACN.
  2. اعداد شروط MS
    1. تعيين مطياف كتله إلى وضع أيون السلبية مع درجه حرارة المسبار 520 درجه مئوية ، والجهد الشعرية السلبية من-0.8 kV ، والجهد الشعرية الايجابيه من 0.8 kV ، وتعيين البرنامج للحصول علي البيانات في 5 نقاط/ثانيه.
    2. تعيين التسجيلات الايونيه المحددة (SIR) لكل المستقلب مع الفولتية مخروط محدده والكتلة علي تهمه (م/ض) القيم. انظر الجدول 1.
  3. تهيئه LC/MS وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
    1. خطوط رئيسيه المذيبات في مدير المذيبات لمده 3 دقائق.
    2. رئيس المذيبات غسل (5 ٪ المياه ، 95 ٪ ACN) وتطهير المذيبات (95 ٪ المياه ، 5 ٪ ACN) لمده 15 ثانيه لمده 5 دورات.
    3. تعيين مدير العينة إلى 10 درجه مئوية.
    4. تثبيت C18 (1.7 μm ، 2.1 مم × 150mm) العمود وتهيئه العمود مع 100 ٪ ACN في 0.3 mL/min لمده 10 دقيقه.
    5. شرط العمود في 95 ٪ المياه و 5 ٪ ACN في 0.3 mL/min لمده 10 دقيقه قبل إدخال المذيبات مع المخازن المؤقتة.
    6. شرط العمود في 95 ٪ المذيبات A (5mM الماء الصالح لل الماء ، والرقم الهيدروجيني 4.75) و 5 ٪ المذيبات B (5 مم التالية في ACN) في 0.3 mL/min لمده 10 دقيقه.
    7. اعداد بروتوكول التدرج مع الشطف بدءا من 95 ٪ المذيبات A و 5 ٪ المذيبات B ، ورفعت إلى 70 ٪ المذيبات B في 10 دقيقه ، ورفعت إلى 100 ٪ المذيبات B في 2 دقيقه وعقد في 100 ٪ المذيبات ب لمده 3 دقائق. العودة إلى الظروف الاوليه (95 ٪ المذيبات ، 5 ٪ المذيبات ب) أكثر من 1 دقيقه وعقد لمده 9 دقائق لأعاده تتوازن العمود.
    8. شرط العمود مع بروتوكول التدرج 3 مرات قبل اي حقن علي العمود.
  4. عينه الحقن والمعايير
    1. حقن 5 μL من العينة في العمود والحصول علي كثافة الأيونات m/z المناسبة ل 12C-انيلين عينه الموسومة.
    2. حقن 5 μL من نفس العينة مره أخرى ، ولكن هذه المرة الحصول علي كثافة الأيونات م/ز ل 13ج-انيلين الموسومة المعايير.
      ملاحظه: لدينا LC/MS النظام غير قادر علي الحصول علي كل من 12c و 13c m/z كثافة في الإطارات الزمنيه المحددة السير ، لأنه هو الكثير من البيانات للحصول علي في الإطار الزمني المحدد. ولذلك ، فاننا حقن نفس العينة مرتين.
    3. حقن معايير المستقلب غير الموسومة من ادني تركيز إلى اعلي وتسجيل كثافة الأيونات m/z المناسبة.

6-القياس الكمي

  1. إنشاء أسلوب التصدير
    1. في برنامج الحصول علي البيانات ، حدد ملف ≫ أسلوب جديد ≫ طريقه التصدير.
    2. حدد اسم ملف ، مثل AnilineTagging_Date.
    3. تحقق من ملف التصدير ASCII واختر دليلا لتصدير الملف النصي اليه.
    4. في نوع التقرير، حدد ملخص حسب الكل.
    5. في المحددات ، للعمود حدد a ،. للصف، حدد [cr] [if].
    6. في الجدول، حدد تصدير ثم قم بتحرير الجدول لتضمين سامبلينامي والمساحة والارتفاع والمقدار والوحدات.
    7. حفظ طريقه التصدير.
  2. قياس نواتج الأيض مع المعايير الداخلية باستخدام برمجيات الحصول علي البيانات
    1. ضمن علامة التبويب مجموعات العينة ، انقر بزر الماوس الأيمن علي تشغيل LC/MS المطابق وحدد عرض ك> قنوات.
    2. حدد جميع قنوات SIR ل 13C-الانيلين المعايير الداخلية لحقنه واحده ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد مراجعه.
    3. إذا لم يظهر اطار " تخطيط أسلوب معالجه LC " تلقائيا ، انتقل إلى عرض ≫ تخطيط أسلوب معالجه.
    4. في معالجه تخطيط الأسلوب، انتقل إلى علامة التبويب التكامل وتعيين apااكسكتاك خوارزميه.
    5. انتقل إلى علامة التبويب تجانس وتعيين نوع إلى يعني ومستوي تجانس إلى 13.
      ملاحظه: يمكن تحديد اي مستوي تجانس ، طالما انه متناسقة عبر كافة العينات.
    6. في علامة التبويب قناه ms ، قم بتعطيل معالجه ms ثلاثية الابعاد .
    7. في نافذه قناه SIR ، ودمج كل الذروة ، قناه واحده في كل مره. بمجرد تكامل الذروة ، انتقل إلى خيارات ≫ تعبئة من النتيجة سيتم ملء تفاصيل الذروة في علامة التبويب المكونات . تغيير اسم الذروة إلى اسم مركب المطابق.
    8. مره واحده وقد تم تقييم جميع قنوات SIR ، حفظ طريقه المعالجة وإغلاق النافذة.
    9. حدد جميع قنوات السير من 13ج-الانيلين و 12ج-الانيلين عينه الموسومة ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عمليه.
    10. تحقق من مربع العملية ، وحدد استخدام أسلوب المعالجة المحدد، واختر طريقه المعالجة التي تم حفظها للتو. أيضا التحقق من مربع التصدير ، حدد استخدام أسلوب التصدير المحدد واختيار طريقه التصدير المحفوظة التي تم إنشاؤها سابقا. انقر فوق موافق.
    11. افتح الملف النصي الذي تم تصديره مع Excel واحسب تركيز المركب غير المعروف باستخدام:
      Equation 1
      حيث Cx ، وانا هو تركيز عينه غير معروفه ل المستقلب i ، ax ، وانا هو المنطقة المتكاملة من المستقلب غير معروف ط ،std ، وانا هو منطقه متكاملة من المعيار الداخلي من المستقلب ط ، Cstd ، وانا تركيز المعيار الداخلي من المستقلب ط ، و D هو عامل التخفيف.
  3. قياس نواتج الأيض غير الموسومة بمنحني قياسي
    1. ضمن علامة التبويب مجموعات العينة ، انقر بزر الماوس الأيمن علي تشغيل LC/MS المطابق وحدد عرض ك> القناات.
    2. حدد جميع قنوات السير للمعايير غير الموسومة من حقنه واحده ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد مراجعه.
    3. إذا لم يظهر اطار " تخطيط أسلوب معالجه LC " تلقائيا ، انتقل إلى عرض ≫ تخطيط أسلوب معالجه.
    4. في "تخطيط أسلوب المعالجة" ، انتقل إلى علامة التبويب تكامل وقم بتعيين Apااكسكتاك خوارزميه.
    5. انتقل إلى علامة التبويب تجانس وتعيين نوع إلى يعني ومستوي تجانس إلى 13.
      ملاحظه: يمكن تحديد اي مستوي تجانس ، طالما انه متناسقة عبر كافة العينات.
    6. في علامة التبويب قناه ms ، قم بتعطيل معالجه ms ثلاثية الابعاد .
    7. في نافذه قناه SIR ، ودمج كل الذروة ، قناه واحده في كل مره. بمجرد تكامل الذروة ، انتقل إلى خيارات ≫ تعبئة من النتيجة سيتم ملء تفاصيل الذروة في علامة التبويب المكونات . تغيير اسم الذروة إلى اسم مركب المطابق.
    8. مره واحده وقد تم تقييم جميع قنوات SIR ، حفظ طريقه المعالجة وإغلاق النافذة.
    9. ضمن علامة التبويب مجموعات العينة ، انقر بزر الماوس الأيمن علي مجموعه عينه وحدد تغيير العينة.
    10. حدد المبلغ في النافذة الجديدة.
    11. حدد نسخه من أسلوب العملية واختر طريقه العملية التي تم حفظها للتو.
    12. ادخل تركيز كل المستقلب لكل قنينة وادخل الوحدة ك < μM لكل مكون (أو الوحدة المقابلة) وحدد OK.
    13. حدد مجموعه العينات مره أخرى ، انقر بزر الماوس الأيمن ، عرض ك> القناات.
    14. حدد جميع قنوات السير من الأيض غير الموسومة للمعايير ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عمليه.
    15. تحقق من مربع العملية واختر استخدام أسلوب معالجه محدد. حدد طريقه المعالجة المناسبة ثم انقر فوق موافق.
    16. حدد قنوات السير لجميع نواتج الأيض غير الموسومة للعينات ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عمليه.
    17. تحقق من مربع العملية ، وحدد استخدام أسلوب معالجه محدد ، واختر طريقه المعالجة التي تم حفظها للتو. أيضا التحقق من تصدير مربع ، حدد استخدام طريقه التصدير المحددة واختيار طريقه التصدير المحفوظة التي تم إنشاؤها في وقت سابق. انقر فوق موافق.
    18. قياس الأيض غير الموسومة مع المنحني القياسي وتصدير النتائج إلى ملف نصي إلى الدليل المحدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كدليل علي المفهوم ، استخدمنا البروتوكول لقياس نواتج الأيض في نظام CFPS القائم علي كولاي الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (gfp).  وكان رد فعل CFPS (14 μL) مروي و deبروتينيه مع الايثانول. ثم تم المفتاحية عينه CFPS مع 12ج-الانيلين, في حين تم الموسومة المعايير مع 13ج-الانيلين. ثم جمعت العينة المعلمة والمعايير وحقنت في LC/MS (الشكل 1). وقد كشف البروتوكول و40 نواتج الأيض المستخدمة في استقلاب الكربون المركزي والطاقة باستخدام المعايير الداخلية ، في حين تم أيضا وضع منحني قياسي ل 5 من نواتج الأيض التي لم تكن موسومة بالانيلين (الشكل 2). وكانت الأيض المتنوعة التي تنطوي عليها هذه المسارات فئة من السكريات الفوسفاتية ، والأحماض فوسفوكاربوكسيليك ، والأحماض الكربوكسيليه ، النيوبوتيديس ، والعوامل المشتركة. الاشتقاق مع انيلين أدخلت شارده مسعور في جزيئات هيدروفيله التي سهلت فصل أكثر فعاليه باستخدام عكس المرحلة اللوني12. الاضافه إلى ذلك ، فان طريقه تمكين فصل أزواج ايزومير الهيكلية مثل الجلوكوز 6-الفوسفات والفركتوز 6-الفوسفات في واحد LC/MS تشغيل. وقد تم تحديد نسبه الكتلة فوق الشحنة (m/z) لكل مجمع ووقت الاستبقاء قبل التجربة عن طريق حقن 1 ملم من مركب واحد في كل مره ومقارنه طيف الكتلة بالفراغ (الجدول 1).

وقدر الحد من الكشف ونطاق الخطية لجميع المركبات من خلال إنتاج منحني القياسية التي تراوحت بين 0.10 μM إلى 400 μM (الجدول 2). وكان متوسط معامل الارتباط (R2) بالنسبة لجميع المركبات 0.988 وكانت معظم المركبات ذات نطاق خطي يتراوح بين 3 أوامر من الحجم. وكانت ثلاثه مركبات اثار التشبع ملحوظة, لا سيما الفا ketoglutarate التي كان لها مجموعه خطيه من 0.1 μM إلى 25 μM. Isocitrate وسيترات أيضا اثار التشبع فوق 100 μM.

Figure 1
الشكل 1: تخطيط سير العمل لوضع علامات الانيلين. البروتين خاليه من الخلايا رد فعل التوليف والموسومة مع 12ج-الانيلين, في حين يتم المفتاحية خليط الأسهم القياسية مع 13ج-الانيلين. ثم يتم خلط كل من الخلائط في نسبه 1:1 الحجمي وتحليلها من قبل LC/MS. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تداخل الكروماتوغرام الأيوني المختار ل40 الأيض. كروماتوجرام الشامل من واحد LC/MS تشغيل من خليط 40 μM القياسية من الأيض 40. تم تحديد القمم من خلال وقت الاحتفاظ بها وقيم m/z لكل مركب. وترد الأسماء المركبة الكاملة ومختصراتها في الجدول 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

رقم الذروة المستقلب اختصار معرف KEGG الاحتفاظ بالوقت (دقيقه) 12C m/z 13C m/z غير التسمية م/ض السيره الذاتيه أنواع MS
1 الجلسرين 3-فوسفات Gly3P C00093 3.85 153 10 M – H2O – H
2 نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد Nad C00003 3.96 698 10 M + Cl-H
3 الجلوكوز GLC C00031 4.06 289.9 296 15 M + A + Cl-H
4 سيدوهولولوز 7-فوسفات S7P C05382 5.41 364 370 10 M + A – H
5 الفركتوز 6-فوسفات F6P C00085 5.48 334 340 10 M + A – H
6 غوانوزين مونوفوسفات GMP C00144 5.57 437.05 443 10 M + A – H
7 ريبولوز 5-فوسفات RL5P C00199 5.58 304 310 10 M + A – H
8 سيتيدين مونوفوسفات Cmp C00055 5.59 397.09 403 10 M + A – H
9 اللاكتات Lac C00186 5.77 164.05 170 10 M + A – H
10 [ادنونوفات] [مونوفوسفيت] امبير C00020 5.85 421.1 427.1 10 M + A – H
11 اوردين مونوفوسفات UMP C00105 5.88 398.07 404 10 M + A – H
12 نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد فوسفات NADP C00006 6.39 724 10 M-H2O-H
13 3-حمض فوسفوجليسيرريك 3PG C00197 6.63 242 248.06 15 M + A – H2O – H
14 سيتيدين ديفسفات Cdp C00112 6.72 477 483 10 M + A – H
15 غوانوزين ثنائي فوسفات الناتج المحلي الاجمالي C00035 6.87 517 523 10 M + A – H
16 الفوسفات الثنائي Adp C00008 6.94 501 507 10 M + A – H
17 ثنائي فوسفات اوردين Udp C00015 6.97 478 484 10 M + A – H
18 فلافين ادينين دينوكليوتيد بدعه C00016 7.03 784.15 15 M – H
19 الفركتوز 1 ، 6-بيفسفات F16P C05378 7.1 395.95 402.1 10 M + A – H2O – H
20 غلوكونات 6-فوسفات 6PG C00345 7.11 425.1 437 10 M + 2A – H
21 نيكوتيناميد ادينين ديكليوكليوتيد خفضت Nadh C00004 7.23 633.13 639.08 10 M + A + H2O – نيكوتيناميد – H
22 الجلوكوز 6-فوسفات G6P C00668 7.32 409.1 421.1 10 M + 2A – H
23 الريبوز 5-الفوسفات R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 M + 2A – H
24 اريثروز 4-الفوسفات E4P C00279 7.71 348.9 361 10 M + 2A – H
25 ثلاثي فوسفات السيتيدين Ctp C00075 7.84 557 563 5 M + A – H
26 غوانوزين ثلاثي فوسفات GTP C00044 7.93 597 603 5 M + A – H
27 اوكسالخلات OAA C00036 7.94 281 293 25 M + 2A – H
28 الفا كيتولوتاراتي aKG C00026 7.95 295 307.1 15 M + 2A – H
29 اوردين ثلاثي الفوسفات Utp C00075 7.97 558 564 10 M + A – H
30 [ادنوفت] ثلاثي فوسفات Atp C00002 8.03 581 587 15 M + A – H
31 فومارات فوم C00122 8.09 265 277.1 10 M + 2A – H
32 بيروفات PYR C00022 8.09 162 168 25 M + A – H
33 مالات مال C00149 8.09 283.06 295.15 10 M + 2A – H
34 د-غليسريالديهيد 3-فوسفات الفجوه C00118 8.09 319 331.1 5 M + 2A – H
35 اسيتيل-انزيم A Aca C00024 8.16 790 10 M – H2O – H
36 نيكوتيناميد الفوسفات الديكليوكليوتيد اللحمية خفضت نادف C00005 8.23 694.92 700.82 10 M + A – نيكوتيناميد – H
37 فوسفونولبيروفات بيب C00074 8.28 317 329.1 20 M + 2A – H
38 سكسينات SUCC C00042 8.64 267.07 279.1 15 M + 2A – H
39 Isocitrate تقنيه C00311 10.13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 سترات مرجع C00158 10.46 416.1 434.06 20 M + 3A – H

الجدول 1: تحديد ووسم نتائج نواتج الأيض. كل مجمع المقابلة عدد الذروة ، والاحتفاظ الوقت ، م/ض قيمه لغير مسمي ، 12ج و 13ج المسمي ، والأنواع MS. MS الأنواع ، وتقف علي العلامة الانيلين.

رقم الذروة المستقلب اختصار معرف KEGG تركيز (مم) SD (ن = 3) حد الكشف (μM) الحد من المدى الخطي (μM) R ^ 2
1 الجلسرين 3-فوسفات Gly3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد Nad C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 الجلوكوز GLC C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 سيدوهولولوز 7-فوسفات S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
5 الفركتوز 6-فوسفات F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 غوانوزين مونوفوسفات GMP C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 ريبولوز 5-فوسفات RL5P C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 سيتيدين مونوفوسفات Cmp C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 اللاكتات Lac C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 [ادنونوفات] [مونوفوسفيت] امبير C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 اوردين مونوفوسفات UMP C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد فوسفات NADP C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-حمض فوسفوجليسيرريك 3PG C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 سيتيدين ديفسفات Cdp C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 غوانوزين ثنائي فوسفات الناتج المحلي الاجمالي C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 الفوسفات الثنائي Adp C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 ثنائي فوسفات اوردين Udp C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 فلافين ادينين دينوكليوتيد بدعه C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 الفركتوز 1 ، 6-بيفسفات F16P C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 غلوكونات 6-فوسفات 6PG C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 نيكوتيناميد ادينين ديكليوكليوتيد خفضت Nadh C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 الجلوكوز 6-فوسفات G6P C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 الريبوز 5-الفوسفات R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 اريثروز 4-الفوسفات E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 ثلاثي فوسفات السيتيدين Ctp C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 غوانوزين ثلاثي فوسفات GTP C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 اوكسالخلات OAA C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 الفا كيتولوتاراتي aKG C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 اوردين ثلاثي الفوسفات Utp C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 [ادنوفت] ثلاثي فوسفات Atp C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 فومارات فوم C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 بيروفات PYR C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 مالات مال C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 د-غليسريالديهيد 3-فوسفات الفجوه C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 اسيتيل-انزيم A Aca C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 نيكوتيناميد الفوسفات الديكليوكليوتيد اللحمية خفضت نادف C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 فوسفونولبيروفات بيب C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 سكسينات SUCC C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 Isocitrate تقنيه C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 سترات مرجع C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

الجدول 2: القياس الكمي المستقلب في عينه CFPS ممثل. تركيز كل المستقلب والانحراف المعياري. الحد من الكشف ، ونطاق الخطية ومعامل الارتباط التي تم تحديدها من المنحنيات القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أنظمه خاليه من الخلايا ليس لديها جدار الخلية ، التالي هناك امكانيه الوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون الحاجة إلى اعداد عينه معقده. غير انه لم ينجز سوي القليل جدا من العمل لوضع بروتوكولات شامله وقويه لاجراء الاستجواب الكمي لنظم رد الفعل الخالي من الخلايا. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقه سريعة وقويه لقياس الأيض في مخاليط التفاعل الخالي من الخلايا وربما في مقتطفات الخلايا الكاملة. التحديد الكمي الفردي لنواتج الأيض في الخلائط المعقدة ، مثل تلك الموجودة في ردود الفعل الخالية من الخلايا ، أو مقتطفات الخلايا الكاملة ، يشكل تحديا لعده أسباب. ومن بين هذه الأسباب المركزية التنوع الكيميائي. مجموعه من المجموعات الوظيفية الموجودة في وقت واحد في هذه الخلائط (علي سبيل المثال ، الأحماض الكربوكسيليه ، الأمينات ، الفوسفات ، هيدروكسي ls ، الخ) يزيد كثيرا من التعقيد التحليلي. للالتفاف علي هذا ، استخدمنا أسلوب اشتقاق الانيلين في تركيبه مع 13C المعايير الداخلية لإدخال مكونات مسعور إلى مخاليط المستقلب. باستخدام هذه الطريقة ، ونحن بقوة الكشف والكمية 40 الأيض في رد فعل الخلية خاليه في واحد LC/MS تشغيل. البروتوكول الموسومة 35 من المركبات 40 في هذه الدراسة, في حين تم تحديد المركبات المتبقية 5 مع طريقه منحني القياسية. اقترح العمل في وقت سابق ان ظروف التفاعل شكلت الملح داخل الجزيء بين الأمين ومجموعه الفوسفات التي تثبط اشتقاق12. لم يتم تحديد ظروف رد الفعل لاشتقاق في وقت واحد من جميع المركبات 40 ؛ ومع ذلك ، البديل الحالي هو التقدير الكمي مع أسلوب منحني قياسي. وفي حين اننا أظهرنا هذه التقنية في خليط التفاعل الخالي من الخلايا ، الا انه من المحتمل أيضا ان يتم تطبيقها علي مقتطفات الخلايا الكاملة ، التالي ، يمكن ان تسمح بالتحديد الكمي المطلق لتركيزات الأيض داخل الخلايا. ولهذا التطبيق الأخير صله بمجموعه متنوعة من المسائل الهامه في مجال التكنولوجيا الاحيائيه وصحة الإنسان.

واستند الأسلوب المعروض هنا علي تقنيه سابقه (جسيست) التي تم تطبيقها علي مقتطفات الخلية الكاملة من الخميرة s. سيريفيسياي12,13. في هذه الدراسة ، قمنا بتوسيع عدد المركبات التي يمكن الكشف عنها وتحديدها كميا ، بما في ذلك جميع النيوتيودس 12 (xMP ، Xmp ، Xmp ، حيث x هو A ، C ، G و U). أضافه هذه المركبات يمكن ان يكون لها اثار بيولوجية هامه. علي سبيل المثال ، هذه النيوبوتيدس تشارك بشكل كبير في عمليات النسخ والترجمة ، والتي هي واحده من العمليات المركزية للاهتمام في تطبيقات CFPS ، وأكثر عموما المركبات الهامه في مجموعه متنوعة من الوظائف الفسيولوجية. الاضافه إلى ذلك ، تمكنا من الكشف عن حمض الخليك الذي هو المستقلب الهامه عند فحص الأيض تجاوز. ومع ذلك ، لم نكن ادراجه في الدراسة لأنه كان هناك انخفاض كبير في الاشاره في مركبات متعددة ، وخصوصا نيكوتيناميد ادينين دينيوكليوتيد خفض (NADH) والفوسفات ديكليوكليوتيد نيكوتيناميد ادينين خفضت (NADPH) عندما حمض الخليك أضيف إلى الخليط القياسي. كان حمض الخليك حدا عاليا من الكشف عن 612 μM ، التالي في هذه المستويات العالية كان لها تاثير سلبي علي إشارات الأيض الأخرى. وعلي الرغم من ذلك ، لا يزال يمكن الكشف عن حمض الخليك وكميتها في عينات من خلال خلق منحني قياسي مع حمض الخليك فقط في القارورة. وكان حمض الخليك م/ض قيمه 134.0 ، والاحتفاظ بالوقت من 5.78 دقيقه ، ومجموعه خطيه من 612 μM إلى 5000 μM (R2 = 0.986) عند الموسومة مع 12ج-الانيلين. لم الأيض المتبقية لا يغير اشاره أيون بعضها البعض وتمثل خليط شامل لتوصيف الأيض CFPS. يقتصر البروتوكول المعروض هنا علي نواتج الأيض المشاركة في استقلاب الكربون المركزي والطاقة. التالي ، فان الطريقة الحالية غير قادره علي قياس وفره المستقلب من المسارات الأخرى التي قد تكون ذات اهميه ، مثل الأحماض الدهنية واستقلاب الأحماض الامينيه.

معا ، وضعنا بروتوكولا سريعا وقويا لتوصيف والتقدير الكمي المطلق للمركبات 40 المشاركة في تحلل الجلوكوز ، والمسار الفوسفات البنتوز ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة ، وتجديد العامل المساعد في cfps ردود الفعل. الطريقة تعتمد علي المعايير الداخلية الموسومة مع 13ج-الانيلين ، في حين تم الموسومة العينة مع 12ج-الانيلين. وقد ساعدت المعايير الداخلية ومركبات العينة علي التخلص من اثار القمع الأيوني التي مكنت من القياس الدقيق لنواتج الأيض الفردية في خلائط المستقلب المعقدة. حددنا ما مجموعه 40 المركبات (41 ، إذا بما في ذلك حمض الخليك) التي يمكن الكشف عنها وتحديدها كميا في خليط رد فعل خاليه من الخلايا ؛ بيد انه يمكن زيادة توسيع قائمه نواتج الأيض وتعديلها باتجاه عمليه الاهتمام البيوكيميائية الخاصة. التالي ، فان الأسلوب يوفر نهجا قويا ودقيقا لتوصيف الأيض خاليه من الخلايا ، والتي من المحتمل ان تكون حاسمه لتحسين الغلة والانتاجيه وكفاءه الطاقة من العمليات الخالية من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

تم دعم العمل الموصوف من قبل المركز علي فيزياء استقلاب السرطان من خلال الجائزة رقم 1U54CA210184-01 من المعهد الوطني للسرطان (https://www.cancer.gov/). المحتوي هو فقط مسؤوليه المؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة. ولم يكن لدي الممولين اي دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، واتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو اعدادها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Tags

الكيمياء الحيوية ، الإصدار 152 ، تخليق البروتين الخالي من الخلايا ، اللوني السائل-قياس الطيف الكتلي ، الوسم الانيلين ، الكربون المركزي ، استقلاب الطاقة ، المعيار الداخلي ، الشبكة الايضيه ، وضع العلامات علي النظائر
التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S.,… More

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter