Summary
Ici, nous présentons un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans le métabolisme central de carbone et d'énergie dans les réactions de synthèse de protéine sans cellules. Le mélange de synthèse sans cellules est dérivé avec de l'aniline pour une séparation efficace à l'aide d'une chromatographie liquide en phase inversée, puis quantifié par spectrométrie de masse à l'aide de normes internes étiquetées isotopiques.
Abstract
La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une technologie émergente dans les systèmes et la biologie synthétique pour la production in vitro de protéines. Toutefois, si le SCFP veut aller au-delà du laboratoire et devenir une technologie de fabrication répandue et standard juste à temps, nous devons comprendre les limites de performance de ces systèmes. Vers cette question, nous avons développé un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d'acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération de cofactor dans les réactions de CFPS. La méthode utilise des normes internes étiquetées avec 13C-aniline, tandis que les composés de l'échantillon sont dérivés de 12C-aniline. Les normes internes et l'échantillon ont été mélangés et analysés par spectrométrie de masse de chromatographie liquide de phase inversée (LC/MS). La co-élution des composés a éliminé la suppression d'ion, permettant la quantification précise des concentrations de métabolites au-dessus de 2-3 ordres de grandeur où le coefficient moyen de corrélation était 0.988. Cinq des quarante composés n'ont pas été étiquetés avec de l'aniline, cependant, ils ont été encore détectés dans l'échantillon DEPFC et quantifiés avec une méthode standard de courbe. La course chromatographique prend environ 10 minutes à compléter. Pris ensemble, nous avons mis au point une méthode rapide et robuste pour séparer et quantifier avec précision 40 composés impliqués dans le SPFC en un seul lcl/MS. La méthode est une approche complète et précise pour caractériser le métabolisme sans cellules, de sorte qu'en fin de compte, nous pouvons comprendre et améliorer le rendement, la productivité et l'efficacité énergétique des systèmes sans cellules.
Introduction
La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une plate-forme prometteuse pour la fabrication de protéines et de produits chimiques, une application traditionnellement réservée aux cellules vivantes. Les systèmes sans cellules sont dérivés d'extraits de cellules brutes et éliminent les complications associées à la croissance cellulaire1. En outre, le SCFP permet un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans interférence d'une paroi cellulaire. Cependant, il n'y a pas eu de compréhension fondamentale des limites de rendement des processus sans cellules. Les méthodes à haut débit pour la quantification des métabolites sont précieuses pour la caractérisation du métabolisme et sont essentielles pour la construction de modèles de calculmétaboliques 2,3,4. Les méthodes courantes utilisées pour déterminer les concentrations de métabolites comprennent la résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopie à infrarouge transformateur (FT-IR) de Fourier, les essais à base d'enzymes et la spectrométrie de masse (MS)5,6,7 ,8. Cependant, ces méthodes sont souvent limitées par leur incapacité à mesurer efficacement plusieurs composés à la fois et nécessitent souvent une taille d'échantillon supérieure aux réactions typiques sans cellules. Par exemple, les essais à base d'enzymes ne peuvent souvent être utilisés que pour quantifier un seul composé dans une course, et sont limités lorsque la taille de l'échantillon est petite, comme dans les réactions de synthèse des protéines sans cellules (généralement exécuté sur une échelle de 10-15 L). Pendant ce temps, la RMN exige une forte abondance de métabolites pour la détection et la quantification5. À l'égard de ces lacunes, les méthodes de chromatographie en tandem avec la spectrométrie de masse (LC/MS) offrent plusieurs avantages, y compris une sensibilité élevée et la capacité de mesurer plusieurs espèces simultanément9; cependant, la complexité analytique augmente considérablement avec le nombre et la diversité des espèces mesurées. Il est donc important de développer des méthodes qui réalisent pleinement le potentiel de haut débit des systèmes LC/MS. Les composés d'un échantillon sont séparés par chromatographie liquide et identifiés par spectrométrie de masse. Le signal du composé dépend de sa concentration et de son efficacité d'ionisation, où l'ionisation peut varier d'un composé à l'autre et peut également dépendre de la matrice de l'échantillon.
Atteindre la même efficacité d'ionisation entre l'échantillon et les normes est un défi lorsque vous utilisez LC/MS pour quantifier les analytes. En outre, la quantification devient plus difficile avec la diversité des métabolites en raison de la division du signal et de l'hétérogénéité dans l'affinité des protons et la polarité10. Enfin, la matrice de co-élutation de l'échantillon peut également affecter l'efficacité de l'ionisation des composés. Pour résoudre ces problèmes, les métabolites peuvent être dérivés chimiquement, ce qui augmente la résolution et la sensibilité de séparation par les systèmes LC/MS, tout en diminuant simultanément le fractionnement du signal dans certains cas10,11. La dérivation chimique fonctionne en étiquetant des groupes fonctionnels spécifiques de métabolites pour ajuster leurs propriétés physiques comme la charge ou l'hydrophobicité pour augmenter l'efficacité de l'ionisation11. Divers agents de marquage peuvent être utilisés pour cibler différents groupes fonctionnels (p. ex. amines, hydroxyles, phosphates, acides carboxyliques, etc.). L'aniline, l'un de ces agents de dérivation, cible plusieurs groupes fonctionnels à la fois, et ajoute un composant hydrophobe dans les molécules hydrophiles, augmentant ainsi leur résolution de séparation et le signal12. Pour faire face à l'effet de suppression des ions de la matrice co-étui, Yang et ses collègues ont mis au point une technique basée sur l'étiquetage de la technologie standard interne spécifique au groupe (GSIST) lorsque les normes sont étiquetées avec des isotopes aniin de 13C et mélangées à l'échantillon. 12,13. Le métabolite et la norme interne correspondante ont la même efficacité d'ionisation puisqu'ils co-éliment, et leur rapport d'intensité peut être utilisé pour quantifier la concentration dans l'échantillon expérimental.
Dans cette étude, nous avons développé un protocole pour détecter et quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d'acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération cofactorielle dans les réactions de CFPS. La méthode est basée sur l'approche GSIST, où nous avons utilisé 12C-aniline et 13C-aniline pour étiqueter, détecter et quantifier les métabolites à l'aide de LC/MS en phase inversée. La plage linéaire de tous les composés s'étendait sur 2-3 ordres de grandeur avec un coefficient de corrélation moyen de 0,988. Ainsi, la méthode est une approche robuste et précise pour interroger le métabolisme sans cellules, et peut-être des extraits de cellules entières.
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Protocol
1. Préparation des réactifs pour le marquage aniline
- Préparer une solution d'aniline de 6 M au pH 4.5. En travaillant dans une hotte, combiner 550 l d'aniline avec 337,5 l d'eau de qualité LCMS et 112,5 l d'acide chlorhydrique (HCl) de 12 M dans un tube de centrifugeuse. Bien Vortex et conserver à 4 oC.
REMARQUE : L'aniline peut être stockée à 4 oC pendant 2 mois.
CAUTION: L'aniline est très toxique et doit être travaillé avec dans un capot de fumée. L'acide chlorhydrique est très corrosif - Préparer une solution d'aniline 6 M 13C au pH 4.5. Mélanger 250 mg de 13C6-aniline avec 132 l d'eau et 44 oL de 12 M HCl. Vortex bien et stocker à 4 oC.
- Préparer 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide hydrochlorure (EDC). Dissoudre 2 mg d'EDC dans 10 l'eau pour chaque échantillon à étiqueter et vortex bien.
REMARQUE : La solution EDC doit être préparée le jour même de la réaction. EDC agit comme catalyseur pour la dérivation des composés à l'aniline12.
2. Préparation des normes
- Faire des solutions de stock séparées de tous les composés dissous dans l'eau de qualité LC/MS (tableau 1).
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Préparation de la solution de stock standard interne
- Combinez tous les composés à l'exception du dinucleotide de nicotinamide adenine (NAD), de la nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), du dinucleotide d'adénine de flavine (FAD), de la coenzyme acétyle A (ACA) et du glycérol 3-phosphate (Gly3P), avec les volumes appropriés à créer une solution de stock de 2 mM de tous les composés.
- Combinez NAD, NADP, FAD, ACA et Gly3P avec les volumes appropriés pour créer une solution de stock de 2 mM.
3. Préparation de l'échantillon (Figure 1)
- Étancher et précipiter les protéines dans une réaction de synthèse des protéines sans cellules en ajoutant un volume égal d'éthanol à 100% glacé à la réaction. Centrifuger l'échantillon à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -80 oC à ce stade et analysés ultérieurement
4. Réaction d'étiquetage
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Échantillon d'étiquetage avec 12solutions C-aniline
- Transférer 6 lL d'échantillon dans un nouveau tube de centrifugeuse et porter le volume à 50 l avec del'eau.
REMARQUE : La taille de l'échantillon de volume peut dépendre de la réaction spécifique du SPFC. - Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
- Ajouter 5 ll de 12c-aniline solution.
REMARQUE : La solution d'aniline se sépare en deux phases. Bien mélanger avant d'ajouter à la réaction. - Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
- Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de triéthylamine (TEA) à la réaction dans un capot de fumée.
REMARQUE : La triéthylamine soulève le pH de la solution qui arrête la réaction de marquage aniline et stabilise les composés.
CAUTION: La triéthylamine est toxique et provoque une irritation des yeux et des voies respiratoires. - Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
- Transférer 6 lL d'échantillon dans un nouveau tube de centrifugeuse et porter le volume à 50 l avec del'eau.
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Étiquetage des normes internes avec une solution 13C-aniline
- Diluer la solution de stock interne à 80 M avec un volume final de 50 L.
REMARQUE : La concentration des normes internes peut être ajustée aux niveaux proches de l'échantillon expérimental. - Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
- Ajouter 5 ll de 13c-aniline solution.
- Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
- Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de TEA à la réaction dans un capot de fumée.
- Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
- Diluer la solution de stock interne à 80 M avec un volume final de 50 L.
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Combinaison de normes internes étiquetées et d'échantillons étiquetés
- Mélanger 25 'L de 12échantillons étiquetés C-aniline avec 25 'L de 13C-aniline étiquetés standard.
- Transférer dans une fiole auto-échantillonneuse et analyser par la procédure LC/MS.
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Création d'une courbe standard pour les métabolites non étiquetés
- Solution de stock diluée de métabolites non étiquetés (NAD, NADP, FAD, ACA et Gly3P) à des concentrations finales de 320 M, 80 M, 20 et 5 M avec un volume de 50 L.
- Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
- Ajouter 5 ll de 12c-aniline solution.
- Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
- Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de TEA à la réaction dans un capot de fumée.
- Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
- Transférer le supernatant sur une fiole auto-échantillonneuse et analyser par la procédure LC/MS.
REMARQUE : Les métabolites non étiquetés suivent la même procédure que l'échantillon pour reproduire la matrice d'échantillon afin de maintenir l'efficacité similaire d'ionisation.
5. Configuration de la procédure LC/MS
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Préparation des solvants
- Préparer une solution aqueuse tri-butylamine (TBA) de 5 mM ajustée au pH 4,75 avec de l'acide acétique.
REMARQUE: TBA dans la phase mobile aide les analytes à atteindre une bonne résolution et la séparation14. - Préparer 5 mM TBA en acetonitrile (ACN).
- Préparer le solvant de lavage avec 5% d'eau et 95% D'ACN.
- Préparer le solvant de purge avec 95% d'eau et 5% D'ACN.
- Préparer une solution aqueuse tri-butylamine (TBA) de 5 mM ajustée au pH 4,75 avec de l'acide acétique.
- Configuration des conditions de SP
- Régler le spectromètre de masse en mode ion négatif avec une température de sonde de 520 oC, une tension capillaire négative de -0,8 kV, une tension capillaire positive de 0,8 kV, et régler le logiciel pour acquérir des données à 5 points/s.
- Définir des enregistrements d'ions sélectionnés (SIR) pour chaque métabolite avec des tensions de cône spécifiées et des valeurs de masse sur charge (m/z). Voir tableau 1.
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Initialisation de LC/MS selon les instructions du fabricant
- Lignes de solvant de premier ordre dans le gestionnaire de solvant pendant 3 min.
- Solvant de lavage de premier choix (5 % d'eau, 95 % D'ACN) et solvant de purge (95 % d'eau, 5 % D'ACN) pendant 15 s pendant 5 cycles.
- Définir le gestionnaire de l'échantillon à 10 oC.
- Installez une colonne C18 (1,7 m, 2,1 mm x 150 mm) et initialisez la colonne avec 100 % ACN à 0,3 ml/min pendant 10 min.
- Conditionner la colonne à 95 % d'eau et 5 % d'ACN à 0,3 ml/min pendant 10 min avant d'introduire des solvants munis de tampons.
- Conditionner la colonne à 95 % de solvant A (5 mM TBA aqueuse, pH 4,75) et 5 % de solvant B (5 mM TBA en ACN) à 0,3 ml/min pendant 10 min.
- Mettre en place un protocole de gradient avec l'élution à partir de 95% solvant A et 5% solvant B, porté à 70% solvant B en 10 min, porté à 100% solvant B en 2 min et maintenu à 100% solvant B pendant 3 min. Retour aux conditions initiales (95% solvant A , 5% solvant B) sur 1 min et maintenez pendant 9 min pour rééquilibrer la colonne.
- Conditionner la colonne avec le protocole de gradient 3 fois avant toute injection sur la colonne.
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Échantillon d'injection et normes
- Injecter 5 ll de l'échantillon dans la colonne et acquérir les intensités ionnées m/z appropriées pour l'échantillon marqué par 12C-aniline.
- Injectez à nouveau 5 ll d'un même échantillon, mais cette fois-ci acquièrent les intensités ionm/z pour les 13normes étiquetées C-aniline.
REMARQUE : Notre système LC/MS n'est pas en mesure d'acquérir des intensités de 12C et 13C m/z aux fenêtres de temps SIR spécifiées, car il y a trop de données à acquérir dans la fenêtre de temps spécifiée. Par conséquent, nous injectons le même échantillon deux fois. - Injectez des normes de métabolites non étiquetées de la plus faible concentration à la plus élevée et enregistrez les intensités d'ion m/z appropriées.
6. Quantification
- Création de la méthode Export
- Dans le logiciel d'acquisition de données, sélectionnez Fichier 'gt; Nouvelle Méthode 'gt; Méthode d'exportation.
- Spécifiez un nom de fichier, tel que AnilineTagging-Date.
- Vérifiez le fichier EXPORT ASCII et choisissez un répertoire pour exporter le fichier texte à.
- Dans le typede rapport , sélectionnez Résumé par tous.
- Dans Delimiters, pour Colonne sélectionnez un ,. Pour Row, sélectionnez [cr][si].
- Dans le tableau, sélectionnez Export, puis Modifier table pour inclure SampleName, Area, Hauteur, Montant et Unités.
- Enregistrer la méthode d'exportation.
- Quantifier les métabolites avec des normes internes à l'aide d'un logiciel d'acquisition de données
- Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'exécution LC/MS correspondante et sélectionnez Afficher sous le titre de 'gt; Channels.
- Sélectionnez tous les canaux SIR pour les 13normes internes C-aniline d'une injection, clic droit et sélectionnez Examen.
- Si la fenêtre de mise en page de la méthode de traitement LC n'apparaît pas automatiquement, allez voir la mise en pagede la méthode de traitement .
- Dans Processing Method Layout, allez à l'onglet Intégration et configurez ApexTrack comme algorithme.
- Aller à l'onglet de lissage et définir le type à moyen et le niveau de lissage à 13.
REMARQUE : Tout niveau de lissage peut être sélectionné, à la fois qu'il est uniforme sur tous les échantillons. - Dans l'onglet MS Channel, désiblisez le traitement MS 3D .
- Dans la fenêtre du canal SIR, intégrer chaque pic, un canal à la fois. Une fois qu'un pic est intégré, rendez-vous sur Options et les détails du pic seront remplis dans l'onglet Composants. Changez le nom de pointe pour le nom composé correspondant.
- Une fois que tous les canaux SIR ont été évalués, enregistrez la méthode de traitement et fermez la fenêtre.
- Sélectionnez tous les canaux SIR de l'échantillon 13C-aniline et 12C-aniline étiquetés, cliquez à droite et sélectionnez Process.
- Cochez la case Processus, sélectionnez Utilisez la méthode de traitement spécifiéeet choisissez la méthode de traitement qui vient d'être enregistrée. Cochez également la case Export, sélectionnez Utilisez la méthode d'exportation spécifiée et choisissez la méthode d'exportation enregistrée créée plus tôt. Cliquez sur OK.
- Ouvrez le fichier texte exporté avec Excel et calculez la concentration du composé inconnu à l'aide de :
où Cx,i est la concentration de l'échantillon inconnu pour le métabolite i, Ax,i est la zone intégrée du métabolite inconnu i, Unstd,i est la zone intégrée de la norme interne de métabolite i, Cstd, est le concentration de la norme interne de métabolite i, et D est le facteur de dilution.
- Quantifier les métabolites non étiquetés avec courbe standard
- Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'exécution LC/MS correspondante et sélectionnez Afficher sous le titre de 'gt; Channels.
- Sélectionnez tous les canaux SIR pour les normes non étiquetées d'une injection, clic droit et sélectionnez Examen.
- Si la fenêtre de mise en page de la méthode de traitement LC n'apparaît pas automatiquement, allez voir la mise en pagede la méthode de traitement .
- Dans La mise en page des méthodes de traitement, allez à l'onglet Intégration et configurez ApexTrack comme algorithme.
- Aller à l'onglet de lissage et définir le type à moyen et le niveau de lissage à 13.
REMARQUE : Tout niveau de lissage peut être sélectionné, à la fois qu'il est uniforme sur tous les échantillons. - Dans l'onglet MS Channel, désiblisez le traitement MS 3D .
- Dans la fenêtre du canal SIR, intégrer chaque pic, un canal à la fois. Une fois qu'un pic est intégré, rendez-vous sur Options et les détails du pic seront remplis dans l'onglet Composants. Changez le nom de pointe pour le nom composé correspondant.
- Une fois que tous les canaux SIR ont été évalués, enregistrez la méthode de traitement et fermez la fenêtre.
- Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'ensemble d'échantillons et sélectionnez L'échantillon Alter.
- Sélectionnez Montant dans la nouvelle fenêtre.
- Sélectionnez la copie de la méthode Processus et choisissez la méthode de processus qui vient d'être enregistrée.
- Entrez la concentration de chaque métabolite pour chaque flacon et entrez l'unité comme 'lt;M pour chaque composant (ou l'unité correspondante) et sélectionnez OK.
- Sélectionnez l'ensemble d'échantillons à nouveau, cliquez à droite, Afficher comme 'gt; Canaux.
- Sélectionnez tous les canaux SIR des métabolites non étiquetés pour les normes, cliquez à droite et sélectionnez Processus.
- Cochez la case Processus et choisissez La méthode de traitement spécifiée . Sélectionnez la méthode de traitement appropriée et cliquez sur OK.
- Sélectionnez les canaux SIR pour tous les métabolites non étiquetés pour les échantillons, cliquez à droite et sélectionnez Processus.
- Cochez la case Processus, sélectionnez Utilisez la méthode de traitement spécifiée et choisissez la méthode de traitement qui vient d'être enregistrée. Cochez également la case Export, sélectionnez Utilisez la méthode d'exportation spécifiée et choisissez la méthode d'exportation enregistrée créée plus tôt. Cliquez OK.
- Quantifier les métabolites non étiquetés avec la courbe standard et exporter les résultats vers un fichier texte vers l'annuaire spécifié.
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Representative Results
Comme preuve de concept, nous avons utilisé le protocole pour quantifier les métabolites dans un système CFPS basé sur E. coli exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). La réaction du SPFC (14 L) a été éteinte et déprotéinée avec de l'éthanol. L'échantillon du SPFC a ensuite été étiqueté avec 12C-aniline, tandis que les normes ont été étiquetées avec 13C-aniline. L'échantillon et les normes étiquetés ont ensuite été combinés et injectés dans le LC/MS (figure 1). Le protocole a détecté et quantifié 40 métabolites impliqués dans le métabolisme central du carbone et de l'énergie en utilisant des normes internes, tandis qu'une courbe standard pour 5 des métabolites qui n'ont pas été étiquetés avec de l'aniline a également été développée (figure 2). Les métabolites divers impliqués dans ces voies étaient une classe des sucres phosphorylés, des acides phosphocarboxyliques, des acides carboxyliques, des nucléotides, et des cofactors. La dérivatisation avec l'aniline a introduit une moiétoy hydrophobe dans les molécules hydrophiles qui a facilité une séparation plus efficace utilisant la chromatographie de phase inversée12. En outre, la méthode a permis la séparation des paires structurales d'isomère telles que le glucose 6-phosphate et le fructose 6-phosphate dans une seule course de LC/MS. Le rapport de masse sur charge (m/z) de chaque composé et le temps de rétention ont été identifiés avant l'expérience en injectant 1 mM d'un composé à la fois et en comparant le spectre de masse au blanc (tableau 1).
La limite de détection et l'étendue de la linéarité pour tous les composés ont été estimées en produisant une courbe standard qui variait de 0,10 m à 400 M(tableau 2). Le coefficient de corrélation moyen (R2) pour tous les composés était de 0,988 et la plupart des composés avaient une plage linéaire de 3 ordres de magnitude. Trois composés ont eu des effets notables de saturation, particulièrement l'alpha-ketoglutarate qui a eu une gamme linéaire de 0.1 à 25 -M. L'isocitrate et le citrate ont également eu des effets de saturation au-dessus de 100 'M.
Figure 1 : Schéma de flux de travail pour le marquage aniline. La réaction de synthèse des protéines sans cellules est déprotéinée et étiquetée avec 12C-aniline, tandis qu'un mélange de stock standard est étiqueté avec 13C-aniline. Les deux mélanges sont ensuite mélangés à un rapport volumétrique 1:1 et analysés par LC/MS. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Chromatogrammes d'ion sélectionnés superposés pour 40 métabolites. Chromatogramme de masse à partir d'une seule course LC/MS d'un mélange standard de 40 m de 40 métabolites. Les pics ont été identifiés par leur temps de rétention et leurs valeurs m/z pour chaque composé. Les noms composés complets et leurs abréviations sont énumérés dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nombre de pointe | Métabolite | abréviation | ID KEGG | Temps de rétention (min) | 12C m/z | 13C m/z | m/z non label | Cv | Espèces de SP | |
| 1 | Glycérol 3-phosphate | Gly3P Gly3P | C00093 (en) | 3.85 | 153 | 10 | M - H2O - H | |||
| 2 | Nicotinamide adenine dinucleotide | Nad | C00003 (en) | 3.96 | 698 | 10 | M et Cl et H | |||
| 3 | glucose | Glc | C00031 (en) | 4.06 | 289.9 | 296 | 15 | M et A et Cl - H | ||
| 4 | Sedoheptulose 7-phosphate | S7P (en) | C05382 (en) | 5.41 | 364 | 370 | 10 | M et A et H | ||
| 5 | Fructose 6-phosphate | F6P (F6P) | C00085 (en) | 5.48 | 334 | 340 | 10 | M et A et H | ||
| 6 | Monophosphate de guanosine | Gmp | C00144 (en) | 5.57 | 437.05 | 443 | 10 | M et A et H | ||
| 7 | Ribulose 5-phosphate | RL5P RL5P | C00199 (en) | 5.58 | 304 | 310 | 10 | M et A et H | ||
| 8 | Monophosphate de cytidine | Cmp | C00055 (en) | 5.59 | 397.09 | 403 | 10 | M et A et H | ||
| 9 | Lactate | BAC | C00186 (en) | 5.77 | 164.05 | 170 | 10 | M et A et H | ||
| 10 | Monophosphate d'adénosine | a | C00020 (en) | 5.85 | 421.1 | 427.1 | 10 | M et A et H | ||
| 11 | Monophosphate d'uridine | Ump | C00105 (en) | 5.88 | 398.07 | 404 | 10 | M et A et H | ||
| 12 | Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Nadp | C00006 (en) | 6.39 | 724 | 10 | M - H2O - H | |||
| 13 | 3-Acide phosphoglycérique | 3PG (en) | C00197 (en) | 6.63 | 242 | 248.06 | 15 | M et A - H2O - H | ||
| 14 | Diphosphate de cytidine | Cdp | C00112 (en) | 6.72 | 477 | 483 | 10 | M et A et H | ||
| 15 | Guanosine diphosphate | Pib | C00035 (en) | 6.87 | 517 | 523 | 10 | M et A et H | ||
| 16 | Adénosine diphosphate | Adp | C00008 (en) | 6.94 | 501 | 507 | 10 | M et A et H | ||
| 17 | Diphosphate d'uridine | Udp | C00015 (en) | 6.97 | 478 | 484 | 10 | M et A et H | ||
| 18 | Flavin adenine dinucleotide | tocade | C00016 (en) | 7.03 | 784.15 | 15 | M et H | |||
| 19 | Fructose 1,6-bisphosphate | F16P (F16P) | C05378 (en) | 7.1 | 395.95 | 402.1 | 10 | M et A - H2O - H | ||
| 20 | Gluconate 6-phosphate | 6PG | C00345 (en) | 7.11 | 425.1 | 437 | 10 | M - 2A - H | ||
| 21 | Nicotinamide adenine dinucleotide réduit | Nadh | C00004 (en) | 7.23 | 633.13 | 639.08 | 10 | M - A - H2O - nicotinamide - H | ||
| 22 | Glucose 6-phosphate | G6P (G6P) | C00668 (en) | 7.32 | 409.1 | 421.1 | 10 | M - 2A - H | ||
| 23 | Ribose 5-phosphate | R5P (en) | C00117 (en) | 7.54 | 379.1 | 391.1 | 15 | M - 2A - H | ||
| 24 | Erythrose 4-phosphate | E4P (E4P) | C00279 (en) | 7.71 | 348.9 | 361 | 10 | M - 2A - H | ||
| 25 | Triphosphate de cytidine | Ctp | C00075 (en) | 7.84 | 557 | 563 | 5 | M et A et H | ||
| 26 | Guanosine triphosphate | Gtp | C00044 (en) | 7.93 | 597 | 603 | 5 | M et A et H | ||
| 27 | Oxalacite | L'OAA | C00036 (en) | 7.94 | 281 | 293 | 25 | M - 2A - H | ||
| 28 | Alpha-ketoglutarate | Akg | C00026 (en) | 7.95 | 295 | 307.1 | 15 | M - 2A - H | ||
| 29 | Triphosphate d'uridine | Utp | C00075 (en) | 7.97 | 558 | 564 | 10 | M et A et H | ||
| 30 | Adénosine triphosphate | Atp | C00002 (en) | 8.03 | 581 | 587 | 15 | M et A et H | ||
| 31 | Fumarate | FUM (FUM) | C00122 (en) | 8.09 | 265 | 277.1 | 10 | M - 2A - H | ||
| 32 | Pyruvate | Pyr | C00022 (en) | 8.09 | 162 | 168 | 25 | M et A et H | ||
| 33 | Malate | MAL (mal) | C00149 (en) | 8.09 | 283.06 | 295.15 | 10 | M - 2A - H | ||
| 34 | D-glycéraldéhyde 3-phosphate | espace | C00118 (en) | 8.09 | 319 | 331.1 | 5 | M - 2A - H | ||
| 35 | Acétyl-coenzyme A | Aca | C00024 (en) | 8.16 | 790 | 10 | M - H2O - H | |||
| 36 | Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate réduit | Nadph | C00005 (en) | 8.23 | 694.92 | 700.82 | 10 | M et A et nicotinamide | ||
| 37 | Phosphoenolpyruvate | entrain | C00074 (en) | 8.28 | 317 | 329.1 | 20 | M - 2A - H | ||
| 38 | Succinate | SUCC (En) | C00042 (en) | 8.64 | 267.07 | 279.1 | 15 | M - 2A - H | ||
| 39 | Isocitrate | ICIT (ICIT) | C00311 (en) | 10.13 | 398 | 416 | 10 | M 3A - H2O - H | ||
| 40 | Citrate | Cit | C00158 (en) | 10.46 | 416.1 | 434.06 | 20 | M 3A et H | ||
Tableau 1 : Résultats d'identification et d'étiquetage des métabolites. Le nombre de pointe correspondant de chaque composé, le temps de rétention, la valeur m/z pour les espèces non étiquetées, 12C et 13C, et les espèces de SP. MS Species, A signifie Aniline tag.
| Pic No. | Métabolite | abréviation | ID KEGG | Concentration (mM) | SD (n ' 3) | Limite de détection (M) | Limite de portée linéaire (M) | R 2 | |
| 1 | Glycérol 3-phosphate | Gly3P Gly3P | C00093 (en) | 0.377 | 0.034 | 0.1 | 400 | 0.995 | |
| 2 | Nicotinamide adenine dinucleotide | Nad | C00003 (en) | 0.052 | 0.010 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 3 | glucose | Glc | C00031 (en) | 0.002 | 0.000 | 0.1 | 400 | 0.997 | |
| 4 | Sedoheptulose 7-phosphate | S7P (en) | C05382 (en) | 0.007 | 0.000 | 0.16 | 400 | 0.988 | |
| 5 | Fructose 6-phosphate | F6P (F6P) | C00085 (en) | 0.029 | 0.004 | 0.1 | 400 | 0.986 | |
| 6 | Monophosphate de guanosine | Gmp | C00144 (en) | 0.007 | 0.001 | 0.39 | 100 | 0.992 | |
| 7 | Ribulose 5-phosphate | RL5P RL5P | C00199 (en) | 0.035 | 0.002 | 0.39 | 400 | 0.996 | |
| 8 | Monophosphate de cytidine | Cmp | C00055 (en) | 0.045 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 9 | Lactate | BAC | C00186 (en) | 2.134 | 0.048 | 0.1 | 400 | 0.988 | |
| 10 | Monophosphate d'adénosine | a | C00020 (en) | 0.020 | 0.002 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 11 | Monophosphate d'uridine | Ump | C00105 (en) | 0.021 | 0.000 | 0.1 | 100 | 0.997 | |
| 12 | Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Nadp | C00006 (en) | 0.014 | 0.002 | 0.34 | 400 | 0.950 | |
| 13 | 3-Acide phosphoglycérique | 3PG (en) | C00197 (en) | 6.125 | 0.239 | 0.1 | 100 | 0.996 | |
| 14 | Diphosphate de cytidine | Cdp | C00112 (en) | 0.202 | 0.029 | 0.39 | 400 | 0.997 | |
| 15 | Guanosine diphosphate | Pib | C00035 (en) | 0.146 | 0.027 | 1.5625 | 400 | 0.984 | |
| 16 | Adénosine diphosphate | Adp | C00008 (en) | 0.797 | 0.161 | 0.39 | 400 | 0.995 | |
| 17 | Diphosphate d'uridine | Udp | C00015 (en) | 0.212 | 0.036 | 0.39 | 400 | 0.991 | |
| 18 | Flavin adenine dinucleotide | tocade | C00016 (en) | 0.008 | 0.001 | 0.1 | 400 | 0.958 | |
| 19 | Fructose 1,6-bisphosphate | F16P (F16P) | C05378 (en) | 3.643 | 0.105 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 20 | Gluconate 6-phosphate | 6PG | C00345 (en) | 0.017 | 0.001 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 21 | Nicotinamide adenine dinucleotide réduit | Nadh | C00004 (en) | 0.063 | 0.028 | 0.39 | 100 | 0.972 | |
| 22 | Glucose 6-phosphate | G6P (G6P) | C00668 (en) | 0.046 | 0.002 | 0.1 | 400 | 0.984 | |
| 23 | Ribose 5-phosphate | R5P (en) | C00117 (en) | 0.055 | 0.005 | 0.39 | 100 | 0.999 | |
| 24 | Erythrose 4-phosphate | E4P (E4P) | C00279 (en) | 0.038 | 0.007 | 0.39 | 400 | 0.979 | |
| 25 | Triphosphate de cytidine | Ctp | C00075 (en) | 0.896 | 0.078 | 6.25 | 100 | 0.998 | |
| 26 | Guanosine triphosphate | Gtp | C00044 (en) | 0.870 | 0.109 | 6.25 | 100 | 0.993 | |
| 27 | Oxalacite | L'OAA | C00036 (en) | 0.023 | 0.008 | 0.56 | 400 | 0.997 | |
| 28 | Alpha-ketoglutarate | Akg | C00026 (en) | 0.391 | 0.020 | 0.1 | 25 | 0.979 | |
| 29 | Triphosphate d'uridine | Utp | C00075 (en) | 0.845 | 0.092 | 1.5625 | 400 | 0.998 | |
| 30 | Adénosine triphosphate | Atp | C00002 (en) | 1.557 | 0.188 | 1.5625 | 400 | 0.991 | |
| 31 | Fumarate | FUM (FUM) | C00122 (en) | 0.576 | 0.100 | 1.5625 | 100 | 0.999 | |
| 32 | Pyruvate | Pyr | C00022 (en) | 5.813 | 0.804 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 33 | Malate | MAL (mal) | C00149 (en) | 2.548 | 0.269 | 0.1 | 400 | 0.991 | |
| 34 | D-glycéraldéhyde 3-phosphate | espace | C00118 (en) | 2.194 | 0.367 | 0.1 | 100 | 0.974 | |
| 35 | Acétyl-coenzyme A | Aca | C00024 (en) | 0.196 | 0.044 | 0.1 | 100 | 0.991 | |
| 36 | Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate réduit | Nadph | C00005 (en) | 0.006 | 0.010 | 0.14 | 100 | 0.990 | |
| 37 | Phosphoenolpyruvate | entrain | C00074 (en) | 3.442 | 0.345 | 0.1 | 100 | 0.962 | |
| 38 | Succinate | SUCC (En) | C00042 (en) | 5.683 | 0.573 | 0.1 | 320 | 0.999 | |
| 39 | Isocitrate | ICIT (ICIT) | C00311 (en) | 0.003 | 0.006 | 0.39 | 100 | 0.998 | |
| 40 | Citrate | Cit | C00158 (en) | 0.002 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.981 | |
Tableau 2 : Quantification des métabolites dans un échantillon représentatif du SPFC. La concentration de chaque métabolite et l'écart type. Limite de détection, gamme de linéarité et coefficient de corrélation identifié à partir des courbes standard.
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Discussion
Les systèmes sans cellules n'ont pas de paroi cellulaire, il y a donc un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans avoir besoin d'une préparation complexe de l'échantillon. Cependant, très peu de travail a été fait pour développer des protocoles complets et robustes pour interroger quantitativement les systèmes de réaction sans cellules. Dans cette étude, nous avons développé une méthode rapide et robuste pour quantifier les métabolites dans les mélanges de réaction sans cellules et potentiellement dans des extraits de cellules entières. La quantification individuelle des métabolites dans les mélanges complexes, tels que ceux trouvés dans les réactions sans cellules, ou les extraits de cellules entières, est difficile pour plusieurs raisons. La diversité chimique est au cœur de ces raisons. La gamme de groupes fonctionnels présents simultanément dans ces mélanges (p. ex. acides carboxyliques, amines, phosphates, hydroxyles, etc.) augmente considérablement la complexité analytique. Pour contourner cela, nous avons utilisé une méthode de dérivatisation aniline en combinaison avec des normes internes de 13C pour introduire des composants hydrophobes dans les mélanges de métabolites. En utilisant cette méthode, nous avons solidement détecté et quantifié 40 métabolites dans une réaction sans cellules dans une seule course LC/MS. Le protocole a marqué 35 des 40 composés de cette étude, tandis que les 5 composés restants ont été quantifiés avec une méthode de courbe standard. Des travaux antérieurs ont suggéré que les conditions de réaction formaient un sel intramoléculaire entre le groupe d'amine et de phosphate qui inhibait la dérivation12. Les conditions de réaction n'ont pas été identifiées pour la dérivation simultanée de tous les 40 composés ; cependant, l'alternative actuelle est la quantification avec une méthode de courbe standard. Tandis que nous avons démontré cette technique dans un mélange de réaction sans cellules, elle pourrait également probablement être appliquée aux extraits entiers de cellules, permettant ainsi potentiellement la quantification absolue des concentrations intracellulaires de métabolites. Cette dernière application est pertinente pour une variété de questions importantes en biotechnologie et en santé humaine.
La méthode présentée ici était basée sur une technique précédente (GSIST) qui a été appliquée à des extraits de cellules entières de la levure S. cerevisiae12,13. Dans cette étude, nous avons augmenté le nombre de composés qui pourraient être détectés et quantifiés, y compris les 12 nucléotides (xMP, xDP, xTP, où x est A, C, G et U). L'ajout de ces composés pourrait avoir d'importantes implications biologiques. Par exemple, ces nucléotides sont fortement impliqués dans les processus de transcription et de traduction, qui est l'un des processus centraux d'intérêt dans les applications DU SCFP, et plus généralement les composés sont importants dans une variété de fonctions physiologiques. En outre, nous avons pu détecter l'acide acétique qui est un métabolite important en examinant le métabolisme de débordement. Cependant, nous ne l'avons pas inclus dans l'étude parce qu'il y avait une réduction significative du signal dans les composés multiples, particulièrement nicotinamide adenine dinucleotide réduit (NADH) et le phosphate de dinucleotide d'adénine de nicotinamide réduit (NADPH) quand l'acide acétique a été ajouté au mélange standard. L'acide acétique avait une limite élevée de détection de 612 M, donc à ces niveaux élevés, il a eu un effet négatif sur les signaux des autres métabolites. Malgré cela, l'acide acétique peut encore être détecté et quantifié dans les échantillons en créant une courbe standard avec juste de l'acide acétique dans le flacon. L'acide acétique avait une valeur m/z de 134,0, un temps de rétention de 5,78 min, et une plage linéaire de 612 M à 5000 M (R2 - 0,986) lorsqu'il est étiqueté avec 12C-aniline. Les métabolites restants n'ont pas modifié le signal ionique de l'autre et représentent un mélange complet pour caractériser le métabolisme de CFPS. Le protocole présenté ici est limité aux métabolites impliqués dans le métabolisme central du carbone et de l'énergie. Ainsi, la méthode actuelle est incapable de mesurer l'abondance des métabolites à partir d'autres voies qui peuvent être d'importance, tels que l'acide gras et le métabolisme des acides aminés.
Pris ensemble, nous avons développé un protocole rapide et robuste pour la caractérisation et la quantification absolue de 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d'acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique, et la régénération de cofactor dans LE CFPS Réactions. La méthode reposait sur des normes internes étiquetées avec 13C-aniline, tandis que l'échantillon était étiqueté avec 12C-aniline. Les normes internes et les composés d'échantillon ont co-élucidé et éliminé des effets ion-suppression qui ont permis la quantification précise des métabolites individuels dans les mélanges complexes de métabolite. Nous avons identifié un total de 40 composés (41, si y compris l'acide acétique) qui peuvent être détectés et quantifiés dans un mélange de réaction sans cellules; cependant, la liste des métabolites pourrait être élargie et ajustée en fonction du processus biochimique particulier d'intérêt. Ainsi, la méthode fournit une approche robuste et précise pour caractériser le métabolisme sans cellules, ce qui est potentiellement essentiel pour améliorer le rendement, la productivité et l'efficacité énergétique des processus sans cellules.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les travaux décrits ont été soutenus par le Center on the Physics of Cancer Metabolism par le biais du prix Numéro 1U54CA210184-01 du National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/ ). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national du cancer ou des National Institutes of Health. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
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