Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

Abstract

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא טכנולוגיה מתפתחים במערכות ובביולוגיה סינתטית לייצור מתורבת של חלבונים. עם זאת, אם CFPS הולך לנוע מעבר למעבדה ולהיות מקובל וסטנדרטי רק בטכנולוגיית ייצור הזמן, אנחנו חייבים להבין את גבולות הביצועים של מערכות אלה. לקראת שאלה זו, פיתחנו פרוטוקול חזק כדי לכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה משתמשת בתקנים פנימיים המתויגים עם 13ג-אנילין, ואילו תרכובות במדגם הן ללעג עם 12ג-אנילין. הסטנדרטים הפנימיים והמדגם היו מעורבים ונותחו על-ידי כרומטוגרפיה ברמה הפוכה-ספקטרומטריה (LC/MS). שיתוף של תרכובות הדיכוי יון מסולק, המאפשר כימות מדויקת של ריכוזי מטבוליט מעל 2-3 הזמנות של גודל שבו מקדם המתאם הממוצע היה 0.988. חמישה מתוך 40 תרכובות לא היו מתוייגות עם אנילין, עם זאת, הם עדיין זוהו במדגם CFPS וכימות עם שיטת עקומה סטנדרטית. לרוץ כרומטוגרפי לוקח בערך 10 דקות להשלים. יחד, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי להפריד ומדויק לכמת 40 תרכובות מעורבות CFPS בריצה LC/MS אחת. השיטה היא גישה מקיפה ומדויקת לאפיון חילוף חומרים ללא תא, כך שבסופו של דבר, אנו יכולים להבין ולשפר את התשואה, הפרודוקטיביות ויעילות האנרגיה של מערכות ללא תא.

Introduction

סינתזה של חלבון תא (CFPS) היא פלטפורמה מבטיחה עבור ייצור של חלבונים וכימיקלים, יישום שהיה שמור באופן מסורתי עבור תאים חיים. מערכות ללא תא נגזרות מתמציות תאים גולמי ומבטלות את הסיבוכים המשויכים לצמיחת התאים1. בנוסף, CFPS מאפשר גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא הפרעה של קיר התא. עם זאת, חסרה הבנה בסיסית של מגבלות הביצועים של תהליכים ללא תא. שיטות תפוקה גבוהה עבור הקוונט מטבוליזם הם יקרי ערך לאפיון של חילוף החומרים והם קריטיים לבניית מודלים מטבולית חישובית2,3,4. שיטות נפוצות המשמשות לקביעת ריכוזי מטבוליט כוללות תהודה מגנטית גרעינית (nmr), התמרת פורייה-ספקטרוסקופיית אינפרא אדום (FT-IR), assays מבוסס אנזימים, וספקטרומטר המסה (MS)5,6,7 ,8. עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לעתים קרובות על ידי חוסר היכולת שלהם למדוד ביעילות תרכובות מרובות בבת אחת ולעתים קרובות דורשים גודל מדגם גדול יותר מאשר התגובות הרגילות ללא תא. לדוגמה, בחני המבוססת על אנזימים יכולים לעתים קרובות לשמש רק כדי לכמת מתחם אחד בהפעלה, ומוגבלים כאשר גודל המדגם קטן, כגון תגובות סינתזה של חלבון תא (בדרך כלל הפעלה בקנה מידה של 10-15 μl). בינתיים, NMR דורש שפע רב של מטבוליטים לאיתור וכימות הכמת5.  לגבי חסרונות אלה, שיטות כרומטוגרפיה במשולב עם ספקטרומטר מסה (LC/MS) מספקות מספר יתרונות, כולל רגישות גבוהה ויכולת למדוד מינים מרובים בו9; עם זאת, המורכבות האנליטית גדלה במידה ניכרת עם המספר והמגוון של המינים הנמדדים. לפיכך, חשוב לפתח שיטות הממש את פוטנציאל התפוקה הגבוהה של מערכות LC/MS. תרכובות במדגם מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית מזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. האות של המתחם תלוי הריכוז שלה ויעילות האינון, שבו האינון יכול להשתנות בין תרכובות יכול להיות גם תלוי במטריצה לדוגמה.

השגת אותו יעילות אינון בין המדגם והתקנים הוא אתגר בעת שימוש LC/MS לכמת מנתחי. עוד, הקוונפיקציה הופכת מאתגרת יותר עם גיוון מטבוליט בשל פיצול האות ו טרוגניות באהדה פרוטון וקוטביות10. לבסוף, מטריצת שיתוף הפעולה של המדגם יכול גם להשפיע על היעילות יינון של תרכובות. כדי לטפל בנושאים אלה, מטבוליטים יכול להיות לריקי כימית, להגדיל את הרזולוציה ואת הרגישות של מערכות LC/MS, ובמקביל להקטין את האות פיצול במקרים מסוימים10,11. העבודה הכימית עובד על ידי תיוג קבוצות פונקציונליות ספציפיות של מטבוליטים כדי לכוונן את המאפיינים הפיזיים שלהם כמו תשלום או hydrophobicity כדי להגדיל את יעילות יינון11. סוכני תיוג שונים יכולים לשמש כדי למקד קבוצות פונקציונליות שונות (למשל, amines, הידרוקסילס, פוספטים, חומצות קרבוקסילית וכו '). אנילין, אחד הסוכנים האלה ללעג, מטרות קבוצות פונקציונליות מרובות בבת אחת, ומוסיף רכיב הידרופובי למולקולות הידרופילית, ובכך מגדיל את רזולוציית ההפרדה שלהם ואת האות12. כדי לטפל באפקט הדיכוי המיני-מטריצות של המטריצה, יאנג ועמיתים פיתחו טכניקה המבוססת על התווית הפנימית של התקן הפנימי (GSIST) לתיוג שבו התקנים מתויגים עם 13ג אנילין איזוטופים ומעורבב עם המדגם 12,13. החומרים הפנימיים של המטאווליט והתקן הפנימי הם בעלי היעילות האינון מאז שהם שותפים, ויחס האינטנסיביות שלהם יכול לשמש לכמת את הריכוז במדגם הניסיוני.

במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול לזהות ולכמת 40 תרכובות מעורבים גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה התחדשות קופקטור ב-cfps תגובות. השיטה מבוססת על הגישה GSIST, שבו השתמשנו 12ג-אנילין ו -13ג-אנילין לתייג, לזהות, ולכמת מטבוליטים באמצעות היפוך-שלב LC/MS. הטווח הליניארי של כל התרכובות המקיפות 2-3 הזמנות של סדר גודל עם מקדם מתאם ממוצע של 0.988. לכן, השיטה היא גישה איתנה ומדויקת לחקור חילוף חומרים ללא תא, ואולי תמציות תאים שלמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים לתיוג אנילין

  1. הכינו תמיסה של 6 מטרים ב-pH 4.5. עבודה בשכונה, לשלב 550 μL של אנילין עם 337.5 μL של מים LCMS כיתה ו 112.5 μL של 12 M חומצה הידרוכלורית (HCl) בשפופרת צנטריפוגה. הבאר מערבולת ולחנות ב 4 ° c.
    הערה: אנילין יכול להיות מאוחסן ב -4 ° c במשך חודשיים.
    התראה: אנילין הוא רעיל מאוד ויש לעבוד איתו בתוך מכסה. חומצה הידרוכלורית היא מאוד מאכל
  2. להכין פתרון אנילין 6 M 13C ב-pH 4.5. לשלב 250 מ"ג של 13ג6-אנילין עם 132 μl של מים ו 44 μl של HCl 12 מ '. ומערבולת היטב ולחנות ב 4 ° c.
  3. הכינו 200 מ"ג/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-אתנוקרבודיוידאיתיההידרוכלק (EDC) פתרון. התמוססות 2 מ"ג של EDC ב 10 μL של מים עבור כל מדגם להיות מתויג ומערבולת היטב.
    הערה: הפתרון EDC צריך להיות מוכן באותו יום כמו התגובה. EDC משמש זרז ללעג של תרכובות עם אנילין12.

2. הכנת תקנים

  1. הפוך פתרונות מניות נפרדים של כל התרכובות המומסים ב-LC/MS מים כיתה (שולחן 1).
  2. הכנת פתרון מניות פנימי סטנדרטי
    1. לשלב את כל התרכובות למעט ניטינאמיד אדנוינה (NAD), הניאודאמיד אדנולין הז פוספט (nadp), הפאווין אדנין dinucleotide גאות (אופנה), מרחלקסיל co A (ACA), וגליצרול 3-פוספט (Gly3P), עם אמצעי האחסון המתאימים ל ליצור פתרון 2 מ"מ מניות של כל התרכובות.
  3. לשלב NAD, NADP, אופנה, ACA, ו Gly3P עם אמצעי האחסון המתאימים כדי ליצור פתרון 2 מ"מ מניות.

3. הכנת דגימה (איור 1)

  1. כיבוי ומזרז את החלבונים בתגובת סינתזה של חלבון ללא תא על ידי הוספת נפח שווה של קרח קר 100% אתנול לתגובה. צנטריפוגה את המדגם ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להעביר את הסופרנטאנט. לצינורית צנטריפוגה חדשה
    הערה: ניתן לאחסן דגימות ב-80 ° c בשלב זה ולנתח במועד מאוחר יותר

4. תגובת תיוג

  1. הוספת תוויות למדגם עם 12ג-תמיסה אנילין
    1. העברה 6 μL של מדגם לתוך צינור צנטריפוגה חדש ולהביא את עוצמת הקול ל 50 μL עם מים.
      הערה: גודל דגימת אמצעי אחסון עשוי להיות תלוי בתגובת CFPS הספציפית.
    2. הוסף 5 μL של 200 mg/mL EDC פתרון.
    3. הוסף 5 μL של 12C-פתרון אנילין.
      הערה: פתרון אנילין מפריד בין שני שלבים. מערבבים היטב לפני הוספת התגובה.
    4. מערבולת התגובה עם טלטול עדין עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 2 h, להסיר את הצינורות מן השייקר ולהוסיף 1.5 μL של triethylamine (תה) לתגובה במנוע.
      הערה: טריאתיאמילין מעלה את ה-pH של הפתרון העוצר את תגובת התיוג של אנילין ומייצב את התרכובות.
      התראה: טריאתילאמין רעיל וגורם לגירוי בעיניים ובדרכי הנשימה.
    6. צנטריפוגה ב 13,500 x g עבור 3 דקות.
  2. הוספת מענה לתקנים פנימיים באמצעות 13ג-פתרון אנילין
    1. לדלל פתרון מניות פנימיות כדי 80 μM עם נפח סופי של 50 μL.
      הערה: ניתן לכוונן את ריכוז התקנים הפנימיים לרמות הקרובות למדגם הנסיוני.
    2. הוסף 5 μL של 200 mg/mL EDC פתרון.
    3. הוסף 5 μL של 13ג-פתרון אנילין.
    4. מערבולת התגובה עם טלטול עדין עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 2 h, להסיר את הצינורות מן השייקר ולהוסיף 1.5 μL של תה לתגובה במנוע.
    6. צנטריפוגה ב 13,500 x g עבור 3 דקות.
  3. שילוב מתויג תקן פנימי ו מתויג לדוגמה
    1. מערבבים 25 μL של 12c-מדגם אנילין עם 25 μl של 13ג-אנילין מסומן כסטנדרט.
    2. העבר למבחנה עם דוגם אוטומטי ונתח לפי הליך LC/MS.
  4. יצירת עקומה סטנדרטית עבור מטבוליטים לא מתויגים
    1. לדלל פתרון מניות של מטבוליטים לא מתויגים (NAD, NADP, אופנה, ACA, ו Gly3P) לריכוזים הסופי של 320 μM, 80 μM, 20 μM ו-5 μM עם נפח של 50 μL.
    2. הוסף 5 μL של 200 mg/mL EDC פתרון.
    3. הוסף 5 μL של 12C-פתרון אנילין.
    4. מערבולת התגובה עם טלטול עדין עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 2 h, להסיר את הצינורות מן השייקר ולהוסיף 1.5 μL של תה לתגובה במנוע.
    6. צנטריפוגה ב 13,500 x g עבור 3 דקות.
    7. העבר supernatant לבקבוקון דוגם הרכב ולנתח על-ידי הליך LC/MS.
      הערה: מטבוליטים לא מתויגים מבצע את אותו ההליך כמו המדגם כדי לשכפל את המטריצה לדוגמה כדי לשמור על יעילות האינון דומה.

5. הכיוונון של הליך LC/MS

  1. הכנת ממיסים
    1. הכינו 5 מ"מ מימית הפתרון (יפורסם) המותאם ל-pH 4.75 עם חומצה אצטית.
      הערה: יפורסם בשלב הנייד מסייע לאנליטים להשיג רזולוציה טובה והפרדה14.
    2. הכינו 5 מ"מ משנת יפורסם ב-acetonitrile (ACN).
    3. להכין לשטוף את הממס עם 5% מים ו 95% ACN.
    4. להכין לטיהור הממס עם 95% מים ו 5% ACN.
  2. הכיוונון של תנאי MS
    1. הגדר את ספקטרומטר המסה למצב יון שלילי עם טמפרטורת החללית של 520 ° c, מתח נימי שלילי של-0.8 kV, מתח קפילר חיובי של 0.8 kV, ולהגדיר את התוכנה כדי לרכוש נתונים ב 5 נקודות/s.
    2. הגדר הקלטות יון נבחרות (SIR) עבור כל מטבוליט עם מתח חרוט שצוין והמסה על חיוב (m/z) ערכים. ראה שולחן 1.
  3. מאתחל LC/MS על פי הוראות היצרן
    1. קווי הממס העיקריים של מנהל הממס עבור 3 דקות.
    2. ממיס הממשלה לשטוף (5% מים, 95% ACN) ו לטהר את הממס (95% מים, 5% ACN) עבור 15 s עבור 5 מחזורים.
    3. הגדר את מנהל הדוגמה ל-10 ° c.
    4. התקנת סי18 (1.7 μm, 2.1 mm x 150mm) עמודה ולאתחל עמודה עם 100% ACN ב 0.3 mL/min עבור 10 דקות.
    5. מצב את העמודה ב 95% מים ו 5% ACN ב 0.3 mL/min עבור 10 דקות לפני היכרות עם ממיסים עם מאגרים.
    6. תנאי העמודה ב 95% ממס A (5mM יפורסם מימית, pH 4.75) ו 5% ממס B (5 מ"מ יפורסם ב ACN) ב 0.3 mL/min עבור 10 דקות.
    7. הגדרת פרוטוקול מעבר צבע עם הימנעות החל 95% ממס A ו 5% מומס B, העלה ל 70% הממס B ב 10 דקות, העלה 100% ממס B ב 2 דקות והחזיק ב 100% מומס B עבור 3 דקות. חזרה לתנאים הראשוניים (95% ממס A , 5% מממס B) מעל 1 דקות ולהחזיק עבור 9 דקות כדי לשחזר את העמודה.
    8. החלת העמודה באמצעות פרוטוקול מעבר הצבע 3 פעמים לפני ההזרקה על העמודה.
  4. הזרקת דגימות ותקנים
    1. הכנס 5 μL של המדגם לתוך העמודה ורכוש את העוצמות המתאימות של כוונת ה-m/z עבור המדגם של 12C-אנילין.
    2. הכנס 5 μL של אותו מדגם שוב, אך הפעם השג את עוצמות היון m/z עבור התקנים המתויגים 13C-אנילין.
      הערה: מערכת ה-LC/MS שלנו אינה מסוגלת לרכוש הן 12c ו -13כוונות מז/ת' בחלונות הזמן המצוינים של האדון, מאחר שהוא מהווה יותר מדי נתונים לרכישה בחלון הזמן שצוין. לכן, אנחנו מזריקים. את אותה דוגמית פעמיים
    3. הכנס תקני מטבוליט לא מתויגים מהריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר והקלט את עוצמות היון המתאימות של m/z.

6. כמת

  1. יצירת שיטת ייצוא
    1. בתוכנת רכישת נתונים, בחר קובץ > שיטה חדשה > שיטת ייצוא.
    2. ציין שם קובץ, כגון AnilineTagging_Date.
    3. בדוק את קובץ ASCII ייצוא ובחר ספרייה לייצא את קובץ הטקסט.
    4. בסוג דוח, בחר סיכום לפי הכל.
    5. במפרידים, עבור עמודה בחר א ,. עבור שורה, בחר [cr] [אם].
    6. בטבלה, בחר באפשרות ייצוא ולאחר מכן ערוך טבלה כדי לכלול את samplename, אזור, גובה, כמות ויחידות.
    7. שמור שיטת ייצוא.
  2. בדיקת מטבוליטים עם תקנים פנימיים באמצעות תוכנת רכישת נתונים
    1. תחת הכרטיסיה ערכות לדוגמה , לחץ לחיצה ימנית על ההפעלה LC/MS המתאימה ובחר באפשרות תצוגה כ> ערוצים.
    2. בחר את כל ערוצי SIR על 13C-הסטנדרטים הפנימיים של אנילין של זריקה אחת, לחץ לחיצה ימנית ובחר סקירה.
    3. אם חלון פריסת שיטת העיבוד של LC אינו מופיע באופן אוטומטי, עבור לתצוגה ≫ פריסת שיטות עיבוד.
    4. בעיבוד שיטה, עבור אל הכרטיסיה שילוב והגדר את apextrack כאלגוריתם.
    5. עבור אל הכרטיסיה החלקה והגדר את הסוג כממוצע ורמת ההחלקה על 13.
      הערה: ניתן לבחור כל רמת החלקה, כל עוד היא עקבית בכל הדגימות.
    6. בכרטיסיה ערוץ ms, בטל עיבוד תלת-ממד של ms .
    7. בחלון הערוץ SIR, לשלב כל שיא, ערוץ אחד בכל פעם. לאחר שהשיא משולב, עבור לאפשרויות > מילוי מהתוצאה ופרטי השיא ימולאו בכרטיסיה רכיבים . שנה את שם השיא לשם המורכב המתאים.
    8. לאחר כל ערוצי סיר כבר הוערכו, לשמור את שיטת העיבוד ולסגור את החלון.
    9. בחר את כל ערוצי SIR של 13ג-אנילין ו 12ג-אנילין מתויג לדוגמה, קליק ימני ובחר תהליך.
    10. בדוק את תיבת התהליך , בחר באפשרות השתמש בשיטת עיבוד שצוינהובחר בשיטת העיבוד שנשמרה. כמו כן, בדוק את תיבת הייצוא , בחר באפשרות השתמש בשיטת ייצוא שצוינה ובחר בשיטת הייצוא שנשמרה שנוצרה מוקדם יותר. לחץ על אישור.
    11. פתח את קובץ הטקסט המיוצא ב-Excel וחשב את הריכוז של המתחם הלא ידוע באמצעות:
      Equation 1
      כאשר Cx, אני הוא הריכוז של המדגם לא ידוע עבור מטבוליזם אני,x, אני הוא האזור המשולב של מטבוליט לא ידוע אני,std, אני הוא האזור המשולב של התקן הפנימי של מטבוליזם אני, Cstd, אני הוא ריכוז של התקן הפנימי של מטבוליט i, ו D הוא גורם הדילול.
  3. כימות מטבוליטים לא מתויגים עם עקום סטנדרטי
    1. תחת הכרטיסיה ערכות לדוגמה , לחץ לחיצה ימנית על ההפעלה LC/MS המתאימה ובחר באפשרות תצוגה כ> ערוצים.
    2. בחר את כל ערוצי SIR לתקנים לא מתויגים של זריקה אחת, לחץ לחיצה ימנית ובחר סקירה.
    3. אם חלון פריסת שיטת העיבוד של LC אינו מופיע באופן אוטומטי, עבור לתצוגה ≫ פריסת שיטות עיבוד.
    4. בפריסת שיטות עיבוד, עבור אל הכרטיסיה שילוב והגדר את apextrack כאלגוריתם.
    5. עבור אל הכרטיסיה החלקה והגדר את הסוג כממוצע ורמת ההחלקה על 13.
      הערה: ניתן לבחור כל רמת החלקה, כל עוד היא עקבית בכל הדגימות.
    6. בכרטיסיה ערוץ ms, בטל עיבוד תלת-ממד של ms .
    7. בחלון הערוץ SIR, לשלב כל שיא, ערוץ אחד בכל פעם. לאחר שהשיא משולב, עבור לאפשרויות > מילוי מהתוצאה ופרטי השיא ימולאו בכרטיסיה רכיבים . שנה את שם השיא לשם המורכב המתאים.
    8. לאחר כל ערוצי סיר כבר הוערכו, לשמור את שיטת העיבוד ולסגור את החלון.
    9. תחת הכרטיסיה ערכות לדוגמה , לחץ לחיצה ימנית על ערכת המדגם ובחר בדוגמה אלטר.
    10. בחר סכום בחלון החדש.
    11. בחרו ' עותק משיטת התהליך ' ובחרו בשיטת התהליך שנשמרה.
    12. הזן את הריכוז של כל מטבוליט לכל בקבוקון והזן את היחידה כ< μM עבור כל רכיב (או היחידה המתאימה) ובחר אישור.
    13. בחר שוב את ערכת הדגימה, לחץ לחיצה ימנית, הצג כ> ערוצים.
    14. בחר את כל ערוצי SIR של מטבוליטים לא מתויגים עבור הסטנדרטים, קליק ימני ובחר תהליך.
    15. בדוק את תיבת התהליך ובחר באפשרות השתמש בשיטת עיבוד שצוינה. בחרו בשיטת העיבוד המתאימה ולחצו על הלחצן ' אשר'.
    16. בחר ערוצים סיר עבור כל מטבוליטים לא מתויגים עבור דגימות, קליק ימני ובחר תהליך.
    17. בדוק את תיבת התהליך , בחר באפשרות השתמש בשיטת עיבוד שצוינה ובחר בשיטת העיבוד שנשמרה. כמו כן, בדוק את תיבת הייצוא , בחר באפשרות השתמש בשיטת הייצוא שצוינה ובחר בשיטת הייצוא שנשמרה שנוצרה מוקדם יותר. לחץ על אישור.
    18. לכמת את מטבוליטים לא מתויגים עם עקומת רגיל ולייצא את התוצאות לקובץ טקסט לספרייה שצוין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כהוכחה-of-קונספט, השתמשנו בפרוטוקול כדי לכמת מטבוליטים ב -E. coli מבוסס cfps מערכת המבטא חלבון פלורסנט ירוק (gfp).  התגובה CFPS (14 μL) היה מוכן ומלא עם אתנול. דגימת CFPS הייתה מתויגת עם 12ג-אנילין, ואילו התקנים תויגו עם 13ג-אנילין. המדגם והתקנים המתויגים שולבו והוזריקו לתוך ה-LC/MS (איור 1). הפרוטוקול זוהה וככמת 40 מטבוליטים מעורב בחילוף החומרים פחמן ואנרגיה מרכזית באמצעות תקנים פנימיים, בעוד עקומת סטנדרטי עבור 5 מטבוליטים שלא תויגו עם אנילין פותחה גם (איור 2). מטבוליטים מגוונים המעורבים במסלולים אלה היו מעמד של סוכרים זרחנים, חומצות פוספופקקסיליות, חומצות קרבוקסיליות, נוקלאוטידים, ו קופנים. הלעג עם אנילין הציג moiety הידרופובי למולקולות הידרופיפילית, אשר הקלה על הפרדה אפקטיבית יותר באמצעות כרומטוגרפיה של שלב היפוך12. בנוסף, השיטה אפשרה את הפרדת זוגות איזוer מבניים כגון גלוקוז 6-פוספט ו פרוקטוז 6-פוספט בריצה אחת LC/MS. היחס ההמוני של כל תרכובת בתשלום (m/z) וזמן ההחזקה זוהו לפני הניסוי על ידי הזרקת 1 מ"מ של תרכובת אחת בכל פעם והשוואת הספקטרום ההמוני לריק (טבלה 1).

המגבלה של זיהוי וטווח של יניאריות עבור כל התרכובות הוערך על ידי הפקת עקומת רגיל נע בין 0.10 μM ל 400 μM (טבלה 2). מקדם המתאם הממוצע (R2) עבור כל התרכובות היה 0.988 ורוב התרכובות היה מגוון ליניארי של 3-הזמנות של גודל. שלושה תרכובות היו השפעות הרוויה הבולטים, במיוחד אלפא-בקטטראט אשר היה טווח ליניארי מ 0.1 μM עד 25 μM. Isocitrate ו ציטראט גם השפעות רוויה מעל 100 μM.

Figure 1
איור 1: סכמטית של זרימת עבודה לתיוג אנילין. התגובה לסינתזה של חלבון ללא תא היא deproteinized ו מתויג עם 12c-אנילין, בעוד תערובת מלאי סטנדרטית מתויגת עם 13ג-אנילין. שני התערובות מעורבבים אז ביחס נפחי 1:1 ונותחו על ידי LC/MS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כרומטוגרם יון חופפים שנבחרו עבור 40 מטבוליטים. כרומוטוגרמה מסה מתוך מפעל יחיד LC/MS של 40 μM שילוב סטנדרטי של 40 מטבוליטים. פסגות זוהו על ידי זמן ההחזקה שלהם ואת ערכי m/z עבור כל תרכובת. שמות מורכבים מלאים והקיצורים שלהם רשומים בטבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מספר שיא מטבוליט קיצור מזהה קג'ה זמן שמירה (מזערי) 12C m/z 13C m/z לא מותג ' m/z CV מינים של MS
1 גליצרול 3-פוספט Gly3P C00093 3.85 153 10 M – H2O – H
2 ניקולט אדנואמיד NAD C00003 3.96 698 10 M + קלרנית – H
3 גלוקוז מגדל הפעמון C00031 4.06 289.9 296 15 M + A + קלרנית-H
4 סדוהפטופסיד 7-פוספט S7P C05382 5.41 364 370 10 M + A – H
מיכל 5 פרוקטוז 6-פוספט F6P C00085 5.48 334 340 10 M + A – H
6 Guanosine monophosphate GMP C00144 5.57 437.05 443 10 M + A – H
7 הריבואבד 5-פוספט RL5P C00199 5.58 304 310 10 M + A – H
8 קיטידיין monophosphate CMP C00055 5.59 397.09 403 10 M + A – H
9 לקטט LAC C00186 5.77 164.05 170 10 M + A – H
10 אדנוזין monophosphate כח C00020 5.85 421.1 427.1 10 M + A – H
11 אורידיין monophosphate ופט C00105 5.88 398.07 404 10 M + A – H
12 ניקולט אדטינואמיד . אני מבין C00006 6.39 724 10 M-H2O – H
13 3-חומצה פוספוליגליתית 3PG C00197 6.63 242 248.06 15 M + A – H2O – H
14 קיטידין דיפוספט שב C00112 6.72 477 483 10 M + A – H
15 Guanosine דיפוספט תוצר C00035 6.87 517 523 10 M + A – H
16 אדנוזין דיפוספט ADP C00008 6.94 501 507 10 M + A – H
17 אורידיין דיפוספט UDP C00015 6.97 478 484 10 M + A – H
18 אדנונין תחביב C00016 7.03 784.15 15 M – H
19 פרוקטוז 1, 6-ביספושונאים F16P C05378 7.1 395.95 402.1 10 M + A – H2O – H
20 גלוקונטה 6-פוספט 6PG C00345 7.11 425.1 437 10 M + 2A – H
21 ניטינאואמיד אדנין NADH C00004 7.23 633.13 639.08 10 M + A + H2O – ניטינאמיד – H
22 גלוקוז 6-פוספט G6P C00668 7.32 409.1 421.1 10 M + 2A – H
23 ריבוז 5-פוספט R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 M + 2A – H
24 אריתרופוייז 4-פוספט E4P C00279 7.71 348.9 361 10 M + 2A – H
25 ציטידיין טריפוספט CTP C00075 7.84 557 563 מיכל 5 M + A – H
26 Guanosine פוספט GTP C00044 7.93 597 603 מיכל 5 M + A – H
27 אוקאלאצטט אואא C00036 7.94 281 293 25 M + 2A – H
28 אלפא-כגלוטאטה מירב לארג C00026 7.95 295 307.1 15 M + 2A – H
29 אורידיין טריפוספט UTP C00075 7.97 558 564 10 M + A – H
30 אדנוזין טריפוספט ATP C00002 8.03 581 587 15 M + A – H
31 פומרטה מרעום C00122 8.09 265 277.1 10 M + 2A – H
32 פירובט מיכל האור C00022 8.09 162 168 25 M + A – H
33 ארמיטה מאל C00149 8.09 283.06 295.15 10 M + 2A – H
34 D-גליצראלדהיד 3-פוספט פער C00118 8.09 319 331.1 מיכל 5 M + 2A – H
35 אצטריל-קואנזים A ACA C00024 8.16 790 10 M – H2O – H
36 ניטינאואמיד אדנין מיכל בע C00005 8.23 694.92 700.82 10 M + A – ניטינאמיד – H
37 פוספולפירופיבט עידוד C00074 8.28 317 329.1 20 M + 2A – H
38 סוסואט היכל הג C00042 8.64 267.07 279.1 15 M + 2A – H
39 שיעור איזוקטיטיבי מיכל מזור C00311 10.13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 ציטראט CIT C00158 10.46 416.1 434.06 20 M + 3A – H

טבלה 1: זיהוי תוצאות ותיוג של מטבוליטים. מספר השיא התואם של כל תרכובת, זמן שמירה, ערך m/z עבור בלתי מסומן, 12c ו- 13c המסומנות בתווית ומינים של MS. , מינים של טרשת נפוצה. מעמדים לתגית אנילין

שיא לא. מטבוליט קיצור מזהה קג'ה ריכוז (ממ) SD (n = 3) הגבלת זיהוי (μM) גבול של טווח ליניארי (μM) R ^ 2
1 גליצרול 3-פוספט Gly3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 ניקולט אדנואמיד NAD C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 גלוקוז מגדל הפעמון C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 סדוהפטופסיד 7-פוספט S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
מיכל 5 פרוקטוז 6-פוספט F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 Guanosine monophosphate GMP C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 הריבואבד 5-פוספט RL5P C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 קיטידיין monophosphate CMP C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 לקטט LAC C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 אדנוזין monophosphate כח C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 אורידיין monophosphate ופט C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 ניקולט אדטינואמיד . אני מבין C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-חומצה פוספוליגליתית 3PG C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 קיטידין דיפוספט שב C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 Guanosine דיפוספט תוצר C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 אדנוזין דיפוספט ADP C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 אורידיין דיפוספט UDP C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 אדנונין תחביב C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 פרוקטוז 1, 6-ביספושונאים F16P C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 גלוקונטה 6-פוספט 6PG C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 ניטינאואמיד אדנין NADH C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 גלוקוז 6-פוספט G6P C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 ריבוז 5-פוספט R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 אריתרופוייז 4-פוספט E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 ציטידיין טריפוספט CTP C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 Guanosine פוספט GTP C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 אוקאלאצטט אואא C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 אלפא-כגלוטאטה מירב לארג C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 אורידיין טריפוספט UTP C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 אדנוזין טריפוספט ATP C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 פומרטה מרעום C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 פירובט מיכל האור C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 ארמיטה מאל C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 D-גליצראלדהיד 3-פוספט פער C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 אצטריל-קואנזים A ACA C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 ניטינאואמיד אדנין מיכל בע C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 פוספולפירופיבט עידוד C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 סוסואט היכל הג C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 שיעור איזוקטיטיבי מיכל מזור C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 ציטראט CIT C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

טבלה 2: כימות מטבוליט במדגם CFPS נציג. הריכוז של כל מטבוליט. וסטיית התקן מגבלת זיהוי, טווח של מקדם יניאריות ומתאם שזוהו מעקומות סטנדרטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכות ללא תא יש קיר תא, ולכן יש גישה ישירה מטבוליטים ומכונות ביו סינתטי ללא צורך הכנה לדוגמה מורכבת. עם זאת, מעט מאוד עבודה נעשתה כדי לפתח פרוטוקולים יסודיים וחזקים כדי כימות לחקור מערכות התגובה של התא ללא. במחקר זה, פיתחנו מהיר, שיטה איתנה כדי לכמת מטבוליטים בתערובות התגובה של התא חינם, פוטנציאל בתמציות תאים שלמים. כימות הפרט של מטבוליטים בתערובות מורכבות, כגון אלה שנמצאו תגובות לתא ללא תא, או תמציות תא שלם, הוא מאתגר מכמה סיבות. המרכז בין הסיבות הללו הוא מגוון כימי. מערך הקבוצות הפונקציונליות הנמצאות בו בתערובות אלה (למשל, חומצות קרקסיליות, אמרינות, פוספטים, הידרוקסילס וכו ') מגבירה במידה ניכרת את המורכבות האנליטית. כדי לעקוף את זה, השתמשנו שיטת ללעג אנילין בשילוב עם 13C סטנדרטים פנימיים כדי להחדיר מרכיבים הידרופובי לתערובות מטבוליט. באמצעות שיטה זו, אנו מכבש זוהה וככמת 40 מטבוליטים בתגובה ללא תא בהפעלה LC/MS אחת. הפרוטוקול מתויג 35 של התרכובות 40 במחקר זה, בעוד 5 תרכובות שנותרו כמותית עם שיטת עקומת רגילה. מוקדם יותר הציע את תנאי התגובה הקימו מלח הפנים מולקולרית בין הקבוצה אמין ו פוספט כי מעכבות ללעג12. תנאי התגובה לא זוהו עבור ללעג סימולטני של כל 40 תרכובות; עם זאת, החלופה הנוכחית היא כימות עם שיטת עקומה סטנדרטית. בעוד אנו הפגינו טכניקה זו בתערובת תא ללא תגובה, זה יכול להיות גם עשוי להיות מיושם על תמציות תאים שלמים, ובכך, פוטנציאל המאפשר הקוונפיקציה מוחלטת של ריכוזי מטבוליטים תאיים. ליישום האחרון יש רלוונטיות למגוון שאלות חשובות בתחום הביוטכנולוגיה ובריאות האדם.

השיטה המוצגת כאן התבססה על טכניקה קודמת (GSIST) שהוחלה על תמציות תאים שלמות של שמרים . cerevisiae ס12,13. במחקר זה, הרחבנו את מספר תרכובות אשר ניתן לזהות וכימות, כולל כל 12 נוקלאוטידים (xMP, xDP, Xdp, שם x הוא, C, G ו U). לתוספת של תרכובות אלה יכול להיות השלכות ביולוגיות חשובות. לדוגמה, נוקלאוטידים אלה מעורבים במידה רבה בתהליכי תמלול ותרגום, שהוא אחד התהליכים המרכזיים של עניין ביישומי CFPS, ובאופן כללי יותר תרכובות חשובות במגוון של פונקציות פיזיולוגיות. בנוסף, הצלחנו לזהות חומצה אצטית שהיא מטבוליט חשוב בעת בחינת חילוף החומרים הגולש. עם זאת, אנחנו לא כוללים את זה במחקר כי היה הפחתה משמעותית של האות בתרכובות מרובות, במיוחד ניטינאמיד אדנין הפחתת מופחת (nadh) וניקולט אדנולין dinucleotide גאות פוספט מופחת (nadh) כאשר חומצה אצטית נוספה לתערובת הסטנדרטית. חומצה אצטית היה מגבלה גבוהה של זיהוי של 612 μM, ולכן ברמות גבוהות אלה היה לו השפעה שלילית על אותות מטבוליטים אחרים. למרות זאת, חומצה אצטית עדיין יכול להיות מזוהה לכמת בדגימות על ידי יצירת עקומת רגיל עם חומצה אצטית רק בבקבוקון. חומצה אצטית היה ערך m/z של 134.0, זמן השמירה של 5.78 דקות, וטווח ליניארי מ 612 μM כדי 5000 μM (R2 = 0.986) כאשר מתויגים עם 12ג-אנילין. מטבוליטים שנותרו לא לשנות את אות היונים של השני ולייצג תערובת מקיפה כדי לאפיין את מטבוליזם CFPS. הפרוטוקול המוצג כאן מוגבל מטבוליטים מעורב בחילוף הפחמן והאנרגיה המרכזית. לכן, השיטה הנוכחית אינה מסוגלת למדוד שפע מטבוליזם ממסלולים אחרים שעשויים להיות בעלי חשיבות, כגון חומצת שומן ומטבוליזם של חומצות אמינו.

יחד, פיתחנו פרוטוקול מהיר, חזק לאפיון וקוונפיקציה מוחלטת של 40 תרכובות מעורבות גליקוליזיס, מסלול פוספט פנטוז מחזור חומצה tricarboxylic מטבוליזם אנרגיה, ו קופקטור התחדשות ב cfps תגובות. השיטה התבססה על סטנדרטים פנימיים המתויגים עם 13ג-אנילין, בעוד המדגם היה מתויג עם 12ג-אנילין. הסטנדרטים הפנימיים לדגום תרכובות לדוגמה מסולק ובוטלו ההשפעות יון לדיכוי המאפשרים קוונפיקציה מדויקת של מטבוליטים בודדים מורכבים תערובות מטבוליט. זיהינו סך של 40 תרכובות (41, אם כולל חומצת חומץ) כי ניתן לזהות וכימות בתערובת התגובה של התא ללא; עם זאת, רשימת מטבוליטים יכול להיות מורחב עוד יותר ומותאם לקראת התהליך הביוכימי המסוים של עניין. לפיכך, השיטה מספקת גישה איתנה ומדויקת לאפיון חילוף חומרים ללא תא, העשוי להיות קריטי לשיפור התשואה, הפרודוקטיביות והאנרגיה של תהליכים ללא תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה שתוארה נתמכת על ידי המרכז על הפיסיקה של מטבוליזם הסרטן באמצעות הפרס מספר 1U54CA210184-01 מהמכון הלאומי לסרטן (https://www.cancer.gov/). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומיים לבריאות. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
  2. Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
  3. Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
  4. Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
  5. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
  6. Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
  7. Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
  8. Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
  9. Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
  10. Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
  11. Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
  12. Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
  13. Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
  14. Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

Tags

ביוכימיה סוגיה 152 סינתזה של חלבון תא מערכת כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטר מסה תיוג אנילין פחמן מרכזי חילוף חומרים באנרגיה תקן פנימי רשת מטבולית תיוג איזונושא
קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S.,… More

Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter