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Biochemistry

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60329
Automatic Translation
1, 1, *1, *1, 1
1Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

ここでは、無細胞タンパク質合成反応において中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40種類の化合物を定量するための堅牢なプロトコルを提示する。無細胞合成混合物は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて効果的な分離のためにアニリンで誘導体化され、同位体標識内部標準を用いて質量分析法によって定量される。

Abstract

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質のインビトロ産生のためのシステムおよび合成生物学における新しい技術です。しかし、CFPSが研究室を超えて、時間の製造技術の中で普及し、標準になる場合は、これらのシステムの性能限界を理解する必要があります。この問題に対して、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を定量する堅牢なプロトコルを開発しました。この方法では、13個の C-アニリンでタグ付けされた内部標準を使用し、サンプル内の化合物は12個の C-アニリンで誘導体化されます。内部標準および試料を混合し、逆相液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)によって分析した。化合物の共溶出によりイオン抑制が排除され、平均相関係数が0.988であった2~3桁以上の代謝物濃度の正確な定量が可能となった。40個の化合物のうち5種はアニリンでタグ付けされていないが、CFPSサンプルで検出され、標準的な曲線法で定量された。クロマトグラフィーの実行は、完了するまでに約 10 分かかります。まとめると、CFPSに関与する40の化合物を単一のLC/MSランで分離し、正確に定量する高速で堅牢な方法を開発しました。この方法は、無細胞代謝を特徴付ける包括的かつ正確なアプローチであり、最終的には、無細胞システムの歩留まり、生産性、エネルギー効率を理解し、改善することができます。

Introduction

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、タンパク質や化学物質の製造に有望なプラットフォームであり、従来は生きている細胞のために予約されてきました。無細胞系は、粗細胞抽出物に由来し、細胞増殖1に関連する合併症を排除する。さらに、CFPSは細胞壁の干渉なしで代謝産物および生合成機械への直接アクセスを可能にする。しかし、無細胞プロセスの性能限界に関する根本的な理解が欠けている。代謝物定量のための高スループット法は、代謝の特性評価に貴重であり、代謝計算モデル2、3、4の構築に不可欠である。代謝産物濃度を決定するために使用される一般的な方法には、核磁気共鳴(NMR)、フーリエ形質転換赤外分光法(FT-IR)、酵素系アッセイ、質量分析(MS)5、6、7などがあります。 、8.しかし、これらの方法は、多くの場合、一度に複数の化合物を効率的に測定できないことによって制限され、多くの場合、典型的な無細胞反応よりも大きいサンプルサイズを必要とします。例えば、酵素ベースのアッセイは、多くの場合、実行で単一の化合物を定量するためにのみ使用することができ、無細胞タンパク質合成反応(通常は10〜15°Lスケールで実行される)のように、サンプルサイズが小さい場合に制限されます。一方、NMRは、検出および定量のための代謝産物の高い量を必要とします5. これらの欠点に対して、質量分析法(LC/MS)と連像のクロマトグラフィー法は、高感度および複数の種を同時に測定する能力を含むいくつかの利点を提供する9;しかし、測定される種の数と多様性に伴い、分析の複雑さが大幅に増加します。したがって、LC/MSシステムの高スループットポテンシャルを十分に実現する方法を開発することが重要です。試料中の化合物は液体クロマトグラフィーで分離され、質量分析によって同定される。化合物のシグナルは、その濃度およびイオン化効率に依存し、そこでイオン化は化合物間で変化し得るし、また、サンプルマトリックスに依存し得る。

LC/MSを使用して分析物を定量する場合、サンプルと規格の間で同じイオン化効率を達成することは課題です。また、プロトン親和性および極性10におけるシグナル分割および不均一性による代謝産物多様性に伴う定量化がより困難となる。最後に、試料の共溶出マトリックスは、化合物のイオン化効率にも影響を与え得る。これらの問題に対処するために、代謝産物を化学的に誘導体化し、LC/MSシステムによる分離分解分解分解と感度を高め、場合によっては信号分割を10、11に減少させることができる。化学誘導体化は、代謝産物の特定の官能基をタグ付けして、電荷や疎水性などの物理的性質を調整してイオン化効率を11上げることによって機能する。種々のタグ付け剤は、異なる官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、リン酸塩、カルボン酸など)を標的とするために使用することができる。アニリンは、そのような誘導体化剤の1つが、一度に複数の官能基を標的とし、親水性分子に疎水性成分を加え、それによってその分離分解能およびシグナル12を増加させる。共溶出マトリックスイオン抑制効果に対処するために、ヤンと同僚は、標準が13Cアニリン同位体でタグ付けされ、サンプルと混合されるグループ固有の内部標準技術(GSIST)ラベリングに基づく技術を開発しました。12、13.代謝産物および対応する内部標準は、共溶成以来同じイオン化効率を有し、その強度比を使用して実験試料中の濃度を定量することができます。

本研究では、CFPS反応における糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝および補因子再生に関与する40の化合物を検出し、定量するプロトコルを開発した。この方法はGSISTアプローチに基づいており、12のC-アニリンと13のC-アニリンを使用して、逆相LC/MSを使用して代謝産物をタグ付け、検出、定量しました。すべての化合物の線形範囲は、平均相関係数0.988の2〜3桁に及んだ。したがって、この方法は、無細胞代謝、および場合によっては全細胞抽出物を問い合わせるための堅牢で正確なアプローチです。

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Protocol

1. アニリンタグ付け用試薬の調製

  1. pH 4.5で6Mアニリン溶液を調製します。フードで働き、550 μLのアニリンとLCMS等級水の337.5°L、12M塩酸(HCl)の112.5°Lを遠心管に組み合わせます。ボルテックスウェルと4°で保存します。
    注:アニリンは4°Cで2ヶ月間保存することができます。
    注意:アニリンは非常に有毒であり、ヒュームフードで作業する必要があります。塩酸は腐食性が高い
  2. pH 4.5で6M 13Cアニリン溶液を調製します。250 mg の13C6-アニリンと水の132°L、12 M HCl. 渦井戸の44°Lを組み合わせ、4°Cで保存します。
  3. 200 mg/mL N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)溶液を調製する。すべてのサンプルに対して10°Lの水に2mgのEDCを溶かし、渦をよく付ける。
    注:EDC溶液は、反応と同じ日に調製されるべきである。EDCは、アニリン12を有する化合物の誘導体化のための触媒として作用する。

2. 基準の整備

  1. LC/MSグレードの水に溶解したすべての化合物の別々のストック溶液を作る(表1)。
  2. 内部標準的なストックソリューションの準備
    1. ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、アセチル補酵素A(ACA)、グリセロール3-リン酸(Gly3P)を除くすべての化合物を、適切な体積で組み合わせ、すべての化合物の2 mMのストックソリューションを作成します。
  3. NAD、NADP、FAD、ACA、および Gly3P を適切なボリュームと組み合わせて、2 mM のストック ソリューションを作成します。

3. サンプルの調製 (図 1)

  1. クエンチし、反応に等量の氷冷100%エタノールを加えることによって、無細胞タンパク質合成反応でタンパク質を沈殿させます。サンプルを12,000 x gで遠心分離し、4°Cで15分間。新しい遠心管に上清を移します。
    注:サンプルは、この時点で-80 °Cで保存し、後で分析することができます

4. 標識反応

  1. 12C-アニリン溶液によるラベリングサンプル
    1. 6 μL のサンプルを新しい遠心管に移し、体積を水で 50°L にします。
      注:体積サンプルサイズは、特定のCFPS反応に依存する場合があります。
    2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
    3. 12C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
      注: アニリン溶液は2つのフェーズに分かれています。反応に加える前によく混ぜます。
    4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
    5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、フュームフードで反応にトリエチルアミン(TEA)を1.5μL加えます。
      注:トリエチルアミンは、アニリンタグ付け反応を停止し、化合物を安定化する溶液のpHを上げます。
      注意: トリエチルアミンは有毒であり、目や気道の刺激を引き起こす.
    6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
  2. 13C-アニリン溶液による内部標準のラベリング
    1. 内部原液を50μLの最終容積で80μMに希釈します。
      注:内部標準の濃度は、実験サンプルに近いレベルに調整することができます。
    2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
    3. 13C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
    4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
    5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。
    6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
  3. タグ付き内部標準とタグ付きサンプルの組み合わせ
    1. 12C-アニリンラベル付きサンプルの25 μLを、25°Lの13C-アニリンラベル標準と混合します。
    2. オートサンプラーバイアルに転送し、LC/MS手順で分析します。
  4. タグなし代謝産物の標準曲線の作成
    1. タグなし代謝産物(NAD、NADP、FAD、ACA、Gly3P)の希薄な原液を、体積50μLの320μM、80μM、20μM、5μMの最終濃度に希釈します。
    2. 200 mg/mL EDC 溶液の 5 μL を追加します。
    3. 12C-アニリン溶液の5°Lを加えます。
    4. 室温で2時間穏やかに振とう反応をボルテックス。
    5. 2時間後、シェーカーからチューブを取り出し、ヒュームフードの反応にTEAの1.5 μLを加えます。
    6. 13,500 x gで3分間遠心分離機。
    7. 上清をオートサンプラーバイアルに移し、LC/MS手順で分析します。
      注: タグなし代謝産物は、同様のイオン化効率を維持するためにサンプルマトリックスを複製するサンプルと同じ手順に従います。

5. LC/MS手順の設定

  1. 溶剤の調製
    1. 酢酸でpH4.75に調整した5mMトライブチラミン(TBA)水溶液を調製する。
      注:モバイルフェーズのTBAは、分解物が良好な解像度と分離14を達成するのに役立ちます。
    2. アセトニトリル(ACN)で5 mM TBAを準備します。
    3. 5%の水と95%のACNで洗浄溶剤を準備します。
    4. 95%の水と5%のACNでパージ溶媒を準備します。
  2. MS 条件の設定
    1. 質量分析計をプローブ温度520°C、負のキャピラリー電圧-0.8kV、正のキャピラリー電圧0.8kVの負イオンモードに設定し、ソフトウェアを5ポイント/sでデータを取得するように設定します。
    2. 指定した円錐電圧と質量過充電(m/z)値を持つ各代謝産物に対して、選択したイオン記録(SIR)を設定します。表 1を参照してください。
  3. 製造元の指示に従って LC/MS を初期化する
    1. 3分間の溶媒マネージャーにおける主な溶媒ライン。
    2. プライム洗浄溶媒(5%水、95%ACN)およびパージ溶媒(95%水、5%ACN)を15sで5サイクル使用。
    3. サンプルマネージャを10°Cに設定します。
    4. C18(1.7μm、2.1mm x 150mm)カラムを取り付け、100%ACNを0.3 mL/分で10分間初期化します。
    5. バッファー付きの溶媒を導入する前に、カラムを95%の水と5%ACNで10分間調整します。
    6. カラムを95%の溶媒A(5mM TBA水性、pH 4.75)と5%の溶媒B(ACNでは5mM TBA)で0.3 mL/分で10分間調整します。
    7. 溶出を95%溶媒Aおよび5%溶媒Bから始めて勾配プロトコルを設定し、10分で70%の溶媒Bに上げ、2分間で100%溶媒Bに上げ、100%溶媒Bで3分間保持した(95%溶媒A)に戻る、5%の溶媒B)を1分間以上保持し、カラムを再平衡化するために9分間保持する。
    8. カラムへの注入の前に、グラデーションプロトコルで列を3回調整します。
  4. サンプルと規格の注入
    1. カラムにサンプルの5μLを注入し、12C-アニラインタグ付きサンプルに対して適切なm/zイオン強度を取得します。
    2. 同じサンプルの5 μLをもう一度注入しますが、今回は13のC-アニラインタグ付き規格のm/zイオン強度を取得します。
      注: LC/MS システムは、指定された時間枠で取得するにはデータが多すぎるため、指定された SIR タイム ウィンドウで12C と13C m/z の両方の強度を取得できません。したがって、同じサンプルを2回注入します。
    3. タグなしの代謝産物規格を最も低濃度から最高に注入し、適切なm/zイオン強度を記録します。

6. 定量

  1. エクスポートメソッドの作成
    1. データ取得ソフトウェアで、[ファイル] → [新しい方法] → [エクスポート方法]を選択します。
    2. ファイル名を指定します。
    3. [ASCII ファイルのエクスポート]をオンにし、テキスト ファイルのエクスポート先ディレクトリを選択します。
    4. [レポートの種類]で、[すべて別に概要]を選択します。
    5. [区切り記号]の [列] で、 を選択します。[行]で[cr][if]を選択します。
    6. [テーブル]で [エクスポート]を選択し、[テーブルの編集]をクリックして、[サンプル名]、[面積]、[高さ]、[金額]、および [単位]を含めます。
    7. エクスポート方法を保存します。
  2. データ取得ソフトウェアを使用した内部標準による代謝産物の定量化
    1. [サンプル セット]タブで、対応するLC/MS実行を右クリックし、[表示] > [チャネル]を選択します。
    2. 1 つのインジェクションの13個の C-aniline 内部規格のすべての SIR チャネルを選択し、右クリックして[レビュー]を選択します。
    3. [LC 処理方法レイアウト]ウィンドウが自動的に表示されない場合は、[表示/処理メソッド レイアウト] に移動します。
    4. [メソッドレイアウトの処理]で、[統合]タブに移動し、ApexTrackをアルゴリズムとして設定します。
    5. [スムージング]タブに移動し、タイプを[平均]に設定し、スムージング レベルを13に設定します。
      注: スムージング レベルは、すべてのサンプルで一貫している限り、選択できます。
    6. [MS チャネル]タブで、[MS 3D 処理]を無効にします。
    7. SIR チャネル・ウィンドウで、各ピークを一度に 1 チャネルずつ統合します。ピークが統合されたら、[オプション] > [結果から塗りつぶし]に移動し、[コンポーネント]タブにピークの詳細が入力されます。
    8. すべての SIR チャネルが評価されたら、処理方法を保存してウィンドウを閉じます。
    9. 13個の C-アニリンと12個の C-アニライン タグ付きサンプルのすべての SIR チャネルを選択し、右クリックして [プロセス]を選択します。
    10. [処理]ボックスをオンにし、[指定した処理方法を使用する] を選択して、保存する処理方法を選択します。また、[エクスポート]ボックスをオンにし、[指定したエクスポート方法を使用する] を選択して、先ほど作成した保存済みのエクスポート方法を選択します。[OK] をクリックします。
    11. エクスポートしたテキスト ファイルを Excel で開き、次の方法で不明なコンパウンドの濃度を計算します。
      Equation 1
      ここで、Cx,iは代謝産物iの未知試料の濃度であり、Ax,iは未知の代謝産物iの集積領域であり、Astd,iは代謝産物iの内部標準の統合領域であり、C std,iは、代謝産物iの内部標準の濃度、およびDは希釈因子である。
  3. 標準曲線を使用したタグなし代謝産物の定量
    1. [サンプルセット]タブで、対応する LC/MS 実行を右クリックし、[表示] > [チャネル]を選択します。
    2. 1 つのインジェクションのタグなし規格のすべての SIR チャネルを選択し、右クリックして[レビュー]を選択します。
    3. [LC 処理方法レイアウト]ウィンドウが自動的に表示されない場合は、[表示/処理メソッド レイアウト] に移動します。
    4. [メソッドレイアウトの処理] で、[統合]タブに移動し、ApexTrack をアルゴリズムとして設定します。
    5. [スムージング]タブに移動し、タイプを[平均]に設定し、スムージング レベルを13に設定します。
      注: スムージング レベルは、すべてのサンプルで一貫している限り、選択できます。
    6. [MS チャネル]タブで、[MS 3D 処理]を無効にします。
    7. SIR チャネル・ウィンドウで、各ピークを一度に 1 チャネルずつ統合します。ピークが統合されたら、[オプション] > [結果から塗りつぶし]に移動し、[コンポーネント]タブにピークの詳細が入力されます。
    8. すべての SIR チャネルが評価されたら、処理方法を保存してウィンドウを閉じます。
    9. [サンプルセット] タブで、サンプル セットを右クリックし、[サンプルの変更] を選択します。
    10. 新しいウィンドウで[金額]を選択します。
    11. [プロセス方法] から [コピー] を選択し、保存したプロセス方法を選択します。
    12. バイアルごとに各代謝産物の濃度を入力し、各コンポーネント(または対応する単位)に対して単位を <μM として入力し、[OK]を選択します。
    13. サンプル セットをもう一度選択し、右クリックして [表示] > [チャネルとして表示]をクリックします。
    14. 標準のタグなし代謝産物のすべての SIR チャネルを選択し、右クリックして [プロセス] を選択します。
    15. [処理] ボックスをオンにし、[ 指定した処理方法を使用する ] を選択します。適切な処理方法を選択し、[OK]をクリックします。
    16. サンプルのすべてのタグなし代謝産物に対して SIR チャネルを選択し、右クリックして [プロセス]を選択します。
    17. [処理]ボックスをオンにし、[指定した処理方法を使用する] を選択して、保存した処理方法を選択します。また、[エクスポート]ボックスをオンにし、[指定したエクスポート方法を使用する] を選択して、先ほど作成した保存済みのエクスポート方法を選択します。[OK] をクリックします。
    18. 標準曲線を使用してタグなしの代謝産物を定量化し、その結果を指定したディレクトリにテキスト ファイルにエクスポートします。

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Representative Results

概念実証として、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する大腸菌系CFPS系の代謝産物を定量化するプロトコルを用いた。 CFPS反応(14μL)をエタノールで急行し、脱タンパク質化した。その後、CFPSサンプルは12C-アニリンでタグ付けされ、標準は13C-アニリンでタグ付けされました。タグ付けされたサンプルと標準を組み合わせて LC/MS に注入しました (図 1)。内部標準を用いて中枢炭素・エネルギー代謝に関与する40個の代謝産物を検出・定量化した一方、アニリンでタグ付けされなかった代謝産物5名の標準曲線も開発された(図2)。これらの経路に関与する多様な代謝産物は、リン酸化糖、ホスホカルボン酸、カルボン酸、ヌクレオチド、および補因子のクラスであった。アニリンによる誘導体化は、逆相クロマトグラフィー12を用いてより効果的な分離を促進する親水性分子に疎水性部分を導入した。さらに、この方法は、グルコース6-リン酸およびフルクトース6-リン酸などの構造異性体対を単一のLC/MSランで分離することを可能にした。各化合物の質量過充電量(m/z)比と保持時間は、一度に1mMの化合物を注入し、質量スペクトルをブランクと比較することにより、実験前に同定した(表1)。

すべての化合物の検出限界と直線性の範囲は、0.10μMから400μMまでの標準曲線を生成することによって推定された(表2)。すべての化合物の平均相関係数(R2)は0.988であり、ほとんどの化合物は3オーダーの線形範囲を有していた。3つの化合物は顕著な飽和効果を有し、特に0.1μMから25μMまでの線形範囲を有するα-ケトグルタル酸は、アイソクエン酸およびクエン酸も100μMを超える飽和効果を有していた。

Figure 1
図 1: アニライン タグ付けのワークフローの概略図無細胞タンパク質合成反応は脱タンパク質化され、12C-アニリンでタグ付けされ、標準的なストック混合物は13C-アニリンでタグ付けされます。両方の混合物を1:1の体積比で混合し、LC/MSによって分析します。

Figure 2
図2:40の代謝産物に対して選択されたイオンクロマトグラムを重ね合わせた。40代謝産物の40 μM標準混合物の単一LC/MSランからの質量クロマトグラム。ピークは、各化合物の保持時間とm/z値によって同定された。完全な複合名とその省略形を表 1に示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ピーク数 代謝 産物 省略 形 KEGG ID 保持時間 (分) 12C m/z 13C m/z ラベル以外の m/z 品種 MS種
1 グリセロール-3-リン酸 Gly3P C00093 3.85 153 10 M – H2O – H
2 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド Nad C00003 3.96 698 10 M + Cl – H
3 グルコース Glc C00031 4.06 289.9 296 15 M + A + Cl - H
4 セドフェプツロース-7-リン酸 S7P C05382 5.41 364 370 10 M + A – H
5 フルクトース-6-リン酸 F6P C00085 5.48 334 340 10 M + A – H
6 グアノシン一リン酸 Gmp C00144 5.57 437.05 443 10 M + A – H
7 リブロース-5-リン酸 RL5P C00199 5.58 304 310 10 M + A – H
8 シチジン一リン酸 Cmp C00055 5.59 397.09 403 10 M + A – H
9 乳酸 ラック C00186 5.77 164.05 170 10 M + A – H
10 アデノシン一リン酸 アンプ C00020 5.85 421.1 427.1 10 M + A – H
11 ウリジン一リン酸 Ump C00105 5.88 398.07 404 10 M + A – H
12 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 Nadp C00006 6.39 724 10 M - H2O – H
13 3-ホスホグリセリン酸 3PG C00197 6.63 242 248.06 15 M + A – H2O – H
14 シチジン二リン酸 Cdp C00112 6.72 477 483 10 M + A – H
15 グアノシン二リン酸 Gdp C00035 6.87 517 523 10 M + A – H
16 アデノシン二リン酸 Adp C00008 6.94 501 507 10 M + A – H
17 ウリジン二リン酸 Udp C00015 6.97 478 484 10 M + A – H
18 フラビンアデニンジヌクレオチド 流行 C00016 7.03 784.15 15 M – H
19 フルクトース-1,6-ビスリン酸 F16P C05378 7.1 395.95 402.1 10 M + A – H2O – H
20 グルコン酸-6-リン酸 6PG C00345 7.11 425.1 437 10 M + 2A – H
21 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド減少 Nadh C00004 7.23 633.13 639.08 10 M + A + H2O – ニコチンアミド – H
22 グルコース-6-リン酸 G6P C00668 7.32 409.1 421.1 10 M + 2A – H
23 リボース-5-リン酸 R5P C00117 7.54 379.1 391.1 15 M + 2A – H
24 エリスロース-4-リン酸 E4P C00279 7.71 348.9 361 10 M + 2A – H
25 シチジン三リン酸 Ctp C00075 7.84 557 563 5 M + A – H
26 グアノシン三リン酸 Gtp C00044 7.93 597 603 5 M + A – H
27 オキサ酢酸 OAA C00036 7.94 281 293 25 M + 2A – H
28 α-ケトグルタル酸 Akg C00026 7.95 295 307.1 15 M + 2A – H
29 ウリジン三リン酸 Utp C00075 7.97 558 564 10 M + A – H
30 アデノシン三リン酸 Atp C00002 8.03 581 587 15 M + A – H
31 フマル酸塩 FUM C00122 8.09 265 277.1 10 M + 2A – H
32 ピルビン 酸 PYR C00022 8.09 162 168 25 M + A – H
33 リンゴ 酸 マル C00149 8.09 283.06 295.15 10 M + 2A – H
34 D-グリセルアルデヒド-3-リン酸 ギャップ C00118 8.09 319 331.1 5 M + 2A – H
35 アセチル補酵素A Aca C00024 8.16 790 10 M – H2O – H
36 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元 Nadph C00005 8.23 694.92 700.82 10 M + A – ニコチンアミド – H
37 ホスホエノールピルビン酸 Pep C00074 8.28 317 329.1 20 M + 2A – H
38 コハク酸塩 SUCC C00042 8.64 267.07 279.1 15 M + 2A – H
39 アイソクエン酸塩 ICIT C00311 10.13 398 416 10 M + 3A – H2O – H
40 クエン酸 Cit C00158 10.46 416.1 434.06 20 M + 3A – H

表1:代謝産物の同定と標識結果各化合物の対応するピーク数、保持時間、標識されていないm/z値、標識された12Cおよび13C、およびMS種。MS種、Aはアニリンタグの略です。

ピーク番号 代謝 産物 省略 形 KEGG ID 濃度 (mM) SD (n = 3) 検出限界 (μM) 線形範囲の限界 (μM) R^2
1 グリセロール-3-リン酸 Gly3P C00093 0.377 0.034 0.1 400 0.995
2 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド Nad C00003 0.052 0.010 0.39 400 0.993
3 グルコース Glc C00031 0.002 0.000 0.1 400 0.997
4 セドフェプツロース-7-リン酸 S7P C05382 0.007 0.000 0.16 400 0.988
5 フルクトース-6-リン酸 F6P C00085 0.029 0.004 0.1 400 0.986
6 グアノシン一リン酸 Gmp C00144 0.007 0.001 0.39 100 0.992
7 リブロース-5-リン酸 RL5P C00199 0.035 0.002 0.39 400 0.996
8 シチジン一リン酸 Cmp C00055 0.045 0.001 0.1 100 0.992
9 乳酸 ラック C00186 2.134 0.048 0.1 400 0.988
10 アデノシン一リン酸 アンプ C00020 0.020 0.002 0.1 100 0.992
11 ウリジン一リン酸 Ump C00105 0.021 0.000 0.1 100 0.997
12 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 Nadp C00006 0.014 0.002 0.34 400 0.950
13 3-ホスホグリセリン酸 3PG C00197 6.125 0.239 0.1 100 0.996
14 シチジン二リン酸 Cdp C00112 0.202 0.029 0.39 400 0.997
15 グアノシン二リン酸 Gdp C00035 0.146 0.027 1.5625 400 0.984
16 アデノシン二リン酸 Adp C00008 0.797 0.161 0.39 400 0.995
17 ウリジン二リン酸 Udp C00015 0.212 0.036 0.39 400 0.991
18 フラビンアデニンジヌクレオチド 流行 C00016 0.008 0.001 0.1 400 0.958
19 フルクトース-1,6-ビスリン酸 F16P C05378 3.643 0.105 0.39 400 0.989
20 グルコン酸-6-リン酸 6PG C00345 0.017 0.001 0.39 400 0.989
21 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド減少 Nadh C00004 0.063 0.028 0.39 100 0.972
22 グルコース-6-リン酸 G6P C00668 0.046 0.002 0.1 400 0.984
23 リボース-5-リン酸 R5P C00117 0.055 0.005 0.39 100 0.999
24 エリスロース-4-リン酸 E4P C00279 0.038 0.007 0.39 400 0.979
25 シチジン三リン酸 Ctp C00075 0.896 0.078 6.25 100 0.998
26 グアノシン三リン酸 Gtp C00044 0.870 0.109 6.25 100 0.993
27 オキサ酢酸 OAA C00036 0.023 0.008 0.56 400 0.997
28 α-ケトグルタル酸 Akg C00026 0.391 0.020 0.1 25 0.979
29 ウリジン三リン酸 Utp C00075 0.845 0.092 1.5625 400 0.998
30 アデノシン三リン酸 Atp C00002 1.557 0.188 1.5625 400 0.991
31 フマル酸塩 FUM C00122 0.576 0.100 1.5625 100 0.999
32 ピルビン 酸 PYR C00022 5.813 0.804 0.39 400 0.993
33 リンゴ 酸 マル C00149 2.548 0.269 0.1 400 0.991
34 D-グリセルアルデヒド-3-リン酸 ギャップ C00118 2.194 0.367 0.1 100 0.974
35 アセチル補酵素A Aca C00024 0.196 0.044 0.1 100 0.991
36 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元 Nadph C00005 0.006 0.010 0.14 100 0.990
37 ホスホエノールピルビン酸 Pep C00074 3.442 0.345 0.1 100 0.962
38 コハク酸塩 SUCC C00042 5.683 0.573 0.1 320 0.999
39 アイソクエン酸塩 ICIT C00311 0.003 0.006 0.39 100 0.998
40 クエン酸 Cit C00158 0.002 0.001 0.1 100 0.981

表2:代表的なCFPSサンプルにおける代謝物定量。各代謝産物の濃度と標準偏差。標準曲線から特定された検出の限界、直線性および相関係数の範囲。

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Discussion

無細胞システムは細胞壁を持たないため、複雑なサンプル調製を必要とせずに代謝産物や生合成機械に直接アクセスできます。しかし、細胞のない反応系を定量的に調べるための徹底的で堅牢なプロトコルを開発する作業はほとんど行われていない。本研究では、無細胞反応混合物および全細胞抽出物中の代謝産物を定量する高速で堅牢な方法を開発した。細胞を含まない反応や全細胞抽出物など、複雑な混合物中の代謝産物の個別定量は、いくつかの理由で困難である。これらの理由の中心は、化学的多様性です。これらの混合物中に同時に存在する官能基の配列(例えば、カルボン酸、アミン、リン酸塩、ヒドロキシルなど)は、分析の複雑さを大幅に増加させる。これを回避するために、13C内部規格と組み合わせてアニリン誘導体化法を用いて、代謝産物混合物に疎水性成分を導入した。この方法を用いて、1回のLC/MSランで無細胞反応で40個の代謝産物を堅牢に検出し、定量した。この研究では40化合物のうち35種類のプロトコルにタグを付け、残りの5種の化合物は標準曲線法で定量した。以前の研究は、誘導体化を阻害したアミンとリン酸基との間に分子内塩を形成した反応条件を示唆した。反応条件は、すべての40化合物の同時誘導体化のために同定されなかった;ただし、現在の代替方法は、標準の曲線法による定量化です。この技術を無細胞反応混合物で実証したが、細胞全体の抽出物にも適用される可能性が高く、細胞内代謝産物濃度の絶対定量を可能にする可能性がある。後者のアプリケーションは、バイオテクノロジーと人間の健康に関する様々な重要な質問に関連しています。

ここで提示された方法は、酵母S.セレビシエ12、13の全細胞抽出物に適用された以前の技術(GSIST)に基づいていた。本研究では、12ヌクレオチド(xMP、xDP、xTP、xはA、C、G、U)すべてを含む、検出および定量化できる化合物の数を拡大した。これらの化合物の添加は、重要な生物学的意味を有し得る。例えば、これらのヌクレオチドは、CFPSアプリケーションにおいて関心のある中心的なプロセスの1つである転写および翻訳プロセスに大きく関与しており、より一般的には化合物が様々な生理機能において重要である。また、オーバーフロー代謝を調べる際に重要な代謝産物である酢酸を検出することができました。しかし、複数の化合物、特にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元(NADH)およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元(NADPH)のシグナルが酢酸の場合に有意に減少したため、研究には含めなかった。標準混合物に添加した。酢酸は612μMの検出限界が高く、これらの高レベルでは他の代謝産物のシグナルに悪影響を及ぼした。それにもかかわらず、酢酸はバイアルに酢酸だけを含む標準曲線を作成することにより、サンプル中で検出および定量することができます。酢酸は、m/z値が134.0、保持時間が5.78分、直線範囲が612μMから5000μM(R2 = 0.986)の12C-アニリンでタグ付けされた場合の距離範囲を有していた。残りの代謝産物は互いのイオンシグナルを変化させなかったし、CFPS代謝を特徴付ける包括的な混合物を表す。ここで提示されるプロトコルは、中央炭素およびエネルギー代謝に関与する代謝産物に限定される。したがって、現在の方法は、脂肪酸やアミノ酸代謝など、重要な他の経路から代謝物の存在量を測定することができません。

まとめると、糖分解、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸サイクル、エネルギー代謝、CFPSにおける補因子再生に関与する40種類の化合物の特性評価と絶対定量のための高速で堅牢なプロトコルを開発しました。反応。この方法は13のC-アニリンでタグ付けされた内部標準に依存し、サンプルは12C-アニリンでタグ付けされました。内部標準とサンプル化合物は、複雑な代謝産物混合物中の個々の代謝産物の正確な定量を可能にするイオン抑制効果を共存させ、排除しました。我々は、無細胞反応混合物中で検出および定量することができる合計40の化合物(41、酢酸を含む)を同定した。しかし、代謝産物のリストはさらに拡大され、関心のある特定の生化学的プロセスに向けて調整される可能性があります。したがって、この方法は、無細胞プロセスの歩留まり、生産性、エネルギー効率を向上させるために重要である可能性のある無細胞代謝を特徴付ける堅牢で正確なアプローチを提供します。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

記載された研究は、国立がん研究所(https://www.cancer.gov/)から1U54CA210184-01賞を通じてがん代謝物理学センターによって支援されました。コンテンツは著者のみ責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12C Aniline Sigma-Aldrich 242284 Aniline 12C
13C labeled aniline Sigma-Aldrich 485797 Aniline 13C6
3-Phosphoglyceric acid Sigma-Aldrich P8877 3PG
Acetic Acid FisherScientific AC222140010 ACE
Acetonitrile, LCMS JT BAKER 9829-03 ACN
Acetyl-coenzyme A Sigma-Aldrich A2056 ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column Waters 186002353 Column
Adenosine diphosphate Sigma-Aldrich A2754 ADP
Adenosine monophosphate Sigma-Aldrich A1752 AMP
Adenosine triphosphate Sigma-Aldrich A2383 ATP
Alpha-ketoglutarate Sigma-Aldrich K1128 aKG
Citrate Sigma-Aldrich 251275 CIT
Cytidine diphosphate Sigma-Aldrich C9755 CDP
Cytidine monophosphate Sigma-Aldrich C1006 CMP
Cytidine triphosphate Sigma-Aldrich C9274 CTP
D-glyceraldehyde 3-phosphate Sigma-Aldrich 39705 GAP
Erythrose 4-phosphate Sigma-Aldrich E0377 E4P
Ethanol Sigma-Aldrich EX0276 EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge FisherScientific Centrifuge
Flavin adenine dinucleotide Sigma-Aldrich F6625 FAD
Fructose 1,6-bisphosphate Sigma-Aldrich F6803 F16P
Fructose 6-phosphate Sigma-Aldrich F3627 F6P
Fumarate Sigma-Aldrich F8509 FUM
Gluconate 6-phosphate Sigma-Aldrich P7877 6PG
Glucose Sigma-Aldrich G8270 GLC
Glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich G7879 G6P
Glycerol 3-phosphate Sigma-Aldrich G7886 Gly3P
Guanosine diphosphate Sigma-Aldrich G7127 GDP
Guanosine monophosphate Sigma-Aldrich G8377 GMP
Guanosine triphosphate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 HCl
Isocitrate Sigma-Aldrich I1252 ICIT
Lactate Sigma-Aldrich L1750 LAC
Malate Sigma-Aldrich 02288 MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit ArborBiosciences 507024 Cell-free protein synthesis
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 03449 EDC
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich 43410 NAD
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Sigma-Aldrich N5755 NADP
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced Sigma-Aldrich 481973 NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide reduced Sigma-Aldrich N8129 NADH
Oxalacetate Sigma-Aldrich O4126 OAA
Phosphoenolpyruvate Sigma-Aldrich P0564 PEP
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280 PYR
Ribose 5-phosphate Sigma-Aldrich R7750 R5P
Ribulose 5-phosphate CarboSynth MR45852 RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate CarboSynth MS07457 S7P
Succinate Sigma-Aldrich S3674 SUCC
Tributylamine Sigma-Aldrich 90780 TBA
Triethylamine FisherScientific O4884 TEA
ultrapure water FisherScientific 10977-015 water
Uridine diphosphate Sigma-Aldrich U4125 UDP
Uridine monophosphate Sigma-Aldrich U6375 UMP
Uridine triphosphate Sigma-Aldrich U6625 UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR Vortex
Water, LCMS JT BAKER 9831-03 WATER
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager Waters LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN Waters LCMS
Waters Acquity Qda detector Waters LCMS
Waters Empower 3 Waters Software
Waters LCMS Total Recovery Vial Waters 186000384c LCMS Vial

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References

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生化学,問題152,無細胞性タンパク質合成,液体クロマトグラフィー質量分析,アニリンタギング,中央炭素,エネルギー代謝,内部標準,代謝ネットワーク,同位体標識
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Vilkhovoy, M., Dai, D., Vadhin, S., Adhikari, A., Varner, J. D. Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (152), e60329, doi:10.3791/60329 (2019).

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